CN102353781B - 一种乳腺癌检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳腺癌检测试剂盒，该试剂盒包括有鼠抗人SPA-1单克隆抗体。本发明揭示乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-1蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，在级别不同的乳腺癌组织中表达也有明显差异，且SPA-1在正常组织、癌旁组织、癌组织表达有明显的组织特异性，进一步在细胞系水平上的研究表明SPA-1可以促进乳腺癌细胞的转移能力。本发明以SPA-1作为乳腺癌及其癌细胞转移检测的生物标记，提供包括鼠抗人SPA-1单克隆抗体的试剂盒，利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-1表达水平。

Description

一种乳腺癌检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及乳腺癌检测技术。
背景技术
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤，全世界每年有四十多万妇女死于乳腺癌起因的疾病，在我国乳腺癌发病率已从五年前十万分之十七增加到2006年的十万分之五十，以每年3％-4％的速度急剧增长，目前约有接近50万患者。乳腺癌发生和转移受环境和遗传因素二者共同作用，复杂的发病机制是长期困扰医学界的一大难题。因此，发现预测和早期诊断乳腺癌发生转移的特异标记物是防治这类重大疾病的关键所在。
目前，对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下三种。1)临床体格检查：定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始于1963年纽约的健康保险计划(HIP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女乳腺癌死亡率比对照组低23％。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，由于乳腺癌普查耗资巨大，成本/效果比高，因此，我国乳腺癌早期发现主要着眼于自我检查和提高自身保健意识，但患者偶尔触及肿块而就诊，常常为时过晚。2)影像学诊断法：影像学检查是以钼靶X线摄片为主要手段，辅以超声扫描和MRI扫描。钼靶X线摄片最早开始于1960年，在近五十年的发展历程中，对乳腺癌的早期诊断起到重要作用。乳腺组织本身密度小，包括肿瘤在内的很多病变表现为微小钙化。钼靶X线摄片方法能发现细小钙化点，如果表现为泥沙样钙化或细颗粒样钙化，或者每1cm2内＜0.5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2005年国际上乳腺癌诊疗领域的23位专家在肯定钼靶X线摄片技术在乳腺癌早期诊断的重要地位的同时，建议结合超声，MRI和病理检查，进行最佳评价。虽然该方法在发达国家乳腺癌的普查和早期发现中起到很大作用，尤其是乳腺MRI技术的应用，将诊断敏感率提高至77％-100％，但是由于特殊仪器的限制，对诊断技术的高要求和昂贵的价格，使这些方法在发展中国家及地区得不到广泛应用。3)生物靶标早期检测：包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCA1和BRCA2的突变分析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表达，在血清中可以检测到Her-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清Her-2水平，可以作为诊断乳腺癌的指标之一。因此，重点发展生物靶标检测，寻找新的乳腺癌检测靶标并发展为可供临床检测且简单实用的技术对于乳腺癌患者提前预警及采取有效的治疗手段意义重大。
SPA-1蛋白分子，即signal-induced proliferation-associated protein 1(SPA-1)，信号诱导的增殖相关蛋白1，是Ras超家族成员Rap1和Rap2的GTP酶活化蛋白，促使其由活性形式向非活性形式转变。小分子G蛋白Rap1在调控细胞增殖、分化、细胞粘附、肿瘤细胞浸润癌细胞转移中发挥重要作用。接受外来刺激而活化的Rap1可通过Raf/ERK、p38MAPK/CREB和PI3K调节造血细胞增殖和恶性转型，并能由内而外调节Integrin介导的粘附作用参与肿瘤细胞浸润[参见：1.Hironori K.，Yasuo W.，Noriyuki T.，Masatsugu M.，Hiroshi K.，Masakazu H.，Kazuhiro I.，Nagahiro M.，HumanSPA-1 Gene Product Selectively Expressed in Lymphoid Tissues Is a Specific GTPase-activating Protein for Rapl andRap2，J Biol Chem，1997，272：28081-28088；2.Noriyuki T.，Masakazu H.，HailinY.，Johannes L.B.，Nagahiro M.，Rapl GTPase-activating Protein SPA-1 Negatively Regulates Cell Adhesion，J Biol Chem，1999，274：18463-18469.；3.Li Su，Masaki Moriyama，Norihito Murata，Masashi Harazaki，Kozo Kaibuchi，and Nagahiro Minato；AF-6 andSPA-1 Form a Molecular Complex and Negatively Regulate Integrin-dependent Cell adhesion via Efficient RaplInactivation，J Biol Chem，2003，278(17)：15232-15238]。越来越多的研究表明，SPA-1与癌细胞转移密切相关。统计学分析发现SPA-1和MMP9多态性与早期宫颈癌淋巴结转移风险增高相关[参见：4.Rebecca Brooks，Nora Kizer，Loan Nguyen，Atthapon Jaishuen，Karolyn Wanat，Elizabeth Nugent，Perry Grigsby，Jenifer E.Allsworth，Janet S.Rader，Polymorphisms in MMP9 and SIPA1 are associated with increased risk of nodalmetastases in early-stage cervical cancer，Gynecologic Oncology 116(2010)539-543]。