CN102590512A - 一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒及其使用方法。所述的试剂盒,包括组分:HER2即用型抗体,PTEN即用型抗体,酶标抗体及与酶相应的显色液。由于PTEN基因表达丢失导致的Src激活是耐药性产生的最主要原因。因此,同时检测HER2和PTEN表达的乳腺癌个性化治疗检测试剂盒,为乳腺癌个性化治疗提供用药原则,极大改善病人的治疗效果,具有重大的临床和社会意义。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测方法技术领域,具体而言,本发明涉及检测乳腺癌个体化用药检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
乳腺癌是女性最常见、也最具生命威胁的恶性肿瘤之一,我国每年新增乳腺癌患者18万人以上。在所有乳腺癌患者中,约有20-30%的患者会出现HER2(人类表皮生长因子受体2)阳性现象。它的状态预示了患者存活时间较短、患者更容易复发以及治疗效果差等。如不治疗,HER2阳性乳腺癌患者存活时间是1-3年,而HER2阴性的患者至少能存活4-6年。对HER2阳性病人采用赫赛汀单抗药物进行治疗是治疗这类癌症患者的主要手段之一。然而,2008年一项针对5480名肿瘤患者的全国性调查报告显示,中国只有57%的患者进行了HER2的检测,也就是说100个乳腺癌患者中有43人未进行HER2检测,这些患者将丧失最佳治疗时机。由于HER2阳性乳腺癌恶化速度更快,更易复发,为了抓住最佳治疗时机,乳腺癌的患者都应该进行HER2检测;在欧美国家,所有乳腺癌患者确诊都会做HER2检测,以排查恶化速度更快的癌症,这也是国外乳腺癌患者治疗更合理、生存质量更高的重要原因。
但是,HER2阳性病人对主要治疗药物赫赛汀(Herceptin,又名曲妥单抗)的耐药性是导致治疗失败的主要原因,给病患带来了巨大的经济损失和生命代价。在美国,曲妥单抗疗法一个疗程的费用为70,000美元,澳大利亚一个疗程的费用为50,000澳元,在中国一个疗程的花费也多于250,000人民币。最新的临床研究表明,高达74%的HER2阳性患者对赫赛汀存在不同程度的耐药性。由于PTEN基因表达丢失导致的Src激活是耐药性产生的最主要原因。因此,盲目使用赫赛汀不仅有可能给患者带来巨大的经济负担,甚至有可能延误治疗时机,造成生命的损失。
发明内容
本发明所要解决的问题在于提供一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒及其使用方法,本发明的试剂盒能够同时检测HER2和PTEN表达,为乳腺癌患者提供个性化治疗的用药原则,极大改善病人的治疗效果。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案为:一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒,包括组分:
(i)HER2即用型抗体,
(ii)PTEN即用型抗体,
(iii)酶标抗体及与酶相应的显色液。
优选地,所述HER2即用型抗体,为小鼠抗人HER2抗体或者兔抗人HER2抗体。
优选地,所述PTEN即用型抗体,为小鼠抗人PTEN抗体或者兔抗人PTEN抗体。
优选地,所述酶标抗体为辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记抗小鼠或者抗兔IgG。
优选地,所述酶标抗体为多聚体辣根过氧化物酶或者多聚体碱性磷酸酶抗小鼠或者抗兔IgG。
优选地,所述的显色液为适用于辣根过氧化物酶的DAB或者AEC显色液;或者为适用于碱性磷酸酶的BCIP/NBT显色液。
优选地,所述的试剂盒中还包括IHC阳性对照片,所述IHC阳性对照片为经过验证的HER2+/PTEN+乳腺癌病理石蜡切片。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒的使用方法。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案为:一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒的使用方法,包括三个主要步骤:
(1)石蜡切片的脱蜡和水化;
(2)抗原修复;
(3)免疫组织化学染色;
(4)IHC评估。
优选地,所述的抗原修复,具体是将切片置于EDTA抗原修复缓冲液中,水煮加热修复,水沸后95℃-100℃保温20分钟,冷却至室温以下,用PBS冲洗切片。
优选地,所述的免疫组织化学染色步骤为,将步骤(2)中所得的切片滴加1∶50稀释的HER2即用型抗体,或者滴加1∶50稀释的PTEN即用型抗体,100ul/片,4℃孵育过夜,滴加酶标抗体,孵育后染色,最后脱水透明处理。
