CN110157805A - 一种hoxb13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒 - Google Patents

一种hoxb13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒 Download PDF

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CN110157805A CN201910429439.9A CN201910429439A CN110157805A CN 110157805 A CN110157805 A CN 110157805A CN 201910429439 A CN201910429439 A CN 201910429439A CN 110157805 A CN110157805 A CN 110157805A
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Abstract

本发明提供了一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒，所述试剂盒中包含HOXB13、ABCG1、EZH2和IL6的q‑PCR引物，利用本发明所述试剂盒，可有效检测HOXB13及其下游靶基因ABCG1、EZH2和IL6的转录表达水平，通过取4分子表达之和预测肺腺癌患者化疗耐药和疾病预后。并且，该分子组合预示化疗耐药和不良预后的发现将为其开展广泛的临床应用奠定基础。

Description

一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及 耐药的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒。
背景技术
肺腺癌发病率逐年升高，目前已经成为所有肺癌中最常见的组织学类型。尽管肺癌的治疗技术发展迅速，但是肺腺癌仍然很难早期发现并且得到及时的治疗，预后没有发生明显的改善，病人的5年存活率仍然很低，只有大约10％左右。顺铂联合紫杉醇或者吉西他滨为肺腺癌化疗的一线用药方案，然而其化疗有效率仅仅为40％-50％，绝大多数腺癌患者会在治疗后半年到一年的时间后产生耐药性，使病情恶化。肺腺癌对治疗药物的耐受和转移已成为导致治疗失败和患者死亡的主要原因。
HOXB13于1996年被发现，是HOX家族中最晚被发现的一个基因。在正常的组织器官中，HOXB13主要在前列腺中表达，少量表达于结直肠和肾脏中，与前列腺中的雄激素受体表达高度相关。在恶性肿瘤中，HOXB13可以双相调控前列腺癌的发生和发展，机制十分复杂。一方面，HOXB13可以抑制雄激素介导的信号并抑制前列腺癌细胞的生长，另一方面，HOXB13也可以通过激活E2F信号通路促进前列腺癌细胞的生长，通过下调细胞内锌离子的浓度从而增加NF-κB信号通路的活性促进前列腺癌的转移。此外，HOXB13还可以促进乳腺癌，膀胱癌，肝癌以及卵巢癌的进展，抑制黑色素瘤，肾癌和结直肠癌的发生发展。乳腺癌中，HOXB13可以通过上调IL-6促进肿瘤的进展，通过下调ERα介导肿瘤对他莫昔芬的耐药。
发明内容
本发明的目的是提供一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒。通过本发明所述试剂盒的使用方法，可有效检测HOXB13及其下游靶基因ABCG1、EZH2和IL6的转录表达水平，通过取4分子表达之和预测肺腺癌患者化疗耐药和疾病预后。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒，所述试剂盒中含有以下成套引物对：
HOXB13F：5’-GTGCTGCCCGCTGGAGTC-3’；
R：5’-AGTTACCTGGACGTGTCTGTGG-3’；
ABCG1F：5’-GGAGAATGCGAAGCTGTACC-3’；
R：5’-GGAGGCGGTTTTTACCTCTC-3’；
EZH2F：5’-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3’；
R：5’-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’；
IL6F：5’-AGTCCTGATCCAGTTCCTGC-3’；
R：5’-CTACATTTGCCGAAGAGCCC-3’；
Actin F：5’-CTGAGCGTGGCTACTCCTTC-3’；
R：5’-GCCATCTCGTTCTCGAAGTC-3’。
进一步的，所述试剂盒中还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和RT-qPCR相关试剂。
进一步的，所述试剂盒的RT-qPCR反应条件为：
95℃，预变性5min；
95℃，变性30s；
60℃，退火及延伸60s，重复40个循环。
所述的成套引物对在制备预测肺腺癌进展、预后及耐药的产品中的应用。