并且SPA-1在高转移的前列腺癌组织中表达有明显差异，有研究表明SPA-1可以促使转录因子Brd4出核而引起ECM相关基因表达降低，最终导致前列腺癌细胞转移[参见：5.Yosuke Shimizu，Yoko H.，Masakazu H.，KeikoDoi，SPA-1 controls the invasion and metastasis of human prostate cancer，Cancer Sci.，2011，]。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳腺癌检测试剂盒。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的这种乳腺癌检测试剂盒包括鼠抗人SPA-1单克隆抗体。该乳腺癌检测试剂盒还可以包括封闭液、工作液、抗体稀释液、Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液、SABC-POD浓缩液、20×DAB显色液A、20×DAB显色液B，所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％(W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％(V/V)的H2O2溶液；所述的抗体稀释液为含有0.1％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)。
本发明提供的乳腺癌检测试剂盒，还可以有以下试剂中的一种或几种或全部：
pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；
pH为6.0，浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液，
苏木素染液；
中性树脂；
75％(V/V)乙醇；
95％(V/V)乙醇；
无水乙醇；
二甲苯。
该试剂盒保存方法：鼠抗人SPA-1单克隆抗体需4℃保存，其它试剂若长期储存需放于-20℃，短期储存可放于4℃以方便使用。
本发明检测试剂盒的乳腺癌检测标签SPA-1蛋白分子，是一种具有GTP酶活性的调控分子，主要通过调控小G蛋白Rap1信号通路而参与细胞的生长、粘附、肿瘤发生等生理过程。本专利申请的发明人通过常规免疫组织化学染色和免疫蛋白质印迹等技术，首次发现乳腺癌患者在正常和癌旁组织细胞中SPA-1蛋白不表达或呈低表达，而在肿瘤细胞中则呈现高表达(见附图1)。进而选取64例已经确诊为不同病理级别的浸润性导管癌患者的组织切片经SPA-1染色后分级并经过统计学分析，发现SPA-1在不同分期的乳腺癌病理组织中表达水平有显著差异(p＜0.05)。在体外细胞转移实验中，通过RNA干扰手段特异性降低内源性高表达的SPA-1，原本高转移能力的MDA-MB-231细胞迁移能力显著降低(见附图2)。综上表明，SPA-1蛋白在乳腺癌的恶化转移中发挥重要作用，而其表达的这种显著差异也为我们将其应用于临床诊断乳腺癌提供佐证。
SPA-1蛋白氨基酸序列如序列表中的序列1所示(来自UniProKB，＞sp|Q96FS4)。
本申请发明人首次发现并证实乳腺癌患者乳腺组织癌细胞中特异性高表达SPA-1蛋白分子，并且其表达程度与乳腺癌细胞的转移能力密切相关，因而临床上可以利用免疫组织化学方法检测乳腺癌患者肿瘤组织SPA-1的表达水平，从而用于乳腺癌及转移的诊断。
以甲醛固定石蜡包埋的组织切片为例，本发明检测试剂盒的使用方法如下：
(1)脱蜡至水：切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中5min，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。
(2)封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。
(3)抗原修复：将切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5-10分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。
(4)封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。
(5)一抗：用抗体稀释液将鼠抗人SPA-1单克隆抗体按1∶100-1∶500稀释(经过稀释的抗体可在4℃短期保存)后，加在切片组织上，37℃放置1个小时或4℃过夜。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(6)二抗：用抗体稀释液将Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1∶100-1∶500稀释为工作液(此工作液可在4℃短期保存)，加在切片组织上，37℃，30分钟到1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(7)SABC-POD复合物：用稀释液按1∶100将SABC-POD浓缩液稀释为工作液(此工作液可在4℃短期保存)，加到切片上，室温或37℃，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(8)DAB显色：用PBS配置，将20×DAB-显色液A和20×DAB显色液B各稀释20倍后混合制备DAB工作液。混匀后加至切片。室温显色，镜下控制显色时间，一般5-10分钟。蒸馏水洗涤终止反应。
(9)苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，1-2分钟，之后用蒸馏水洗涤。
(10)脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
本申请发明人通过免疫组织化学染色发现SPA-1在正常组织、癌旁组织、癌组织表达有明显的的组织特异性，并且在级别不同的乳腺癌组织中表达也有明显差异，进一步在细胞系水平上的研究表明SPA-1可以促进乳腺癌细胞的转移能力。所以，SPA-1可以作为乳腺癌癌细胞转移检测的生物标记而应用于乳腺癌生物靶标检测预警。
[实验资料]
利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织切片中SPA-1表达的实验资料
检测试剂盒：
(1)鼠抗人SPA-1单克隆抗体，购自美国BD公司；
(2)封闭液，其制备方法是：从Biosharp公司购得牛血清蛋白BSA，用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制成浓度为5％(W/V)牛血清蛋白(BSA)溶液；
(3)3％(V/V)H2O2工作液，其制备方法是：用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％(V/V)的H2O2溶液，30％H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；