优选地,所述的免疫组织化学染色步骤,具体为:将步骤(2)中所得的切片以H2O2阻断内源性过氧化物酶处理,用PBS冲洗后,滴加1∶50稀释的HER2即用型抗体,或者1∶50稀释的PTEN即用型抗体,4℃孵育过夜;PBS冲洗后滴加酶标抗体,室温下孵育后用PBS冲洗甩干,滴加显色液,最后蒸馏水冲洗,苏木精复染,最后脱水透明处理。
优选地,所述的脱水透明处理,具体步骤为:
1.切片置于80%乙醇后快速抽提5-10下,
2.95%乙醇中快速抽提5-10下,
3.无水乙醇中快速抽提5-10下,更换无水乙醇后快速抽提5-10下,
4.二甲苯中快速抽提10-20下,更换二甲苯后抽提10-20下。
5.最后,切片干燥后用中性树胶、盖玻片封固。
优选地,所述步骤(4)的IHC评估,即HER2和PTEN的表达水平是基于染色强度(SI)和阳性细胞(PP)的百分比来判断,通过半定量的免疫反应性分数(IRS)来确定:计算公式为IRS=SI×PP,其中SI=0为阴性、SI=1为弱阳性、SI=2为中等阳性、SI=3为强阳性;PP=0代表1%阳性细胞、PP=1代表1%-10%阳性细胞、PP=2代表11%-50%阳性细胞、PP=3代表51%-80%阳性细胞、PP=4代表80%以上阳性细胞,当IRS小于或者等于3代表PTEN丢失;IRS大于或者等于3代表HER2阳性。
在本文中,术语“检测”具有本领域技术人员所熟知的含义,包括鉴定目标产物的存在性和定量目标产物的数量。本发明的试剂盒的使用方法所得到的最终结果是对来自临床的乳腺癌切片进行HER2抗体检测的染色,以及检测PTEN抗体的染色。由于在所有乳腺癌患者中,约有20-30%的患者会出现HER2(人类表皮生长因子受体2)阳性现象。由于本发明的实施者不一定是临床医师,因此并不清楚病人在被取“样品”之前是否经过治疗以及治疗的程度。本发明的第一个方面的方法仅仅可以看作诊断过程中的一个中间步骤,得到的是“样品”中的乳腺癌细胞表达结果而已,本身并不能直接得出是否患有乳腺肿瘤或者有乳腺肿瘤复发、转移发生倾向等诊断结果。
在本文中,术语“样品”指的是人类乳腺组织,优选是来自人的样品。本发明的样品优选是临床常规的石蜡包埋组织切片。
相比于现有技术中的解决方案,本发明的有益效果是:
1、由于PTEN基因表达丢失导致的Src激活是耐药性产生的最主要原因。因此,同时检测HER2和PTEN表达的乳腺癌个性化治疗检测试剂盒,为乳腺癌个性化治疗提供用药原则,极大改善病人的治疗效果,具有重大的临床和社会意义。
2、商品化容易,检测成本低。由于试剂本身可以通过已经商业化的方法来制备,而且检测中所需的仪器也可以购买得到,因此可以快速在大、中、小型医院、甚至诊所普及应用。
3、产品质量稳定,储存条件要求不高,不易变性,容易长时间保存,这造成产品的有效期将大大延长。
4、操作简单,检测时间短。由于本发明的方法实际上只需要将试剂和带检测的样品混合放置并检测,无需复杂仪器及特别技巧,节省了试剂使用并加快了检测进程,可以推广进行实际的产业应用。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1显示动物模型中抑制SRC活性克服曲妥单抗耐药性的实验结果。
图2为本发明的试剂盒对HER2阳性的乳腺癌细胞进行的强胞膜着色。
图3为本发明的试剂盒对PTEN阳性的乳腺癌细胞进行的细胞质染色。
具体实施方式
为了便于理解,以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,这些描述仅仅是示例性的描述,并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述,本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
以下将以举例形式进行说明,如有未详尽之处,可以参见常用的实验手册,如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中,所有化学试剂均采用分析级,实验用水经Milli-XQ过滤,各试剂均和材料可以商用渠道获得,具体而言:第一抗体HER2即用型抗体,为小鼠抗人HER2抗体或者兔抗人HER2抗体,由博生吉医药科技(苏州)有限公司提供,按1∶50稀释。
另一第一抗体PTEN即用型抗体,为小鼠抗人PTEN抗体或者兔抗人PTEN抗体,购买自美国Cell Signaling Technology公司,按1∶50稀释。IHC阳性对照片来源于博生吉医药科技(苏州)有限公司。其它试剂如酶及酶标抗体由博生吉医药科技(苏州)有限公司提供。
实施例
一、标本取样
HER2阳性的乳腺癌病理标本50例由MD安德森癌症研究中心提供。这些患者均接受了首次曲妥单抗治疗、而且被免疫组织化学(IHC)鉴定为HER2阳性。
二、IHC分析
福尔马林固定、石蜡包埋的4μm组织切片被用于IHC分析。第一抗体小鼠抗人HER2抗体由博生吉医药科技(苏州)有限公司提供(产品目录号:MM0082),按1∶50稀释。另一第一抗体anti-PTEN购买自美国CellSignaling Technology公司(产品目录号:138G6),兔抗人单克隆抗体,按1∶50稀释。
