CN112237168A - 用马兜铃酸i或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法 - Google Patents
用马兜铃酸i或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组用马兜铃酸I或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，包括以下步骤：通过腹腔注射对小鼠进行马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳给药；选取前述处理后的小鼠进行解剖和肿瘤统计以及小鼠肝癌的病理组化判定。本发明为研究马兜铃酸I诱导肝癌的机制、马兜铃酸I在癌症过程中引起的突变和突变指纹以及马兜铃酸I诱导肝癌的治疗提供了有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及利用化学致癌物建立小鼠肝癌模型，是针对马兜铃酸I来建立小鼠肝癌 模型，具体涉及一组用马兜铃酸I或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法。
背景技术
二十世纪九十年代，研究者发现马兜铃酸(aristolochic acid，AA；主要包含马兜铃 酸I或马兜铃酸II)能够引起马兜铃酸肾病，继而发现马兜铃酸能够引起尿路上皮癌，被国际癌症研究机构列为Ⅰ类人类致癌物。马兜铃酸作为具有遗传毒性的化学致癌物， 其代谢产物能够与嘌呤碱基结合形成AA-DNA加合物—马兜铃内酰胺(aristolactam， AL)-DNA加合物(dA-AL和dG-AL)，作为AA暴露的特异标志物，能够引起以A>T 颠换为特点的DNA突变，对应的可能相关的突变指纹为COSMIC signature 22 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures)。
2012年，我们对国内HBV(hepatitis B virus)相关的肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)样本进行全外显子组测序，首次发现40％(4/10)的HCCs显著富集 A>T颠换，提示AA可能对HCC发生发展具有重要作用。2013年，新加坡的研究者通 过分析已发表的88例中国HCC的病人的基因组测序数据发现有10例具有较高比例的 A>T突变。2017年10月，一项来自新加坡和中国台湾学者的研究指出，通过对98例 中国台湾HCC患者进行全外显子组测序发现78％的患者具有突变指纹signature 22，这 可能与大约1/3中国台湾居民服用过含有AA的中草药有关，同时他们还分析了包含多 个国家或地区的已发表的HCC病人的基因组测序数据发现较高比例的亚洲地区的HCC 病人具有signature 22，而欧洲和北美则较低。AA可能相关突变指纹signature 22在众多 HCC病人中存在，很大程度上表明AA可能与HCC有关。HCC是肝癌的主要类型， 大约占90％。但是迄今为止还没有实验证据证明马兜铃酸能够引起肝癌。
早先的研究表明马兜铃酸具有多种治疗效果，包括抗肿瘤、抗炎症、止痛剂、抗感染、避孕和调节血压等，因此AA广泛应用于治疗包括肝炎、湿疹、肺炎、中风、毒蛇 咬伤、关节炎、痛风和冠心病等在内的多种疾病，即使已经认识到AA的肾毒性和能引 起尿路上皮癌，但是很多含有AA的中草药和中成药仍然在销售和使用。CFDA公布的 仍在销售和使用的含有AA的中草药和中成药分别多达24和43种。
因此，利用马兜铃酸I来构建小鼠肝癌模型，不仅可以通过动物实验证明马兜铃酸I能够导致肝癌，而且为研究马兜铃酸I诱导肝癌的机制提供了有力工具，对于诊断、 治疗和预防马兜铃酸I导致的肝癌具有重要意义。同时，也为国家相关部门制定相应政 策方针来保障人民群众的生命安全提供了可靠证据。
发明内容
本发明的目的在于提供一组利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝 癌模型的方法。本发明通过腹腔注射马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳来构建马兜铃酸I小鼠肝癌模型。该模型为研究马兜铃酸I诱导肝癌的机制提供了强有力的工具， 对于诊断、治疗和预防马兜铃酸导致的肝癌具有重要意义。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一组利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方 法，所述包括如下步骤：