本发明的另一方面：
上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)将上述的成套引物对稀释成10uM工作浓度备用；
2)Trizol提取患者标本中的mRNA；
3)逆转录上述步骤2)提取得到的mRNA反转录成cDNA，-80℃可长期保存；
4)利用上述的成套引物对，以及步骤3)逆转录后cDNA模板做RT-q-PCR，测定患者癌组织中HOXB13、EZH2、Slug和IL-6的表达水平。
进一步的，步骤2)的具体提取方法为：
A.患者癌组织50-200mg，加1ml TRIzol，置于冰上，电动匀浆器匀浆1-2min，室温放置5min，之后轻缓吹打细胞并吸至EP管中；
B.4℃，14,000×g离心10min，吸取上层无色水相转移至新EP管，按照1ml TRIzol比例加入0.2ml氯仿，用力震荡15s；
C.4℃，14,000×g离心10min，此时液体出现分层，将上层透明水相转移至新EP管，按照1mlTRIzol比例加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀；
D.4℃，14,000×g离心10min，此时管底会有白色沉淀，弃掉上清，留沉淀。加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀，漂洗沉淀；
E.4℃，14,000×g离心5min，小心弃掉上清，留沉淀，室温干燥，直至液体挥发干净；
F.待液体挥发干净加入无RNA酶的超纯水30μl，将沉淀充分溶解，利用分光光度计测定RNA样品A260和A260/A280值，计算样品的浓度和纯度，置于-80℃长期保存。
进一步的，步骤3)所述逆转录的具体方法为：
逆转录体系为25μl：
Random primer 2μl
RNA样品 2μl
补足无RNA酶的超纯水至18μl，70℃水浴变性5min，再加入：
5×逆转录buffer 5μl
dNTP 1μl
逆转录酶 1μl
将以上反应物置于37℃水浴，2h，完成整个逆转录过程，产物即为cDNA模版，-20℃保存。
进一步的，步骤4)所述RT-q-PCR的具体方法为：
A.Real-time PCR反应体系为10μl：
B.设置RT-qPCR条件：
95℃，预变性5min，
95℃，变性30s，
60℃，退火及延伸60s，重复40个循环，每次在延伸阶段读取荧光信号，最后加溶解曲线。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、目前对于癌症预后的分子病理检测主要是k-ras、b-Raf等分子，本项发明提供潜在的另一预测分子组合HOXB13、EZH2、ABCG1和IL6，联合检测在肺腺癌中效果显著。该分子组合预示化疗耐药和不良预后的发现将为其开展广泛的临床应用奠定基础；
2、本发明发现在HOXB13的转录表达水平与肺腺癌分期分级及耐药预后显著相关。然而联合应用HOXB13、EZH2、ABCG1和IL6效果显著好于单独使用和三两组合；
3、本发明所制备得到的引物可有效识别HOXB13、EZH2、ABCG1和IL6的转录水平表达量，联合应用4个指标之和比单指标应用获得更好的判断人肺腺癌化疗耐药和疾病预后。
附图说明
图1为不同分期分级肺腺癌表达HOXB13的差异结果图及生存期图；
图2为高表达与低表达HOXB13的细胞耐药能力的检测结果图；
图3为动物体内HOXB13的高表达与肺腺癌细胞顺铂和紫杉醇耐药曲线图；
图4为确定EZH2、ABCG1和Slug为HOXB13靶基因的ChIP检测图；
图5为比较耐药患者与药物敏感患者标本中HOXB13表达水平图；
图6为肺腺癌PDX耐药实验中HOXB13和EZH2表达的免疫组化检测结果图；
图7为ABCG1介导HOXB13引发肺腺癌耐药的体外实验图；
图8为采用单因素、双因素、三因素以及四因素综合评价对患者生存期区分度的比较结果。
具体实施方式
本发明实施例中所采用的材料：浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戊巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、Triton X-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。
实施例1
在本实施例中收集北医三院肺癌病理切片75例肺腺癌。收集齐全的病例资料：包括档案号、姓名、性别、年龄、病理诊断(类型及分化程度)、TNM分级和生存期等。免疫组织化学法检测HOXB13的表达水平。评价不同分期分级肺腺癌表达HOXB13的差异。结果如图1显示：HOXB13高水平与肿瘤大小分级、淋巴结转移分级和AJCC分级成正相关。Kaplan-Meier分析表达与不表达组之间的生存差异，具体检测方法如下所述。HOXB13高表达预示不良肺腺癌的预后。
免疫组织化学方法具体步骤如下：
1)石蜡切片免疫组织化学染色(Envision二步法)
