WO2011110084A1 - 异戊酰螺旋霉素ⅰ、ⅱ或ⅲ的分离制备方法、及含有它们的药用组合物及其应用 - Google Patents

异戊酰螺旋霉素ⅰ、ⅱ或ⅲ的分离制备方法、及含有它们的药用组合物及其应用 Download PDF

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WO2011110084A1
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isovalerylspiramycin
iii
preparation
ethyl acetate
separation
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PCT/CN2011/071603
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姜洋
梁鑫淼
金郁
郝玉有
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沈阳同联集团有限公司
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to the separation of antibiotics and their use in anti-infective diseases, in particular, the separation and preparation method of isopyryl spunmycin single-component compound I, II or III, and pharmaceutical compositions containing the same and application thereof .
  • Background technique isopyryl spunmycin single-component compound I, II or III, and pharmaceutical compositions containing the same and application thereof .
  • Colimycin is a novel spiramycin derivative developed by genetic engineering technology. It was originally named Betmycin and was once called biochemical [patent number: ZL97104440.6]. According to the "Chinese Drug Generic Name Naming Principle", the Chinese generic name of Betmycin was changed to Coriomycin, and the English name was Calimycin, as determined by the National Pharmacopoeia Commission technical review and research.
  • Colimycin is a fermentation product of genetic engineering bacteria. Its chemical structure is based on 4"-isovalerylspiramycin, including 4"-isovalerylspiramycin I, II, III, and also contains about 6 The 4"-position hydroxyacylated spiramycin, so its chemical name is collectively referred to as 4" acylated spiromycin.
  • R H , COCH 3 , COCH2CH3 ;
  • R' COCH 2 CH(CH 3 ) 2 ,
  • Coriomycin is a 16-membered cyclic macrolide antibiotic whose mechanism of action is to inhibit protein synthesis by binding to bacterial ribosomes.
  • the results of in vitro tests indicate that colimycin is effective against Gram-positive bacteria, especially for certain resistant bacteria (such as ⁇ -lactam-resistant Staphylococcus aureus, erythromycin-resistant Staphylococcus aureus, etc.). Cross-resistance.
  • colimycin is an oral safe and effective antibiotic.
  • the high-performance liquid chromatography peak height calculation method currently established can treat several pairs of difficult-to-separate substances in the sample of coli-mycin such as isovalerylspiramycin ⁇ and (iso)butyryl spiromycin m, (iso)butyryl.
  • the separation of spiramycin m from its earlier small component was 1.2.
  • the currently established quality control standard for coriomycin tablets is to determine the 9 acylated spiramycin components of colimycin by high-performance liquid phase peak height calculation method, wherein isovalerylspiramycin ( ⁇ + ⁇ ) +m )
  • the total content should be not less than 65%; the total content of acylated spiramycin should not be less than 80%.
  • the present inventors have surprisingly found that isopenicylspiramycin I, II or III, a major component of kalliktomycin, has more excellent anti-infective activity.
  • the present invention provides isovalerylspiramycin I, II or III in the preparation of anti-infective drugs. Summary of the invention
  • the invention prepares the compound of isovalerylspiramycin I, II or III into a single component antibiotic with simplified production process, easy control of quality standards and excellent drug effect.
  • the present invention adopts the following technical solutions:
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of isovalerylspiramycin I, II or III, wherein the compound of isovalerylspiramycin I, II or III has the following structural formula:
  • the present invention also provides a process for the preparation of the above pharmaceutical composition, which comprises the step of mixing a compound of isovalerylspiramycin I, II or III with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the preparation method of the above pharmaceutical composition provided by the present invention comprises a method for separating and preparing the compound of isovalerylspiramycin I, II or III.
  • the present invention also provides a method for separating and preparing a compound of isovalerylspiramycin I, II or III, which comprises: preparing a chlortetracycline according to the patent ZL97104440. 6, and then performing crude separation of the sample, and purifying and purifying Sample post-treatment steps.
  • the crude separation was carried out by silica gel column chromatography eluting with ethyl acetate and methanol as eluent, and the eluent was collected and concentrated to dryness to give a crude sample.
  • the elution was carried out by using a three column volume volume ratio of 3:1 ethyl acetate/methanol solution and three to five column volumes in a volume ratio of 1:1 ethyl acetate/methanol solution, respectively.
  • the collection was carried out to collect a 1 : 1 volume ratio of ethyl acetate / methanol.
  • the high-efficiency purification is as follows: Purification of the crude separated sample by preparative high performance liquid chromatography, using 0DS as a chromatographic packing, gradient elution with acetonitrile and ammonia acetate buffer, and recording the separated ultraviolet spectrum by ultraviolet detection, The target peak of isovaleryl spiromycin I, II or III was collected.
  • Instrument Industrial grade preparative chromatography, the main components include binary gradient pump, UV detector and chromatography workstation; Column: 0DS preparative column, 70i. d. ⁇ 380 hidden, 10 ⁇ ;
  • Mobile phase B 75% 100 mM NH ⁇ c aqueous solution
  • the post-treatment is as follows: the collected sample is subjected to rotary evaporation to remove acetonitrile, followed by extraction with 1 time of ethyl acetate, and then the ethyl acetate in the extract is removed by rotary evaporation to obtain a paste sample; The resulting sample was re-dissolved, and finally petroleum ether was removed by rotary evaporation to obtain a white powdery solid of isovalerylspiramycin I, II or III, respectively.
  • the present invention provides structural determination of isovaleryl spiromycin I, II or III;
  • the invention also provides a separation and preparation method of isovalerylspiramycin I, II or III, which mainly comprises the following steps: preparing kallikmycin according to patent ZL97104440. 6, and then performing crude separation, high-efficiency purification, sample post-treatment, etc. step.
  • the present invention also provides anti-bacterial, anti-mycoplasmal and chlamydia activity assays of isovalerylspiramycin I, II or III.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition prepared by using the isovalerylspiramycin I, II or III of the present invention as a pharmaceutically active substance, and the weight percentage of isovalerylspiramycin I, II or III in the pharmaceutical composition can be It is 0. 01-99. 99%, and the rest are pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is in the form of a unit dosage form, which means a unit of the preparation, such as each tablet of the tablet, each capsule of the capsule, each bottle of the oral solution, each of the injections, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in any pharmaceutically acceptable dosage form, and includes: a tablet, a sugar-coated tablet, a film-coated tablet, an enteric coated tablet, a capsule, a hard capsule, a soft capsule, an oral solution. , buccal, granules, granules, pills, powders, ointments, elixirs, suspensions, powders, solutions, injections, suppositories, ointments, plasters, creams, sprays, drops, patches.
  • the preparation of the present invention is preferably an injection type such as a water needle, a powder needle, an infusion solution or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain conventional excipients such as a binder, a filler, a diluent, a tablet, a lubricant, a disintegrant, a coloring agent, a flavoring agent, and a moisturizing agent.
  • a binder such as a polyethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, polypropylene glycol dimethacrylate, a steaglycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, a glycerin, a talct, talct, talct, talct copolymer, graft copolymer, graft copolymer, graft copolymer, graft copolymer, graft copolymer, graft cop
  • Suitable fillers include cellulose, mannitol, lactose and other similar fillers.
  • Suitable disintegrating agents include starch, polyvinylpyrrolidone and starch derivatives such as sodium starch glycolate.
  • Suitable lubricants include, for example, magnesium stearate.
  • Suitable pharmaceutically acceptable wetting agents include sodium lauryl sulfate.
  • the solid oral composition can be prepared by a usual method such as mixing, filling, tableting or the like. Repeated mixing allows the active material to be distributed throughout those compositions that use large amounts of filler.
  • the oral liquid preparation may be in the form of, for example, an aqueous or oily suspension, solution, emulsion, syrup or elixir, or may be a dry product which may be formulated with water or other suitable carrier before use.
  • Such liquid preparations may contain conventional additives such as suspending agents such as sorbitol, syrup, methylcellulose, gelatin, hydroxyethylcellulose, carboxymethylcellulose, aluminum stearate or hydrogenated edible fats.
  • Emulsifiers such as egg phosphatide, sorbitan monooleate or gum arabic; non-aqueous carriers (which may include edible oils), such as almond oil, fractionated coconut oil, oily esters of esters such as glycerol, propylene glycol or ethanol
  • a preservative such as p-hydroxybenzyl or propylparaben or sorbic acid, and if desired, may contain conventional flavoring or coloring agents.
  • the liquid unit dosage form prepared contains the active substance of the invention and a sterile vehicle.
  • This compound can be suspended or dissolved depending on the carrier and concentration.
  • the solution is usually prepared by dissolving the active substance in a carrier, sterilizing it in a suitable vial or ampoule, and then sealing. Excipients such as a local anesthetic, preservative and buffer may also be dissolved in such a carrier.