2.1石蜡切片的脱蜡和水化
优选准备来源同一病人相同部位的切片各两张,将上述的两张切片连同IHC阳性对照片,一同进行脱蜡和水化,
2.2抗原修复
将经过脱蜡和水化后的上述石蜡切片,置于1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液中,95℃加热20分钟,自然冷却至室温以下,用PBS冲洗切片;
2.3免疫组织化学染色
将经过上述抗原修复的切片,以PBS稀释的3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10-15分钟,用PBS冲洗3次,每次3分钟(3×3),甩去PBS;然后将组织切片用1%山羊血清于室温下封闭1小时,然后与小鼠抗人HER2抗体或者小鼠抗人PTEN抗体,用抗体稀释液按1∶50进行稀释(抗体稀释液的配方:1%牛血清白蛋白、0.1%明胶、0.05%叠氮化钠、0.01M pH7.2磷酸缓冲液),通常100ul/片,在4℃下孵育18小时或过夜;之后用PBS冲洗3次,每次5分钟(3×5);甩去PBS后,接着每张切片滴加1滴辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG,室温下孵育30min,再用PBS冲洗3次,每次3分钟(3×3),甩去PBS液;最后,每张切片滴加2滴或100ul DAB或者AEC,镜检显色6分钟;蒸馏水冲洗,苏木精复染25秒,蒸馏水冲洗,PBS冲洗返蓝;
2.3脱水透明处理,具体步骤为:
2.3.1切片置于80%乙醇后快速抽提5-10下,
2.3.295%乙醇中快速抽提5-10下,
2.3.3无水乙醇中快速抽提5-10下,更换无水乙醇后快速抽提5-10下,
2.3.4二甲苯中快速抽提10-20下,更换二甲苯后抽提10-20下,
2.3.5最后,切片干燥后用中性树胶、盖玻片封固,如图2、图3所示。
三、IHC评估
HER2和PTEN表达水平基于染色强度(SI)和阳性细胞(PP)的百分比来判断,通过半定量的免疫反应性分数(IRS)来确定:计算公式为IRS=SI×PP,其中SI=0为阴性、SI=1为弱阳性、SI=2为中等阳性、SI=3为强阳性;PP=0代表1%阳性细胞、PP=1代表1%-10%阳性细胞、PP=2代表11%-50%阳性细胞、PP=3代表51%-80%阳性细胞、PP=4代表80%以上阳性细胞,当IRS小于或者等于3代表PTEN丢失;IRS大于或者等于3代表HER2阳性。其中的IHC阳性对照片为经过验证的HER2+/PTEN+乳腺癌病理石蜡切片,本试剂盒中增设IHC阳性对照片的意义就在于验证试剂盒中的试剂是否有效或处理方法中是否出现失误,在实际操作中,便于操作人员进行试验的自我监控。
四、曲妥单抗药物的应答与统计分析
乳腺癌患者对曲妥单抗治疗的应答是基于如下标准进行评估:完全应答(CR)=放射显影或者肉眼观察下所有的肿瘤组织完全消失;部分应答(PR)=可测量的转移肿瘤出现最大肿瘤直径大于或者等于30%的减少,并且在至少未来4周内没有新病灶出现;稳定疾病(SD)定义为没有超过20%肿瘤尺寸的减少,也没有出现新的病灶;进行性疾病(PD)定义为出现新的病灶,或者现有病灶出现超过20%的尺寸增加。总生存率(OS)定义为从启动曲妥单抗治疗到病人死亡或者随访日止。
HER2、PTEN的表达与曲妥单抗治疗效果的相关性用Fisher’s exacttest和χ2test。生存分析用Kaplan-Meier曲线及log-rank tests进行。当P value<0.05时被认为具有统计学的显著意义。所有的统计分析均采用SPSS 16.0程序(SPSS,Chicago,IL)。
六、曲妥单抗治疗结果
我们对50例HER2阳性、首次接受曲妥单抗治疗的乳腺癌患者进行了PTEN表达状态与预后相关性的分析,结果显示(表1),对于首次接受曲妥单抗治疗的乳腺癌患者,PTEN表达的丢失与病人对治疗的耐受性显著相关(P<0.028),那就是与CR+PR+SD病人相比,PD病人中PTEN的表达出现显著丢失,而且总生存率显著下降(P<0.008)。
表1.PTEN表达状态与曲妥单抗治疗效果的相关性
七、动物模型研究
6周大的雌性严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)被皮下植入60天释放型的0.72mg 17β-雌二醇颗粒(Innovative Research,Sarasota,美国)。然后乳腺癌模型被通过注射8×106BT474.m 1乳腺癌细胞(该细胞株是曲妥单抗耐药性细胞)来建立。8×106BT474.m1细胞被配制在100μl的PBS缓冲液中,与Matrigel混合物按1∶1配制在一起,注射进乳房脂肪垫中。当肿瘤生长到100-150mm3大小时,小鼠被随机分组,按10只小鼠/组。之后每只小鼠接受10mg/kg(小鼠体重)的曲妥单抗的腹腔注射,或者IgG对照。每周注射一次。塞卡替尼(Saracatinib)的用量则为25mg/kg(小鼠体重),溶解在含有0.1%Tween 20的羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose)中,通过灌胃的方式进行。肿瘤的生长每周监测两次,计算肿瘤的体积大小:体积=长度x宽度2/2。不同小组间肿瘤体积的改变通过ANOVA(two-tailed)法进行统计分析。在所有的试验中,当P<0.05被认为具有统计学上的显著差别。