①石蜡切片脱蜡水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；100％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；95％酒精Ⅰ、Ⅱ各5min；90％酒精5min；80％酒精5min，70％酒精5min；
②3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下，10min；
③自来水冲洗2min，蒸馏水冲洗2次；
④抗原修复(抗原修复液分为pH6.0)：水浴锅煮沸10min，之后自然冷却到室温；
⑤PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；
⑥加一抗4℃冰箱中过夜；以PBS代替一抗做阴性对照；
⑦PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；
⑧滴加相应二抗，室温孵育30min；
⑨PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；
⑩DAB显色，苏木精复染细胞核，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；镜检。
实施例2
采取细胞耐药实验，检测高表达与低表达HOXB13的细胞耐药能力。结果如图2所示，HOXB13的高表达与肺腺癌细胞顺铂和紫杉醇耐药程度正相关，高表达使细胞耐药曲线右移，即耐药能力增强。
具体步骤如下：
1)取对数生长期的各组细胞，然后用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，用完全培养液中和制备单细胞悬液，离心后用PBS清洗3次，用完全培养液重悬；
2)细胞计数，调整细胞悬液浓度为2×104个/ml；
3)96孔板每孔加入100μl培养基含2000个细胞，每组细胞设置3个复孔；
4)传代一天后加入一定浓度的顺铂，紫杉醇化疗药物；
5)实验组检测前弃去孔内液体，加入100μl新鲜培养基，每孔加入20μl MTS溶液。并以没有加入细胞但加了相应的细胞培养基及MTS溶液的孔作为空白对照；
6)在细胞培养箱内继续孵育2h后，用酶标仪450nm吸光度处检测。
实施例3
采用裸鼠成瘤实验联合化学治疗，在体内成瘤后给顺铂和紫杉醇治疗，结果如图3所示，高表达使细胞耐药能力增强。HOXB13高表达上调EZH2、ABCG1、Slug和它自身的表达。如图6所示采用在异种移植物模型，免疫组化检测发现耐药组比敏感组HOXB13和EZH2表达升高，顺铂的治疗显著上调肿瘤中HOXB13和EZH2的表达。
裸鼠成瘤耐药实验：
1)使用北京大学医学部SPF级动物中心饲养的SPF级BALB/c裸鼠，4-6周龄的雌性小鼠。每组7只，分为四组，分别为Flag对照组，Flag给药组，Flag-HOXB13对照组以及Flag-HOXB13给药组；
2)生长状态良好的各组细胞用胰酶消化并计数，用无血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为2×107个/ml；
3)在裸鼠腋下注射细胞100μl；
4)每隔2-3天观察一次，用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并计算肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2；
5)待肿瘤长到一定程度，开始给药。Flag对照组和Flag-HOXB13对照组腹腔注射PBS，Flag实验组和Flag-HOXB13组实验组腹腔注射顺铂。注射顺铂的剂量为5mg/kg，每周三次；
6)4周后，采用断颈法处死动物，剥离肿瘤组织；
7)对肿瘤组织用组织裂解液裂解，提取蛋白，利用Western blot检测相关蛋白指标。
Western Blot检测：
1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
①胶的制备
配制所需浓度的下层分离胶，混匀后灌胶，并在胶面上小心加入蒸馏水，待胶自然凝结后将未凝的蒸馏水倾出，将配置好的5％浓缩胶倒入上层，迅速插入梳子，待凝结后小心拔出梳子，备用；
②样品的制备
将蛋白质样品(根据不同实验要求取合适蛋白量上样)与上样缓冲液(5×)在离心管中混合，沸水加热5min，最大转数离心10s；
③电泳
将配好的胶正确装入电泳槽中，倒入电泳液。用微量移液器将蛋白质样品加入样品孔底部，避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的样品孔中。将电极插头与适当的电极相连。浓缩胶中电泳电压80V，当样品进入分离胶后，调节电压使之恒定在120V。染料的前沿迁移至分离胶的底部时关闭电源；
④转膜
SDS-PAGE结束后，从电泳槽中取出凝结玻璃板。轻轻撬开玻璃板，凝胶会贴在其中的一块玻板上。取下凝胶，放入电转缓冲液中平衡5min后进行转膜。将塑料支架平放，注意黑片(负极)在下，依次放置海绵垫、3层厚滤纸、凝胶、转印膜(PVDF膜)、3层厚滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，200mA，约2h(PVDF膜需先经甲醇浸透，电转液平衡10min后方可使用)。电转结束后，将膜剪去右上角作为标记；2)抗原抗体反应
