KR20200112897A

KR20200112897A - mTOR 억제제, 약물 조성물 및 이의 응용

Info

Publication number: KR20200112897A
Application number: KR1020207023821A
Authority: KR
Inventors: 밍위 시아; 시아오펑 자오; 쉰레이 지앙; 쉰동 지앙
Original assignee: 쉔양 푸양 파마슈티컬 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-10-05
Also published as: US20200405739A1; EP3741374A1; RU2020126432A3; CN110051845A; AU2019209738A1; WO2019141254A1; JP7127136B2; MX2020007625A; RU2020126432A; RU2768583C2; JP2021516663A; CA3088818A1; EP3741374A4

Abstract

mTOR 억제제, 약물 조성물 및 이의 응용. 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성이 포함된다. 이의 약물 조성물은 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물을 제2 활성 성분으로 더 포함할 수 있다. mTOR 억제제는 mTOR 통로 관련 질병의 세포에 뚜렷한 억제 작용이 있으며, mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에 사용된다.

Description

mTOR 억제제, 약물 조성물 및 이의 응용

본 발명은 약물 분야에 관한 것으로, 구체적으로, mTOR 억제제, 약물 조성물 및 이의 응용에 관한 것이다.

종양은 흔하고 자주 발생하는 질병의 일종으로, 체내와 체외의 각종 종양 형성 요인의 장기적인 영향을 받은 신체의 조직 세포에, 유전자 돌연 변이가 발생하여 정상적인 성장과 분화 조절 능력을 상실하고, 클론성 비정상적 증식 및 분화에 의해 형성된 신생물 또는 증식물이다. 종양은 양성 종양 및 악성 종양으로 분류되며, 악성 종양은 또 상피 조직에서 발생하는 암, 간엽 조직에서 발생하는 육종 및 암육종을 포함하여 총 3가지로 세분할 수 있다. 대중들이 말하는 “암”은 일반적으로 모든 악성 종양을 가리킨다.

악성 종양은 인류 건강을 위협하는 주된 악성 질환 중 하나이며, 현재 전세계 인구의 사망 원인 중 1위이다. 최근 통계 데이터에 따르면, 2007년 전세계 약 790만 명이 다양한 유형의 암으로 사망하였고, 이는 총 사망자수의 13%를 차지하며, 1,200만 건을 초과하는 종양 발병 사례가 진단되었고, 그 중 72% 이상의 종양 환자 및 사망 사례가 저개발국가에서 발생하였으며, 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있다. 2015년 전세계 종양 사망자가 900만 명으로 늘어났으며, 2030년에는 1,200만 명을 넘어설 것으로 예상되며; 현재, 중국의 연간 암 발병자는 약 280만 명이며, 그 중 사망자는 40만 명을 초과하여, 중국에서 질병별 사망 원인 중 1위가 되었으며, 지속적으로 증가하는 양상을 보이고 있다. 현대 사회의 생활 리듬이 빨라지고, 경쟁 스트레스가 커지며, 인류 생활 방식 및 환경이 변화함에 따라, 종양의 발병률 및 사망자수는 해마다 증가하고 있으며, 현대 사회에서 흔한 발병과 높은 발병율로, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 줄 뿐만 아니라, 가정과 사회에 무거운 경제적 정신적 부담을 주고 있으며, 전세계를 괴롭히는 중대한 사회적 문제가 되었는바, 암의 치료 및 예방은 전세계적으로 해결이 가장 시급한 문제 중 하나이다.

포유류 라파마이신 표적 단백질(mammalian target ofrapamycin, mTOR)은 비정형 세린/트레오닌 단백질 키나아제이며, 포스포이노시타이드-3-키나아제 (phosphoinositide 3 kinase, PI3K) 관련 단백질 키나아제 그룹 중 하나이다. mTOR는 생체 내에서 mTORC1 및 mTORC2인 2종류의 복합체 형태로 존재한다. mTOR는 영양, 에너지 및 성장인자와 같은 다양한 세포 외 신호를 통합하고, 유전자 전사, 단백질 번역, 리보솜 합성 및 세포 골격 합성과 같은 생물학적 과정에 참여하며, 세포의 성장, 증식, 사멸 및 대사에서 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다. 신호 경로 활성화의 초기 작용 인자는 주로 아미노산, 다양한 성장 인자 및 저산소증 등이다. mTOR는 생체 내에서 mTORC1 및 mTORC2인 2종류의 복합체 형태로 존재한다.

PI3K/AKT/mTOR 통로는 포유류의 세포 활동을 조절하는 신호 통로이며, 이 통로는 세포의 생존, 성장 및 증식에 큰 의미가 있다. 중요한 미토겐(인슐린, 호르몬, 성장 인자 등)은 세포막에서 세포질의 일측에 가까운 분자를 활성화시켜, mTOR 통로 중의 중요 분자인 PI3K를 활성화시킨다. 활성화된 PI3K는 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 디 포스페이트(PIP2, phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate)에서 포스파티딜 이노시톨 -3,4,5- 트리포스페이트(PIP3, phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphate)로의 전환을 촉진하며, 후자는 Akt의 PH 도메인에 결합하며, 동시에 다른 키나아제에 의한 Akt의 인산화를 동반하며, 궁극적으로 결절성 경화증 복합체 1 및 2(TSC1/2, tuberous sclerosis complex 1 and 2)가 PRAS40 (proline rich AKT substrate 40000)을 탈중합 및/또는 인산화하여, mTORC1을 상향 조절하도록 한다. PI3K/AKT/mTOR 신호 경로의 이상은 비소세포 폐암, 자궁내막암 및 자궁경부암 등을 포함하는 다양한 종양 유형에서 자주 발생한다.

또한, 가타 환경 스트레스 요인도 mTOR 신호 경로를 조절할 수 있다. 예를 들어, 세포 대사에 필수적인 산소의 장기 부족은, 에너지 결핍으로 이어지고, 이는 세린/트레오닌 키나아제 간 키나아제 B1(LKB1, liver kinase B1) 또는 AMPK가 mTORC1 억제를 매개하는 것을 돕는다. 에너지의 공급은 mTOR 활성의 중요한 조절 요인이다. AMP 활성 단백질 키나아제(AMPK, AMP-activatedprotein kinase)는 mTORC1의 “에너지 센서”로 작용할 수 있다. 에너지가 부족하면, 세포 내의 AMP 수준이 상승하고, AMPK에 결합하며, 업 스트림 키나아제를 통해 AMPK를 활성화한다. AMPK는 활성화되면, TSC2를 인산화시키고, 생산성의 분해 과정을 증가시키고, 단백질 합성과 같은 에너지 소비 합성 과정을 감소시킬 수 있다.

mTORC1 활성화의 가장 중요한 특징은 단백질 합성이다. mTORC1은 리보솜 단백질 S6 키나아제 1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1, S6K1)의 소수성 그룹 Thr389를 직접 인산화하여, PDK1에 작용함으로써 후속 단백질을 인산화시킨다. S6K1의 인산화는 다운 스트림의 여러 기질을 활성화시켜 eIF4F, 하나의 eIF4F 복합체의 포워드 레귤레이터를 포함한 mRNA 번역의 개시를 촉진한다. mTORC1은 다운 스트림의 진핵 번역 개시 인자 결합 단백질(eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1, 4E-BP1)을 직접 인산화하며, 4E-BP1 인산화는 이것이 캡 결합 단백질 eIF4E에 결합하는 것을 방지하여, 캡 단백질의 의존적 번역을 개시하는데 필요한 eIF4F 복합체의 형성에 참여할 수 있게 한다. S6K1 및 4E-BP1의 인산화는 mRNA의 번역을 활성화시켜, 다양한 이펙터의 활성 수준을 증가시킨다. mTORC1은 mRNA의 번역에 매우 중요한 의미를 가지며, mTOR의 활성 부위 억제제는 mTORC1의 기능을 완전히 억제하여, 세포에서의 단백질 합성을 감소시킬 수 있다. mTORC1은 단백질 합성 조절 외에도, 세포막에 필요한 지질 합성을 제어하며, 동시에 세포 대사 및 ATP 합성을 능동적으로 조절한다.

mTORC2는 mTOR, mLST8, Deptor, Rictor(rapamycin-insensitive companion of mTOR), 포유류 스트레스 활성화 단백질 키나아제 상호 작용 단백질 1(mammalian stressactivated protein kinase interacting protein 1, mSIN1) 및 Protor 1/2(protein observed with Rictor-1/2)로 조성된다. mSIN1 및 단백질 키나아제 C-α(PKCα)를 통해 액틴의 조절 및 세포 골격의 형성에 참여할 수 있다. mTORC2의 높은 발현은 세포 생존을 촉진할 수 있는 반면, 낮은 발현은 세포 사멸을 유도할 수 있다.

mTORC2 통로의 핵심 단계는 단백질 포스타파제(PTEN, phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome 10)를 통해 PIP2에서 PIP3으로의 변환을 조절하고 억제하는 것이다. mTORC1은 리보솜 생합성을 활성화시키고, 매개형 자가포식 리보솜 회전율을 억제함으로써 mTORC2를 간접적으로 활성화시킬 수 있다. mTORC2의 활성화는 Akt 473 세린(Ser473)의 인산화를 유발할 수 있으며, Akt 활성화는 SIN1-T86의 인산화를 추가로 유도하며, mTORC2의 활성이 증가되어, mTORC2가 포워드 루프를 형성하도록 하며, 반면에 TSC1/2 복합체의 억제 과정에서는 해당 과정을 약화시킨다.

다양한 인체 종양에서, mTOR는 모두 비정상적으로 활성화된다. mTOR 억제제를 사용하여 폐암, 유방암, 췌장암, 위암, 흑색종, 신경교종, 간암 등 다양한 종양 세포에서 PI3K/Akt/mTOR 신호 경로의 비정상적인 활성화를 효과적으로 억제하여, 종양 세포 이동, 침입 및 상피 중간엽 전이를 억제할 수 있다. 다수의 암 환자는 PI3K/AKT/mTOR 경로 및 Ras/Raf/MEK/ERK 경로를 포함하는 mTORC1의 업 스트림 발암 통로에 돌연변이가 있으며, 상기 두 경로의 돌연변이는 mTORC1의 과도한 활성화를 유발한다. 또한, 통상적인 종양 억제제 인자인 TP53 및 LBK1은 mTORC1의 업 스트림 TSC1 및 TSC2의 음성 조절제이다. mTORC1의 다운 스트림도 종양의 발생에 참여하며, eIF4E 및 S6K1 유전자와 단백질의 과발현은 많은 암에 존재하며, 그 중에서 4E-BP1의 인산화가 가장 핵심적이며, 일부 AKT 및 ERK 구동 종양 세포주는 모두 4EBP의 인산화에 의존하며, mTOR 억제제는 4EBP와 eIF4E의 발현 비율을 변화시킬 수 있으며, 이러한 세포의 증식에 대해 비교적 강력한 억제 효과를 가진다.

mTORC2 신호도 암과 관련되며, 주로 Akt를 활성화 시키는 작용으로 인하여, 활성화 된 Akt는 포도당 흡수 및 해당 분해와 같은 증식 과정을 촉진하며, 동시에 세포 사멸을 억제한다. 실제로, 일부 PI3K/Akt가 유도하는 종양도 mTORC2의 활성에 의존하며, 전립선암 마우스 모델에 PTEN이 결여될 경우, 인간 전립선암 세포주에서도 PTEN은 결여된다.

