JP7127136B2 - mTOR阻害剤、薬物組成物及びその応用 - Google Patents
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Description
別の案として、薬物組成物は第1活性成分及び第2活性成分を含む。前記第1活性成分は上記のようなmTOR阻害剤を含み、前記第2活性成分はmTOR経路関連疾患を治療及び/または予防する薬物を含む。
本発明の第4の目的は、mTOR阻害剤を含む抗腫瘍薬を提供することである。前記mTOR阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンI、イソバレリルスピラマイシンII、イソバレリルスピラマイシンIIIの1つ、またはイソバレリルスピラマイシンI、イソバレリルスピラマイシンII、イソバレリルスピラマイシンIIIの2種若しくは3種の組合せを含む。
さらなる案として、前記カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンI、イソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIIIは、mTORを標的とする方式により、代謝微小環境を制御して、mTOR経路関連疾患を抑制する。
以下、図を組み合わせて本発明の具体的な実施方式について、さらに詳細に記載する。
図は本発明の一部分とし、本発明をさらに理解するために使用される。本発明の概要的実施例及びその説明は本発明を説明するのに用いるが、本発明を不当に限定しない。以下の記載において図はいくつかの実施例に過ぎず、当業者が、創造的労働を行わない前提で、これらの図に基づいてその他の図を得ることができることは明らかである。
規格:200mg/350mg
裸錠の処方:
イソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII 200g
微結晶セルロース 110g
カルボキシメチルデンプンナトリウム 22g
ポビドンK30(5%) 15g
ステアリン酸マグネシウム 3g
製造 1000錠
コーティング液の処方:
オパドライII 21g
蒸留水 適量
製造 105ml
裸錠の調製:主薬及び添加剤をそれぞれ100メッシュに通し、処方量のイソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII、微結晶セルロース及び処方の1/2量のカルボキシメチルデンプンナトリウムを均一に混合する。その後5%ポビドンK30水溶液を添加して練合物を作製し、18メッシュで造粒し、湿潤顆粒を60℃の通風条件下で2h乾燥させる。乾燥後18メッシュで整粒し、さらに処方の1/2量のカルボキシメチルデンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合した後、直径11mmの臼で打錠すると、重量が350mg、硬度が6.5kgの薬物含有裸錠が得られる。
処方:
イソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII原料粉末 1000g
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース(5%) 92.5g
カルボキシメチルデンプンナトリウム(3%) 55.5g
ステアリン酸マグネシウム(1%) 18.5g
デンプン 総重量-その他の原料、添加剤の重量
総重量 1850g
処方:
イソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII原料粉末 1000g
デンプン 1080-イソバレリルスピラマイシンI原料粉末の重量
薬用3号カプセル 1000粒
流動パラフィン 50ml
処方:
イソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII原料粉末 1250g
クエン酸(0.5%) 15g
スクロース 総重量-その他の原料、添加剤
総重量 約5000g
色素(クルクミン) 約1g
処方:
イソバレリルスピラマイシンIまたはイソバレリルスピラマイシンIIまたはイソバレリルスピラマイシンIII原料粉末 1250g
粉糖 20000g
デキストリン 9000g
5%PVP-K30 適量
イソバレリルスピラマイシンI250mg及びイソバレリルスピラマイシンII原料粉末250mg、並びに等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、5ml水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、pHは4.6~5.6の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール40mgを添加し、低温で9h急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に10mlの滅菌水で溶解する。
カリマイシン500mg、及び等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、5mlの水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、pHは4.6~5.6の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール40mgを添加し、低温で9h急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に10mlの滅菌水で溶解する。