①封闭：拆卸转移装置，将滤纸揭下，用镊子或戴手套将膜放入容器中。5％牛奶(TBST配置)室温振摇封闭1h；
②加一抗：用封闭液按最佳比例稀释一抗，与PVDF膜室温孵育1h或4℃过夜。洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10min；
③加二抗：用封闭液以1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG，与PVDF膜在室温下孵育1h。洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10min。3)辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应)
取等体积Western Blot Luminol Reagent试剂A液、B液混合(按每平方厘米转印膜0.125ml混合液计算)。将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上，然后将A、B混合液加到转印膜上，反应1min，提起转印膜，轻轻接触滤纸吸干液体。用保鲜膜覆盖转印膜，有蛋白质的一面朝上，表面要注意平整，用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在显影盒中，使用超敏化学发光成像系统进行曝光。
裂解液RIPA buffer：
PBS-TDS裂解液：
SDS PAGE胶主要试剂及配方：
储存液：
1.0M Tris-HCl(pH6.8)：称取12.11g Tris碱溶于80ml双蒸水中，加入浓盐酸调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml；
1.5M Tris-HCl(pH8.8)：称取45.4g Tris碱溶解于200ml双蒸水中，加入浓盐酸调pH至8.8，加双蒸水定容至250ml；
10％SDS：称取10g SDS溶于90ml双蒸水，用1M HCl调pH至7.2，加双蒸水定容至100ml；
30％丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺(Fluka公司)及1g N,N-亚甲双丙烯酰胺加入60ml双蒸水中，37℃助溶，加双蒸水至100ml，验证其pH≤7.0，4℃避光保存；
10％过硫酸胺(AP)：称取1g过硫酸胺溶于10ml双蒸水中，分装，4℃保存。
实施例4
通过高表达HOXB13及敲低HOXB13后检测肺腺癌细胞系基因表达谱的改变，捞取潜在的下游靶基因。ChIP验证HOXB13的下游靶基因EZH2，ABCG1和HOXB13本身。结果如图4所示：HOXB13直接结合到EZH2，ABCG1和HOXB13本身的启动子上。
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunopricipitation，ChIP)：
1)10cm培养皿中培养贴壁细胞，长到80％-90％的密度。如果有必要，则进行刺激或处理；
2)固定：用真空泵吸尽培养皿中的培养液细胞，经PBS洗两次后，每盘加入1％福尔马林，室温放置10min，然后在每个培养皿中加入1ml 10×甘氨酸，淬灭未反应的甲醛，室温放置5min后，用真空泵吸尽培养皿中的液体；
3)加入10ml预冷PBS，洗涤细胞3次；
4)细胞裂解：在每个培养皿中加入含1×蛋白酶抑制剂混合物II的1ml预冷的PBS。使用无菌细胞刮棒从每个培养皿中收集细胞，放在另一个离心管中。在4℃800g的转速下离心5分钟，使细胞沉淀。加入0.5ml细胞裂解缓冲液，使细胞沉淀再悬浮于其中，在冰上孵育15分钟，每5分钟震荡一次。细胞悬浮液用微量离心机4℃800g离心5分钟，去除上清，使细胞沉淀再悬浮于0.5ml细胞核裂解缓冲液中；
5)超声处理12次，每次超声5s、冰上放置1min。4℃12 000rpm离心15min，收集上清；
6)取出10μl上清，加入Dilution buffer 80μl，作为input于-80℃存放；
7)将剩余上清分为两管，每管100μl上清，并加入dilution buffer 900μl，磁珠A/G 45ul，再分别加入抗体或者IgG，混匀，4℃摇床过夜；
8)按照试剂盒的要求，先后用低盐洗涤缓冲液，高盐洗涤缓冲液，LiCl洗涤缓冲液以及TE缓冲液洗涤一次；
9)解交联。新鲜配制Elution buffer，每管加入100μl，同时取出Input，一起放置于65℃水浴过夜；
10)使用试剂盒自带的离心柱进行纯化，纯化后放入-20℃保存或者进行下一步实验；
11)用q-PCR进行promoter引物被抗体下拉定量分析。
实施例5