(4)抗体稀释液，由含有0.1％(V/V)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)构成，其制备方法是：用磷酸盐缓冲液(PBS)将Tween-20稀释1000倍得到，Tween-20购自Amresco公司；
(5)Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；
(6)SABC-POD浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；
(7)20×DAB显色液A，购自北京索莱宝科技有限公司；
(8)20×DAB显色液B，购自北京索莱宝科技有限公司。
试剂盒保存方法：
鼠抗人SPA-1单克隆抗体需4℃保存，其它试剂若长期储存需放于-20℃，短期储存可放于4℃以方便使用。
实验室还需要准备以下试剂：
pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；
pH为6.0，浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液，
苏木素染液；
中性树脂；
75％(V/V)乙醇；
95％(V/V)乙醇；
无水乙醇；
二甲苯。
实验步骤：
从肿瘤医院病理科获取乳腺癌组织甲醛固定石蜡包埋的组织切片两张，一张作为阴性对照，一张用于检测SPA-1蛋白表达。该组织切片病理诊断情况为右乳浸润性导管癌I期。现根据本试剂盒提供实验方法进行SPA-1检测操作。
(1)脱蜡至水：切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中5min，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。
(2)封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。
(3)抗原修复：将切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。
(4)封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。
(5)一抗：用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-1单克隆抗体按1∶200稀释后，加在切片组织上，4℃过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-1单克隆抗体工作液，其余操作相同。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(5)二抗：用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1∶100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37℃，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(6)SABC-POD复合物：用稀释液按1∶100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液加到切片上，室温或37℃，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(7)DAB显色：配置1mlDAB工作液，将20×DAB-显色液A和20×DAB显色液B各取50μL加入900μL PBS溶液中混匀，加至切片，室温显色，镜下控制显色时间，5分钟。蒸馏水洗涤终止反应。
(8)苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。
(9)脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
(10)待中性树脂凝固后，显微镜下观察切片染色效果。
染色结果见图4和图5，图4为阴性对照，图5为SPA-1单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-1主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-1着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明SPA-1呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。
附图说明
图1为免疫组织化学方法检测SPA-1蛋白在乳腺癌组织肿瘤细胞(见a图)和正常乳腺组织细胞中的表达(见b图)，在图1中的a图中，箭头所指为SPA-1蛋白表达；在图1中的b图中，则未见到有SPA-1蛋白表达。
图2免疫蛋白印迹方法检测SPA-1蛋白在乳腺癌正常组织(Lane 1)、乳腺癌癌旁组织(Lane 2)和乳腺癌组织细胞(Lane 3)中的表达
图3 SPA-1蛋白表达降低后即231-Si细胞，可显著降低乳腺癌细胞系MDA-MB-231的转移能力。
图4和图5为实施例1中显微镜下观察切片染色效果图，图4为阴性对照，图5为SPA-1单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-1主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-1着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明SPA-1呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。
图6和图7为实施例2中的显微镜下观察染色效果图，图6为阴性对照，图7为SPA-1单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图6阴性对照中无棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图7中棕色部分即为阳性着色，SPA-1主要表达在细胞质中，并且可以看到棕色着色基本围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。表明SPA-1在高转移能力的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中特异性表达于癌细胞胞浆中，在癌细胞胞浆中呈阳性着色。
图8为操作流程框图。
具体实施方式
实施例1：利用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织切片中SPA-1的表达
从肿瘤医院病理科获取乳腺癌组织甲醛固定石蜡包埋的组织切片两张，一张作为阴性对照，一张用于检测SPA-1蛋白表达。该组织切片病理诊断情况为右乳浸润性导管癌I期。现根据本试剂盒提供实验方法进行SPA-1检测操作。
(1)脱蜡至水：切片依次浸没在二甲苯中5分钟，二甲苯中5分钟，无水乙醇中5min，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，PBS溶液中5分钟。