測定の目的は、測定試料の体外での細胞増殖抑制作用または細胞毒性活性を評価することである。
細胞株:
ヒト乳腺癌細胞MCF-7及びMDA-MB-231、ヒト肝癌細胞HepG2、ヒト非小細胞肺癌細胞A549、ヒト大細胞肺癌細胞H460及びH1299、ヒト腎淡明細胞癌細胞786-O、ヒト腎細胞癌細胞769-P、ヒト神経膠腫細胞U251、ヒト神経膠芽腫細胞A172、ヒト組織リンパ腫細胞U937、ヒト子宮頸癌細胞HeLa、ヒト前立腺癌細胞PC3、ヒト膵臓腺癌細胞PANC-1、ヒト食道癌細胞TE-1、ヒト胃腺癌細胞SGC7901、ヒト結腸癌細胞HT-29、ヒト前骨髄球性白血病細胞HL-60はAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA)で購入する。
試薬:
RPMI1640培地、MEM培地、DMEM低グルコース培地、ウシ胎児血清は米国Gibco社から購入し、トリプシン、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メチルチアゾリルテトラゾリウム(MTT)は、米国Sigma社から購入する。
機器:
炭酸ガスインキュベータ(Sanyo、Japan)、酵素免疫測定装置(Tecan、Austria)、96ウェル培養プレート(Corning、USA)、倒立顕微鏡(Motic、China)。
接着細胞:
MCF-7、MDA-MB-231、HepG2、A549、H460、H1299、786-O、769-P、U251、A172、HeLa、PC3、PANC-1、TE-1、SGC7901、HT-29は接着細胞である。対数期の接着腫瘍細胞を選択し、パンクレアチンで消化した後、10%ウシ胎児血清を含む培地で4~5×104/mlの細胞懸濁液を調製する。96ウェル細胞プレート中に各ウェル100μlで接種し、37℃、5%CO2で24h培養する。実験群は異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む新しい培地に交換し、対照群は同体積の溶媒を含む培地に交換する。各群に3つの平行ウェルを設け、37℃、5%CO2で48h培養する。上清液を捨て、PBSで慎重に3回洗浄し、各ウェルに0.5mg/mlのMTTを含む新しく調製した培地を100μL添加し、37℃で続けて4h培養する。慎重に上清を除去し、150mLのDMSOを添加し、小型振盪器で10min均一に混合した後、マイクロプレートリーダを用いて492nm部分の光学密度値を測定する。
U937、HL-60は浮遊細胞である。対数期の細胞を選択し、10%仔牛血清を含むRPMI1640培地で2×105/mlの細胞懸濁液を調製する。96ウェル培養プレート中に各ウェル50μlで接種し、37℃、5%CO2で24h培養する。実験群に異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む培地50μLを添加し、対照群は同体積の溶媒を含む培地を添加する。各群に3つの平行ウェルを設け、37℃、5%CO2で48h培養する。各ウェルに5mg/mlのMTTを含む新しく調製した培地を10μL添加し、37℃で続けて4h培養する。溶解液(SDS10g、0.1mLの10MHCl、イソブタノール5mLを蒸留水で100mLに希釈する)100μLで結晶を溶解し、37℃で12h培養する。マイクロプレートリーダを用いて492nm部分の光学密度値を測定する。
腫瘍細胞成長抑制率(%)=[A492(陰性対照)-A492(投与群)]/A492(陰性対照)×100%
これから試料の半数阻害濃度(IC50)を求める。
細胞株:
A549細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA)から購入する。細胞は10%ウシ胎児血清、2%グルタミン、ペニシリン(100U/ml)を含むDMEM培地中で培養し、5%CO2、37℃のインキュベータ中で培養する。実験で用いる細胞は、いずれも対数期の細胞である。
試薬:
ラパマイシン(Rapamycin)は、アメリカSigma社(St.Louis、MO、USA)から購入する。
A549は接着細胞である。対数期の細胞を用い、異なる濃度(0.05、5、17、50μg/ml)のイソバレリルスピラマイシンI及び対照薬物のラパマイシン(Rapamycin、20μg/ml)を添加し、5%CO2、37℃のインキュベータで24h培養する。細胞を収集して、ウェスタンブロッティング法で測定する。
1 溶液の調製
1)30%ポリアクリルアミド溶液:
試薬の名称 用量
アクリルアミド 290g
メチレンビスアクリルアミド 10g
ddH2O 1,000ml
ddH2Oを添加して1,000mlに定容する必要があり、褐色瓶に入れて4℃で保存する。
2)Tris緩衝液は、Tris塩基を脱イオン水に完全に溶解した後、HClで溶液のpH値を調節する。
分離ゲル用緩衝液:1.5MTris-HCl(pH8.8);
スタッキングゲル用緩衝液:1MTris-HCl(pH6.8)。
3)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS):脱イオン水で10%のストック液を調製して室温で保存し、使用に備える。