  • the composition can be frozen after filling the vial and the water removed under vacuum.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may optionally be added to a suitable pharmaceutically acceptable carrier when prepared as a medicament, the pharmaceutically acceptable carrier being selected from the group consisting of: mannitol, sorbitol, sodium metabisulfite, sodium hydrogen sulfite , sodium thiosulfate, cysteine hydrochloride, thioglycolic acid, methionine, vitamins (:, EDTA disodium, EDTA calcium sodium, Monovalent alkali metal carbonate, acetate, phosphate or its aqueous solution, hydrochloric acid, acetic acid, ': sulfuric acid, phosphoric acid, amino acid, sodium chloride, potassium chloride, sodium lactate, xylitol, maltose, glucose, sugar ,: dextran, glycine, starch, sucrose, lactose, mannitol, silicon derivatives, cellulose and its derivatives, alginate, gelatin, polyvinylpyrrolidone, gly
  • the invention has the advantages and positive effects of providing a pharmaceutical company with a method for separating and preparing isovalerylspiramycin I, II or III which is simplified in production process, easy to control in quality standards, and easy to industrialize in large-scale production, and is obtained by the method of the invention.
  • a high purity isovalerylspiramycin I, II or III single component preparation; the single component preparation or a pharmaceutical composition thereof and a pharmaceutically acceptable carrier have strong antibacterial, antimycoplasma and Chlamydia activity provides a rapidly and easily accepted dosage form for clinically critical patients or patients who are not suitable for oral administration.
  • Figure 5 is a nuclear magnetic resonance spectrum of isopovalerylmycin I
  • FIG. 6 shows the nuclear magnetic resonance 13 C spectrum of isovalerylspiramycin I
  • Figure 8 shows a nuclear magnetic resonance spectrum of isopyryl spiromycin II
  • Figure 9 shows a nuclear magnetic resonance 13 C spectrum of isovalerylspiramycin II
  • Figure 11 is a nuclear magnetic resonance spectrum of isopyryl spiromycin III
  • Figure 12 is a nuclear magnetic resonance 13 C spectrum of isopyryl spiromycin III;
  • Figure 13 shows the cumulative bacteriostatic percentage of 7 erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae compounds and their comparators
  • Figure 14 shows the cumulative bacteriostatic percentage of the compound and the control drug against 7 strains of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae; Series 1 Coriomycin
  • Figure 15 Percentage inhibition of 7 strains of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae by compound and reference drug;
  • Figure 16 Accumulated bacteriostatic percentage of 6 erythromycin-resistant S. pyogenes by compound and reference drug
  • Figure 17 Percentage inhibition of 6 strains of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes by compound and reference drug;
  • the raw material of the chloramphenicol is prepared according to the patent "Method for producing biotechnology by genetic engineering technology" (patent number: ZL97104440.6).
  • the colimycin sample was separated by preparative high performance liquid chromatography to obtain a pure product of isovalerylspiramycin I. Specifically, it includes steps such as crude sample separation, high-efficiency purification, and post-sample processing.
  • Instrument Industrial grade preparative chromatography.
  • the main components include binary gradient pump, UV detector and chromatography workstation;
  • sample post-treatment The collected isovalerylspiramycin I sample, acetonitrile was removed by rotary evaporation, and then extracted with 1 ⁇ ethyl acetate, and ethyl acetate in the extract was removed by rotary evaporation to obtain a paste sample. The obtained sample was re-dissolved with petroleum ether, and petroleum ether was removed by rotary evaporation to obtain a white powdery solid of isovalerylspiramycin I.
  • Example 2 Separation and preparation of isovalerylspiramycin II
  • the raw material of the chloramphenicol is prepared according to the patent "Method for producing biotechnology by genetic engineering technology" (patent number: ZL97104440.6).
  • the colimycin sample was separated by preparative high performance liquid chromatography to obtain a pure product of isovalerylspiramycin II compound. Specifically, it includes steps such as crude sample separation, high-efficiency purification, and sample post-treatment.
  • Instrument Industrial grade preparative chromatography. Main components include binary gradient pump, UV Detector and chromatography workstation; Column: ODS preparative column (70 idx380mm, 10 ⁇ ) ;
  • sample post-treatment collected samples of isovalerylspiramycin II, respectively, by rotary evaporation to remove acetonitrile, and then extracted with 1 times the amount of ethyl acetate, remove the ethyl acetate in the extract by rotary evaporation, to obtain a paste sample .
  • the obtained sample was re-dissolved with petroleum ether, and petroleum ether was removed by rotary evaporation to obtain a white powdery solid of isovalerylspiramycin II.
  • the raw material of the chloramphenicol is prepared according to the patent "Method for producing biotechnology by genetic engineering technology" (patent number: ZL97104440.6).
  • the colimycin sample was separated by preparative high performance liquid chromatography to obtain a pure product of isovalerylspiramycin III compound. Specifically, it includes steps such as crude sample separation, high-efficiency purification, and sample post-treatment.
  • Instrument Industrial grade preparative chromatography.
  • the main components include binary gradient pump, UV detector and chromatography workstation;
  • sample post-treatment The sample of isopyryl spiromycin III was collected, and acetonitrile was removed by rotary evaporation, and then extracted with 1 time of ethyl acetate, and ethyl acetate was removed by rotary evaporation to obtain a paste sample. The obtained sample was re-dissolved with petroleum ether, and petroleum ether was removed by rotary evaporation to obtain a white powdery solid of isovalerylspiramycin III.
  • the molecular weight of the isolated compound was confirmed by high resolution mass spectrometry (Bruker APEXII, HR-SI-MS) to be 926.
  • the high-resolution mass spectrum of isovalerylspiramycin I is shown in Fig. 4, and it is confirmed by nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectra [Bruker AM500, solvent CDC1 3 , internal standard TMS (tetramethyl silane)].
  • the structure of the compound is isovalerylspiramycin I.
  • the isohistyl spiromycin I nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectra are shown (Fig. 5, 6), and the nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectral data are shown in (Table 1, 2).
  • the molecular weight of the isolated compound was confirmed by high resolution mass spectrometry (Bruker APEXII, HR-SI-MS).
  • the high-resolution mass spectrum of isovaleryl spiromycin II is shown in Fig. 7 and confirmed by nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectra [Bruker AM500, solvent CDC1 3 , internal standard TMS (tetramethyl silane)].
  • the structure of the compound is isovalerylspiramycin II.
  • the isohistyl spiromycin II nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectra are shown (Fig. 8, 9), and the nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectral data are shown in Table (3, 4).
  • the molecular weight of the isolated compound was confirmed by high resolution mass spectrometry (Bruker APEXII, HR-SI-MS) to be 982.
  • the high-resolution mass spectrum of isovalerylspiramycin III is shown in Fig. 10, and confirmed by nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectra [Bruker AM500, solvent CDC1 3 , internal standard TMS (tetramethyl silane)].
  • the structure of the compound is isovalerylspiramycin III.
  • the 1H and 13 C spectra of isovalerylspiramycin III nuclear magnetic resonance are shown (Fig. 11, 12), and the nuclear magnetic resonance 1H and 13 C spectral data are shown in Table 5, 6).
  • Compound 1 Colimycin Lot No.: 0812512, Potency: 92. 8%, provided by Shenyang Tonglian Group Co., Ltd.;
  • Compound 2 Isovalerylspiramycin I: Lot No.: 0811214, Potency: 93. 7%, Shenyang Provided by Tonglian Group Co., Ltd.;
  • Azithromycin Batch number: 0421-9603, Potency: 99. 3%, China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products; Clarithromycin: Batch number: 0482-9901, Potency: 90. 4%, China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.
  • MH (Muel ler-Hinton) medium (g / L): acid hydrolysis of casein 17. 5, beef soaked bone powder 2, starch 1. 5, agar 12.
  • S. pneumoniae was incubated in a blood medium (5% medium defibrated sheep blood was added to the MH medium) and incubated for 20-24 hours in a 35 ° C 5% C0 2 environment (C0 2 incubator).
  • S. pyogenes was incubated in blood medium (5% medium defibrated sheep blood was added to MH medium) and incubated at 35 ° C for 20-24 hours.
  • test bacterial suspension was inoculated with a multi-point inoculation instrument, and the inoculation amount per spot was 10 4 CFU.
  • the minimum inhibitory concentration of each antibacterial drug against various pathogenic bacteria was determined.
  • the one-component isovalerylspiramycin I, II, III pairs of the present invention The antibacterial effect of streptococcus (the antibacterial effect of isopyryl spiromycin I II III single-component compound on streptococcus is MIC 5 . 0.5 mg / L and MIC 9 . 2 mg / L) are superior to colimycin At the same time, it was significantly stronger than the control drugs erythromycin, azithromycin, and clarithromycin (Table 7). For 7 strains of erythromycin-resistant S.
  • Compound 1 Colimycin Lot No.: 0812512, Potency: 92. 8%, Shenyang Tonglian Group Co., Ltd. provides compound 2 isovalerylspiramycin I: batch number: 0811214, potency: 93. 7%, Shenyang Tong Provided by Union Group Co., Ltd.
  • Compound 3 isovalerylspiramycin ⁇ : Lot number: 0811214, potency: 93. 7%, provided by Shenyang Tonglian Group Co., Ltd.
  • Azithromycin Lot number: 0421-9603, Potency: 99. 3%, China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
  • Mycoplasma pneumoniae (ATCC-FH).
  • Mycoplasma agar medium Mycoplasma agar basic medium (Oxoid, CM0401) 2.84g, added 80ml of ultrapure water, sterilized at 121 °C for 15min, placed in a water bath at 50 °C, added with Mycoplasma pneumoniae additive (Oxoid , SR0059C) 1 bottle (20ml), prepare agar culture dish.