PI3K/AKT/mTOR 신호 전달 경로 활성화는 다양한 자극에 의해 유도된 세포 사멸을 억제하고, 세포주기 진행, 세포 생존 및 증식을 촉진하며, 동시에 혈관 형성, 종양 침습 및 전이에 참여하며, 종양 형성 과정에서 중요한 역할을 수행할 수 있다. AKT는 복수 개의 사멸 관련 단백질을 조절하여 세포 사멸을 억제하며, AKT의 과발현은 세포 사멸 단백질 억제 인자1(Dap-1)의 발현을 증가시켜 세포 사멸을 억제하는 작용을 할 수 있다. AKT는 mTOR 및 이의 다운 스트림 분자인 S6K1 및 4E-BP1의 인산화를 통해, 생존 신호를 하향 전달하고, P53 비의존적 세포사멸을 억제하고, 세포 생존을 촉진할 수도 있다. 최근들어, 다양한 종양에서 발견한 바에 따르면, eIF-4E에는 체외에서 세포 전환 및 항세포사멸 활성이 있으며, eIF-4E의 과발현은 세포를 특정 사멸 효과로부터 보호할 수 있다.

세포외 조절 키나아제(extracellular regulated protein kinases, ERK)에는 ERK1 및 ERK2가 포함되며, 이는 신호를 표면 수용체에서 핵으로 전송하는 핵심이다. 인산화에 의해 활성화된 ERK1/2는 세포질에서 핵으로 전위되며, 나아가 Elk-1, ATF, Ap-1, c-fos 및 c-Jun의 전사 활성화를 매개하여, 세포 증식 및 분화, 세포 형태 유지, 세포 골격 구축, 세포 사멸 및 세포의 전암 등 과정에 참여하며, ERKs는 세포의 증식, 분화 및 생존을 조절하며, 다양한 성장 인자(EGF, NGF, PDGF 등)의 다운 스트림 단백질이며, ERK 및 이들의 신호 경로는 종양 침입 및 전이 과정에서 신호를 매개하고 증폭시키는 역할을 하며, 한편으로 성장 인자, 미토겐, 환경 스트레스 등으로부터 많은 신호를 수신하며, 다른 한편으로 ERK 신호 캐스케이드 반응을 통해 AP-1, NF-㎊B 등 핵 전사 인자에 작용하여, 유전자 발현을 조절한다. 인류의 여러 가지 암(예를 들어 구강암, 흑색종, 유방암 등)에서 모두 ERK의 과도한 활성화가 발견되었다. 이의 전형적인 경로는 Ras/Raf/MER/ERK이다.

주목할만한 것은, PI3K/AKT/mTOR 및 ERK/MAPKs 신호 통로 사이에는 다중 누화 현상이 존재하여 복잡한 상호 작용이 형성된다. 이 두 개의 통로 사이의 상호 작용은 서로를 억제하거나, 서로를 활성화시키는 것일 수 있다. PI3K/AKT/mTOR 및 ERK/MAPKs 신호 통로는 종양 세포의 성장, 증식, 분화, 침습, 전이 및 약물 내성에 중요한 역할을 하며, 이의 기능과 조절 메커니즘이 매우 복잡하므로, 이러한 경로 중 하나를 억제한다고 하여 이상적인 치료 효과를 얻을 수 있는 것이 아니며, 주된 이유는 그들 사이에 복잡한 크로스 토크 관계가 형성되기 때문이다.

라파마이신 및 이의 유도체인 "라파로그"와 같은 mTOR 억제제는, mTORC1을 특이적으로 억제 하고, 다양한 종양 세포의 성장에 대해 농도 및 시간 의존적 억제 효과를 가지며, 화학 요법 약물에 대한 종양 세포의 민감성을 증가시키며, 사멸의 발생을 유도하며, 동시에 시너지 효과를 생성한다.

캐리마이신(Carrimycin)은 비테스피라마이신(Bitespiramycin), 셍지마이신 (Shengjimycin)으로도 불리며, 중국의학과학원 생명공학 연구소가 본 출원인과 함께, 유전자변형 기술에 의해 카보마이신 생성균의 4" 이소발레릴 전이효소 유전자(4"-o-acyl-transferase)를 스피라마이신 생성균에 클론 발현하고, 스피라마이신 4"-OH를 정향 아실화하고, 4"-에 이소발레릴 측쇄를 첨가하여 형성한 4"-이소발레릴 스피라마이신을 주요 조성 성분으로 하는 신형 항생제이다.

식(I)

캐리마이신은 다양한 스피라마이신 파생물로 조성되며, 주요 활성 성분인 이소발레릴 스피라마이신(I+II+III)의 총함량은 60% 이상이고, 아실화 스리라마이신의 총함량은 80% 이상이며, 약학적으로 허용 가능한 약학 조성물이다. 중심 구조는 16 원자 락톤 고리이며, 1개의 포로사민(Forosamine) 분자, 1개의 미카미노즈(mycaminose) 분자 및 1개의 미카로즈(Mycarose) 분자와 연결되며, 주요 성분인 이소발레릴 스피라마이신I, II, III의 구조와 스피라마이신 구조의 차이점은 미카로즈 4"-에 연결된 라디칼은 하이드록실이 아닌 이소발레릴인 것에 있다. 화학구조는 식(I)에 나타낸 바와 같이, 10가지가 넘는 조성 성분을 포함한다. 현재 캐리마이신 최종 생성물의 조성 기준은 이소발레릴 스피라마이신III≥30%, 이소발레릴 스피라마이신I, II, III 의 비율≥60%, 총 아실화 스피라마이신의 비율≥80%, 기타 알 수 없는 조성의 총 합≤5%이다.

캐리마이신은 16 원자 마크로라이드계 항생제이며, 자유라디칼인 카르복실기, 알콕시기, 에폭시기, 케톤기, 알데하이드기 및 한쌍의 공액 C=C를 가지며, 분자량은 약 884~982이다. 유사한 화학 구조로 인해, 캐리마이신은 마크로라이드계 항생제와 많은 공통점을 가지며, 에스테르, 아세톤, 클로로포름, 알코올 등과 같은 다수의 유기 용제에 쉽게 용해되고, 석유 에테르에 약간 용해되며, 물에 용해되기 어렵고; 분자 구조는 2개의 디메틸아민기를 함유하고 있어 약 알칼리성이며, 산성 수용액에 잘 용해되며; 온도가 상승함에 따라 용해도는 감소하는 "음의 용해도" 특성을 가진다. 캐리마이신의 주성분인 이소발레릴 스피라마이신 4"- 탄소 사슬은 비교적 길기 때문에, 친수성이 떨어지고, 이의 수중 용해도는 스피라마이신 및 4"- 아세틸 스피라마이신보다 낮다.

캐리마이신은 백색의 비결정 분말이며, 약간의 흡습성을 지니며, 비선광도는 약 -80.8°이고, 자외선의 최대 흡수 파장은 231~232nm이며, 자체적으로 약간의 형광 발색 라디칼을 가지고 있기 때문에, 진한 황산 또는 염산과 만나면 자색을 보이는 반응이 일어나고, 강한 자색 형광이 나타나며, 231~232nm 지점에서 최대 흡광도를 가진다. 이 약물은 친지성이 좋고, 조직 삼투력이 강하며, 내복 흡수력이 빠르고, 체내에서 유지되는 시간이 길며, 지속적인 항생제 지발효과가 있다. 약효와 화학 배위의 관계에 따르면, 마크로라이드계 항생제 4"-가 아실화된 후, 이의 친지성 및 체내 활성은 향상되고, 체내 항균 활성과 임상 치료 효과 모두 현저하게 향상되며, 체내에서 항생제의 안정성이 4" 하이드록시 에스테르의 탄소 사슬 증가에 따가 강화되었으며, 즉 이소발레릴 스피라마이신 ＞ 부티릴 스피라마이신 ＞ 프로피오닐 스피라마이신 ＞ 아세틸 스피라마이신이다.

초보적인 체내 체외 테스트 결과에 따르면, 이 약물은 다수의 G+균에 대해 비교적 좋은 항균 활성을 보일 뿐만 아니라, 일부 G-균에도 일정한 작용을 하며, 각 항 기술적 스펙이 아지트로마이신, 에리트로마이신, 아세틸 스피라마이신 및 메디마이신보다 현저하게 우수하며, 특히 폐렴 마이코프라즈마에 대한 항균 활성이 제일 강하며, 에리트로마이신 약제에 내성이 있는 균, 네이세리아 고노로이애, 폐렴구균, 황색포토상구균, 녹농균, 인플루엔자 바실러스, 헤모필루스 인플루엔자, 박테로이데스 프라길리스, 레지오넬라, 박테로이데스 테타이오타오미크론 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대해서도 일정한 항균 활성을 가지며, 임상적으로 에리트로마이신에 내성을 가지는 황색포도상구균에 대해서 극히 적은 교차내성만 가진다. 캐리마이신은 주로 그람양성균의 감염성 질병 치료에 사용되며, 특히 기관지 감염 치료에 적용될 것이며, 비뇨기 계통의 감염 등에 사용될 수도 있다.

약물동력학 연구 결과에 따르면, 캐리마이신에서 활성을 가지는 유효 조성 성분은 이소발레릴 스피라마이신I, II, III이다. 캐리마이신은 체내에 유입된 후 아주 빠르게 스피라마이신으로 대사되며, 모약물인 이소발레릴 스피라마이신I, II, III 및 활성 대사 산물인 스피라마이신 I, II, III의 합으로 계산하면, 이를 경구 투여 시, 절대생체이용률 평균은 91.6%이다. 문헌 보도에 따르면, 스피라마이신의 인체 경구 투여 시, 절대생체이용률은 30-40%이다[Frydman AM et al J Antimicrob Chemother. 1988，22(suppl B):90-103]. 이는 이소발레릴 스피라마이신의 구조가 활성성분인 스피라마이신의 생체이용률을 현저하게 개선하였음을 설명한다. 일회성으로 복용한 캐리마이신의 제거는 비교적 느리며, T1/2β는 23-27시간 사이이다.

본 출원인은 최근의 연구를 통해 놀랍게도 캐리마이신, 캐리마이신 중의 단일 활성 성분 또는 조성에는 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로의 단백질을 억제하는 효과가 있어, mTOR 억제제로 사용될 수 있으며, PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 관련 질병에 치료 효과 있음을 발견하였으며, 이는 중요한 경제 및 사회적 효과를 가진다.

이를 고려하여 본 발명이 제안된다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 종래 기술의 단점을 극복하고, mTOR 억제제, 약물 조성물 및 이의 응용을 제공하는 것이다. 본 발명에서 제공되는 mTOR 억제제는 mTOR 통로 관련 질병의 세포에 뚜렷한 억제 작용이 있으며, mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물 제조에서의 응용 및 임상 보급에 이론적 근거를 제공하였으며, 중요한 경제 및 사회적 효과를 가진다.

상술한 기술문제를 해결하기 위해, 본 발명에서 채용하는 기술방안의 기본 구상은 다음과 같다:

본 발명은 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성을 포함하는 mTOR 억제제를 제공하는 것을 첫 번째 목적으로 한다.

캐리마이신은 복수의 활성 성분의 혼합물이며, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 이 3가지 활성 성분 이외에도, 기타 불순물을 더 포함한다.

캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 이 네 가지는 모두 독립적으로 mTOR 억제제로 사용될 수 있다. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III은 임의로 조성하여 사용할 수도 있다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중 단백질의 다른 자리 입체성 억제제 또는 촉매 억제제이다.

추가 방안으로, 상기 촉매 억제제는 AKT 억제제와 같은 키나아제 억제제이다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTORC1 및 mTORC2의 활성화를 억제하며;

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 항암 약물, 및/또는 당뇨병 치료 약물, 및/또는 알츠하이머 치료 약물, 및/또는 노화 완화 약물이다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 항암 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 당뇨병 치료 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 알츠하이머 치료 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

추가 방안으로, 상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 노화 완화 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

본 발명은 약물 조성물을 제공하는 것을 두 번째 목적으로 하며, 상기 약물 조성물에는 상기 어느 방안의 mTOR 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체;가 포함되며,

바람직하게는, mTOR 억제제의 용량은 1~10000mg/kg; 바람직하게는 10~5000mg/kg; 바람직하게는 50~1000mg/kg; 더 바람직하게는 100~500mg/kg이다.