A、通过腹腔注射对小鼠进行马兜铃酸I(AAI)或马兜铃酸I联合四氯化碳给药；
B、选取步骤A处理后的小鼠进行解剖和肿瘤统计；
C、选取步骤B处理的样本进行小鼠肝癌的病理组化判定。
步骤A中，腹腔注射给药采用的马兜铃酸I溶液是将马兜铃酸I用磷酸盐缓冲液(PBS) 配制的浓度为0.25或0.5mg/ml的马兜铃酸I溶液，采用的四氯化碳溶液是将四氯化碳 (CCl4)用玉米油配为浓度为10％的四氯化碳溶液。
作为本发明的一个实施方案，步骤A中，马兜铃酸I给药包括采用以下任一种次数和 剂量的马兜铃酸I给药：
出生2周的野生型雄性小鼠，隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为5mg/kg；
出生1周的野生型Pten肝特异敲除的雄性小鼠，隔一天1次共7次，注射马兜铃酸I溶 液，给药量为2.5mg/kg。
作为本发明的一个实施方案，步骤A中，马兜铃酸I联合四氯化碳给药为：马兜铃酸I给药后的小鼠1月龄或2月龄时一周3次共12次或一周一次共10次，每克小鼠体重注射0.5μl四氯化碳。
作为本发明的一个实施方案，步骤A中，马兜铃酸I联合四氯化碳给药包括如下步骤：
对于出生2周的野生型雄性小鼠进行以下任一种次数和剂量的马兜铃酸I联合四氯 化碳给药：
隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；给药结束后，在2月鼠龄时，腹腔注射四氯化碳溶液，给药量为0.5ml/kg，一周3次共4周；
一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；给药结束后，第二天开始腹腔注射四氯化碳溶液，给药量为0.5ml/kg，一周1次共10次。
作为本发明的一个实施方案，步骤B中，所述解剖和肿瘤统计具体包括以下步骤：
B1、选取不同鼠龄的小鼠进行解剖；
B2、对肝脏上的肿瘤进行个数和直径的统计；
B3、将带有癌旁的肝癌组织块用4％多聚甲醛固定。
作为本发明的一个实施方案，步骤C中，所述小鼠肝癌的病理组化判定具体包括以下步骤：
C1、将经4％多聚甲醛固定的组织进行脱水、包埋和切片；
C2、H&E(苏木素和伊红)染色；
C3、免疫组化(IHC)染色。
所述免疫组化(IHC)染色是针对AFP(甲胎蛋白)、Ki67和CK19(细胞角蛋白19) 进行的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明是首次利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型，包括C57/BL6野生型雄性小鼠和Pten肝特异敲除雄性小鼠。
2、本发明不仅可以作为基础研究的手段，有助于揭示马兜铃酸I诱导肝癌的机制，还可以为诊断、治疗和预防马兜铃酸I导致的肝癌提供动物模型工具。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目 的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1马兜铃酸I诱导小鼠肝癌的给药线路简图；其中，图1A为 实验组；图1B为对照组；
图2为本发明实施例2的小鼠肝癌的发生率(A)、肿瘤个数(B)和最大肿瘤尺寸 (C)统计结果；
图3为马兜铃酸I诱导小鼠肝癌的脏外观图以及类型的统计结果；其中，图A为马兜铃酸I诱导小鼠肝细胞癌(HCC)的肝脏外观图(标尺：1cm)、H&E染色(标尺： 100μm)、IHC染色(标尺：100μm，Ki67、AFP和CK19)；图B为cHCC-ICC(肝细 胞癌-肝内胆管细胞癌混合癌)的肝脏外观图(标尺：1cm)、H&E染色(标尺：100μm)、 IHC染色(标尺：100μm，Ki67、AFP和CK19)；图C是马兜铃酸I诱导小鼠肝癌类型 的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于 本发明的保护范围。
实施例1、通过腹腔注射对小鼠进行给药
1.配制马兜铃酸I和四氯化碳溶液
1.1将马兜铃酸I用磷酸盐缓冲液(PBS)配制浓度为0.25或0.5mg/ml的马兜铃酸 I溶液，将四氯化碳(CCl4)用玉米油配为浓度为10％的四氯化碳溶液。
1.2放入65℃水浴锅中，加热20分钟进行灭菌。
2.对于出生1周或2周的C57/BL6野生型雄性小鼠或Pten肝特异敲除的雄性小鼠(Pten基因带有LoxP位点的小鼠(Ptenf/f)和Alb-Cre小鼠均购自Jackson实验室。Ptenf/f和Alb-Cre进行多代交配以获得纯合的Pten肝脏特异敲除小鼠(PtenLKO)。)进行不同次 数和不同剂量的马兜铃酸I给药，对于其中一些已经马兜铃酸I给药的野生型小鼠，进 行不同给药时间和给药次数的四氯化碳给药。