  • Mycoplasma PPL0 broth Mycoplasma PPL0 broth basal medium (BD) 2. 1 g, deionized purified water 70ml, autoclaved at 121 °C, 15min. After cooling to room temperature, 1 bottle of freeze-dried Mycoplasma pneumoniae culture supplement (Oxoid supplement) (dissolved in 20 ml of sterile deionized water), sterile 50% glucose solution 2.0 ml, and 0.4% phenol red 0.5 ml were added.
  • Oxoid supplement freeze-dried Mycoplasma pneumoniae culture supplement
  • the Mycoplasma pneumoniae FH strain was inoculated into 20 ml of PPL0 broth medium, harvested with glass beads for 72 hours, centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. The pellet was resuspended in 8 ml of fresh PPL0 broth and dispensed in 8 tubes. Store -80 ° C refrigerator.
  • the above-mentioned preparation of Mycoplasma pneumoniae FH inoculum was cultured in PPL0 broth medium at 1:10, 1:100, and 1:1000, and then applied to a Mycoplasma pneumoniae agar plate, cultured at 37 ° C, 5 % CO 2 for 7 days, in a 40-fold microscope. Count down. Calculate the titer of Mycoplasma pneumoniae.
  • the compound was dissolved in absolute ethanol at 16 mg/ml and diluted 10 times with Mycoplasma PPL0 broth.
  • the Mycoplasma pneumoniae inoculum was added to the above-mentioned serially diluted drug tubes, and the final inoculation concentration of Mycoplasma pneumoniae FH was 8.25 ⁇ 10 5 CFU/ml.
  • the culture tubes (including the control tubes) after inoculation were cultured at 37 ° C and the color changes were observed every day. Test establishment:
  • Anhydrous ethanol killing interference control diluted M. pneumoniae FH inoculum ( 1.65xl0 6 CFU/ml) 0.5 ml, PPLO broth medium 0.5 ml, final concentration 0.05% absolute ethanol.
  • the antibiotic concentration of the color change tube does not occur at this time as the minimum inhibitory concentration, ie, the MIC concentration.
  • Chlamydia pneumoniae species CWL-029 (ATCC VR1310).
  • Cell culture medium 10% fetal bovine serum (HyClone) Dulbecco's MEM (Sigma) culture medium.
  • Chlamydia pneumoniae culture medium 10% fetal bovine serum Dulbecco's MEM medium containing 2 g/ml of cycloheximide (Sigma).
  • BGMK green monkey kidney cells, Diagnostic HYBRIDS
  • Negative control BGMK cells, Chlamydia pneumoniae culture medium.
  • Chlamydia pneumoniae inoculum was aspirated and a serial dilution of 0.1 ml/well was added. 37. C, 5 % C0 2 was incubated for 72 min. After the culture was completed, the antibiotic drug solution was taken up, washed twice with PBS (0.01 M, pH 7.4), and fixed with 100% absolute ethanol for 15 min.
  • MIC The minimum antibiotic dilution concentration for the complete inhibition of the growth of the Chlamydia pneumoniae inclusion body in the 96-well assay plate (no inclusions for fluorescence staining in the whole well).
  • the activity of isovaleryl spiromycins I, II and III in the anti-Pneumococcal activity measured was significantly stronger than that of colimycin and was significantly superior to the control drug.
  • Activity against Chlamydia pneumoniae Isovalerylspiramycin I, II and III are comparable to colimycin and superior to erythromycin.
  • the present invention can prepare a single component of isovalerylspiramycin I as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • mannitol 30-150 mg was added as a lyophilized proppant, and after rapid freezing at low temperature for 9 hours, it was freeze-dried to obtain a pale yellow loose mass, which was dissolved with 2-10 ml of sterile water before use.
  • the present invention can prepare a single component of isovalerylspiramycin II as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • 100-500mg of isovalerylspiramycin II (referred to as raw material) and solvent adipic acid 18-90mg or 26-130mg of citric acid or 14-70mg of maleic acid are evenly mixed and dissolved in 1 In 5 ml of water, a pale yellow clear solution is obtained with a pH between 4.6 and 5.6.
  • mannitol 30-150 mg was added as a lyophilized proppant, and after rapid freezing at low temperature for 9 hours, it was freeze-dried to obtain a pale yellow loose mass, which was dissolved with 2-10 ml of sterile water before use.
  • the present invention can prepare a single component of isovalerylspiramycin III as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be prepared into various clinically usable dosage forms.
  • mannitol 30-150 mg was added as a lyophilized proppant, and after rapid freezing at low temperature for 9 hours, it was freeze-dried to obtain a pale yellow loose mass, which was dissolved with 2-10 ml of sterile water before use.

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Description

说 明 书
异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的分离制备方法、 及含有它们的药用组合物及其应用 技术领域
本发明涉及抗生素的分离及其在抗感染性疾病中的应用， 特别涉及异戊酰螺旋 霉素单组分化合物 I、 II或 III的分离制备方法、 及含有它们的药用组合物及其应用。 背景技术
可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋霉素衍生物， 原命名为必特霉素， 曾用名为生技霉素 [专利号： ZL97104440.6 ]。 根据"中国药品通用名称命名原则"， 经 国家药典委员会技术审核及研究确定， 必特霉素的中文通用名称更改为可利霉素， 英文名称为 Calimycin。
可利霉素为基因工程菌发酵产物， 其化学结构是以 4"-异戊酰螺旋霉素为主成 分， 包括 4"-异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III， 其次还含有约 6种 4"-位羟基酰基化的螺旋 霉素， 故其化学名统称为 4"酰化螺旋霉素。