다른 방안으로, 약물 조성물을 제공하며, 상기 약물 조성물에는 제1 활성 성분 및 제2 활성 성분이 포함되며, 상기 제1 활성 성분에는 상기 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 제2 활성 성분에는 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물이 포함된다.

나아가, 복합제제를 제조할 경우, 제1 활성 성분과 제2 활성 성분의 용량 비율은 1~99: 99~1이며, 바람직하게는 5~95: 95~5, 더 바람직하게는 10~90: 90~10, 보다 더 바람직하게는 20~80: 80~20이다.

추가 방안으로, 상기 약물 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 임의의 제형이 포함되며; 바람직하게는, 제형에는 산제, 정제, 과립제, 캡슐, 용액제, 유제, 현탁제가 포함된다.

본 발명에서, 상기 mTOR 억제제 중의 활성 성분인 이소발레릴 스피라마이I은 기존 기술의 방법에 기초하여 분리 제조하여 얻을 수 있으며, 예를 들면 CN101785778A의 실시예 1의 방법에 따라 분리 제조하여 얻을 수 있다.

본 발명의 세 번째 목적은 조합 제품을 제공하는 것이며, 상기 조합 제품에는 제1 약제가 포함되며, 상기 제1 약제에는 상기 mTOR 억제제 또는 상기 약물 조성물이 포함된다.

추가 방안으로, 상기 조합 제품에는 제2 약제가 더 포함된다.

추가 방안으로, 상기 제2 약제에는 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물이 포함된다.

해당 방안에서 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물은 이와 같은 질환을 치료하는 주요 약물을 의미하며, 예를 들어, 당뇨병과 관련하여, 제2 약제는 인슐린 및 이의 유사체, 설포닐우레아, 메트포르민, α- 글루코시다제 억제제, 티아졸리 딘디온 유도체 증감제, 페나닐산 유도체 분비촉진제, GLP-1 수용체 작용제, DPP-4 효소 억제제 및 중약제제일 수 있다.

조합하여 약물을 투여할 경우, 제1 약제와 제2 약제의 용량 비율은 1~99: 99~1이며, 바람직하게는 5~95: 95~5, 더 바람직하게는 10~90: 90~10, 보다 더 바람직하게는 20~80: 80~20이다.

조합하여 약물을 투여할 경우, 제1 약제와 제2 약제의 투여 순서에는 제한이 없으며, 제1 약제를 먼저 투여할 수 있고, 제2 약제를 먼저 투여할 수도 있으며, 두 가지 약제를 동시에 투여할 수도 있다.

본 발명의 네 번째 목적은 항암 약물을 제공하는 것이며, 상기 항암 약물에는 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성;이 포함되며,

바람직하게는, 상기 mTOR 억제제는 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중 단백질의 다른 자리 입체성 억제제 또는 촉매 억제제이며;

바람직하게는, 상기 촉매 억제제는 키나아제 억제제이며;

바람직하게는, 상기 mTOR 억제제는 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제한다.

세포 증식, 세포 주기, 단백질 합성, 세포 이동 등과 같이 종양과 밀접하게 연관된 많은 세포 기능은 모두 mTOR에 의해 제어된다. 유방암, 전립선암 및 폐암과 같은 많은 종양이 mTOR 신호 통로의 비정상적 조절을 갖는 것으로 밝혀졌다. 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종은 mTOR 억제제로 조성되어, mTORC1의 활성을 억제하며, 나아가 이의 다운 스트림에 영향을 주며, mTORC1에 의해 제어되는 표적 분자인 p70S6K, ATG13, 4EBP1, HIF-1, PGC-1α, PPARr 등에 영향을 준다. mTORC1의 활성이 감소하면, p70S6가 음성 조절되고, 세포 성장이 정체되며, ATG13이 더 이상 억제되지 않아, 세포사멸 및 자가포식 작용이 촉진된다. 본 발명의 억제제는 세포 주기 정체를 일으키는 것 이외에도, 사멸 및 자가포식 작용에 의해 암 세포의 사멸을 일으킬 수 있다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 당뇨병 치료 약물을 제공하는 것이며, 당뇨병 치료 약물에는 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성;이 포함되며,

바람직하게는, 상기 촉매 억제제는 키나아제 억제제이며;

또한, mTOR는 다양한 기능성 복합체(mTORC1 및 mTORC2)를 형성하여 인슐린 신호 통로의 활성을 조절하고, 췌장섬 β 세포의 발달, 사멸 및 인슐린 분비에 영향을 줄 수 있고, ghrelin/nesfatin-1과 같은 포도당 대사와 밀접하게 관련된 호르몬의 분비를 조절하여, 골격근, 지방 등 말초 조직의 설탕 섭취 등 다양한 경로로 혈당을 조절할 수 있다. 인슐린 감수성에 대한 mTORC1의 메커니즘은 복잡하며, 한편으로는 성장 인자가 전형적인 PI3K-AKT 신호 통로를 통해 mTOR를 활성화시키고, 다른 한편으로는 mTOR/S6K1 신호가 음성 피드백 메커니즘을 통해 인슐린 감수성을 저하시킬 수 있다. 본 발명의 mTOR 억제제는 mTOR 및 S6K1의 과인산화를 억제하고, 인슐린 저항 상태에서 IRS 세린의 인산화를 역전시키며, 지방 세포 당의 흡수를 향상시키고, 지방 축적을 억제한다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 알츠하이머 치료 약물을 제공하는 것이며, 알츠하이머 치료 약물에는 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성;이 포함되며,

바람직하게는, 상기 촉매 억제제는 키나아제 억제제이며;

신경계에서 mTOR의 과도한 활성화는 뇌종양으로 이어질 수 있다. 또한, 많은 증거 자료에서 알츠하이머병(AD), 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 일부 퇘행성 신경 질환에서 mTOR 신호 통로가 비정상으로 나타난다. 이와 같은 질병에는 하나의 공통점이 있는데, 바로 대뇌의 특정 영역에 다량의 뉴런 손실이 있으며, 이는 모두 mTOR 통로의 이상과 관련이 있을 수 있다. AD는 주로 노년기에 발생하는 진행성 치매를 주요 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환이다. AD의 가장 전형적인 병리학 특징은: 뉴런 외부의 β-아밀로이드 단백질(β-amyloid protein, Aβ)은 노인성 플라크를 형성하고, 뉴런의 고도로 인산화된 단백질은 신경 섬유 엉킴 및 뉴런 손실을 형성하며, 임상학 적으로 학습 및 기억기능의 변화로 나타난다. AD의 발명 메커니즘은 매우 복잡하기 때문에, 현단계의 연구에서 mTOR 경로에는 두 가지 상이한 변화 상황이 있으며(업 레귤레이션/다운 레귤레이션), mTOR 경로의 다운 레귤레이션은 일부 신경 독성 작용을 가지는 단백질(tau 단백질 등)의 합성을 감소시킬 수 있으며, 따라서 mTOR의 억제제는 신경 퇴행성 질환의 치료에 효과적인 약물이 될 수 있다.

본 발명의 일곱 번째 목적은 노화 완화 약물을 제공하는 것이며, 노화 완화 약물에는 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성;이 포함되며,

바람직하게는, 상기 촉매 억제제는 키나아제 억제제이며;

mTOR/S6K 신호 통로의 억제는 노화를 지연시키고, 미토콘드리아 생산을 증가시키고 호흡기 사슬 활성을 개선하며, 소포체 스트레스를 감소하고, 자가포식 작용을 촉진하여 세포 내의 손상된 구조를 제거할 수 있다. mTOR 억제제에 의한 mTOR/S6K 신호 통로의 억제는 자가포식 관련 신호 통로를 크게 향상시킬 수 있으며, mTORC1이 억제 된 후, 자가포식 작용이 향상되고, 대사 부산물을 제거하는 능력도 향상되어, 궁극적으로 수명이 연장된다. 또한, mTOR는 미토콘드리아 산화성 호흡 기능의 수호자이며, PPARr 및 PGC1 수준을 상향 조절함으로써, 미토콘드리아 관련 유전자 발현, 미토콘드리아 생성 및 조직 산소 소비 증가를 촉진한다. mTORC1이 억제되면 보호 기능을 발휘하는 유전자 그룹을 활성화하고, 미토콘드리아 호흡을 제한하여 산소 자유 라디칼에 의한 손상을 줄임으로써, 신체의 수명을 연장시킬 수 있다.

본 발명의 여덟 번째 목적은 mTOR 통로 관련 질병의 치료 및/또는 예방 약물 제조에서의 상기 mTOR 억제제 또는 상기 약물 조성물 또는 상기 조합 제품의 응용을 제공하는 것이다.

추가 방안으로, 상기 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III은 mTOR을 표적화하여 대사 미세환경을 조작함으로써, mTOR 통로 관련 질병을 억제한다.

추가 방안으로, mTOR 통로 관련 질병은, 연령 관련 질환, 이식 거부 관련 질환, 만성 염증성 질환, 글리코겐 저장 관련 질환, 헌팅턴병, 악성 종양, 전이암, 전신성 홍반성 루푸스, 염증 및 면역 활성화 관련 질환, 백혈구 감소증 관련 질환, 빈혈, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅 관련 질환, 신장 기능 부전, 비만, 당뇨병, 비알코올성 지방간 관련 질환, 질병으로 인한 감소, 다낭성 신장 질환, 파킨슨병 및 섬유증 중 적어도 하나이다.

추가 방안으로, 연령 관련 질환은 근육감소증, 피부 위축, 근육 위축, 뇌 위축, 죽상 동맥 경화, 동맥 경화, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 고혈압, 발기 부전, 치매, 알츠하이머병, 백내장, 연령 관련 황반 변성, 전립선 암, 뇌졸중, 수명 감소, 신장 기능 장애 및 연령 관련 난청, 노화 관련 이동성 장애, 인지 기능 저하, 기억 장애, 힘줄 강성화, 심근 비대 및 수축 이완기 기능 장애 등 심장 기능 장애, 면역 기능 노화에서 선택된다.

추가 방안으로, 상기섬유증에는 간 섬유증, 심근 섬유증, 심혈관 섬유증, 폐 섬유증, 췌장 섬유증, 신장 섬유증 또는 비장 섬유증이 포함된다.

추가 방안으로, 상기 악성 종양은 림프계의 조혈성 종양, 골수계 조혈성 종양, 중간엽 세포원 종양, 중추 및 말초 신경계의 종양, 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선 여포암 및 카포시 육종에서 선택되며;

바람직하게는, 림프계의 조혈 종양은 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프 모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모세포 림프종, 외투 세포 림프종, 골수종 및 버킷 림프종;에서 선택되며, 골수계 조혈성 종양에는 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수세포 백혈병;이 포함되며, 중간엽 세포원 종양에는 섬유 육종 및 횡문근 육종;이 포함되며, 중추 및 말초 신경계의 종양에는 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종이 포함된다.

추가 방안으로, 악성 종양에는 방광암, 유방암, 결장암, 중피종, 신장암, 간암, 폐암, 두경부암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 위암, 림프종, 자궁경부암, 대장암, 갑상선암, 전립선암, 피부암, 구강암;이 더 포함된다.

추가 방안으로, mTOR 억제제의 악성 종양 세포에는 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2 또는 쥐 간암 세포 H₂₂, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC-7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60이 포함된다.

가장 바람직한 방안으로, 인체 비소세포 폐암 A549는 폐암을 일으킨다.