(2)封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。
(3)抗原修复：将切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5分钟。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5分钟。
(4)封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。
(5)一抗：用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-1单克隆抗体按1∶200稀释后，加在切片组织上，4℃过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-1单克隆抗体工作液，其余操作相同。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(5)二抗：用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1∶100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37℃，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(6)SABC-POD复合物：用稀释液按1∶100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液加到切片上，室温或37℃，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(7)DAB显色：配置1mlDAB工作液，将20×DAB-显色液A和20×DAB显色液B各取50μL加入900μL PBS溶液中混匀，加至切片，室温显色，镜下控制显色时间，5分钟。蒸馏水洗涤终止反应。
(8)苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。
(9)脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
(10)待中性树脂凝固后，显微镜下观察切片染色效果。
染色结果见图4和图5，图4为阴性对照，图5为SPA-1单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图4阴性对照中无任何棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图5中棕色部分即为阳性着色，SPA-1主要表达在呈肥大、增生性病变的恶性肿瘤细胞的细胞质中，并且可以看到棕色着色大部分围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。而正常的间质细胞中则没有SPA-1着色，如黑色箭头所示，是正常的阴性结果，同样没有出现假阳性和假阴性。表明SPA-1呈特异性分布在乳腺癌组织恶性的肿瘤细胞胞浆中，呈强阳性着色分布，预示着肿瘤细胞有较强的转移能力，需对患者乳腺癌细胞的转移加以监测和预防。
实施例2：利用免疫组织化学方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231中SPA-1的表达
乳腺癌细胞系MDA-MB-231(来自华中科技大学中法联合实验室，具有较高的转移能力)在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养于细胞培养板中，生长至90％丰度时，使用PBS溶液洗一次，加入胰酶消化2分钟后，加入培养基终止消化，1000rpm离心5分钟后弃去上清液，培养基重悬细胞沉淀制备成细胞悬液待用。
(1)准备细胞：将MDA-MB-231细胞铺于经过多聚赖氨酸包被过的盖玻片上，一片用作阴性多照，一片用于SPA-1染色。待其丰度为80％以上吸去培养基，PBS溶液洗涤三次；
(2)固定：加入4％(V/V)多聚甲醛溶液，室温放置8分钟，PBS洗涤3次；
(3)破膜：加入0.2％(V/V)Triton PBS溶液，室温放置6分钟，PBS洗涤3次；
(4)封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H2O2，可覆盖整张组织切片。室温放置10分钟以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5分钟。
(5)封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30分钟。之后甩去多余液体。
(6)一抗：用抗体稀释液将试剂盒中鼠抗人SPA-1单克隆抗体按1∶200稀释后，加在切片组织上，4℃过夜。阴性对照使用PBS溶液代替SPA-1单克隆抗体，其余操作相同。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(7)二抗：用抗体稀释液将试剂盒中Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1∶100稀释为工作液，将工作液加在切片组织上，37℃，1个小时。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(8)SABC-POD复合物：用稀释液按1∶100将试剂盒中SABC-POD浓缩液稀释为工作液，将工作液加到切片上，室温或37℃，30分钟。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5分钟。
(9)DAB显色：配置1mlDAB工作液，将20×DAB-显色液A和20×DAB显色液B各取50μL加入900μL PBS溶液中混匀，加至切片，室温显色。室温显色，镜下控制显色时间，5分钟。蒸馏水洗涤终止反应。
(10)苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，2分钟，之后用蒸馏水洗涤。
(11)脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇中5分钟，二甲苯中5分钟。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
(12)待中性树脂凝固后，显微镜下观察染色效果。
染色结果见图6和图7，图6为阴性对照，图7为SPA-1单克隆抗体免疫染色结果(SPA-1着色为棕色部分，紫色部分为细胞核)。可以看到在图6阴性对照中无棕色着色，表明实验体系没有问题，可有效避免非特异性背景着色即假阳性。图7中棕色部分即为阳性着色，SPA-1主要表达在细胞质中，并且可以看到棕色着色基本围绕紫色的细胞核分布，如红色箭头所示。表明SPA-1在高转移能力的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中特异性表达于癌细胞胞浆中，在癌细胞胞浆中呈阳性着色。
 