可利霉素主成分的化学结构如式 （1 ) 所示：
Figure imgf000002_0001
( 1 )
其中： R=H ， COCH3 、 COCH2CH3 ； R' =COCH2CH(CH3)2 、
COCH2CH(CH3)2 、 COCH2CH(CH3)2 可利霉素为 16元环大环内酯类抗生素， 其作用机制是通过与细菌核糖体结合而 抑制其蛋白质合成。 体外试验结果表明， 可利霉素对革兰阳性菌、 尤其对某些耐药菌 （如耐 β -内酰 胺金葡菌、 耐红霉素金葡菌等） 有效， 与同类药无明显的交叉耐药性。 同时它对支 原体、 衣原体有很好的抗菌活性， 对部分革兰阴性菌也有抗菌活性， 且对弓形体、 军团菌等有良好抗菌活性和组织渗透性， 还有潜在的免疫调节作用。 其体内抗菌活 性明显优于体外 [ ZL200310122420.9 ]。 临床研究表明， 每日服用可利霉素片剂 0.2-0.4mg5-7天， 可适用于治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性咽炎、急性化脓性扁 桃体炎； 敏感细菌引起的细菌性鼻窦炎、 急性支气管炎； 肺炎链球菌、 流感嗜血杆 菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎； 支原体、 衣原体引起的非淋球菌性尿道炎； 敏 感细菌引起的皮肤软组织感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其总有效率为 87.76%， 可利霉素的不良反应率低。 临床研究证明， 可利霉素是一个口服安全有效的抗生素。 然而， 由于可利霉素 本身是多组分药物， 经过发酵得到的产品， 在发酵过程产生的多种杂质， 给组分 定量测定带来一定困难。 目前建立的高效液相色谱峰高计算法， 能将可利霉素样 品中几对难分离的物质如异戊酰螺旋霉素 π与 （异） 丁酰螺旋霉素 m、 （异） 丁酰 螺旋霉素 π与丙酰螺旋霉素 m、 丙酰螺旋霉素 m与其前面的小组分、 丙酰螺旋霉素 π与乙酰螺旋霉素 πι的分离， 度达到中国药典规定的 1.5 以上； 而乙酰螺旋霉素 m 与其前面的小组分的分离度为 1.2。 目前建立的可利霉素片剂质控标准， 系采用 高效液相分析峰高计算法， 测定可利霉素 9个酰化螺旋霉素组分， 其中异戊酰螺 旋霉素 （Ι+Π+m ) 总含量应不低于 65%; 酰化螺旋霉素总含量应不低于 80%。 尽管 按照目前的片剂生产工艺， 可以得到产品组分比例可控、 质量稳定的可利霉素， 然 而， 为了改进提取纯化工艺、 简化质量检测过程、 提高临床治疗效果， 有必要研制 异戊酰螺旋霉素主要单一组分的注射制剂。 尤其对于临床危重病人或不宜口服用药 的病人， 注射给药见效迅速， 更易接受。 对于发酵产生的多组分抗生素， 按照化学 药品质控方法很难控制其质量， 而且任何细小的变化， 均有可能导致物质基础的变 化， 增加终产品质控标准的难度， 引发不可预测的用药不良反应。 所以通过发酵产 生的多组分抗生素注射剂迄今尚不多见。
药代动力学研究结果表明， 可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺旋霉 素 I、 II、 III。 可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素， 以母体药物异戊酰螺旋霉 素 I、 II、 III和活性代谢物螺旋霉素 I、 II、 III 的 AUC。- 1总和计算， 其口服绝对生物 利用度平均为 91. 6%。 文献报道， 螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为 30-40% [Frydman AM et al J Ant imicrob Chemother. 1988， 22 (suppl B) : 93-103]。 说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。 单次服药 可利霉素消除较慢， Τ1/2Ρ在 23-27小时之间。
本发明人惊讶的发现， 可利霉素的主要组分异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III具有更 加优良的抗感染活性， 为此， 本发明提供异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III在制备抗感染 药物中的应用。 发明内容
本发明的目的是， 提供一种异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III的分离制备、 及含有它 们的药用组合物， 以及其在抗感染治疗中的应用。 本发明将异戊酰螺旋霉素 I 、 II 或 III化合物制备成一种生产工艺简化、 质量标准易控， 药物效果优良的单组分抗生 素。
为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案：
一种含有异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III化合物的药物组合物， 其中， 所述异戊酰 螺旋霉素 I、 II或 III化合物具有以下结构式：
Figure imgf000004_0001
其中： R=H， R' =C0CH2CH (CH3) 2 ;
或1^=(：0( ¾， R' =C0CH2CH (CH3) 2 ；
或1^=(：0(¾(¾， R' =C0CH2CH (CH3) 2 。
本发明还提供上述药物组合物的制备方法， 其中， 该方法包括将异戊酰螺旋霉 素 I 、 II或 III化合物和药学上可接受的载体混合的步骤。
本发明所提供的上述药物组合物的制备方法包括所述异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III化合物的分离制备方法。
因此， 本发明还提供了异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III化合物的分离制备方法， 该 分离制备方法包括： 按照专利 ZL97104440. 6制备可利霉素， 然后进行样品粗分离， 高效纯化和样品后处理步骤。
所述的粗分离为： 采用硅胶柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂进行洗 脱， 收集洗脱液， 浓縮至干， 得粗分离样品。
所述的洗脱为分别采用三倍柱体积的体积比 3 : 1的乙酸乙酯 /甲醇溶液和三至五 倍柱体积的体积比 1 : 1的乙酸乙酯 /甲醇溶液进行洗脱。
所述的收集为收集体积比 1 : 1的乙酸乙酯 /甲醇部分。
所述的高效纯化为： 采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 0DS 作为色谱填料， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的 紫外谱图， 并对异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III目标峰进行收集。
其中， 色谱条件如下：
仪器： 工业级制备色谱， 主要部件包括二元梯度泵， 紫外检测器和色谱工作站； 色谱柱： 0DS制备色谱柱， 70i. d. χ380隱， 10μ;
流动相 A: 25%乙腈，
流动相 B: 75%100mM NH^c水溶液；
梯度条件： 采用线性梯度；
流速： 260 mL/min; 进样量： 10mL; 进样浓度： 0. 5g/mL; 检测波长： 231nm; 收集方式： 紫外触发收集；
分别按照异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT40. 88， 异戊酰螺旋霉素 II的保留时 间 RT43. 34或戊酰螺旋霉素 III的保留时间 RT48. 009收集样品。
所述的后处理为： 将收集的样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 接着用 1 倍量乙酸 乙酯萃取， 然后用旋转蒸发除去萃取液中的乙酸乙酯， 得膏状样品； 再用石油醚重 溶所得样品， 最后用旋转蒸发除去石油醚， 分别获得异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III白 色粉末状固体。
本发明提供了异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III的结构确定； 本发明还提供了异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III的分离制备方法， 主要包括以下步 骤： 按照专利 ZL97104440. 6制备可利霉素， 然后进行样品粗分离， 高效纯化， 样品 后处理等步骤。
本发明还提供了异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III抗细菌、 抗支原体及衣原体活性测 定。
本发明还提供以本发明的异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III作为药物活性物质制备的 药物组合物， 异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III在药物组合物中所占重量百分比可以是 0. 01-99. 99%， 其余为药物可接受的载体。 本发明的药物组合物， 以单位剂量形式存 在， 所述单位剂量形式是指制剂的单位， 如片剂的每片， 胶囊的每粒胶囊， 口服液 的每瓶， 注射剂的每支等。
本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型， 这些剂型包括： 片剂、 糖衣片 剂、 薄膜衣片剂、 肠溶衣片剂、 胶囊剂、 硬胶囊剂、 软胶囊剂、 口服液、 口含剂、 颗粒剂、 冲剂、 丸剂、 散剂、 膏剂、 丹剂、 混悬剂、 粉剂、 溶液剂、 注射剂、 栓剂、 软膏剂、 硬膏剂、 霜剂、 喷雾剂、 滴剂、 贴剂。 本发明的制剂， 优选的是注射剂型， 如： 水针， 粉针， 输液等剂型。
本发明的药物组合物， 其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂， 诸如粘合剂、 填充剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着色剂、 调味剂和湿润剂， 必要时可 对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、 甘露糖醇、 乳糖和其它类似的填充剂。 适宜的崩解 剂包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物， 例如羟基乙酸淀粉钠。 适宜的润滑剂 包括， 例如硬脂酸镁。 适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合， 填充， 压片等常用的方法制备固体口服组合物。 进行反复混合可 使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、 溶液、 乳剂、 糖浆剂或酏 剂， 或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。 这种液体 制剂可含有常规的添加剂， 诸如悬浮剂， 例如山梨醇、 糖浆、 甲基纤维素、 明胶、 羟乙基纤维素、 羧甲基纤维素、 硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪， 乳化剂， 例如卵磷 月旨、 脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶； 非水性载体 （它们可以包括食用油） ， 例如 杏仁油、 分馏椰子油、 诸如甘油的酯的油性酯、 丙二醇或乙醇； 防腐剂， 例如对羟 基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸， 并且如果需要， 可含有常规的香味剂或着 色剂。