如图1A所示，本发明总共涉及8种给药方法，(1)“AAI(×3)”，小鼠出生两周 时腹腔给药，AAI给药量为2.5mg/kg，隔一天1次共3次；(2)“AAI(×14)”，小鼠 出生两周时腹腔给药，AAI给药量为2.5mg/kg，一天1次共14次；(3)“AAI(high×3)”， 小鼠出生两周时腹腔给药，AAI给药量为5mg/kg，隔一天1次共3次；(4)“AAI(high ×14)”，小鼠出生两周时腹腔给药，AAI给药量为5mg/kg，一天一次共14次；(5)“AAI (×3)+CCl4”，AAI给药结束后，在2月鼠龄时，腹腔注射CCl4(给药量为0.5mg/kg)， 一周3次共4周；(6)“AAI(×14)+CCl4”，AAI给药结束后第二天开始腹腔注射CCl4 (给药量为0.5mg/kg)，一周1次共10次；(7)“AAI(×7)”，小鼠出生一周时腹腔给 药，AAI给药量为2.5mg/kg，隔一天1次共7次；(8)“AAI(high×14,PtenLKO)”， Pten肝脏特异性敲除小鼠出生两周时腹腔给药，AAI给药量为5mg/kg，一天1次共14 次。另外，如图1B所示，单独用CCl4和溶剂处理小鼠来做为对照组：其中，“AAI(×3)+CCl4”和“AAI(×14)+CCl4”的对照组分别为“CCl4(2m)”和“CCl4(1m)”；“AAI (high×14,PtenLKO)”的对照组包括PBS处理的Pten肝脏特异敲除小鼠(PtenLKO)—“PBS (PtenLKO)”和Pten基因带有LoxP位点的小鼠(Ptenf/f)—“PBS(Ptenf/f)”。此外，还 有溶剂对照组。
实施例2、小鼠解剖和肿瘤统计
分别选取实施例1各组处理后的小鼠进行解剖和肿瘤统计：
将小鼠用异氟烷麻醉，然后进行眼球取血，血液室温静置30分钟后，室温5000rpm，30分钟，取上清，分装，于-80℃保存。
将小鼠断颈处死，将小鼠固定在解剖板上，进行解剖，将心、肝、脾、肺、肾、脑、 睾丸、输尿管、膀胱、胃和尾取出，观察各脏器是否异常，对于长有肝癌的肝脏，用游 标卡尺对各个灶点进行测量，并统计灶点个数，肝和肾进行称重拍照。对于各脏器切取 部分置于4％多聚甲醛中，室温固定24h，其余置于-80℃保存。对于肝组织取部分置 于OCT中，-80℃保存。对于肝癌样本，则将带有癌旁的肝癌组织块用4％多聚甲醛固 定，肿瘤部分和癌旁组织大部分直接置于-80℃保存，一部分加入TRIzol，一部分置于 OCT中，于-80℃保存。马兜铃酸I诱导小鼠肝癌的肝脏外观图如图3A和图3B所示； 肿瘤统计如图2所示。由图3A和图3B可知，不同给药方法都能引起肝癌的发生；由 图2可知，(1)AAI单独给药能引起肝癌，且具有剂量效应。在每次相同给药量的情况 下，给药次数增多(“AAI(×14)”vs.“AAI(×3)”)，肝癌发生提前(9m vs.12m)， 肝癌发生率增加(12m，55.6％vs.20％，P＝0.17)，肿瘤个数增加(12m，平均值：1.4 vs.0.2，P＝0.058)和最大肿瘤尺寸(直径)变大(12m，平均值：5.62mmvs.0.22mm， P＝0.048)；在相同给药次数的情况下，增加每次给药量(“AAI(high×3)”vs.“AAI (×3)”)，同样会导致肝癌发生提前(9m vs.12m)，发生率增加(12m，55.6％vs.20％，P＝0.17)，肿瘤个数增加(12m，平均值：1.78vs.0.2，P＝0.058)和肿瘤尺寸变大(12 m，平均值：4.63mm vs.0.22mm，P＝0.048)。另外，给药时间提早的话(“AAI(×7)” vs.“AAI(×14)”)，肝癌的发生率(85.7％(13.5m)vs.55.6％(12m))，肿瘤个数(平 均值：3(13.5m)vs.1.4(12m))和最大肿瘤尺寸(平均值：9.52mm(13.5m)vs.5.62 mm(12m)都会增加。
(2)在AAI给药的前提下，CCl4会增加小鼠肝癌的发生。与AAI单独给药相比 (“AAI(×3)+CCl4”vs.“AAI(×3)”；“AAI(×14)+CCl4”vs.“AAI(×14)”)， AAI和CCl4联合给药会导致肝癌提前发生(9m vs.12m；6m vs.9m)、发生率增加(12 m，100％vs.20％，P＝0.007；9m，100％vs.71.4％，P＝0.2)，肿瘤个数增加(12m， 平均值：4.3vs.0.2，P＝0.00048；9m，3.75vs.0.86，P＝0.0013)和肿瘤尺寸变大(12 m，平均值：6.53mm vs.0.22mm，P＝0.00051；9m，平均值：8.25mm vs.2.86mm，P ＝0.014)