4)過硫酸アンモニウム(AP):脱イオン水で少量の10%(w/v)ストック液を調製して4℃で保存する。過硫酸アンモニウムはゆっくりと分解するため、隔週で新しく調製しなければならない。
5)5×Tris-グリシン電気泳動バッファー:
試薬の名称 用量
Tris 7.55g
10%(w/v)のSDS 25mL
グリシン 47g
ddH2O 500mLに定容する
4℃の冷蔵庫で保存して使用に備え、使用するときddH2Oで1×バッファーに希釈して使用する。
6)細胞溶解液:50mMのHepes(pH7.4)、1%Triton-X100、100mMのNaF、1mMのEDTA、1mMのEGTA、2mMのオルトバナジン酸ナトリウム、1mMのPMSF、10mg/mlのaprotinin、10mg/mlのleupeptin、10mg/mlのpepstatinA。
7)5×ローディングバッファー
試薬の名称 用量(mL)
Tris-HCL(pH6.8) 0.6
グリセリン(50%) 5
SDS(10%) 2
β-メルカプトエタノール 0.5
ブロモフェノールブルー(1%) 1
8)転写バッファー:
試薬の名称 用量
Tris-Base 4.55g
グリシン 21.65g
ddH2O 1200mL
メタノール 300mL
9)ブロッキング液:
試薬の名称 用量
脱脂粉乳 5g
PBST 100mL
1)各チューブの細胞に60~100μlの細胞溶解液を添加し、4℃のアイスボックス内で1h氷浴する。12,000r/minで10~15min遠心分離し、上清を0.5mlEPチューブに取り、Bio-Radでタンパク質を測定、定量する。その後、5×ローディングバッファーを加え、沸騰水浴に3~5min入れ、-80℃で凍結保存する。
2)Tab.2-1に基づいて15%、12%または10%のアクリルアミド分離ゲルを調製する。順番に各成分を混合し、TEMED及びAPを添加すると、すぐに混合物を高速で回転させて電気泳動槽の2枚のガラス板の間にスタッキングゲルに必要な空間を残して流し込む。分離ゲル上を1層のイソプロパノールで覆い、ゲルを垂直にして室温で約30min置く。
3)分離ゲルが完全に重合すると、イソプロパノールを除き、脱イオン水で10回洗浄し、ろ紙で水を吸い取る。Tab.2-2に基づいてスタッキングゲルを調製し、電気泳動槽の2枚のガラス板の間に流し込んだ後、すぐにきれいなサンプルコームを挿入する。
4)スタッキングゲルが完全に重合した後、電気泳動装置中に1×電気泳動バッファーを満たし、試料を所定の順序で試料ウェルに入れて電気泳動を開始する。試料がスタッキングゲルにあるとき、電圧は50~60V、試料が分離ゲルまで泳動すると、電圧を100~140Vに調整する。
1)SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動が終了すると、ゲルを転写バッファー中に30min浸漬し、8枚のWhatman3MMろ紙及び1枚のニトロセルロースメンブレンをゲルの大きさに合わせて切る。ニトロセルロースメンブレンをメタノール中に1min浸し、ニトロセルロースメンブレンを脱イオン水中に浸して気泡を除去する。
2)ゲルを「サンドイッチ」状に重ね、転写タンク中に入れ、ゲルの一面を陰極に接続する。100mAで3h行う。
3)転写後のニトロセルロースメンブレンをポンソーS溶液中に5~10min入れ、その間は軽く揺らす。タンパクのバンドが出現すると、脱イオン水で数回洗浄し、染色液で基準のタンパク分子量の位置を標識する。
4)ブロッキング液を入れたシャーレにメンブレンを入れ、2hブロッキングする。
5)さらに0.1ml/cm2で第1抗体を含むブロッキング液を加え、4℃で一夜置く(各種抗体の希釈倍数はTab.2-2の通り)。
6)第1抗体を回収し、PBSTでメンブレンを1回あたり10minで3回洗浄する。メンブレンを150mMのNaCl、50mMのTris-HCl(pH7.5)を含む溶液中に移して10min揺らす。
7)0.1ml/cm2で第2抗体を含み、リン酸塩及びアジ化ナトリウムを含まないブロッキング液中にメンブレンを入れる。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した第2抗体は1,000倍に希釈する。
8)150mMのNaCl、50mmol/lのTris-HCl(pH7.5)を含む溶液を用いて、メンブレンを1回あたり10minで3回洗浄する。暗室でECLキットを用いて呈色させ、写真をスキャンして保存する。
イソバレリルスピラマイシンIをA549細胞に24時間作用させた後、ウェスタンブロッティング法を採用してPI3K/Akt/mTORシグナル経路のタンパク及びそのリン酸化型のレベルを考察した。結果は図1及び図2に示す通りである。
(1)MTT法でカリマイシンの体外での腫瘍細胞生存率に対する影響を測定する
A549細胞を4×103個/mLの密度で96ウェルプレートに各ウェル100μLで接種し、24または48h培養する。その後、異なる濃度のカリマイシンを添加し、5%CO2のインキュベータに入れて37℃で異なる時間引き続き培養した後、各ウェルに濃度が5mg/mLのMTTを100μL添加して2~3h培養する。その後、上清液を除去し、150μLのDMSOを添加し、マイクロシェーカで10min振とうさせて結晶を完全に溶解させ、マイクロプレートリーダで各ウェルの吸光度(A値)を測定する。発光波長は492nmである。同時にラパマイシンを陽性対照とし、以下の公式に基づいて細胞に対する薬物の成長抑制率を計算する:抑制率(%)=[A492(control)-A492(カリマイシン)]/[A492(control)-A492(blank)]×100%