对于注射剂， 制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。 根据载 体和浓度， 可以将此化合物悬浮或者溶解。 溶液的制备通常是通过将活性物质溶解 在一种载体中， 再将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒， 然后密封。 辅料例 如一种局部麻醉剂、 防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。 为了提高其稳定性， 可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻， 并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物， 在制备成药剂时可选择性地加入适合的药学上可接受的 载体， 所述药学上可接受的载体选自： 甘露醇、 山梨醇、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、 蛋氨酸、维生素（：、 EDTA二钠、 EDTA钙钠， 一价碱金属的碳酸盐、 醋酸盐、 磷酸盐或其水溶液、 盐酸、 醋酸、 '：硫酸、 磷酸、 氨 基酸、 氯化钠、 氯化钾、 乳酸钠、 木糖醇、 麦芽糖、 葡萄糖、 糖、：右旋糖苷、：甘 氨酸、 淀粉、 蔗糖、 乳糖、 甘露糖醇、 硅衍生物、 纤维素及其衍生物、 藻酸盐、 明' 胶、 聚乙烯吡咯垸酮、 甘油、 土温 80、 琼脂、 碳酸钙、 碳酸氢钙、 表面活性剂、 聚 乙二醇、 环糊精、 β—环糊精、 磷脂类材料、 高岭土、 滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸 本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量， 可每日服三次， 每次 1-20剂。
本发明的优点和积极效果是， 为制药企业提供了生产工艺简化、 质量标准易控、 易工业化大规模生产的异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III的分离制备方法， 采用本发明方 法得到了纯度高的异戊酰螺旋霉素 I 、 II或 III单一组分制品； 该单一组分制品或其 与药学上可接受的载体组成的药用组合物具有较强的抗细菌、 抗支原体及衣原体活 性， 为临床危重病人或不宜口服给药的病人提供了见效迅速， 易于接受的用药剂型 的可能性。 附图说明
图 1异戊酰螺旋霉素 I 的 HPLC图谱；
图 2异戊酰螺旋霉素 II的 HPLC图谱；
图 3异戊酰螺旋霉素 III的 HPLC图谱；
图 4异戊酰螺旋霉素 I 的高分辨质谱图；
图 5异戊酰螺旋霉素 I 的核磁共振氢谱图；
图 6异戊酰螺旋霉素 I 的核磁共振 13C谱图；
图 7异戊酰螺旋霉素 II高分辨质谱图；
图 8异戊酰螺旋霉素 II的核磁共振氢谱图；
图 9异戊酰螺旋霉素 II的核磁共振 13C谱图；
图 10异戊酰螺旋霉素 III高分辨质谱图；
图 11异戊酰螺旋霉素 III的核磁共振氢谱图；
图 12异戊酰螺旋霉素 III的核磁共振 13C谱图；
图 13化合物及对照药对 7株红霉素耐药肺炎链球菌的累积抑菌百分率；
中：
系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 I
系列 3 红霉素
系列 4 阿奇霉素
→ ~系列 5 克拉霉素
图 14化合物及对照药对 7株红霉素耐药肺炎链球菌的累积抑菌百分率； 系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 II
系列 3
系列 4 阿奇霉素
系列 5 克拉霉素
图 15化合物及对照药对 7株红霉素耐药肺炎链球菌的累积抑菌百分率; 其中：
系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 ΠΙ
系列 3
系列 4 阿奇霉素
系列 5 克拉霉素
图 16 化合物及对照药对 6株红霉素耐药化脓性链球菌的累积抑菌百分率; 其中：
-^—系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 I
系列 3 红霉素
- 系列 4 阿奇霉素
牛 系列 5 克拉霉素
图 17化合物及对照药对 6株红霉素耐药化脓性链球菌的累积抑菌百分率； 其中：
― ~~系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 II
系列 3 红霉素
系列 4 阿奇霉素
系列 5 克拉霉素
图 18化合物及对照药对 6株红霉素耐药化脓性链球菌的累积抑菌百分率。 其中：
♦ 系列 1 可利霉素
系列 2 异戊酰螺旋霉素 III
系列 3 红霉素
系列 4 阿奇霉素
~系列 5 克拉霉素 具体实施方式
以下所列实施例只是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明， 但不以任何 方式限制本发明。
【实施例 1】异戊酰螺旋霉素 I的分离制备
可利霉素原料按照 "一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法" 专利 （专 利号： ZL97104440.6) 制备得到。 采用制备型高效液相色谱对可利霉素样品进行分 离， 获得异戊酰螺旋霉素 I化合物纯品。 具体包括样品粗分离， 高效纯化， 样品后处 理等步骤。
1 )、粗分离： 首先从可利霉素样品中对异戊酰螺旋霉素 I组分进行粗分离， 采用 硅胶柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂， 分别采用三倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （3: 1 ) 和三至五倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 进行洗脱， 收集乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 部分， 将收集液浓縮至干， 获得异戊酰螺旋霉素 I、 II 、 III组分， 用 于进一步纯化分离。
2)、 高效纯化： 采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 ODS作为 色谱填料， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外 谱图， 并对异戊酰螺旋霉素 I目标峰进行收集。
具体色谱条件如下： 仪器： 工业级制备色谱。 主要部件包括二元梯度泵， 紫外 检测器和色谱工作站； 色谱柱： ODS制备色谱柱 （70 i.d.x380mm , 10μ);
流动相： 乙腈 （A)25%， 100mM NH4Ac水溶液 75% (Β)。
流速： 260 mL/min; 进样量： 10mL; 进样浓度： 0.5g/mL; 检测波长： 231nm; 收集方式： 紫外触发收集； 按照异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 （RT 40.88)， 收 集样品。 异戊酰螺旋霉素 I高压液相色谱图见 （图 1 )。
3)、 样品后处理： 收集的异戊酰螺旋霉素 I样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 然后 用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品。 用石油 醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得异戊酰螺旋霉素 I白色粉末状固体。 【实施例 2】异戊酰螺旋霉素 II的分离制备
可利霉素原料按照 "一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法" 专利 （专 利号： ZL97104440.6) 制备得到。 采用制备型高效液相色谱对可利霉素样品进行分 离， 获得异戊酰螺旋霉素 II化合物纯品。 具体包括样品粗分离， 高效纯化， 样品后 处理等步骤。
1 )、 粗分离： 首先从可利霉素样品中对异戊酰螺旋霉素 II组分进行粗分离， 采 用硅胶柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂， 分别采用三倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （3: 1 ) 和三至五倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 进行洗脱， 收集乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 部分， 将收集液浓縮至干， 获得异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III组分， 用于 进一步纯化分离。
2)、 高效纯化： 采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 ODS作为 色谱填料， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外 谱图， 并对异戊酰螺旋霉素 II目标峰进行收集。
具体色谱条件如下： 仪器： 工业级制备色谱。 主要部件包括二元梯度泵， 紫外 检测器和色谱工作站； 色谱柱： ODS制备色谱柱 （70 i.d.x380mm , 10μ);
流动相： 乙腈 （A)25%， lOOmM NH4Ac水溶液 75%(B) ； 梯度条件： 采用线性梯度。 流速： 260 mL/min; 进样量： 10mL; 进样浓度： 0.5g/mL; 检测波长： 231nm; 收集方式： 紫外触发收集； 按照异戊酰螺旋霉素 II的保留时间 （RT 43.34、） 收 集样品。 异戊酰螺旋霉素 II高压液相色谱见 （图 2)。
3)、 样品后处理： 收集的异戊酰螺旋霉素 II样品， 分别采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品。 用 石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得异戊酰螺旋霉素 II白色粉末 状固体。
【实施例 3】异戊酰螺旋霉素 III的分离制备
可利霉素原料按照 "一种利用基因工程技术制造生技霉素的方法" 专利 （专 利号： ZL97104440.6) 制备得到。 采用制备型高效液相色谱对可利霉素样品进行分 离， 获得异戊酰螺旋霉素 III化合物纯品。 具体包括样品粗分离， 高效纯化， 样品后 处理等步骤。
1 )、 粗分离： 首先从可利霉素样品中对异戊酰螺旋霉素 III组分进行粗分离， 采 用硅胶柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂， 分别采用三倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （3: 1 ) 和三至五倍柱体积乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 进行洗脱， 收集乙酸乙酯： 甲醇 （1 : 1 ) 部分， 将收集液浓縮至干， 获得异戊酰螺旋霉素 I 、 II、 III组分， 用 于进一步纯化分离。