<110>  华中科技大学
<120>  一种乳腺癌检测试剂盒
<160>  1    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  1042
<212>  PRT
<213>  人类
<400>  1
Met Pro Met Trp Ala Gly Gly Val Gly Ser Pro Arg Arg Gly Met Ala
1               5                   10                  15     
 
Pro Ala Ser Thr Asp Asp Leu Phe Ala Arg Lys Leu Arg Gln Pro Ala
            20                  25                  30         
 
Arg Pro Pro Leu Thr Pro His Thr Phe Glu Pro Arg Pro Val Arg Gly
        35                  40                  45             
 
Pro Leu Leu Arg Ser Gly Ser Asp Ala Gly Glu Ala Arg Pro Pro Thr
    50                  55                  60                 
 
Pro Ala Ser Pro Arg Ala Arg Ala His Ser His Glu Glu Ala Ser Arg
65                  70                  75                  80 
 
Pro Ala Ala Thr Ser Thr Arg Leu Phe Thr Asp Pro Leu Ala Leu Leu
                85                  90                  95     
 
Gly Leu Pro Ala Glu Glu Pro Glu Pro Ala Phe Pro Pro Val Leu Glu
            100                 105                 110        
 
Pro Arg Trp Phe Ala His Tyr Asp Val Gln Ser Leu Leu Phe Asp Trp
        115                 120                 125            
 
Ala Pro Arg Ser Gln Gly Met Gly Ser His Ser Glu Ala Ser Ser Gly
    130                 135                 140                
 
Thr Leu Ala Ser Ala Glu Asp Gln Ala Ala Ser Ser Asp Leu Leu His
145                 150                 155                 160
 
Gly Ala Pro Gly Phe Val Cys Glu Leu Gly Gly Glu Gly Glu Leu Gly
                165                 170                 175    
 
Leu Gly Gly Pro Ala Ser Pro Pro Val Pro Pro Ala Leu Pro Asn Ala
            180                 185                 190        
 
Ala Val Ser Ile Leu Glu Glu Pro Gln Asn Arg Thr Ser Ala Tyr Ser
        195                 200                 205            
 
Leu Glu His Ala Asp Leu Gly Ala Gly Tyr Tyr Arg Lys Tyr Phe Tyr
    210                 215                 220                
 
Gly Lys Glu His Gln Asn Phe Phe Gly Met Asp Glu Ser Leu Gly Pro
225                 230                 235                 240
 
Val Ala Val Ser Leu Arg Arg Glu Glu Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly
                245                 250                 255    
 
Thr Leu His Ser Tyr Arg Val Ile Val Arg Thr Thr Gln Leu Arg Thr
            260                 265                 270        
 
Leu Arg Gly Thr Ile Ser Glu Asp Ala Leu Pro Pro Gly Pro Pro Arg
        275                 280                 285            
 