PI3K/AKT/mTORシグナル経路の異常は、数種の腫瘍型で頻繁に発生する。PI3Kは細胞内ホスファチジルイノシトールキナーゼであり、PI3Kプロテインファミリーは細胞増殖、分化、アポトーシス及びグルコース輸送など数種の細胞機能の調節に関与する。AKT(プロテインキナーゼB)はPI3K下流の主要なエフェクターであり、AKTはmTORを直接リン酸化することにより、またはTSC2(結節性硬化症複合体2)を不活性化することにより、mTORC1を活性化することができる。mTORC1は下流の真核生物翻訳開始因子結合タンパク4E-BP1及びリボソームタンパクS6キナーゼ1S6K1を直接リン酸化し、これにより細胞の生合成及び増殖を調節する。
方法:蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーで細胞のオートファジーを測定する
ダンシルカダベリン(Dansylcadaverine、MDC)は、蛍光色素で、好酸性染色剤である。通常、オートファゴソーム形成の測定に用いられる特異的標識染色剤の酸性リソソームの凝集は、一定程度にオートファジーのレベルを反映することができる。
方法:AnnexinVは分子量が35kDaのCa2+依存性リン脂質結合タンパク質であり、ホスファチジルセリン(Phosphatidylserine、PS)に特異的に結合することができる。ホスファチジルセリンは主に細胞膜の内側に分布し、細胞にアポトーシスが生じたとき、細胞はホスファチジルセリンを細胞表面、すなわち細胞膜外側に移動させる。FITC標識AnnexinVプローブ、すなわちAnnexinV-FITCは、これらの移動したホスファチジルセリンに特異的に結合することができ、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡で非常に簡単で直接的に、細胞にアポトーシスが生じた状況を確認する。
低酸素及びその他のインスリン、成長因子などの要素は、HIF-1αの発現を誘導することができる。過剰に活性化したmTORも酸素が十分な条件下で、転写レベルからHIF-1αの発現を活性化させることができ、さらにはその下流の血管内皮増殖因子VEGFなど血管形成遺伝子の転写をもたらし、血管透過性の増加、細胞外マトリックスの変性、血管内皮細胞の遊走、増殖及び血管形成などを促進する作用を有する。
Ras/Raf/MEK/ERKシグナル経路は、細胞外シグナルを細胞核内に伝達する最も重要なシグナル経路の1つであり、細胞の生存、増殖、分化、アポトーシス、代謝などを制御する機能において、重要な作用を有する。
異なる濃度のカリマイシンでそれぞれA549を24及び48h処理した後、PIフローサイトメトリーを使用してその細胞周期の分布を測定した。24h薬物処理しても、細胞周期に明らかな影響がないことを発見した。48h薬物処理すると、対照群と比較して、1.7μg/ml、5μg/ml、17μg/ml及び50μg/mlのS期細胞はそれぞれ1.86%、9.39%、4.75%、24.38%増加した。データをまとめると、カリマイシンで48h処理すると、A549細胞のS期停止を濃度依存的に誘導する。
Claims (9)
- PI3K/Akt/mTORシグナル経路におけるタンパクの活性化を抑制する際に用いる、カリマイシンまたはイソバレリルスピラマイシンIを含む、mTOR活性阻害剤であって、前記カリマイシンは主要な活性成分としてイソバレリルスピラマイシンI、イソバレリルスピラマイシンIIおよびイソバレリルスピラマイシンIIIを含み、イソバレリルスピラマイシンI、イソバレリルスピラマイシンIIおよびイソバレリルスピラマイシンIIIの総量は60%以上である、mTOR活性阻害剤。
- mTORC1及びmTORC2の活性化を抑制するために用いられる、請求項1に記載のmTOR活性阻害剤。
- PI3K/Akt/mTORシグナル経路におけるPI3Kタンパク、AKTタンパク、mTORタンパク、S6K1タンパク、4EBP1タンパクの1つまたは複数の活性化を少なくとも抑制するために用いられる、請求項1に記載のmTOR活性阻害剤。
- PI3K/Akt/mTORシグナル経路におけるタンパクの活性化を抑制する際に用いる、請求項1から3に記載のmTOR阻害剤並びに薬学的に許容可能な担体及び/または活性成分を含むmTOR活性阻害用薬物組成物。
- mTOR阻害剤の用量範囲は1~10000mg/kgである、請求項4に記載の薬物組成物。
- mTOR阻害剤の用量範囲は10~5000mg/kgである、請求項4に記載の薬物組成物。
- mTOR阻害剤の用量範囲は50~1000mg/kgである、請求項4に記載の薬物組成物。
- mTOR阻害剤の用量範囲は100~500mg/kgである、請求項4に記載の薬物組成物。
- 薬学的に許容可能な剤形も含み、前記剤形は散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤を含む、請求項4に記載の薬物組成物。
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