2)、 高效纯化： 采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 ODS作为 色谱填料， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外 谱图， 并对异戊酰螺旋霉素 III目标峰进行收集。
具体色谱条件如下： 仪器： 工业级制备色谱。 主要部件包括二元梯度泵， 紫外 检测器和色谱工作站； 色谱柱： ODS制备色谱柱 （70 i.d.x380mm , 10μ);
流动相： 乙腈 25%(A)， lOOmM NH4Ac水溶液 75% (Β) 。 流速： 260 mlJmin; 进 样量： 10mL; 进样浓度： 0.5g/mL; 检测波长： 231nm;
收集方式： 紫外触发收集； 按照异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 （RT 48.009)， 收集样品。 异戊酰螺旋霉素 III高压液相色谱图见 （图 3)。
3)、 样品后处理： 收集的异戊酰螺旋霉素 III样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 然 后用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品。 用石 油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状 固体。
【实施例 4】异戊酰螺旋霉素 I的鉴定
通过高分辨质谱 （Bruker APEXII, HR— SI— MS) 确证所分离化合物的分子量 为 926。 异戊酰螺旋霉素 I 高分辨质谱图见 （图 4)， 经核磁共振 1H和 13C谱 [Bruker AM500, 溶剂 CDC13， 内标 TMS (四甲基娃烷)]等分析确证， 所分离的化合物的结构为 异戊酰螺旋霉素 I。 异戊酰螺旋霉素 I核磁共振 1H和 13C谱见 （图 5， 6)， 核磁共振 1H 和 13C谱数据见 （表 1， 2)。
表 1.异戊酰螺旋霉素 I的核磁共振 1H谱数据 (500MHz, CDC13)
Proton <5 ppm ( M , JHz ) Η-Ή COSY Proton «5 ppm ( , JHz ) COSY
2ax 2.67 (dd, J= 11.0, 14.7) 2 eq, 3
2eq 2.25 (m) 2 ax, 3
3 3.79(brd,J= 11.0) 2eq, 2ax, 4
4 3.06 (brd, J = 8.8) 5,3
5 4.10(brd,J = 8.8) 4
6 2.14 (m) 7eq, 17b
7ax 1.49 (m) 7eq, 8
7eq 0.96 (m) 7ax, 6
8 1.93 (m) 7ax, 19
9 4.04 ( dd , J = 9.7 , 4.0 ) 10
10 9, 11
11 6.23 (dd, J = 15.1 , 10.5) 10, 12
12 6.00(dd, J= 11.0, 15.0) 11 , 13
II
13 5.55 (ddd, J= 15.0, 11.0,4.0) 12， 14ax， 14eq
14ax 2.10 (m) 13 , 14eq , 15
14eq 2.47 ( m ) 13 , 14ax
15 5.27 ( m ) 14ax, 16
16 1.29 (d, J = 6.2) 15
17a 2.32 ( m) 17b
17b 2.79 ( dd , J = 10.2 , 17.5 ) 6, 17a
18 9.81 (s)
19 0.97 ( d , J = 6.6 ) 8
20 3.49 ( s )
Γ 4.46 ( d , J = 7.5 ) 2，
2， 3.50 (m) l',3'
3' 2.45 ( m ) 2', 4'
4， 3.25 ( m ) 3'
5， 3.27 ( m ) 6，
6， 1.21 (d, J = 6.7) 5，
7', 8' 2.49 ( s )
1" 5.06 (d, J = 3.4) 〃 ax
2"ax 1.82 (dd,J= 3.9, 14.1 ) 1 , eq
2"eq 2.02 (dd, J = 14.1 ,9.8) 2"ax
4" 4.61 (d, J = 10.2) 5"
5" 4.44 (d, J= 10.2 , 6.2 ) 4"， 6"
6" 1.12(d, J=6.2) 5"
7" 1.10(s)
9" 2.29(d,J=7.1 ) 10"
10" 2.14 (m) 9", 11", 12"
11", 12" 0.96 ( d , J=6.6 ) 10"
1" 4.36(dd, J= 1.8 ,9.2) ax , eq
L ax 1.49 (m) 1 , eq , J eq
L eq 1.81 (m) 1 , ax , J ax j » ax 1.43 (m) eq， j eq , 4 i eq 1.83 (m) ax , J ax , 4
4" 2.21 (m) j ax , J eq , j
5" 3.42 ( dq , J=6.2 , 9.4 ) 4 ，6
6" 1.22 (d, J = 6.2)
7", 8" 2.22 ( s ) 表 2.异戊酰螺旋霉素 I的核滋共振 13C谱数据 (125MHz, CDC13)
Carbon *5 Carbon *5
1 174.2 4， 76.0
2 37.7 5， 73.0
3 68.3 6， 18.9
4 85.2 7' , 8' 41.9
5 79.4 1" 97.0
6 30.6 2" 41.7
7 30.7 3" 69.4
8 31.9 4" 77.1
9 78.9 5" 63.5
10 128.7 6" 17.8
11 134.5 7" 25.4
12 132.8 8" 172.9
13 131.0 9" 43.3
14 41.9 10" 25.5
15 69.2 11" 22.37a
16 20.1 12"
17 43.3 1 " 100.3
18 202.7 2" 31.3
19 15.3 3" 18.5
20 61.7 4" 64.9
Γ 103.9 5" 73.8
2， 71.7 6" 18.8
3' 68.8 7" , 8" 40.7
【实施例 5】异戊酰螺旋霉素 II的鉴定
通过高分辨质谱 （Bruker APEXII, HR— SI— MS) 确证所分离的化合物的分子 量 968。 异戊酰螺旋霉素 II高分辨质谱图见 （图 7 )， 经核磁共振 1H和 13C谱 [Bruker AM500, 溶剂 CDC13， 内标 TMS (四甲基娃烷)]等分析确证， 所分离的化合物的结构为 异戊酰螺旋霉素 II。 异戊酰螺旋霉素 II核磁共振 1H和 13C谱见（图 8， 9)， 核磁共振 1H和 13C谱数据见表 (3， 4)所示。
表 3.异戊酰螺旋霉素 II的核磁共振 1H谱数据 (500MHz, CDCI3)
Proton «5 ( , JHz ) COSY
2ax 2.73 (dd, J= 11.0, 13.2) 2 eq, 3
2eq 2.26 (bd, J = 13.2) 2 ax, 3
5.13 (brd, J = 11.0) 2eq, 2 ax, 4
3.23 (brd, J = 9.1)
3.87 (brd, J = 9.1)
6 2.15 (m) 7eq, 17b
7ax 0.97 (m) 7eq, 8
7eq 1.45 (m) 7ax, 6
8 1.93 (m) 7ax, 19
9 3.93 (dd, J = 9.7, 4.0) 10
10 5.62 (dd, J = 9.7, 15.2) 9, 11
11 6.55 (dd, J = 15.2, 10.5) 10, 12
12 6.06 (dd, J = 10.5, 15.0) 11, 13
13 5.72 (ddd, J= 15.0, 11.2, 3.6) 12, 14ax, 14eq Proton «5 ( , JHz ) COSY
14ax 2.12 (m) 13, 14eq, 15
14eq 2.47 (m) 13, 14ax
15 5.06 (m) 14ax, 16
16 1.25 (d, J = 5.5) 15
17a 2.32 (dd, J = 3.0, 18.3) 17b
17b 2.82 (bdd, J = 11.1, 18.3) 6, 17a
18 9.65 (s)
19 0.98 (d, J = 6.6) 8
21 2.27 (s)
22 3.52 (s)
Γ 4.42 (d, J = 7.5) 2，
2， 3.50 (dd, J = 7.5, 10.4) l', 3'
3' 2.46 (dd, J = 6.7, 10.4) 2', 4'
4， 3.26 (m) 3'
5， 3.28 (m) 6，
6， 1.19 (d, J = 6.6) 5，
7' , 8' 2.50 (s)
1" 5.06 (d, J = 3.5) ax
2"ax 1.83 (dd, J= 4.0, 14.2) , eq
2"eq 2.00 (brd, J = 14.2) 2"ax
4" 4.61 (d, J = 10.2) 5"
5" 4.44 (dq, J = 10.2, 6.2) 4", 6"
6" 1.13 (d, J=6.2) 5"
7" 1.11 (s)
9" 2.29 (d, J=7.0) 10"
10" 2.14 (m) 9", 11", 12"
11" , 12" 0.97 (d, J=6.6) 10"
1" 4.39 (bd, J = 9.3) ax, eq » ax 1.48 (m) , eq, J eq » eq 1.84 (m) ， ax, j ax j ax 1.43 (m) eq, 5 eq, j eq 1.85 (m) ax, j ax,
4w 2.25 (m) j ax, 5 eq, j
5W 3.40 (dq, J=6.2, 9.3) 4，6
6W 1.20 (d, J = 6.2)
2.21 (s) 表 4.异戊 螺旋霉素 II的核磁共振 13C谱数据 (125MHz, CDC13)
Carbon *5 Carbon *5
1 169.96 2， 71.61
2 37.14 3' 68.71
3 69.10 4， 75.96
4 84.80 5， 72.95
5 77.60 6， 18.98
6 28.86 7' , 8' 41.92
7 30.03 1" 97.04
8 31.97 2" 41.69
9 79.79 3" 69.34 10 126.59 4" 77.00
11 135.41 5" 63.50
12 132.25 6" 17.81
13 131.84 7" 25.34
14 41.02 8" 172.92
15 69.18 9" 43.29
16 20.33 10" 25.52
17 42.42 11" 22.36a
18 201.21 12"
19 15.37 1 " 100.29
20 170.79 2" 31.21
21 21.25 3" 18.47
22 62.45 4" 64.84
Γ 103.74 5" 73.75
6" 18.79
7", 8" 40.66
【实施例 6】异戊酰螺旋霉素 III的鉴定
通过高分辨质谱 （Bruker APEXII, HR— SI— MS) 确证所分离的化合物的分子 量为 982。 异戊酰螺旋霉素 III高分辨质谱图见 （图 10)， 经核磁共振 1H和 13C谱 [Bruker AM500, 溶剂 CDC13， 内标 TMS (四甲基娃烷)]等分析确证， 所分离的化合物的结构为 异戊酰螺旋霉素 III。 异戊酰螺旋霉素 III核磁共振 1H和 13C谱见 （图 11， 12), 核磁共 振 1H和 13C谱数据见 （表 5， 6)。
表 5.异戊酰螺旋霉素 III的核磁共振 1H谱数据 (500MHz, CDC13)
Proton «5 ( , JHz ) COSY