在肺腺癌患者中免疫组化检测HOXB13和EZH2的表达，结果如图5显示：顺铂和紫杉醇耐药的癌组织(n＝9)中高表达HOXB13和EZH2，而顺铂和紫杉醇敏感的癌组织(n＝6)中高表达HOXB13和EZH2；在异种移植物模型动物中耐药组比敏感组HOXB13和EZH2表达升高，顺铂的治疗显著上调肿瘤中HOXB13和EZH2的表达，如图6所示。
实施例6
在高表达HOXB13和对照组的肺腺癌细胞中敲低ABCG1，结果如图7显示：HOXB13高表达引起的细胞耐药能力增强可以被敲低ABCG1恢复药物敏感。说明HOXB13引起的细胞耐药能力增强是通过上调ABCG1实现的。
实施例7
在K-Mplot数据库中719例肺腺癌病理中，采用HOXB13、EZH2、ABCG1单因素评价，HOXB13+ABCG1双因素评价，HOXB13+ABCG1+EZH2三因素评价以及HOXB13+ABCG1+EZH2+IL6四因素综合评价对患者生存期的区分度，结果如图8：联合应用HOXB13、ABCG1、EZH2和已经报道的靶基因IL6可更有效地区分肺腺癌患者的生存期。
实施例8
本实施例提供了一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒，所述试剂盒含有以下成套引物对：
HOXB13F：5’-GTGCTGCCCGCTGGAGTC-3’；
R：5’-AGTTACCTGGACGTGTCTGTGG-3’；
ABCG1F：5’-GGAGAATGCGAAGCTGTACC-3’；
R：5’-GGAGGCGGTTTTTACCTCTC-3’；
EZH2F：5’-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3’；
R：5’-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’；
IL6F：5’-AGTCCTGATCCAGTTCCTGC-3’；
R：5’-CTACATTTGCCGAAGAGCCC-3’；
Actin F：5’-CTGAGCGTGGCTACTCCTTC-3’；
R：5’-GCCATCTCGTTCTCGAAGTC-3’。
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)将以上引物稀释成10uM工作浓度备用。
2)Trizol提取患者标本中的RNA；
RNA提取相关试剂Trizol，(购于Invitrogen公司)、有机试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇RNAse-free水(购于Qiagen公司)；
具体提取方法为：
A.患者癌组织50-200mg，加1ml TRIzol，置于冰上，电动匀浆器匀浆1-2min，室温放置5min，之后轻缓吹打细胞并吸至EP管中；
B.4℃，14,000×g离心10min，吸取上层无色水相转移至新EP管，按照1ml TRIzol比例加入0.2ml氯仿，用力震荡15s；
C.4℃，14,000×g离心10min，此时液体出现分层，将上层透明水相转移至新EP管，按照1mlTRIzol比例加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀；
D.4℃，14,000×g离心10min，此时管底会有白色沉淀，弃掉上清，留沉淀。加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀，漂洗沉淀；
E.4℃，14,000×g离心5min，小心弃掉上清，留沉淀，室温干燥，直至液体挥发干净；
F.待液体挥发干净加入无RNA酶的超纯水30μl，将沉淀充分溶解，利用分光光度计测定RNA样品A260和A260/A280值，计算样品的浓度和纯度，置于-80℃长期保存。
3)逆转录上述mRNA为cDNA，-80℃可长期保存；
逆转录的具体方法为：
逆转录体系为25μl：
Random primer 2μl
RNA样品 2μl
补足无RNA酶的超纯水至18μl，70℃水浴变性5min，再加入：
5×逆转录buffer 5μl
dNTP 1μl
逆转录酶 1μl
将以上反应物置于37℃水浴，2h，完成整个逆转录过程，产物即为cDNA模版，-20℃保存。
4)利用上述引物、以及步骤3)所述逆转录后cDNA模板做RT-qPCR，测定患者癌组织中HOXB13、EZH2、Slug和IL-6的表达水平；
RT-qRCR相关试剂：
A.Random Primer(购于Gene Star公司)
B.MMLV反转录酶(购于Promega公司)
C.SYBR Green Maser(购于Roche公司)；
RT-q-PCR的具体方法为：
A.Real-time PCR反应体系为10μl：
逆转录cDNA模版(一般将逆转录的cDNA稀释5-10倍) 1μl；
B.设置RT-qPCR条件：
95℃，预变性5min，
95℃，变性30s，
60℃，退火及延伸60s，重复40个循环，每次在延伸阶段读取荧光信号，最后加溶解曲线。
C.一般每个样品设置3个平行孔，计算平均值。内参选择一般为ACTIN。