본 발명은 추가로 체내 시험을 통해 이소발레릴 스피라마이신I이 쥐 간암 세포 H₂₂, 비소세포 폐암 세포 A549의 성장에 모두 뚜렷한 억제 작용이 있음을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 mTOR 억제제로 진행한 치료는, 1종 이상의 기타 암 치료와 결합하여 진행할 수 있으며, 상기 기타 암 치료에는 외과 치료, 방사선 치료 (예를 들어, 감마 방사선, 중성자 방사선 치료, 전자빔 방사선 치료, 양성자 치료, 근접 치료(brachytherapy) 및 전신 방사성 동위 원소 치료 등), 내분비 요법, 생물학적 반응 조절 요법 (예를 들어, 그중 일부의 명칭은 인터페론, 인터루킨, 종양괴사인자 (TNF)임), 찜질, 냉동 요법, 완화 약물(예를 들어, 항구토제) 및 기타 암 화학 요법 약물의 부작용 등이 포함된다. 상기 기타 약물은 본 발명에서 제공하는 mTOR 억제제를 제공하기 이전, 제공 과정 중 또는 제공 후에 사용될 수 있으며, 본 발명에서 제공하는 mTOR 억제제와 동일하거나 상이한 제제, 투여 경로 및 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명의 mTOR 억제제 및 약물 조성물은 기타 약물과 함께 사용되어 부작용 완화(예를 들어, 스타틴, 진통제, 항구토제, G-CSF, GM-CSF 등) 및/또는 기타 적절한 화학 요법 약물과 함께 사용할 수 있다. 상기 기타 약물은, 알킬화 항암제 또는 내재 약물(예를 들어, 질소머스터드, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란 및 이포스파미드); 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트); 퓨린 길항제 또는 피리미딘 길항제(예를 들어, 6- 메르 캅토 퓨린, 5- 플루오로 우라실, 시타라빈, 카페시타빈 및 젬시타빈); 스핀들 독소(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 및 파클리탁셀); 포도필로톡신(예를 들어, 에토포시드, 이리노테칸, 토포테칸); 항생제(예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신 및 미토마이신); 니트로우레아(예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴); 무기 이온(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴 또는 oxiplatin); 효소(예를 들어, 아스파라기나제); 호르몬(예를 들어, 타목시펜, 류프로렐린아세트산염, 플루타마이드 및 메게스트롤); 프로테아좀 억제제(예를 들어, Velcade, 기타 프로테아좀 억제제 또는 예를 들어 IkK 억제제를 포함하는 기타 NF-kB 억제제); 기타 키나아제 억제제(예를 들어, Src, BR /Abl, kdr, flt3, Aurora-2 및 글리코겐 신타제 키나아제 3 ( "GSK-3"), EGF-R 키나아제(예를 들어, Iressa, Tarceva 등), VEGF-R 키나아제, PDGF-R 키나아제 등); 항체, 암과 관련된 수용체 또는 호르몬을 길항하는 수용성 수용체 또는 기타 수용체(EGFR, ErbB2, VEGFR, PDGFR 및 IGF-R, 및 허셉틴과 같은 약물(또는 기타 항-Her2 항체), 아바스틴, 얼비툭스 등 수용체를 포함)등 중의 1종 이상을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.

기타 치료 약물의 예에는 알로푸리놀, 알렘투주맙, 헥사메틸멜라민, 아미포스틴, nastrozole, 전립선 특이적 막항원 항체(예를 들어, MLN-591, MLN591RL 및 MLN2704), 비소 삼산화물, 벡사로텐, 블레오마이신, 부 술판, 카페시타빈, Gliadel Wafer, 세레콕시브, 클로람부실, 시스플라틴-아드레날린 젤, 클라드리빈, 사이타라빈 리포솜, 다우노루비신 리포솜, 다우노루비신, 다우노마이신, 덱사라옥산, 도세탁셀, 독소루비신, 엘리엇 B 용액, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포사이드포스페이트, 에토포사이드, 엑세메스탄, 플루다라빈, 5- 플루오로 우라실, 퓨전트란트, 젬시타빈, 기무맙-오조미신, 고실린아세테이트, 하이드록시우레아, 이다루비신, 데메톡시다우노루비신, 이포스파미드, 이마티닙메실레이트, 이리노테칸 (또는 MLN576(XR11576)과 같은 항체를 포함하는 기타 토포이소머라제 억제제), 레트로졸, 폴리닉산, 레바미솔폴리닉산, 다우노루비신 리포좀, 멜팔란, L-PAM, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡살린, 미토마이신 C, 미톡스안트라퀴논, MLN518 또는 MLN608 (또는 flt-3 수용체 티로신 키나아제의, PDFG-R, c-kit 기타 억제제), itoxantrone, 파클리탁셀, 퍼가자임, 펜토스타틴, 포핀나트륨, 리툭산, 활석, 타목시펜, 테모졸로 마이드, 테포 시드, VM-26, 토포테칸, 토레미펜, 2C4(또는 HER2 매개 신호 전달을 방해하는 기타 항체), 트레티노인, 레티노산, 발루비신, 비노렐빈 또는 파미트로 네이트 또는 졸레드로네이트(zoledronate) 또는 비스포스포네이트 화합물이 포함된다.

본 발명의 mTOR 억제제 치료는 세포독성제 중의 1종 이상의 조합과 함께 치료 방안의 일부로 사용될 수 있다. 세포독성제의 조성은 CHOPP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); COP(시클로포스파미드,빈크리스틴 및 프레드니손), CAP-BOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 프로카르바진,블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손); m-BACOD(메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린); ProMACE-MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 시타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴); MACOP-B(메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린); MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 데카르바진); ABV(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ABVD(아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진)와 교대되는 MOPP(메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진); ChIVPP(클로르암부실, 빈블라스틴, 프로카바진 및 프레드니손); IMVP-16(이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); MIME(메틸-gag, 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); DHAP(덱사메타손, 고용량 시타리빈 및 시스플라틴); ESHAP(에토포시드, 메틸프레드니손, 고용량 시타라빈 및 시스플라틴); CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신); CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손) 및 CVP-1(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손)EPOCH(다량의 시클로포스파미드 및 경구 프레드니손과 함께 96시간 동안 에토포시드, 빈크리스틴 및 독소루비신 사용), ICE(이포스파미드, 사이클로포스파미드 및 에토포시드), CEPP(B)(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진, 프레드니손 및 블레오마이신), CHOP-B(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 블레오마이신), CEPP-B(사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카바진 및 블레오마이신) 및 P/DOCE(에피루비신 또는 독소루비신, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드 및 프레드니손)로부터 선택된다.

상기 기술방안을 채용한 후, 본 발명은 종래 기술에 비해 하기 유익한 효과를 가진다:

1. 본 발명의 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성이 포함된다. 상기 각 활성성분은 각각 또는 결합되어 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로에서의 일부 단백질의 활성에 대해 억제 작용을 할 수 있으며, 따라서 본 발명의 mTOR 억제제에는 mTOR 통로 관련 질병의 세포에 뚜렷한 억제 작용이 있으며, mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물 제조에서의 응용 및 임상 보급에 이론적 근거를 제공한다.

2. 본 발명의 mTOR 억제제는 특히 비교적 우수한 항암 작용이 있으며, 특히 유방암, 간암, 폐암, 림프종, 자궁경부암, 전립선암, 결장암 또는 백혈병 등 종양에 비교적 우수한 치료 효과를 가지며, PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 단백질 활성을 억제하여 암세포의 증식을 억제할 수 있으며, 항암 약물 제조에서의 mTOR 억제제의 응용 및 임상 보급에 이론적 근거를 제공하며, 중요한 경제적 및 사회적 효과를 가진다.

이하 도면과 결합하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 추가로 자세하게 설명한다.

도면은 본 발명의 추가 이해를 위해, 본 발명의 일부로서 사용된다. 본 발명의 예시적인 실시예 및 이의 설명은 본 발명을 설명하기 위해 사용되지만, 본 발명의 한정하지 않는다. 이하의 설명에서 도면은 일부 실시예일뿐이며, 당업자에게 있어서, 창조적 노동의 대가 없이, 이들 도면에 기초하여 다른 도면을 얻을 수 있음은 자명하다. 도면에서,
도 1은 웨스턴 블랏에 의해 측정한 p-PI3k/PI3K, p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, p-S6K1/S6K1, p-4EBP1/4EBP1, β-actin 등 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 관련 단백질 및 인산화된 단백질 수준을 측정한 결과이다. 여기서, A1-A2는 p-PI3k/PI3K의 결과, B1-B2는 p-AKT/AKT의 결과, C1-C2은 p-mTOR/mTOR의 결과, D1-D2는 p-S6K1/S6K1의 결과, E1-E2는 p-4EBP1/4EBP1의 결과이다.
도 2는 웨스턴 블랏에 의해 측정한 p-PI3k/PI3K, p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, p-S6K1/S6K1, p-4EBP1/4EBP1, β-actin 등 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 관련 단백질 발현 수준이다.
도 3은 캐리마이신으로 24시간, 48시간 처리한 후의 A549 세포 성장에 대한 억제 결과이며;
도 4는 웨스턴 블랏에 의해 캐리마이신으로 24시간, 48시간 처리한 후의 A549 세포의 PI3K/AKT/mTOR 신호 통로 관련 단백질에 대한 발현 수준을 측정한 결과이며;
도 5는 웨스턴 블랏으로 A549 세포의 PI3K/AKT/mTOR 신호 통로 관련 단백질에 대한 캐리마이신의 발현 수준을 측정한 결과이며; A-E는 각각 p-PI3k/PI3K, p-mTOR/mTOR, p-4EBP1/4EBP1, p-AKT/AKT, p-S6K1/S6K1의 결과이다.
도 6은 캐리마이신에 의해 유도된 A549 세포의 자가포식 결과이며, 유도 후 MDC 염색의 양성률이 증가하며; 도 6a는 24시간 이후의 결과이고, 도 6b는 48시간 이후의 결과이다.
도 7은 캐리마이신으로 A549 세포를 24시간, 48시간 동안 처리한 후, P62 및 Lc3의 발현 수준을 웨스턴 블랏에 의해 측정한 결과이며;
도 8은 자가포식 억제제 3-MA를 첨가한 후 측정한 A549 세포 성장에 대한 캐리마이신의 억제 결과이며;
도 9는 위상차 현미경으로 24시간 및 48시간 동안 처리한 후의 세포 형태 변화를 관찰한 결과이며;
도 10은 캐리마이신으로 A549세포를 24시간 및 48시간동안 처리한 후, AV-PI 염색 이후의 유세포 측정 결과이며;
도 11은 캐리마이신으로 A549 세포를 24시간, 48시간동안 처리한 후, 웨스턴 블랏으로 pro-caspse3, cpase3, PARP 단백질 수준을 측정한 결과이며;
도 12는 A549 세포 내의 caspe3의 효소활성을 측정한 결과이며;
도 13은 상이한 농도의 캐리마이신으로 A549세포를 24시간 및 48시간동안 처리한 후, IF-1αVEGF-A 단백질 수준을 정량 분석한 결과이며;
도 14는 상이한 농도의 캐리마이신으로 A549세포를 24시간 및 48시간 동안 처리한 후, Ras, Raf, p-ERK/ERK 단백질 수준을 정량 분석한 결과이다.
설명해야할 것은, 상기 도면 및 텍스트 설명은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 특정 실시예를 참조하여 당업자에게 본 발명의 개념을 설명하기 위한 것이다.