Gly Leu Ser Pro Arg Lys Leu Leu Glu His Val Ala Pro Gln Leu Ser
    290                 295                 300                
 
Pro Ser Cys Leu Arg Leu Gly Ser Ala Ser Pro Lys Val Pro Arg Thr
305                 310                 315                 320
 
Leu Leu Thr Leu Asp Glu Gln Val Leu Ser Phe Gln Arg Lys Val Gly
                325                 330                 335    
 
Ile Leu Tyr Cys Arg Ala Gly Gln Gly Ser Glu Glu Glu Met Tyr Asn
            340                 345                 350        
 
Asn Gln Glu Ala Gly Pro Ala Phe Met Gln Phe Leu Thr Leu Leu Gly
        355                 360                 365            
 
Asp Val Val Arg Leu Lys Gly Phe Glu Ser Tyr Arg Ala Gln Leu Asp
    370                 375                 380                
 
Thr Lys Thr Asp Ser Thr Gly Thr His Ser Leu Tyr Thr Thr Tyr Gln
385                 390                 395                 400
 
Asp His Glu Ile Met Phe His Val Ser Thr Met Leu Pro Tyr Thr Pro
                405                 410                 415    
 
Asn Asn Gln Gln Gln Leu Leu Arg Lys Arg His Ile Gly Asn Asp Ile
            420                 425                 430        
 
Val Thr Ile Val Phe Gln Glu Pro Gly Ser Lys Pro Phe Cys Pro Thr
        435                 440                 445            
 
Thr Ile Arg Ser His Phe Gln His Val Phe Leu Val Val Arg Ala His
    450                 455                 460                 
 
Thr Pro Cys Thr Pro His Thr Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Arg Thr
465                 470                 475                 480
 
Gln Asp Thr Pro Ala Phe Gly Pro Ala Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro
                485                 490                 495    
 
Phe Ala Ala Asn Ala Asp Phe Arg Ala Phe Leu Leu Ala Lys Ala Leu
            500                 505                 510        
 
Asn Gly Glu Gln Ala Ala Gly His Ala Arg Gln Phe His Ala Met Ala
        515                 520                 525            
 
Thr Arg Thr Arg Gln Gln Tyr Leu Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Val
    530                 535                 540                
 
Thr Thr Thr Ser Leu Asp Ser Ala Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ser Leu
545                 550                 555                 560
 
Gly Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Gln
                565                 570                 575    
 
Ala Ala Gly Ser Leu Val Trp Gly Val Arg Ala Ala Pro Gly Ala Arg
            580                 585                 590        
 
Val Ala Ala Gly Ala Gln Ala Ser Gly Pro Glu Gly Ile Glu Val Pro
        595                 600                 605            
 
Cys Leu Leu Gly Ile Ser Ala Glu Ala Leu Val Leu Val Ala Pro Arg
    610                 615                 620                
 
Asp Gly Arg Val Val Phe Asn Cys Ala Cys Arg Asp Val Leu Ala Trp
625                 630                 635                 640
 
Thr Phe Ser Glu Gln Gln Leu Asp Leu Tyr His Gly Arg Gly Glu Ala
                645                 650                 655    
 
Ile Thr Leu Arg Phe Asp Gly Ser Pro Gly Gln Ala Val Gly Glu Val
            660                 665                 670        
 
Val Ala Arg Leu Gln Leu Val Ser Arg Gly Cys Glu Thr Arg Glu Leu
        675                 680                 685            
 
Ala Leu Pro Arg Asp Gly Gln Gly Arg Leu Gly Phe Glu Val Asp Ala
    690                 695                 700                
 
Glu Gly Phe Val Thr His Val Glu Arg Phe Thr Phe Ala Glu Thr Ala
705                 710                 715                 720
 
Gly Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Leu Arg Val Cys Gly Gln Thr Leu
                725                 730                 735    
 
Pro Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ala Ala Gln Leu Leu Arg Ser Ala Pro
            740                 745                 750        
 
Lys Val Cys Val Thr Val Leu Pro Pro Asp Glu Ser Gly Arg Pro Arg
        755                 760                 765            
 
Arg Ser Phe Ser Glu Leu Tyr Thr Leu Ser Leu Gln Glu Pro Ser Arg
    770                 775                 780                
 