D.数据分析：采用ΔCt法ΔCtT＝CtT(目的基因)-CtT(内参)。
5)取4个分子HOXB13、EZH2、ABCG1和IL6的q-PCR值之和，比较其高低从而判断患者化疗耐药可能性及预后情况。
所述引物必须为所检测基因的特异性引物，设计过程中考虑到PCR产物80-100bp，两引物之间跨内含子以避免DNA污染造成的假阳性。

Claims (8)

1.一种HOXB13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有以下成套引物对：
HOXB13 F： 5’-GTGCTGCCCGCTGGAGTC-3’；
R： 5’-AGTTACCTGGACGTGTCTGTGG-3’；
ABCG1 F： 5’-GGAGAATGCGAAGCTGTACC-3’；
R： 5’-GGAGGCGGTTTTTACCTCTC-3’；
EZH2 F： 5’-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3’；
R： 5’-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3’；
IL6 F： 5’-AGTCCTGATCCAGTTCCTGC-3’；
R： 5’-CTACATTTGCCGAAGAGCCC-3’；
Actin F： 5’-CTGAGCGTGGCTACTCCTTC-3’；
R： 5’-GCCATCTCGTTCTCGAAGTC-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和RT-qPCR相关试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的RT-qPCR反应条件为：
95℃，预变性5 min；
95℃，变性30s；
60℃，退火及延伸60s，重复40个循环。
4.权利要求1所述的成套引物对在制备预测肺腺癌进展、预后及耐药的产品中的应用。
5.一种如权利要求1-3任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
1）将权利要求1所述的成套引物对稀释成10uM工作浓度备用；
2）Trizol提取患者标本中的mRNA；
3）逆转录上述步骤2）提取得到的mRNA反转录成cDNA，-80℃可长期保存；
4）利用权利要求1所述的成套引物对，以及步骤3）逆转录后cDNA模板做RT-q-PCR，测定患者癌组织中HOXB13、EZH2、Slug和IL-6的表达水平。
6.权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤2）的具体提取方法为：
A. 患者癌组织50-200mg，加1ml TRIzol ，置于冰上，电动匀浆器匀浆1-2min，室温放置5min，之后轻缓吹打细胞并吸至EP管中；
B. 4℃，14,000×g 离心10 min，吸取上层无色水相转移至新EP管，按照 1 ml TRIzol比例加入0.2 ml 氯仿，用力震荡15s；
C. 4℃，14,000×g 离心10min，此时液体出现分层，将上层透明水相转移至新EP管，按照1mlTRIzol比例加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀；
D. 4℃，14,000×g 离心10min，此时管底会有白色沉淀，弃掉上清，留沉淀；
加入1ml75%乙醇，上下颠倒混匀，漂洗沉淀；
E. 4℃，14,000×g 离心5 min，小心弃掉上清，留沉淀，室温干燥，直至液体挥发干净；
F. 待液体挥发干净加入无RNA酶的超纯水30μl，将沉淀充分溶解，利用分光光度计测定RNA样品A260和 A260/A280值，计算样品的浓度和纯度，置于-80℃长期保存。
7.权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤3）所述逆转录的具体方法为：
逆转录体系为25μl：
Random primer 2μl
RNA样品 2μl
补足无RNA酶的超纯水至18μl，70℃水浴变性5min，再加入：
5×逆转录 buffer 5μl
dNTP 1μl
逆转录酶 1μl
将以上反应物置于37℃水浴，2 h，完成整个逆转录过程，产物即为cDNA模版，-20℃保存。
8.权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤4）所述RT-q-PCR的具体方法为：
A. Real-time PCR 反应体系为10μl：
超纯水 3.4μl
正向引物 0.3μl
反向引物 0.3μl
2×SYBR PCR master Mix 5μl
逆转录cDNA模版 1μl；
B. 设置 RT-qPCR 条件：
95℃，预变性5 min，
95℃，变性30s，
60℃，退火及延伸60s，重复40个循环，每次在延伸阶段读取荧光信号，最后加溶解曲线。
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