본 발명 실시예의 목적, 기술방안 및 장점을 더 명확하게 설명하기 위해, 이하에서 본 발명의 실시예의 도면과 결합하여, 실시예의 기술방안을 명확하고 완정하게 설명하며, 이하 실시예는 본 발명을 설명할 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 정제

규격: 200mg/350mg

정제 핵의 처방:

이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 200g

아비셀 110g

카르복시메틸스타치나트륨 22g

포비돈 K₃₀₍5%) 15g

스테아린산마그네슘 3g

------------------------------------------

1,000알 제조

코팅액 처방:

오파드라이II 21g

증류수 적당량

-----------------------------------------

105ml 제조

제조공정:

정제 핵의 제조: 주약과 보조제를 각각 100 메쉬 체로 치고, 처방량의 이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III, 아비셀과 1/2 처방량의 카르복시메틸 스타치 나트륨을 골고루 섞은 후, 5% 포비돈 K₃₀수용액을 첨가하여 연제를 만들고, 18 메쉬 체로 과립을 제조하고, 젖은 과립을 60℃ 통풍 조건 하에서 2시간 건조하며; 건조 후 18 메쉬 체로 과립을 체질하고, 1/2 처방량의 카르복 메틸 스타치 나트륨과 스테아린산 마그네슘을 골고루 섞어 넣고, 직경 11mm의 얕은 오목형 다이로 정제함으로써, 정제 중량 350mg, 경도 6.5kg의 정제 코어를 얻는다.

코팅액의 제조: 필요한 오파드라이II(백색)의 무게를 달고, 필요한 양의 물을 여러 차례에 나누어 배액 용기에 부으며, 전부 부은 다음, 교반 속도를 늦추어, 소용돌이가 사라지도록, 계속하여 30분 동안 교반하여 얻는다.

필름 코팅의 제조: 정제 코어를 코팅 솥에 넣고, 코팅 조건을 확인하며, 메인 설비 속도 20r/min, 입풍 온도 40℃, 송풍 온도 30℃, 분사 압력 0.02Mpa, 분사 유량 1ml/min으로 코팅하며, 안정된 다음 지속적으로 1.5시간 동안 분사 코팅하여, 정제 표면이 매끄럽고, 색갈이 균일하며, 필름 코팅 검수 기준에 부합되도록 하면 합격이다. 코팅 후 무게는 5% 정도 증가한다.

실시예 2. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 정제(10,000알로 계산함)

처방:

이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 원분 1,000g

저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스(5%) 92.5g

카르복시메틸 스타치 나트륨(3%) 55.5g

스테아린산 마그네슘(1%) 18.5g

전분 총 중량 - 기타 원료와 보조재의 중량

총 중량 1,850g

제조공정: 적당한 량의 전분을 취하여, 농도가 15%가 되도록 희석한 후, 크림처럼 될 때까지 가열하여, 접착제를 만들고; 주재료 이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III, 보조재 전분, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸스타치나트륨, 스테아린산 마그네슘을 각각 100 메쉬 체로 치고, 처방량에 따라, 필요한 만큼 주재료와 보조재를 취하고; 이소발레릴 스피라마이신I, 전분, 저치환도 하이드록시 프로필 셀룰로오스를 균일하게 충분히 혼합한 후, 전분 농도가 15%인 전분을 이용하여 연제를 만들며, 14 메쉬 체로 과립을 제조하고, 50~60℃ 온도에서 건조하며, 수분은 3~5%로 제한하고, 14 메쉬 체로 체질하며, 카르복시메틸 스타치 나트륨과 스테아린산 마그네슘을 넣어 과립의 함량을 측정하며; 과립 함량에 기초하여, 정제의 무게를 측정하고, 정제를 프레스하여(φ9mm 얕은 오목형 펀치), 정제 중량 편차를 검사하고; 검사에 합격한 후 포장한다.

실시예 3. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 캡슐(10,000알로 계산함)

처방:

전분 1,080 - 이소발레릴 스피라마이신I 원분 중량

약용 3호 캡슐 1,000알

액체 파라핀 50ml

제조공정: 공정 처방에 따라 주재료 이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III과 보조재인 약용 전분의 무게를 각각 달고, 혼합기에 넣어 1.5~2시간을 충분히 혼합하며; 표본을 추출하여 측정한 함량의 수치는 이론수치와 기본적으로 일치해야 하며(캡슐 하나의 내용량은 약 0.105g), 자동 캡슐기기 작동 요구에 따라 검증에 합격한 약용 3호 캡슐 및 혼합된 포장 예정인 원료를 각각 포장용 기계에 넣어 충전하며, 충전된 캡슐에 대해 편차를 검증하며(±10%이내，＜0.3g), 용해율은 요구에 부합해야 하며, 검증 후 요구에 부합하는 캡슐을 폴리싱 머신에 넣고 액체 파라핀을 첨가하여 15~20분간 폴리싱한 후, 꺼내어 완성품 포장 용기 점검을 진행한다.

실시예 4. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 드라이 시럽(10,000 팩으로 계산함)

처방:

이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 원분 1,250g

구연산(0.5%) 15g

사카로즈 총 중량 - 기타 원료와 보조재

총 중량 5,000g

색소(쿠르쿠민) 약 1g

제조공정: 고속 제트 분쇄기로 이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 원분, 구연산, 사카로즈를 각각 분쇄하여 과립으로 만들고, 그 중에 85%는 300 메쉬 체로 치고, 나머지 15%는 180 메쉬 체로 치며, 분쇄된 가루를 처방에 따라 무게를 단 후 1~1.5시간 동안 충분히 혼합하여, 그 함량을 측정하고, 팩당 함량을 계산하며(이론적인 팩당 함량은 500mg임), 이어서 혼합물을 비닐 포장용 기계에 넣고, 알루미늄 박지를 넣은 후, 분리기 제어 요구에 따라 나누어 담되, 팩당 함량 편차는 ±5% 이내로 제한해야 하고, 패킹하고 테스트에 합격하면 겉포장을 한다.

실시예 5. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 과립제(10,000 팩으로 계산함)

처방:

슈가파우더 20,000g

덱스트린 9,000g

5%PVP-K₃₀ 적당량

제조공정: 이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 원분, 슈가파우더 및 덱스트린을 120 메쉬 체로 치고, 처방량에 따라 이소발레릴 스피라마이신I, 슈가파우더 및 덱스트린 무게를 단 다음 균일하게 혼합하며, 균일하게 혼합한 상기 재료를 5% PVP-K₃₀의 점액을 이용하여 연제를 만들고, 진동 과립기로 과립을 만들고, 70℃의 온도에서 건조하고, 체로 친 다음, 테스트에 합격하면 분리하여 포장한다.

실시예 6. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 동결건조 주사용 분말

이소발레릴 스피라마이신I 또는 이소발레릴 스피라마이신II 또는 이소발레릴 스피라마이신III 원분 500mg을 무게를 달아 몰 량이 동일한 아디프산과 균일하게 혼합하여 5ml의 정제수에 용해하여, 담황색 투명액체를 얻되, pH는 4.6~5.6 이어야 한다. 이어서 동결건조 프롭프엔트로 40mg의 마니톨을 넣고, 저온에서 쾌속으로 9시간 냉동 후, 동결건조하여, 담황색의 푸석한 덩어리를 얻으며, 사용 전에 10ml의 무균수를 사용하여 용해한다.

실시예 7. 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II 동결건조 주사용 분말

이소발레릴 스피라마이신I 및 이소발레릴 스피라마이신II 원분 250mg을 무게를 달아 몰 량이 동일한 아디프산과 균일하게 혼합하여 5ml의 정제수에 용해하여, 담황색 투명액체를 얻되, pH는 4.6~5.6 이어야 한다. 이어서 동결건조 프롭프엔트로 40mg의 마니톨을 넣고, 저온에서 쾌속으로 9시간 냉동 후, 동결건조하여, 담황색의 푸석한 덩어리를 얻으며, 사용 전에 10ml의 무균수를 사용하여 용해한다.

실시예 8. 캐리마이신 동결건조 주사용 분말

캐리마이신 500mg을 무게를 달아 몰 량이 동일한 아디프산과 균일하게 혼합하여 5ml의 정제수에 용해하여, 담황색 투명액체를 얻되, pH는 4.6~5.6 이어야 한다. 이어서 동결건조 프롭프엔트로 40mg의 마니톨을 넣고, 저온에서 쾌속으로 9시간 냉동 후, 동결건조하여, 담황색의 푸석한 덩어리를 얻으며, 사용 전에 10ml의 무균수를 사용하여 용해한다.

시험예 1. 항종양 활성 생체 측정

측정의 목적은 테스트 대상 샘플의 체외 세포 증식 억제 작용 또는 세포상해활성을 평가하는 것이다.

세포주:

인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 세포 폐암 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 Hl-60은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다.

시약제:

RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, DMEM 배양액, 및 송아지 태아 혈청은 미국 Gibco사에서 구매하였고, 트립신, 글루타민, 페니실린, 스트렙토 마이신, 디메틸 술폭시드(DMSO), 메틸 티아졸 테트라졸리움(MTT)은 미국 Sigma사에서 구매하였다.

측정 기구:

이산화탄소 인큐베이터(Sanyo, Japan), 효소 결합 면역 측정기(Tecan, Austria), 96웰 배양 플레이트(Corning, USA), 도립 현미경 (Motic, China).

동작 단계는 다음과 같다:

부착세포:

MCF-7, MDA-MB-231, HepG2, A549, H460, H1299, 786-O, 769-P, U251, A172, HeLa, PC3, PANC-1, TE-1, SGC7901, Ht-29는 부착세포이며, 로그 생장기의 종양 부착 세포를 선택하여, 판크레아틴으로 소화한 다음, 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 배양액을 사용하여 4~5×10⁴/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 96웰 배양 플레이트에 접종하여, 웰당 100μL씩, 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양한다. 실험군은 상이한 농도의 테스트 대상 샘플을 포함하는 캐리마이신 배양액으로 교체하고, 대조군은 동일 부피의 용매를 포함하는 배양액으로 교체하며, 각 그룹은 3개의 평행 홀을 구비하고, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 배양한다. 상청액을 버리고, PBS를 사용하여 조심스럽게 3번 세척하고, 0.5mg/ml MTT를 함유하는 새로 제조된 배양액 100μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 계속하여 4h 배양한다. 상청액을 조심스럽게 버리고, DMSO를 150mL 첨가하며, 마이크로 쉐이커로 10분 동안 균일하게 혼합한 후, 효소 면역 측정기를 사용하여 492nm에서 광학밀도를 측정한다.

부유세포:

U937, HL-60은 부유 세포이며, 로그 생장기의 세포를 사용하여, 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 RPMI l640 배양액으로 2×10⁵/ml의 세포 현탁액을 제조하고, 96웰 배양 플레이트에 접종하여, 웰당 50μL, 37℃, 5％CO₂로 24시간 배양한다. 실험군에 상이한 농도의 테스트 대상 샘플을 포함하는 캐리마이신 배양액 50μL를 첨가하고, 대조군에는 동일 부피의 용매를 포함하는 배양액을 첨가하며, 각 그룹은 3개의 평행 홀을 구비하고, 37℃, 5％CO₂에서 48시간 배양하며, 5mg/ml MTT를 함유하는 새로 제조된 배양액 10μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 계속하여 4h 배양한다. 삼중용액(SDS 10g, 10M HCl 0.1mL, 이소부틸알콜 5mL를 증류수로 100mL까지 희석함) 100μL를 사용하여 결정을 용해하고, 37℃에서 12h 부화한다. 효소 면역 측정기를 사용하여 492nm에서 광학밀도를 측정한다.

결과 평가: 하기 식에 따라 종양 세포에 대한 약물의 억제율을 계산한다:

종양 세포 성장 억제율(%) = [A492(음성대조군) - A492(투여군)] / A492(음성대조군) × 100%

이에 근거하여 샘플의 반억제농도(IC50)를 얻는다.