(3)AAI能有效加速和提高Pten缺陷小鼠肝癌的发生。与PBS处理的Pten缺陷 小鼠相比(“AAI(high×14,PtenLKO)”vs.“PBS(PtenLKO)”)，AAI处理的Pten缺陷 小鼠肝癌发生时间大幅度提前(鼠龄6m，100％vs.0％,P＝0.002)，肿瘤个数的平均值 为6.67(P＝0.0084)，最大肿瘤尺寸的平均值为11.67mm(P＝0.0043)；从另一个角度 讲，Pten缺陷可加速AAI处理的小鼠，相同AAI处理方式时(“AAI(high×14,PtenLKO)” vs.“AAI(high×14)”)，Pten缺陷小鼠则在6m时全部产生肿瘤，而野生型小鼠则 没有肿瘤发生。
实施例3、小鼠肝癌的病理组化判定
1组织脱水、包埋和切片
1.1待组织在4％多聚甲醛中固定24小时后，对组织按以下流程进行脱水处理：
自来水冲洗10mim→50％乙醇30min→60％乙醇30min→70％乙醇30min→80％乙醇30min→90％乙醇30min→95％乙醇30min→95％乙醇30min→100％乙醇30min→ 100％乙醇30min→无水乙醇：二甲苯(1:1)10min→二甲苯5min→二甲苯5min→石 蜡60℃10min→石蜡60℃10min。
1.2将浸过蜡的组织块用石蜡包埋机进行包埋，-20℃冷却后，于-20℃保存。
1.3将石蜡切片机切片厚度调为5μm，进行切片，放于42℃ddH2O进行展片，待 充分舒展无褶皱时用黏附性载玻片进行捞片，置于37℃烤片机上烤片过夜，室温保存。
2H&E(苏木素和伊红)染色
2.1将烤好的石蜡切片首先按以下流程进行脱蜡处理：
二甲苯10min→二甲苯10min→100％乙醇5min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→50％乙醇5min→自来水5min。
2.2将复水后的石蜡切片置于苏木素染液(Mayer)中，染20-30min，自来水冲洗2min，然后置于碳酸锂溶液中返蓝30秒，自来水冲洗2min，镜下观察着色情况，以深 蓝色为准。
2.3将经苏木素染过的石蜡切片置于80％乙醇脱水5min，然后置于伊红染液(醇溶性)中浸泡 2秒，用95％乙醇(I)、(II)调色，每次10秒左右，用100％乙醇(Ⅰ)、(Ⅱ)进行脱水，每次2min， 用二甲苯(I)、(II)进行透明，每次2min，用中性树胶进行封片，待二甲苯挥发完全后，用显微镜 进行拍照。结果如图3A和图3B所示。由图3A和图3B可知，马兜铃酸I或马兜铃酸I联 合四氯化碳引起的肝癌类型为肝细胞癌(HCC)和cHCC-ICC(肝细胞癌-肝内胆管细胞癌 混合癌)。
3免疫组化(IHC)染色
3.1将烤好的石蜡切片进行脱蜡复水。
3.2抗原修复。抗原修复液采用柠檬酸钠溶液(10mM，pH 6.0)，将复水后的石蜡 切片置于抗原修复液中，90℃以上，30min，然后室温自然冷却。
3.3将经抗原修复的石蜡切片置于Tris盐缓冲液(TBS，含0.025％Triton X-100)中， 在水平摇床上慢速清洗3次，每次5min。
3.4用含10％胎牛血清的1％牛血清白蛋白(BSA，溶于TBS中)，室温封闭1小时。
3.5将AFP、Ki67和CK19的抗体分别按1：100、1：200和1：400用1％BSA(溶于TBST(含有Tween 20的tris盐缓冲液)中)溶液进行稀释。每个样本加50μl抗体稀释液，4℃ 过夜。
3.6用TBST在水平摇床上慢速清洗1次，5min。
3.7将HRP(辣根过氧化物酶)标记山羊抗兔二抗用1％BSA按1：400进行稀释，每 个样本加50μl，室温1小时。
3.8用TBST在水平摇床上慢速清洗3次，每次5min。
3.9采用生工的DAB免疫组织化学显色试剂盒进行显色，每个样本加50μl DAB显色液，室温显色，显微镜下观察显色状况，以目的蛋白呈棕色为准，显色时间为3-30min。
3.10用自来水终止显色反应，用苏木素染液(Mayer)复染20-30min，经碳酸锂溶液返蓝30秒后，按以下流程进行脱水：
50％乙醇5min→70％乙醇5min→95％乙醇5min→100％乙醇5min→100％乙醇5min →二甲苯5min→二甲苯5min。