Arg Gly Ala Pro Asp Pro Val Gln Asp Glu Val Gln Gly Val Thr Leu
785                 790                 795                 800
 
Leu Pro Thr Thr Lys Gln Leu Leu His Leu Cys Leu Gln Asp Gly Gly
                805                 810                 815    
 
Ser Pro Pro Gly Pro Gly Asp Leu Ala Glu Glu Arg Thr Glu Phe Leu
            820                 825                 830        
 
His Ser Gln Asn Ser Leu Ser Pro Arg Ser Ser Leu Ser Asp Glu Ala
        835                 840                 845            
 
Pro Val Leu Pro Asn Thr Thr Pro Asp Leu Leu Leu Ala Thr Thr Ala
    850                 855                 860                
 
Lys Pro Ser Val Pro Ser Ala Asp Ser Glu Thr Pro Leu Thr Gln Asp
865                 870                 875                 880
 
Arg Pro Gly Ser Pro Ser Gly Ser Glu Asp Lys Gly Asn Pro Ala Pro
                885                 890                 895    
 
Glu Leu Arg Ala Ser Phe Leu Pro Arg Thr Leu Ser Leu Arg Asn Ser
            900                 905                 910        
 
Ile Ser Arg Ile Met Ser Glu Ala Gly Ser Gly Thr Leu Glu Asp Glu
        915                 920                 925            
 
Trp Gln Ala Ile Ser Glu Ile Ala Ser Thr Cys Asn Thr Ile Leu Glu
    930                 935                 940                
 
Ser Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Ile Pro Glu Ser Gly Asp Pro Lys
945                 950                 955                 960
 
Gly Thr Pro Lys Ser Asp Ala Glu Pro Glu Pro Gly Asn Leu Ser Glu
                965                 970                 975    
 
Lys Val Ser His Leu Glu Ser Met Leu Arg Lys Leu Gln Glu Asp Leu
            980                 985                 990        
 
Gln Lys Glu Lys Ala Asp Arg Ala  Ala Leu Glu Glu Glu  Val Arg Ser
        995                 1000                 1005            
 
Leu Arg  His Asn Asn Arg Arg  Leu Gln Ala Glu Ser  Glu Ser Ala
    1010                 1015                 1020            
 
Ala Thr  Arg Leu Leu Leu Ala  Ser Lys Gln Leu Gly  Ser Pro Thr
    1025                 1030                 1035            
 
Ala Asp  Leu Ala
    1040        
 
 
 

Claims (1)

1. 一种乳腺癌检测试剂盒，包括鼠抗人SPA-1单克隆抗体、封闭液、工作液、抗体稀释液、Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液、SABC-POD浓缩液、20×DAB显色液A、20×DAB显色液B 、pH为7.2-7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液、pH为6.0，浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液、苏木素染液、中性树脂、75%（V/V）乙醇、95%（V/V）乙醇、无水乙醇、二甲苯；所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5%（W/V）牛血清蛋白(BSA)溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30% H2O2溶液稀释为3%（V/V）的H2O2 溶液；所述的抗体稀释液为含有0.1%（V/V）Tween-20的磷酸盐缓冲液PBS。
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Germline polymorphisms in SIPA1 are associated with metastasis and other indicators of poor prognosis in breast cancer;Nigel PS Crawford et al.;《Breast Cancer Research》;20060321;第8卷(第2期);R16 *
Mia M. Gaudet et al..Genetic variation in SIPA1 in relation to breast cancer risk and survival after breast cancer diagnosis.《Int. J. Cancer》.2009,第124卷(第7期),1716-1720.
Nigel PS Crawford et al..Germline polymorphisms in SIPA1 are associated with metastasis and other indicators of poor prognosis in breast cancer.《Breast Cancer Research》.2006,第8卷(第2期),R16.
SPA-1通过Rap1信号通路参与疾病的发生和发展;李敏;《医学综述》;20110131;第17卷(第2期);198-201 *
李敏.SPA-1通过Rap1信号通路参与疾病的发生和发展.《医学综述》.2011,第17卷(第2期),198-201.
梁晓俐.第五章 组织病理学制片技术.《病理学基础与实验技术》.北京：军事医学科学出版社,2003,112-114,117-120,124,127-130. *

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