결과: 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 Hl-60을 실험 대상으로 한다. 샘플에 대해 진행한 체외 항증식 활성 평가 결과는 표 1과 같다:

[표 1] 종양 세포에 대한 캐리마이신의 증식 억제 작용

결과에 따르면, 샘플은 테스트된 모든 세포에 양호한 항증식 활성을 보인다.

시험예 2. 이소발레릴 스피라마이신I의 PI3k/AKT/mTOR 통로에 대한 억제작용

세포주:

A549 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 10% 송아지 태아 혈청, 2% 글루타민, 페니실린(100U/ml)을 함유하는 DMEM 배양액에서 세포를 배양하며, 5% CO₂，37℃의 인큐베이터에서 배양한다. 실험에서 사용하는 세포는 모두 로그 생장기 세포이다.

시약제:

라파마이신(Rapamycin)은 미국 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.

동작 단계는 다음과 같다:

A549는 부착세포이며, 로그 생장기의 세포를 선택하여, 상이한 농도(0.05, 5, 17, 50μg/ml)의 이소발레릴 스피라마이신I 및 대조 약물 라파마이신(Rapamycin, 20μg/ml)을 첨가하여, 5% CO₂，37℃의 인큐베이터에서 24시간 배양하며, 세포를 수집하여, 단백질 면역 기억법 측정을 진행한다.

단백질 면역 기억법:

1. 작업용액의 제조

1）30% 폴리아크릴아마이드 용액：

시약제 명칭 용량

아크릴아미드 290g

메틸렌비스아크릴아미드 10g

ddH₂O 1,000ml

ddH₂O를 첨가하여 1,000 ml까지 정용하고, 갈색병에 넣어, 4℃에서 보관한다.2) Tris 완충용액, Tris 염기를 탈이온수에 완전히 용해시킨 후, Hcl로 pH를 조절한다.

분리 겔 완충용액: 1.5 MTris-HCl (pH 8.8);

적층 겔 완충용액: 1 MTris-HCl (pH 6.8).

3) 로릴 황산 나트륨(SDS): 탈 이온수로 10% 저장 용액을 만들고 나중에 사용할 수 있도록 실온에 보관한다.

4) 과황산암모늄(AP): 탈 이온수로 소량의 10%(w/v) 저장용액을 준비하여 4℃에서 보관한다. 과황산암모늄은 천천히 분해되므로, 격주로 신선하게 제조한다.

5) 5≠Tris-그리신 전자 영동 완충용액:

시약제 명칭 용량

Tris 7.55g

10%(w/w)의 SDS 25mL

글리신 47g

ddH₂O 500mL로 정용

나중에 사용하기 위해 4℃로 냉장고에 보관하고, ddH₂O를 사용하여 1x완충용액으로 희석하여 사용한다.

6) 세포 가수분해 용액: 50 mMHepes(pH 7.4), 1% Triton-X 100, 100 mMNaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2mM 오소바나데이트 나트륨, 1mM PMSF, 10 mg/ml aprotinin, 10 mg/ml leupeptin, 10mg/ml pepstatin A.

7) 5×로딩 완충용액:

시약제 명칭 용량(mL)

Tris-HCL(pH 6.8) 0.6

글리세린(50%) 5

SDS(10%) 2

β-메르캅토에탄 0.5

브로모페놀블루(1%) 1

8) 트랜스퍼 버퍼:

시약제 명칭 용량

Tris-Base 4.55g

글리신 21.65g

ddH₂O 1200mL

메탄올 300mL

9) 차단액:

시약제 명칭 용량

탈지분유 5g

PBST 100mL

2. 단백질 전기영동

1) 각 튜브의 세포에 60-100μl의 가수분해 용액을 넣고, 4℃ 온도의 냉장고에서 1시간 동안 아이스 배스를 진행한다. 12,000r/min으로 10-15분 동안 원심 분리하고, 상청액을 0.5ml EP 튜브로 흡인하고, Bio-Rad를 사용하여 단백질을 검출 및 정량화하고, 5X 로딩 완충용액을 추가하고, 수조에서 3-5분 동안 끓인 후, -80℃에서 동결 보관한다.

2) Tab. 2-1에 따라 15%, 12% 또는 10%의 아크릴아미드 분리 겔을 제조하고, 각 성분을 순차적으로 혼합하며, TEMED 및 AP를 첨가한 즉시, 혼합물을 빠르게 회전시켜 전기 영동 탱크의 두 유리판 사이에 부으며, 라미네이트 접착제를 붓는 데 필요한 공간을 남겨둔다. 분리 겔을 이소프로판올 층으로 덮고, 겔을 실온에서 약 30분 동안 수직으로 놓는다.

3) 분리 겔이 완전히 중합된 후, 이소프로판올을 제거하고, 탈이온수로 10 회 세척하고, 여과지로 물을 흡수 한 후, Tab. 2-2에 따라 적층 겔을 준비하여, 전기 영동 탱크에 첨가한 후, 즉시 깨끗한 샘플 빗을 삽입한다.

4) 적층 겔이 완전히 중합된 후, 전기 영동 장치에 1X 전기 영동 완충용을 채우고, 샘플을 미리 정해진 순서대로 샘플 웰에 추가하여 전기 영동을 시작하며, 샘플이 적층 겔에 있을 때의 전압은 50-60V, 샘플이 분리 겔에 영동될 때의 전압은 100-140V로 조절한다.

3. 면역 기억

1) SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동이 완료된 후, 겔을 트랜스퍼 버퍼에 넣고 30분간 담근 후, Whatman 3MM 여과지 8장과 나이트로셀룰로스 막 1장을 겔 크기에 맞게 자른다. 나이트로셀룰로스 막을 메탄올에 1분간 담그고, 나이트로셀룰로스 막을 탈 이온수에 담가 기포를 제거 한다.

2) 젤을 "샌드위치"모양으로 눌러 접고, 이송 탱크에 삽입하고, 젤 한 쪽을 음극에 연결하고, 100mA로 3 시간 동안 연결한다.

3) 이송된 나이트로셀룰로스 막 퐁슈 S염색 액에 5 ~ 10분 동안 담그고, 이 시간 동안 부드럽게 흔들어주고, 단백질 밴드가 나타나면 탈이온수로 여러 번 헹구고, 표준 단백질 분자량의 위치를 잉크로 표시한다.

4) 막을 차단 용액이 첨가된 배양 플레이트에 넣고, 2시간 동안 차단한다.

5) 이어서 0.1ml/cm²농도로 1차 항체가 포함된 차단 용액을 첨가하고, 4℃에서 하루 밤을 경과한다(각 항체의 희석 배수는 Tab. 2-2와 동일).

6) 1차 항체를 회수하고, 회 당 10분씩, PBST로 막을 3회 헹구고, 150mMNaCl, 50mMTris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 용액으로 막을 옮기고, 10분 동안 흔들어준다.

7) 0.1ml/cm²농도로 2차 항체가 포함된 인산염 및 아지드화나트륨이 포함되지 않은 차단 용액에 첨가하고, 양고추냉이퍼옥시다제 표지 2차 항체를 1,000 배 희석한다.

8) 회 당 10분씩, 150mMNaCl, 50mMTris-HCl(pH 7.5) 용액으로 3회 헹군다. 어두운 방에서 ECL 키트를 사용하여 색상을 현상하고 사진을 스캔하여 저장한다.

[표 2-A] 전기 영동 분리 겔용 용액의 제조

[표 2-B] Tris-글라이신 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동 5% 증착층 겔용 용액의 제조

[표 2-1C] 단백질 전기 영동에서 사용하는 항체

결과:이소발레릴 스피라마이신I을 A549 세포에 24시간 동안 작용한 후, 면역 기억법에 의해 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 단백질 및 인산화의 수준을 관찰하였으며, 결과는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같다.

PI3K, AKT, mTOR 및 mTOR 기질 S6K1, 4EBP1, 및 이의 활성화 형태인 p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, p-S6K1, p-4EBP1의 단백질 수준 발현에 대한 이소발레릴 스피라마이신I의 영향은 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같으며, 실험 결과, 이소발레릴 스피라마이신I은 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 단백질 활성화를 억제할 수 있고, 특히 PI3K 단백질, 4EBP1 단백질 및 mTOR 단백질의 활성화를 억제할 수 있으며, AKT 단백질, S6K1 단백질의 발현 및 이의 활성화 단백질의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 도 1 및 도 2에서, 라파마이신에 비해, 본 발명의 mTOR 억제제인 이소발레릴 스피라마이신I은 AKT, S6K1 및 4EBP1에 대한 억제 효과가 더 우수함을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 mTOR 억제제인 이소발레릴 스피라마이신I에 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로를 억제하는 우수한 작용이 있음을 의미하며, mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물 제조에서의 응용 및 임상 보급에 이론적 근거를 제공하여, 중요한 경제 및 사회적 효과를 가진다.

이외에도, 본 출원인은 독립적으로 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신II 및 이소발레릴 스피라마이신III을 이용하거나, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II 및 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종을 조합하여 이용하여, A549 세포에 24시간 동안 작용한 후, 면역 기억법으로 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 단백질 및 이의 인산화 형식의 수준을 관찰하였으며, 그 결과는 시험예 2와 유사하여, PI3K 단백질, 4EBP1 단백질 및 mTOR 단백질의 활성화를 억제할 수 있고, AKT 단백질, S6K1 단백질의 발현 및 이의 활성화 단백질의 발현을 억제할 수 있으며, 여기서 반복하여 설명하지 않는다.

시험예 3: 비소세포 폐암 A549 증식에 대한 캐리마이신 억제제의 억제 작용

(1) MTT 측정법으로 측정한 종양세포 생존율에 대한 캐리마이신의 체외 영향

4×10³개/mL의 밀도로 A549세포를 96웰 플레이트에, 웰당 100μL 접종하고, 24 또는 48시간 동안 배양한다. 상이한 농도의 캐리마이신 첨가하고, 5％CO₂, 37℃의 인큐베이터에 넣고 계속하여 상이한 시간 동안 배양한 후, 웰당 100μL씩 5 mg/mL 농도의 MTT를 2-3시간 배양한 후, 상청액을 흡입하며, 150μL DMSO를 추가하고, 마이크로 쉐이커로 10분간 흔들어 결정을 완전히 용해시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도 값(A 값)을 측정하고, 492nm 파장을 방출하며, 동시에 라파마이신을 양성 대조군으로 사용하여, 다음 공식에 따라 약물의 세포 성장 억제율을 계산한다: 억제율(%) = [A492(대조군) - A492(캐리마이신)] / [A492(대조군) - A492(블랭크)] × 100 %

결과: 캐리마이신은 농도 의존적 방식으로 A549 세포의 증식을 억제할 수 있으며, 24시간 및 48시간 후의 IC₅₀은 각각 24.88μg/mL 및 17.84μg/ml이다.

(2) 캐리마이신의 PI3K/AKT/mTOR 통로에 대한 억제작용

PI3K/AKT/mTOR 신호 경로의 이상은 다양한 종양 유형에서 자주 발생한다. PI3K는 세포 내 포스파티딜이노시톨 키나아제로, PI3K 단백질 계열은 세포 증식, 분화, 세포 사멸 및 포도당 수송과 같은 다양한 세포 기능의 조절에 관여한다. AKT(단백질 키나아제 B)는 PI3K의 주요한 다운 스트림 이펙터이며, AKT는 mTOR을 직접 인산화하거나 TSC2(결절성 경화증 복합체 2)를 비활성화하여 mTORC1을 활성화할 수 있다. mTORC1은 다운 스트림의 진핵 번역개시인자 결합단백질 4E-BP1 및 리보솜 단백질 S6 키나아제1 S6K1을 직접 인산화하여, 세포 생체 합성 및 증식을 조절한다.