2ax 2.72 (dd, J = 11.0, 13.3) 2 eq, 3
2eq 2.25 (m) 2 ax, 3
3 5.14 (brd, J = 10.8) 2eq, 2ax, 4
4 3.22 (brd, J = 9.1) 5, 3
5 3.83 (brd, J = 9.1) 4
6 2.15 (m) 7eq, 17b
7ax 0.97 (m) 7eq, 8
7eq 1.45 (m) 7ax, 6
8 1.92 (m) 7ax, 19
9 3.96 (dd, J = 9.6, 3.9) 10
10 5.61 (dd, J = 9.6, 15.2) 9, 11
11 6.56 (dd, J = 15.2, 10.5) 10, 12
12 6.05 (dd, J = 10.5, 14.7) 11, 13
13 5.73 (ddd, J= 14.7, 11.3, 3.6) 12, 14ax, 14eq
14ax 2.12 (m) 13, 14eq, 15
14eq 2.47 (m) 13, 14ax
15 5.01 (m) 14ax, 16
16 1.24 (d, J = 6.1) 15
17a 2.30 (m) 17b
17b 2.79 (dd, J = 11.1, 18.2) 6, 17a
18 9.64 (s)
19 0.97 (d, J = 6.5) 8 Proton «5 ( , JHz ) COSY
21a 2.48 (not resolved) 21b, 22
21b 2.58 (dq, J = 7.5, 15.7) 21a, 22
22 1.20 (t, J = 7.5) 21a, 21b
23 3.51 (s)
Γ 4.42 (d, J = 7.8) 2，
2， 3.49 (m) 1 ', 3'
3' 2.45 (m) 2', 4'
4， 3.25 (m) 3'
5， 3.27 (m) 6，
6， 1.19 (d, J = 6.1) 5，
7' , 8' 2.50 (s)
1" 5.05 (d, J = 3.5) 〃 ax
2"ax 1.82 (dd, J= 4.0, 14.1) 1 , eq
2"eq 1.99 (brd, J = 14.1) 2"ax
4" 4.61 (d, J = 10.2) 5"
5" 4.44 (dq, J = 10.2, 6.1) 4", 6"
6" 1.12 (d, J=6.1) 5"
7" 1.10 (s)
9" 2.29 (d, J=7.5) 10"
10" 2.14 (m) 9", 11", 12"
11" , 12" 0.96 (d, J=6.6) 10"
1 " 4.40 (m) ax, eq »
ax 1.49 (m) 1 , eq, J eq »
eq 1.85 (m) 1， ax, j ax j ax 1.42 (m) eq, 5 eq, 4 j eq 1.87 (m) ax, j ax, 4
2.27 (m) j ax, 5 eq, j
3.40 (dq, J=6.2, 9.2) 4，6
1.21 (d, J = 6.2)
2.23 (s) 表 6.异戊酰螺旋霉素 III的核磁共振 13C谱数据 (125MHz, CDC13)
Carbon *5 Carbon *5
1 169.94 2， 71.60
2 37.25 3' 68.73
3 68.73 4， 75.90
4 84.69 5， 72.97
5 77.71 6， 19.00
6 28.93 7' , 8' 41.92
7 30.11 1" 97.02
8 31.85 2" 41.67
9 79.78 3" 69.33
10 126.64 4" 77.00
11 135.29 5" 63.48
12 132.18 6" 17.81
13 131.91 7" 25.32
14 41.03 8" 172.92
15 69.14 9" 43.28
16 20.31 10" 25.52 17 42.46 11" 22.36
18 201.28 12" 22.42
19 15.36 1" 100.09
20 173.85 2" 31.17
21 27.64 3" 18.55
22 8.94 4" 64.85
23 62.39 5" 73.61
Γ 103.88 6" 18.79
7", 8" 40.64
【实施例 7】异戊酰螺旋霉素 I的抗菌活性测定
Α抗细菌活性
1 ) 化合物样品：
化合物 1可利霉素： 批号： 0812512， 效价： 92. 8%， 沈阳同联集团有限公司提供; 化合物 2异戊酰螺旋霉素 I： 批号： 0811214， 效价： 93. 7%， 沈阳同联集团有限 公司提供；
化合物 3异戊酰螺旋霉素 Π : 批号： 0703113， 效价： 93. 7%， 沈阳同联集团有限 公司提供
化合物 4异戊酰螺旋霉素 III： 批号： 0811153， 效价： 91. 9%， 沈阳同联集团有限 公司提供
红霉素： 批号： 0706392， 效价： 91. 6%， 中国药品生物制品检定所；
阿奇霉素： 批号： 0421-9603, 效价： 99. 3%， 中国药品生物制品检定所； 克拉霉素： 批号： 0482-9901， 效价： 90. 4%， 中国药品生物制品检定所。
2 ) 试验菌株：
标准菌株： 肺炎链球菌 ATCC49619;
临床分离革兰阳性菌；
红霉素而描肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae ( 7株)；
红霉素耐药化脓性链球菌 Str印 tococcus pyogenes ( 6株）。
每株细菌在试验前均经过平板转活分纯， 以新鲜菌体用于试验。 每次实验均用 标准菌株作为敏感实验质控菌； 用不含抗菌药物的平皿做为试验菌株生长对照。
3 ) 培养基与孵育条件：
M-H (Muel ler-Hinton)培养基（g/L)：酸水解酪素 17. 5、牛肉浸骨粉 2、淀粉 1. 5、 琼脂 12。肺炎链球菌在血培养基（M-H培养基中加入 5%脱纤维羊血制成）上， 35 °C 5% C02环境 （C02培养箱） 中孵育 20_24h。 化脓性链球菌在血培养基 （M-H培养基中加 入 5%脱纤维羊血制成） 上， 35°C 孵育 20_24h。
4) 最低抑菌浓度 （MIC) 测定：
采用标准平皿二倍稀释法。 被试菌悬液用多点接种仪接种， 每点接种量为 104CFU。 测定各抗菌药物对各种致病菌的最低抑菌浓度。
结果：
在所测定的红霉素耐药链球菌中， 本发明的单组分异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III对 链球菌的抗菌作用 （异戊酰螺旋霉素 I II III单组分化合物对链球菌的抗菌作用均 为 MIC5。0.5mg/L和 MIC9。2mg/L)均比可利霉素更加优越， 同时， 明显强于对照药红霉 素、 阿奇霉素、 克拉霉素 （表 7)。 对于 7株红霉素高耐药肺炎链球菌 （红霉素 MIC 64->256mg/L), 阿奇霉素与克拉霉素也同样表现为高度耐药， 而本发明化合物异戊 酰螺旋霉素 I II III的 MIC值在 0. 25-32mg/L， 低于可利霉素 2_4倍， 低于对照药 8-1024倍 （表 8， 图 13 15和 17)。 对于 6株红霉素低耐药化脓性链球菌 （红霉素 MIC=l-8mg/L), 本发明化合物异戊酰螺旋霉素 I II III的 MIC5。值在 0. 5mg/L， 低于 可利霉素， 优于对照药红霉素、 阿奇霉素、 克拉霉素 2-32倍。 （表 7 9， 图 14 16 和 18)。
表 7.化合物及对照药 MIC结果
Figure imgf000016_0001
表 8.化合物及对照药对 7株红霉素耐药肺炎链球菌 MIC (mg/L) 菌号 化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合物 4 红霉素 阿奇霉素 克拉霉素
1 8 4 4 2 128 >256 128
2 32 32 32 32 256 >256 >256
3 1 0.5 1 0.5 64 128 64
4 64 16 8 16 256 >256 >256
5 16 16 8 16 256 >256 256
6 2 0.25 1 0.25 256 >256 256
7 1 1 1 1 256 512 256 表 9.化合物及对照药对 6株红霉素耐药化脓性链球菌 MIC (mg/L) 化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合
1 0.25 0.25 0.25 0.25 1 4 0.5
2 0.125 0.25 0.25 0.25 1 4 0.5
3 2 2 1 2 4 32 4
4 1 0.5 0.5 0.5 8 16 4 5 2 2 2 2 2 16 1
6 4 2 2 2 2 16 1
B 抗肺炎支原体和肺炎衣原体活性
1. 化合物
化合物 1可利霉素： 批号： 0812512， 效价： 92. 8%, 沈阳同联集团有限公司提供 化合物 2异戊酰螺旋霉素 I： 批号： 0811214， 效价： 93. 7%， 沈阳同联集团有限 公司提供
化合物 3异戊酰螺旋霉素 Π : 批号： 0811214， 效价： 93. 7%， 沈阳同联集团有限 公司提供
化合物 4异戊酰螺旋霉素 III： 批号： 0811214， 效价： 93. 7%， 沈阳同联集团有限 公司提供
红霉素： 批号： 0706392， 效价： 91. 6%， 中国药品生物制品检定所
阿奇霉素： 批号： 0421-9603, 效价： 99. 3%， 中国药品生物制品检定所
2. 肺炎支原体菌种
肺炎支原体菌种 （ATCC— FH)。
3. 肺炎支原体培养基
1. 支原体琼脂培养基： 支原体琼脂基础培养基（Oxoid公司， CM0401 ) 2.84g, 加入超纯水 80ml， 121 °C高压 15min灭菌， 放置在 50°C的水浴中， 加入肺炎支原体 添加剂 （Oxoid, SR0059C) 1瓶 （20ml)， 制备琼脂培养皿。
2. 支原体 PPL0肉汤培养基： 支原体 PPL0肉汤基础培养基 （BD公司） 2. 1 g， 去离子纯净水 70ml， 121 °C、 15min高压灭菌。 冷却至室温后加入冻干肺炎支原体培 养添加物（Oxoid添加物） 1瓶（20ml无菌去离子水溶解）、无菌 50%葡萄糖溶液 2.0ml 禾口 0 .4%的酚红 0.5ml。
4. 肺炎支原体培养
肺炎支原体 FH株接种于含 20ml PPL0 肉汤培养基， 72h收获用玻璃珠刮下， 12000rpm,10min离心沉淀， 弃上清液， 沉淀用 8ml新鲜 PPL0肉汤培养基再悬， 分装 8管冻存 -80°C冰箱。
肺炎支原体 FH接种物滴定
上述制备肺炎支原体 FH接种物培养使用 PPL0肉汤培养基进行 1 : 10、 1： 100 和 1 : 1000稀释后涂布于肺炎支原体琼脂平皿， 37°C5 %C02培养 7天， 在 χ40倍显 微镜下计数。 计算肺炎支原体滴度。
5. 肺炎支原体 MIC的测定
化合物以 16mg/ml溶解于无水乙醇，用支原体 PPL0肉汤培养基以 10倍比稀释。 肺炎支原体接种物加入上述系列稀释的药物管内， 肺炎支原体 FH最终接种浓度为 8.25xl05CFU/ml, 接种后的培养管 （包括对照管） 于 37°C培养并每天观察颜色的变 化。 试验设立：
( 1 )阳性对照：稀释后的肺炎支原体 FH接种物（ 1. 65xl06CFU/ml ) 0. 5ml +PPL0 肉汤培养基 0. 5ml ;
( 2 ) 阴性对照： PPL0肉汤培养基 1ml；
( 3 )无水乙醇杀灭干扰对照：稀释后的肺炎支原体 FH接种物（ 1.65xl06CFU/ml) 0.5ml, PPLO肉汤培养基 0.5ml ， 最终浓度 0.05 %无水乙醇。
当阳性对照管发生明显的颜色改变 （由红色变黄色） 时， 而此时没有发生颜色 改变管的抗生素浓度为最低抑菌浓即 MIC浓度。