在产品使用上,HER2+/PTEN+患者建议使用赫赛汀、而HER2+/PTEN-患者建议使用赫赛汀+Src抑制剂。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种乳腺癌个体化用药检测试剂盒,包括组分:
(i)HER2即用型抗体,
(ii)PTEN即用型抗体,
(iii)酶标抗体及与酶相应的显色液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的HER2即用型抗体,为小鼠抗人HER2抗体或者兔抗人HER2抗体。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述PTEN即用型抗体,为小鼠抗人PTEN抗体或者兔抗人PTEN抗体。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体为辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记抗小鼠或者抗兔IgG。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体为多聚体辣根过氧化物酶或者多聚体碱性磷酸酶抗小鼠或者抗兔IgG。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的显色液为适用于辣根过氧化物酶的DAB或者AEC显色液;或者为适用于碱性磷酸酶的BCIP/NBT显色液。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括IHC阳性对照片,所述IHC阳性对照片为经过验证的HER2+/PTEN+乳腺癌病理石蜡切片。
8.一种权利要求1所述的乳腺癌个体化用药检测试剂盒的使用方法,包括三个主要步骤:
(1)石蜡切片的脱蜡和水化;
(2)抗原修复;
(3)免疫组织化学染色;
(4)IHC评估。
9.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,所述的步骤(2)的抗原修复,具体是将切片置于EDTA抗原修复缓冲液中,水煮加热修复,水沸后95℃-100℃保温20分钟,冷却至室温以下,用PBS冲洗切片。
10.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,所述步骤(3)的免疫组织化学染色步骤为:将步骤(2)中所得的切片滴加1∶50稀释的HER2即用型抗体,或者滴加1∶50稀释的PTEN即用型抗体,100ul/片,4℃孵育过夜,滴加酶标抗体,孵育后染色,最后脱水透明处理。
11.根据权利要求10所述的使用方法,其特征在于,所述的免疫组织化学染色步骤,具体为:将步骤(2)中所得的切片以H2O2阻断内源性过氧化物酶处理,用PBS冲洗后,滴加1∶50稀释的HER2即用型抗体,或者1∶50稀释的PTEN即用型抗体,4℃孵育过夜;PBS冲洗后滴加酶标抗体,室温下孵育后用PBS冲洗甩干,滴加显色液,最后蒸馏水冲洗,苏木精复染,最后脱水透明处理。
12.根据权利要求10或11所述的使用方法,其特征在于,所述的脱水透明处理,具体步骤为:
1.切片置于80%乙醇后快速抽提5-10下,
2.95%乙醇中快速抽提5-10下,
3.无水乙醇中快速抽提5-10下,更换无水乙醇后快速抽提5-10下,
4.二甲苯中快速抽提10-20下,更换二甲苯后抽提10-20下,
5.最后,切片干燥后用中性树胶、盖玻片封固。
13.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,所述步骤(4)的IHC评估,即HER2和PTEN的表达水平是基于染色强度(SI)和阳性细胞(PP)的百分比来判断,通过半定量的免疫反应性分数(IRS)来确定:计算公式为IRS=SI×PP,其中SI=0为阴性、SI=1为弱阳性、SI=2为中等阳性、SI=3为强阳性;PP=0代表1%阳性细胞、PP=1代表1%-10%阳性细胞、PP=2代表11%-50%阳性细胞、PP=3代表51%-80%阳性细胞、PP=4代表80%以上阳性细胞,当IRS小于或者等于3代表PTEN丢失;IRS大于或者等于3代表HER2阳性。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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