상이한 농도의 캐리마이신을 사용하여 A549 세포를 24시간 및 28시간 처리하며, 웨스턴 블랏으로 세포 중의 mTOR 단백질 수준과 업 스트림 및 다운 스트림 단백질 수준을 관찰한다. 그 결과, 5μg/ml 이상의 캐리마이신이 A549 세포에 24시간 동안 작용하면, mTOR 및 다운 스트림 4E-BP1 및 S6K1의 단백질의 인산화 수준을 감소시킬 수 있으며, 동시에, PI3K 및 AKT의 인산화 수준을 하향 조절하는 것을 발견하였다.

5, 17 및 50μg/ml의 캐리마이신으로 A549 세포를 48시간 처리한 후, mTOR 인산화 수준이 현저하게 감소하였으며, mTOR 다운 스트림 단백질 인산화 수준이 현저하게 억제되었지만, 5, 17μg/ml의 캐리마이신은 PI3K 및 AKT의 인산화 수준을 증가시켰고, 50μg/ml의 캐리마이신은 PI3K 및 AKT의 인산화 수준을 현저하게 감소시켰다.

상기 결과는, 캐리마이신이 mTOR 및 다운 스트림 단백질의 인산화 수준을 억제함으로써, 세포의 단백질 합성을 억제하여, A549 세포의 증식을 억제하는 것을 증명한다. 시험 결과는 중저 농도의 캐리마이신은 mTORC1에 대한 억제 정도가 비교적 높고, 48시간 작용할 경우, mTORC2에 대한 음성 피드백 활성화가 있음을 설명한다. 반면에 높은 농도의 캐리마이신은 동시에 mTORC1 및 mTORC2의 이중 억제제로 작용할 수 있고, 음성 피드백 활성화 작용을 일으키지 않음을 알 수 있다(도 4 및 도 5에 도시됨).

(3) 캐리마이신의 A549 세포에 대한 자가포식 유도

방법: 형광현미경 및 유세포 분석에 의한 자가포식 측정

단실카다베린(dansylcadaverine, MDC)은 형광성 색소 및 호산구성 염색제이며, 통상적으로 자가포식체 형성을 감지하는 데 사용되는 특정 마커 염색제 산성 리소좀의 축적은 자가포식 수준을 어느 정도 반영한다.

로그 생장기의 A549 세포를 웰당 2 x 10⁵개씩, 6웰 플레이트에 접종한다. 24시간 배양 후, 배양액을 버리고, 24시간 또는 48시간 동안 상이한 약물을 추가하고, PBS로 1 회 세척하고, 동일한 부피의 0.05mM MDC를 추가하고, 어둠속에서 37℃에서 20 분 동안 배양 한 후, PBS로 1 회 세척하고, 형광 현미경으로 관찰하거나 유세포 분석을 사용하여 감지한다.

결과: mTORC1은 ULK1 복합체에 결합하여 자가포식을 억제할 수 있으므로, 24시간 및 48시간 동안 캐리마이신으로 처리한 세포의 자가포식 수준을 조사했다. MDC 염색 결과를 통해, 대조군의 세포는 균일한 녹색 형광을 내며, 캐리마이신의 농도가 증가할수록, 세포는 뚜렷한 밝은 녹색 형광 응집 입자를 나타냄을 알 수 있다. 유세포 분석의 결과는 약물 처리 후, MDC 염색의 양성 비율이 증가했으며, 24시간 및 48시간의 결과가 일관된 것으로 나타났다(도 6a 및 도 6b에 도시됨).

LC3는 자가포식 마커 단백질로, 세포가 자가포식을 하게 되면, 세포 내에서 LC3 I형에서 II형으로의 전환 수준이 크게 증가한다. P62는 자가포식의 기질이며, 자가포식이 발생하면, P62는 자가포식 기질과 자가포식체 결합을 매개하고, 나아가 자가포식체와 함께 리소좀으로 포장되어 분해된다. 따라서, 세포가 자가포식을 겪을 때, 세포 내의 P62의 발현 수준이 감소한다. 웨스턴 블랏을 통해, 캐리마이신 첨가 후 자가포식 기질 P62의 수준이 감소하고, 자가포식 관련 단백질 LC3의 I형에서 II형으로 전환이 증가하는 것으로 나타났으며, 24시간과 48시간의 결과는 동일하다(도 7). 상기 결과는 모두 캐리마이신이 A549 세포에 대한 자가포식을 유도함을 증명한다.

자가포식이 종양세포에 이중 효과가 있기 때문에, 세포를 보호할 수도, 죽일 수도 있다. 따라서, 자가포식 억제제 3-Ma를 사용하여 캐리마이신이 유도하는 세포 자가포식이 A549 세포 사멸 과정에서 일으키는 작용을 관찰하였다. 자가포식 억제제 3-Ma 첨가한 후, A549 세포 성장에 대한 캐리마이신의 억제 작용이 저하되었으며(도 8), 이는 캐리마이신이 유도하는 자가포식이 A549 세포의 증식을 억제함을 설명한다.

(4) 캐리마이신의 A549 세포 사멸 유도

방법: Annexin V는 분자량이 35 kDa인 Ca2+ 의존성 인지질 바인딩 단백질이며, 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, Ps)에 특이적으로 결합할 수 있다. 포스파티딜세린은 주로 세포막 내측에 분포되며, 세포가 사멸을 겪게 되면, 세포는 포스파티딜세린을 세포 표면, 즉 세포막 외부로 노출시킨다. FITC가 라벨된 Annexin V 프로브, 즉 Annexin V-FITC는, 이와 같이 외부로 노출된 포스파티딜세린을 특이적으로 결합할 수 있으며, 유세포 분석기 또는 형광 현미경을 통해 매우 간단하고 직접적으로 세포 사멸을 감지할 수 있다.

프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI)는, 정상적인 세포막을 통과할 수 없는 핵산 염료로서, 세포가 괴사 또는 사멸 중기 또는 말기에 있을 때, 세포는 막의 완전성을 잃고, 프로피디움 아이오다이드가 세포에 들어가, 세포핵의 핵산에 결합하며, 유세포 분석기 또는 형광현미경으로 측정하면, 세포막의 무결성 정보를 반영한다. 따라서 Annexin V-FITC와 PI를 결합하여 사용하여, 상이한 사멸 단계의 세포를 구분한다.

로그 생장기의 A549 세포를 웰당 2 x 10⁵개씩, 6웰 플레이트에 접종한다. 24시간 배양 후, 배양액을 버리고, 24시간 또는 48시간 동안 상이한 약물을 첨가하고, PBS로 1회 세척하고, 준비된 세포 사멸 염색 용액(250μl Binding buffer, 7.5μl Annexin V-FITC, 10μl Propidium Iodide, 균일하게 혼합)을 첨가하며, 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 배양하며, 이어서 형광현미경 관찰 및 유세포 분석 검출을 수행한다.

결과: A549 세포에 대한 캐리마이신의 기전을 확인하기 위해, AV-PI 염색법을 사용하고 유세포 분석법을 사용하여, 정상 세포, 초기 사멸 세포, 후기 사멸 세포 및 괴사 세포를 구별한다. Caspase 족은 세포 사멸을 매개하는 과정에서 매우 중요한 작용을 하며, 여기서, Caspase3은 사멸의 다운 스트림 수행 단백질로서, Caspase 족은 세포 사멸을 매개하는 과정에서 매우 중요한 작용을 하며, 여기서, Caspase3은 사멸의 다운 스트림 수행 단백질로서, 이는 DNA 단편화, 염색질 응축 및 사멸체 형성과 관련이 있다.

실험 결과, 캐리마이신으로 A549 세포를 24시간 처리한 후, 17, 50μg/ml에는 녹색 형광이 나타 내기 시작했지만, 적색 형광은 나타나지 않았으며, 유세포 분석 결과, 50μg/ml 농도의 세포에 조기 사멸 세포가 나타났으며(도 10), caspase3의 단백질 수준은 크게 증가하지 않았고, PARP 프로토 타입은 절단되지 않았다(도 11A). 캐리마이신으로 A549 세포를 48시간 처리한 결과, 농도가 증가함에 따라, 세포질이 수축하기 시작하고, 세포 사멸체가 나타나기 시작했으며(도 9), AV-PI 결과, 5 및 17 μg/ml 세포에서 뚜렷한 녹색 형광이 나타나고, 50μg/ml 세포핵은 뚜렷한 적색 형광을 보였으며, 유세포 분석 결과, 5 및 17 μg/ml 세포의 초기 세포 사멸의 수가 증가했으며, 50μg/ml 세포에서는 다량의 후기 사멸 세포가 나타났으며(도 10), caspase3이 전구체에서 활성화된 형태로의 전환이 증가하고, 기질인 PARP가 절단되었으며(도 11B), caspase3의 효소 활성이 증가하였으며(도 12), 이는 세포 사멸이 발생하였음을 증명한다.

(5) 캐리마이신의 HIF-1α 단백질 수준 저감 작용

저산소증 및 인슐린, 성장인자와 같은 기타 요인은 HIF-1α의 발현을 유도할 수 있고, 과도하게 활성화된 mTOR는 충분한 산소 조건 하에서 전사 수준에서 HIF-1α의 발현을 활성화 시킬수 있으며, 나아가 다운 스트림 혈관 내피 성장 인자 VEGF 등 혈관에 유전자 전사가 형성되게 하여, 혈관 투과성 증가, 세포외기질의 변성, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 신생을 촉진하는 작용이 있다.

웨스턴 블랏으로 측정한 결과, 캐리마이신으로 A549 세포를 24시간 및 48시간 처리한 후, 혈관 생합성 단백질 HIF-1α와 VEGF-A의 단백질 수준이 크게 감소하여 (도 13), 캐리마이신이 A549 저산소증 유발 인자의 단백질 수준을 억제하여, 종양 세포의 증식을 억제할 수 있음을 시사한다.

(6) ERK 신호 전달 통로에 대한 캐리마이신의 영향

Ras/Raf/MEK/ERK 신호 통로는 세포외 신호를 세포핵으로 전달하는 가장 중요한 신호 통로 중 하나이며, 세포 생존, 증식, 분화, 사멸, 신진대사 등 기능을 조절함에 있어서 핵심적인 역할을 한다.

캐리마이신으로 세포를 24시간 처리할 경우, Ras, Raf 단백질 수준 및 ERK 단백질 인산화 수준을 향상시킬 수 있으며; 또한, 캐리마이신으로 A549 세포를 48시간 처리할 경우, Ras, Raf 단백질 수준을 향상시킬 수 있으며, 중간 농도의 약물은 ERK 인산화 수준을 유의하게 향상시킬 수 있는 반면에, 고농도의 약물은 ERK 인산화 수준을 저하시키며, 결과는 도 14에 도시된 바와 같다.

(7) A549 세포 주기에 대한 캐리마이신의 영향

상이한 농도의 캐리마이신으로 A549 세포 각각 24시간, 48시간 처리한 후, PI 유세포 방법으로 세포 주기 분포를 측정한다. 24시간 약물 처리한 후, 세포 주기에는 뚜렷한 영향이 없었다. 48시간 약물 처리한 후, 대조군에 비해, 1.7μg/ml 5 μg/ml, 17μg/ml 및 50μg/ml의 S기 세포는 각각 1.86%, 9.39%, 4.75%, 24.38% 증가하였다. 상기 데이터를 종합하면, 48시간 동안 처리된 캐리마이신은 농도 의존적 방식으로 A549 세포에서 S기 정지를 유도한다.