7. 肺炎衣原体菌种
肺炎衣原体菌种： CWL-029 (ATCC VR1310)。
8. 肺炎衣原体培养
( 1 ) 细胞培养液： 10 %胎牛血清 （HyClone公司） Dulbecco's MEM ( Sigma公 司） 培养液。
(2)肺炎衣原体培养液： 10 %胎牛血清 Dulbecco's MEM培养液， 含 2 g/ml的 放线菌酮 （Sigma公司）。
( 3 ) BGMK (绿猴肾细胞， Diagnostic HYBRIDS公司） 种植在 96孔细胞培养 板内， 37°C， 5 %C02培养 48小时成为单层细胞。
9. 肺炎衣原体 MIC的测定
化合物以 16mg/ml溶解于无水乙醇， 首先用衣原体培养液以 10倍比稀释， 将浓度为 3.3xl07cfu (包涵体形成单位） /1ml肺炎衣原体接种物 1 : 200稀释， 最终 浓度为： 1.65xl05cfu/lml， 吸去 96孔培养板内的细胞培养液， 然后按 0.1 ml/孔进行接种。 菌种接种完毕离心 96孔细胞培养板， 使用 Beckman-Coulter公司的 J-6MC 离心机， 离 心力 xl500g， 离心温度 35°C， 离心时间 60min。
设立对照
( 1 ) 阳性对照： BGMK细胞， 稀释的肺炎衣原体 CWL-029菌种。
(2) 阴性对照： BGMK细胞， 肺炎衣原体培养液。
( 3 ) 药物对照： BGMK细胞， 最高稀释浓度 (8μ§/ηι1) 的化合物， 最终浓度 0.05
%无水乙醇。
离心完毕后， 吸去肺炎衣原体接种物， 分别加入系列稀释的化合物 0.1ml/孔。 37 。C , 5 %C02培养 72min。 培养完毕， 吸取抗生素药物溶液， PBS ( 0.01M, pH 7.4)洗 涤 2次， 100 %无水乙醇固定 15min。
间接免疫荧光染色鉴定： 肺炎衣原体单克隆抗体， 50μ1/孔， 37 °C湿盒内温育 30min， 然后洗板机洗板 4次， 再加入兔抗鼠荧光抗体 （Sigma公司）， 50μ1/孔， 同 样方法及条件温育及洗板。 加入封片甘油， ΙΟΟμΙ/孔， 在 01ympUsX71倒置荧光显微 镜下观察
MIC的定义： 96孔试验板中肺炎衣原体包涵体生长完全被抑制孔 （全孔未发现 荧光染色的包涵体） 的最小抗生素稀释浓度。
10. 结果：
在所测定的抗肺炎支原体活性中的异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III的活性显著强于 可利霉素， 并明显优于对照药。 对肺炎衣原体的活性异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III与 可利霉素相当， 优于红霉素。
表 10.化合物对肺炎支原体 /衣原体活性 ^g/ml)
菌号 化合物 1 化合物 2 化合物 3 化合物 4 红霉素 阿奇霉素 肺炎支原体 0.125 0.032 0.032 0.032 > 5 0.25 肺炎衣原体 0.064 0.064 0.064 0.064 0.5 0.064
【实施例 8】异戊酰螺旋霉素 I药物制剂的制备
本发明可以将异戊酰螺旋霉素 I单组分作为活性成分， 与药学上可接收的载体 制备成临床可用的各种剂型。 如注射剂： 分别将异戊酰螺旋霉素 I (简称原料） 100 -500mg与溶剂己二酸 18— 90mg或枸橼酸 26— 130mg或马来酸 14一 70mg等摩尔混 合均匀后溶解于 1一 5ml水中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4.6-5.6之间。 再加入 甘露醇 30-150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏 松块状物， 使用前用 2— 10ml无菌水溶解。
【实施例 9】异戊酰螺旋霉素 II药物制剂的制备
本发明可以将异戊酰螺旋霉素 II单组分作为活性成分， 与药学上可接收的载体 制备成临床可用的各种剂型。 如注射剂： 分别将异戊酰螺旋霉素 II (简称原料） 100 -500mg与溶剂己二酸 18— 90mg或枸橼酸 26— 130mg或马来酸 14一 70mg等摩尔混 合均匀后溶解于 1一 5ml水中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4.6-5.6之间。 再加入 甘露醇 30-150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏 松块状物， 使用前用 2— 10ml无菌水溶解。
【实施例 10】异戊酰螺旋霉素 III药物制剂的制备
本发明可以将异戊酰螺旋霉素 III单组分作为活性成分， 与药学上可接收的载体 制备成临床可用的各种剂型。 如注射剂： 分别将异戊酰螺旋霉素 III (简称原料） 100 -500mg与溶剂己二酸 18— 90mg或枸橼酸 26— 130mg或马来酸 14一 70mg等摩尔混 合均匀后溶解于 1一 5ml水中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4.6-5.6之间。 再加入 甘露醇 30-150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏 松块状物， 使用前用 2— 10ml无菌水溶解。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种含有异戊酰螺旋霉素 I II或 III化合物的药物组合物， 其特征在于， 所 述异戊酰螺旋霉素 I II或 III化合物具有以下结构式：
Figure imgf000020_0001
其中： R=H， R' =C0CH2CH (CH3) 2；
或1^=(：0( ¾， R' =C0CH2CH (CH3) 2 ；
或1^=(：0(¾(¾， R' =C0CH2CH (CH3) 2。
2、 一种权利要求 1所述的药物组合物的制备方法， 其特征在于， 该方法包括将 异戊酰螺旋霉素 I II或 III化合物和药学上可接受的载体混合的步骤。
3、 根据权利要求 2所述的制备方法， 其特征在于， 所述异戊酰螺旋霉素 I II 或 III化合物的分离制备方法包括粗分离、 高效纯化和后处理的步骤。
4、 根据权利要求 3所述的制备方法， 其特征在于， 所述的粗分离为： 采用硅胶 柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂进行洗脱， 收集洗脱液， 浓縮至干， 得 粗分离样品。
5、 根据权利要求 4所述的制备方法， 其特征在于， 所述的洗脱为分别采用三倍 柱体积的体积比 3 : 1的乙酸乙酯 /甲醇溶液和三至五倍柱体积的体积比 1 : 1的乙酸乙 酯 /甲醇溶液进行洗脱。
6、根据权利要求 4所述的制备方法，其特征在于，所述的收集为收集体积比 1： 1 的乙酸乙酯 /甲醇部分。
7、 根据权利要求 3所述的制备方法， 其特征在于， 所述的高效纯化为： 采用制 备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 0DS作为色谱填料， 用乙腈和醋酸氨 缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 并对异戊酰螺旋霉素 I II或 III目标峰进行收集。
8、 根据权利要求 7所述的制备方法， 其特征在于， 色谱条件如下：
仪器： 工业级制备色谱， 主要部件包括二元梯度泵， 紫外检测器和色谱工作站； 色谱柱： 0DS制备色谱柱， 70i. d. χ380 10μ;
流动相 A: 25%乙腈，
流动相 B: 75%100mM NH^c水溶液；
梯度条件： 采用线性梯度；
流速： 260 mL/min; 进样量： 10mL; 进样浓度： 0. 5g/mL; 检测波长： 231nm; 收集方式： 紫外触发收集；
分别按照异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT40. 88， 异戊酰螺旋霉素 II的保留时 间 RT43. 34或异戊酰螺旋霉素 I I I的保留时间 RT48. 009收集样品。
9、根据权利要求 3-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的后处理为： 将收集的样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 接着用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 然后用旋转 蒸发除去萃取液中的乙酸乙酯， 得膏状样品； 再用石油醚重溶所得样品， 最后用旋 转蒸发除去石油醚， 分别获得异戊酰螺旋霉素 I II或 III白色粉末状固体。
10、 权利要求 1所述的药物组合物或权利要求 3-9任意一项所述的制备方法所 得的异戊酰螺旋霉素 I II或 III在制备抗感染药物中的应用。
11、权利要求 1-10任意一项所述的异戊酰螺旋霉素 I II或 III的分离制备方法， 其特征在于， 该方法包括如下粗分离、 高效纯化和后处理。
12、 根据权利要求 11所述的分离制备方法， 其特征在于， 所述的粗分离为： 采 用硅胶柱层析方法， 以乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂进行洗脱， 收集洗脱液， 浓縮至 干， 得粗分离样品。
13、 根据权利要求 12所述的分离制备方法， 其特征在于， 所述的洗脱为分别采 用三倍柱体积的体积比 3 : 1的乙酸乙酯 /甲醇溶液和三至五倍柱体积的体积比 1 : 1的 乙酸乙酯 /甲醇溶液进行洗脱。
14、 根据权利要求 12所述的分离制备方法， 其特征在于， 所述的收集为收集体 积比 1 : 1的乙酸乙酯 /甲醇部分。
15、 根据权利要求 11所述的分离制备方法， 其特征在于， 所述的高效纯化为： 采用制备型高效液相色谱对粗分离样品进行纯化， 以 0DS作为色谱填料， 用乙腈和 醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 并对异戊酰螺 旋霉素 I II或 III目标峰进行收集。
16、 根据权利要求 15所述的分离制备方法， 其特征在于， 色谱条件如下： 仪器： 工业级制备色谱， 主要部件包括二元梯度泵， 紫外检测器和色谱工作站； 色谱柱： 0DS制备色谱柱， 70i. d. χ380 10μ;
流动相 A: 25%乙腈，
流动相 B: 75%100mM NH^c水溶液；
梯度条件： 采用线性梯度；
流速： 260 mL/min; 进样量： 10mL; 进样浓度： 0. 5g/mL; 检测波长： 231nm; 收集方式： 紫外触发收集；
分别按照异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT40. 88， 异戊酰螺旋霉素 I I的保留时 间 RT43. 34或异戊酰螺旋霉素 I I I的保留时间 RT48. 009收集样品。
17、 根据权利要求 16所述的分离制备方法， 其特征在于， 所述的后处理为： 将 收集的样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 接着用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 然后用旋转蒸 发除去萃取液中的乙酸乙酯， 得膏状样品； 再用石油醚重溶所得样品， 最后用旋转 蒸发除去石油醚， 获得异戊酰螺旋霉素 I II或 III白色粉末状固体。
18、 含有权利要求 11-17任意一项所述的分离制备方法所得的异戊酰螺旋霉素 I II或 III的药物组合物。
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