3.11封片，显微镜拍照。结果如图3A和图3B所示；经H&E和IHC分析后，确定肝癌类型， 统计结果如图3C所示。由图3A和图3B可知，肝细胞癌(HCC)表现为AFP和Ki67阳性， 而CK19阴性；cHCC-ICC(肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合癌)表现为CK19和Ki67阳性， 而AFP阴性；由图3A-C可知，AAI诱导的小鼠肝癌中以肝细胞癌(HCC)为主，还有 少量的肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合癌(cHCC-ICC)。将每组每个有肝癌发生的时间 点的所有小鼠进行统计，有71.4％(60/84)的小鼠发生了肝癌。91.7％(55/60)的小 鼠发生了HCC，表现为膨胀性生长、核深染肿大、核质比增加、Ki67高表达、正常肝 结构缺失和表达AFP；另外，8.3％(5/60)的小鼠发生了cHCC-ICC：其中4个小鼠表 现为同一个肿瘤内AFP和CK19都表达，包括AAI单独诱导、AAI和CCl4联合给药和 Pten缺陷组，此外，1个AAI单独诱导的Pten缺陷小鼠发生的cHCC-ICC的类型是同 一个肝上具有独立的HCC和ICC肿瘤。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改， 这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的 特征可以任意相互组合。
Claims (8)
1.一组利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，所述包括如下步骤：
A、通过腹腔注射对小鼠进行马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳给药；
B、选取步骤A处理后的小鼠进行解剖和肿瘤统计；
C、选取步骤B处理的样本进行小鼠肝癌的病理组化判定。
2.根据权利要求1所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤A中，腹腔注射给药采用的马兜铃酸I溶液是将马兜铃酸I用磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.25或0.5mg/ml的马兜铃酸I溶液，采用的四氯化碳溶液是将四氯化碳用玉米油配为浓度为10％的四氯化碳溶液。
3.根据权利要求2所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤A中，马兜铃酸I给药包括采用以下任一种次数和剂量的马兜铃酸I给药：
出生2周的野生型雄性小鼠，隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；
出生2周的野生型雄性小鼠，一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为5mg/kg；
出生1周的野生型Pten肝特异敲除的雄性小鼠，隔一天1次共7次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg。
4.根据权利要求2所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤A中，马兜铃酸I联合四氯化碳给药为：马兜铃酸I给药后的小鼠1月龄或2月龄时一周3次共12次或一周一次共10次、每克小鼠体重注射0.5μl四氯化碳。
5.根据权利要求2所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤A中，马兜铃酸I联合四氯化碳给药包括如下步骤：
对于出生2周的野生型雄性小鼠进行以下任一种次数和剂量的马兜铃酸I联合四氯化碳给药：
隔一天1次共三次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；给药结束后，在2月鼠龄时，腹腔注射四氯化碳溶液，给药量为0.5ml/kg，一周3次共4周；
一天1次共14次，注射马兜铃酸I溶液，给药量为2.5mg/kg；给药结束后，第二天开始腹腔注射四氯化碳溶液，给药量为0.5ml/kg，一周1次共10次。
6.根据权利要求1所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤B中，所述解剖和肿瘤统计具体包括以下步骤：
B1、选取不同鼠龄的小鼠进行解剖；
B2、对肝脏上的肿瘤进行个数和直径的统计；
B3、将带有癌旁的肝癌组织块用4％多聚甲醛固定。
7.根据权利要求1所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，步骤C中，所述小鼠肝癌的病理组化判定具体包括以下步骤：
C1、将经4％多聚甲醛固定的组织进行脱水、包埋和切片；
C2、苏木素和伊红染色；
C3、免疫组化染色。
8.根据权利要求7所述的利用马兜铃酸I或马兜铃酸I联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法，其特征在于，所述免疫组化染色是针对AFP、Ki67和CK19进行的。
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