상기 시험예에서 보다시피, 캐리마이신으로 A549 세포를 24시간 동안 처리한 후, mTOR의 인산화 수준은 현저하게 저하되고, mTOR 다운 스트림의 진핵 번역 개시 인자 결합 단백질 4E-BP1 및 리보솜 단백질 S6 키나아제1 S6K1의 인산화를 유의하게 억제하였으며, 종양 세포의 단백질 생합성을 감소시켜 종양 세포의 증식 속도를 늦추고, PI3K의 인산화 수준을 하향 조절하였으며, AKT의 인산화 수준에는 큰 영향을 미치지 않았다. 캐리마이신으로 A549 세포를 48 시간 동안 처리 한 후, mTOR 통로의 단백질 인산화 수준은 여전히 하향 조절 되었지만, 중간 농도에서 PI3K/AKT 통로는 피드백 방식으로 활성화되어, PI3K 및 AKT의 인산화 수준이 크게 증가하였다. 그러나 PI3K 및 AKT 단백질의 인산화 수준은 고농도(50μg/ml)에서 다시 억제되었다. 따라서, 과감하게 추측컨대, 캐리마이신은 mTORC1과 mTORC2의 이중 억제제일 수 있으며, 중저 농도 조건에서 캐리마이신은 mTORC1을 강한 수준으로 억제할 수 있지만, 48시간 작용할 경우, 강력한 음성 피드백 조절 작용이 있으며; 고농도 조건에서는, mTORC2에 대한 특정 억제 효과도 있다.

위상차 현미경을 통해 캐리마이신으로 48시간 동안 처리한 A549 세포를 관찰하면, 세포가 수축되고, 염색질이 응집되어, 뚜렷한 세포 사멸체를 형성하는 것을 관찰할 수 있으며, JC-1 염색의 결과는, 약물 농도가 증가함에 따라, 녹색 형광을 보이는 세포의 비율이 점차 증가하는 것으로 나타나며, 이는 캐리마이신이 농도 의존적으로 A549 세포의 미토콘드리아 막 전위를 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 웨스턴 블랏을 사용하여 세포 사멸 관련 단백질의 수준을 측정하였다. Procaspase-3의 단백질 수준은 감소하고, cleaved-caspase3의 단백질 수준은 증가하였으며, 동시에 caspase-3 기질 PARP가 저하되어, 캐리마이신이 A549 세포의 사멸을 유도하고 caspase 캐스케이드 반응을 활성화 시켰음을 나타낸다. Bax 수준은 증가하고, Bcl-XL 및 Bcl-2 수준은 감소하였다. 따라서, 캐리마이신으로 48시간 동안 처리하면, A549 세포의 사멸을 유도하여, 종양 세포 증식을 억제할 수 있다. 위 데이터는 캐리마이신을 24시간 동안 처리한 후, 세포 사멸 현상이 뚜렷하지 않고, 48시간 처리 후에 뚜렷한 농도 의존적 세포 사멸이 있으며, 초기 세포 사멸에서 후기 세포 사멸로 변화 함을 보여준다.

캐리마이신은 mTOR 억제제로서, A549 세포의 LC I형에서 II형으로의 형질 전환을 뚜렷하게 향상시킬 수 있으며, 자가포식 기질 P62의 단백질 수준을 하향 조절하며, MDC 염색 및 유세포 분석을 통해서도 자가포식의 증가를 입증했다. 자가포식 억제제 3-MA를 첨가한 후, A549에 대한 캐리마이신의 억제 효과가 감소하여, 캐리마이신이 유도하는 A549 세포의 자가포식은 파괴형 자가포식, 즉, 개리마이신이 자가포식 수준을 증가시켜 A549 세포의 증식을 억제함을 증명하며, A549 세포는 24시간 및 48시간 후, 비교적 뚜렷한 자가포식이 발생하며, 세포가 사멸을 겪기 전에, 캐리마이신은 주로 자가포식을 유도하여 세포 생존을 억제할 수 있다. 본 발명에서 A549 세포를 캐리마이신으로 24시간 처리하면, ERK의 단백질 인산화 수준이 현저히 높아져, PI3K/AKT/mTOR 통로를 억제하여 Ras/Raf/MEK/ERK 통로를 활성화시키는 것으로 판단된다.

종합해보면, 캐리마이신은 농도 의존적으로 인체 비소세포 폐암 A549의 증식을 억제하고, 세포 사멸을 유도할 수 있으며; mTORC1 및 mTORC2의 이중 억제제로 작용할 수 있으며, 중저 농도에서는, 주로 mTORC1을 억제하여, PI3K, AKT의 피드백 활성화를 일으키며, 고농도에서는, mTORC2를 억제하여, PI3K, AKT 단백질의 인산화 수준을 감소시키며; A549 세포의 자가포식을 유도할 수 있으며, 자가포식은 세포를 사멸하는 작용을 하며; A549 세포에 S기 정지를 유도할 수 있으며; 또한, 캐리마이신은 Ras/Raf/ERK 경로를 활성화하여, Ras, Raf 단백질 수준을 향상시키고, ERK의 인산화 수준을 향상시킨다.

상기 내용은 본 발명의 비교적 바람직한 실시예일뿐, 어떠한 형식으로든 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 본 발명은 비교적 바람직한 실시예를 들어 상기와 같이 공개했지만, 본 발명을 한정하는 것은 아니며, 본 발명을 익숙히 아는 기술자가 본 발명의 기술 방안을 벗어나지 않는 범위 내에서, 상기 제시된 기술 내용을 적용하여 일부를 변경하거나 동등한 변화를 주는 동등한 실시예로 수정할 경우, 본 발명의 기술 방안의 내용을 벗어나지 않는 한, 본 발명의 기술적 본질에 근거하여 상기 실시예에 대해 임의의 간단한 수정, 동등한 변화 및 수정을 할 경우, 모두 본 발명의 방안에 포함된다.

Claims

mTOR 억제제에 있어서, 상기 mTOR 억제제에는 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성이 포함되는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제1항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중 단백질의 다른 자리 입체성 억제제 또는 촉매 억제제이며;
바람직하게는, 상기 촉매 억제제는 키나아제 억제제이며;
바람직하게는, 상기 mTOR 억제제는 mTORC1 및 mTORC2의 활성화를 억제하며;
바람직하게는, 상기 mTOR 억제제는 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 항암 약물, 및/또는 당뇨병 치료 약물, 및/또는 알츠하이머 치료 약물, 및/또는 노화 완화 약물인 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제3항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 항암 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제3항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 당뇨병 치료 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 경로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제3항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 알츠하이머 치료 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
제3항에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 mTOR 신호 통로 경로를 통해 작용하는 노화 완화 약물이며, 적어도 PI3K/Akt/mTOR 신호 통로 경로 중의 PI3K 단백질, AKT 단백질, mTOR 단백질, S6K1 단백질, 4EBP1 단백질 중의 1종 이상의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제.
약물 조성물에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따르는 상기 mTOR 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 활성 성분;을 포함하며,
바람직하게는, mTOR 억제제의 용량 범위는 1~10000mg/kg; 바람직하게는 10~5000mg/kg; 바람직하게는 50~1000mg/kg; 더 바람직하게는 100~500mg/kg이며;
바람직하게는, 상기 약물 조성물에는 제1 활성 성분 및 제2 활성 성분이 포함되며, 상기 제1 활성 성분에는 제1항 또는 제2항에 따르는 상기 mTOR 억제제가 포함되며, 상기 제2 활성 성분에는 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물이 포함되며;
바람직하게는, 상기 약물 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 임의의 제형이 포함되며, 바람직하게는, 제형에는 산제, 정제, 과립제, 캡슐, 용액제, 유제, 현탁제가 포함되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
조합 제품에 있어서, 상기 조합 제품에는 제1 약제가 포함되며, 상기 제1 약제에는 제1항 또는 제2항에 따르는 상기 mTOR 억제제 또는 제8항에 따르는 상기 약물 조성물;이 포함되며,
바람직하게는, 상기 조합 제품에는 제2 약제가 더 포함되며;
바람직하게는, 상기 제2 약제에는 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물이 포함되는 것을 특징으로 하는 조합 제품.
제1항 또는 제2항에 따르는 상기 mTOR 억제제 또는 제8항에 따르는 상기 약물 조성물 또는 제9항에 따르는 상기 조합 제품을 mTOR 통로 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 약물에 응용함에 있어서,
바람직하게는, 상기 캐리마이신, 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 1종, 또는 이소발레릴 스피라마이신I, 이소발레릴 스피라마이신II, 이소발레릴 스피라마이신III 중의 2종 또는 3종의 조성은 mTOR를 표적화하는 방법에 의해 대사 미세환경을 제어하여, mTOR 통로 관련 질병을 억제하며;
바람직하게는, mTOR 통로 관련 질병은, 연령 관련 질환, 이식 거부 관련 질환, 만성 염증성 질환, 글리코겐 저장 관련 질환, 헌팅턴병, 악성 종양, 전이암, 전신성 홍반성 루푸스, 염증 및 면역 활성화 관련 질환, 백혈구 감소증 관련 질환, 빈혈, 혈소판 감소증, 스텐트 코팅 관련 질환, 신장 기능 부전, 비만, 당뇨병, 비알코올성 지방간 관련 질환, 질병으로 인한 감소, 다낭성 신장 질환, 파킨슨병 및 섬유증 중 적어도 하나이며;
바람직하게는, 연령 관련 질환은 근육감소증, 피부 위축, 근육 위축, 뇌 위축, 죽상 동맥 경화, 동맥 경화, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 고혈압, 발기 부전, 치매, 알츠하이머병, 백내장, 연령 관련 황반 변성, 전립선 암, 뇌졸중, 수명 감소, 신장 기능 장애 및 연령 관련 난청, 노화 관련 이동성 장애, 인지 기능 저하, 기억 장애, 힘줄 강성화, 심근 비대 및 수축 이완기 기능 장애 등 심장 기능 장애, 면역 기능 노화에서 선택되며;
바람직하게는, 상기 섬유증에는 간 섬유증, 심근 섬유증, 심혈관 섬유증, 폐 섬유증, 췌장 섬유증, 신장 섬유증 또는 비장 섬유증이 포함되며;
바람직하게는, 상기 악성 종양은 프계의 조혈성 종양, 골수계 조혈성 종양, 중간엽 세포원 종양, 중추 및 말초 신경계의 종양, 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선 여포암 및 카포시 육종에서 선택되며;
바람직하게는, 림프계의 조혈 종양은 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프 모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모세포 림프종, 외투 세포 림프종, 골수종 및 버킷 림프종;에서 선택되며, 골수계 조혈성 종양에는 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수세포 백혈병;이 포함되며, 중간엽 세포원 종양에는 섬유 육종 및 횡문근 육종;이 포함되며, 중추 및 말초 신경계의 종양에는 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종;이 포함되며,
바람직하게는, 악성 종양에는 방광암, 유방암, 결장암, 중피종, 신장암, 간암, 폐암, 두 경부암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 위암, 림프종, 자궁경부암, 대장암, 갑상선암, 전립선암, 피부암, 구강암;이 더 포함되며,
바람직하게는, mTOR 억제제의 악성 종양 세포에는, 인체 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 인체 간암 세포 HepG2, 인체 비소세포 폐암 세포 A549, 인체 대세포 폐암 세포 H460 및 H1299, 인체 신장 투명세포 선암 세포 786-O, 인체 신장 선암 세포 769-P, 인체 신경교종 세포 U251, 인체 교모세포종 세포 A172, 인체 조직 림프종 세포 U937, 인체 자궁경부암 세포 HeLa, 인체 전립선암 세포 PC3, 인체 췌장암 세포 PANC-1, 인체 식도암 세포 TE-1, 인체 위선암 세포 SGC-7901, 인체 결장암 세포 HT-29, 인체 전골수성 백혈병 세포 HL-60;이 포함되며,
바람직하게는, mTOR 억제제는 인체 비소세포 폐암 세포 A549를 억제하는 응용.