KR101812952B1

KR101812952B1 - 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101812952B1
Application number: KR1020160115026A
Authority: KR
Inventors: 박범준; 정연진
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2017-12-28
Also published as: WO2018048195A1

Abstract

본 발명은 퀴나크린(Quinacrine)을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 기술로, 더욱 상세하게는, 퀴나크린은 암 세포의 생존율을 억제하고 암 세포의 세포사멸을 증가시켰으며, 특히 침략적 암 세포에서 민감성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있고, 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 활용될 수 있다.

Description

퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating refractory cancer comprising Quinacrine}

본 발명은 퀴나크린(Quinacrine)을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현재 통계청 자료에 따르면, 한국인의 사망 원인 중 암으로 인한 사망이 1위를 차지하고 있다. 암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 세포분열을 계속하는 질병으로, 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생한다. 암의 원인은 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 일어나고 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비 정상적으로 증식하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있으나, 암의 발생 원인에 대해서는 아직도 명확하게 밝혀진 바가 없다.

암은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)로 구분되어지는데, 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되어지는 전이(metastasis)가 되지 않는 것에 반해 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르는 아주 중요한 원인이 된다.

세포의 주기는 S기(DNA 복제), M기(유사분열) 및 이러한 S기와 M기 사이의 2개의 간기(G1기 및 G2기)를 포함한다. 세포 주기 중의 체크포인트(check point)는 세포 주기 스테이지를 통해 정확한 진행이 이루어지게 하며, DNA 완전성, DNA 복제, 세포 크기 및 주위 환경 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 다세포 생물체는 게놈의 완전성을 유지하는 것이 특히 중요하며, 게놈의 상태를 모니터링 하는 다수의 체크포인트가 존재한다. 그 중에서, G1 체크포인트와 G2 체크포인트는 각각 DNA 복제와 유사분열 전에 존재한다. 손상된 DNA가 복제되면 이는 종종 돌연변이를 유발하기 때문에 S기에 진입하기 전에 DNA 손상을 복구하거나 교정하는 것이 중요하다. 대규모의 DNA 손상을 복구하지 않고 G1 및 G2 체크포인트를 통해 진행되면 유사분열 대변동(catastrophe) 및/또는 세포사멸(apoptosis)이 유도된다.

대부분의 암 세포는 G1 체크포인트 관련 단백질, 예컨대 p53, Rb, MDM-2, p16^INK4 및 p19^ARF에 이상을 가지고 있다. 또한, 돌연변이는 종양 유전자 산물, 예컨대 Ras, MDM-2 및 사이클린 D의 과잉발현 및/또는 과다 활성화를 일으킬 수 있으며, 이는 G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킨다. 이러한 돌연변이 외에도, 과도한 성장 인자 시그널링이 성장인자의 과잉 발현으로 유발되어, G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킬 수 있다. 기능상실 돌연변이 및 기능획득 돌연변이와 함께, 성장 인자 수용체 또는 다운스트림 시그널 전달 분자에 의한 연속 활성화는 G1 체크포인트를 압도함으로써 세포의 형질전환을 일으킬 수 있다. 또한, 파괴되거나 폐기된 G1 체크 포인트는 보다 높은 돌연변이율 및 암 세포에서 관찰되는 다수의 돌연변이에 기여한다. 결과적으로, 대부분의 암 세포는 과도한 DNA 손상에 대한 생존을 위해 G2 체크포인트에 의존한다.

암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있으나 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그에 따른 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하더라도 미세하게 전이된 암 세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 다양한 항암제의 개발에도 불구하고 항암제를 이용한 암 치료 시, 항암제에 대한 암 세포의 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 항암제에 대한 내성이 생긴 암 세포들이 급격히 증식하기 때문이다. 오늘날에는 약 60여 종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 암 발생 및 암 세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 항암제들은 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암 세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다. 또한, 대부분의 항암제는 세포 내 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로 효과를 나타내는데, 이들 항암제는 암 세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직 세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위장관 점막 손상, 탈모 등 여러 부작용이 나타나는 단점이 있다. 또한, 방사선 치료도 방사선에 대한 암 세포가 나타나게 되어 완치가 어렵다.

퀴나크린(Quinacrine)은 (RS)-N′-(6-Chloro-2-methoxy-acridin-9-yl)-N,N-diethylpentane-1,4-diamine로서, 1930년대에 항말라리아제로서 최초 승인되어 2차 세계대전 동안 널리 사용되었으며, 장내 기생충인 편모충증 치료제로서도 승인되었다. 또한, 퀴나크린은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 억제제로서 연구되어 왔으며, 구충제 즉, 촌충 감염 치료제로서도 사용되어 왔다. 퀴나크린은 프리온 단백질과 결합하여 in vitro 상에서 프리온 응집 형성을 예방할 수 있으며, 크로이츠펠트 야곱병 치료를 위해 영국과 미국 등에서 임상 진행 중에 있다. 또한, 퀴나크린은 여성의 비수술적 불임을 위해 사용되며, 수술적 불임보다 안전하다고 알려져 있다.

대한민국 등록특허 제 10-1298631호 (2013. 08. 14. 등록)

본 발명의 목적은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 퀴나크린(Quinacrine)은 암 세포의 생존율을 억제하고 암 세포의 세포사멸을 증가시켰으며, 특히 침략적 암(aggressive cancer) 세포에서 민감성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있고, 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 활용될 수 있다.

도 1A 및 도 1B는 유방암 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 1C 및 도 1D는 유방암 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 프리마퀸과 비교한 것이다.
도 1E는 유방암 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 유세포 분석으로 확인한 것이다.
도 2A는 HCT 116 p53-/- 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 2B는 p53 억제제인 PFT-α를 처리하였을 때, 퀴나크린에 의해 유도되는 암 세포의 사멸이 증가하는 것을 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 2C 및 도 2D는 퀴나크린과 세포주기와의 연관성을 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 3A는 c-바이오포털 프로그램을 이용한 암 유전체학(genomics) 분석을 통해 Chk1/2와 p53과의 연관성을 확인한 것이다.
도 3B는 퀴나크린에 의한 p-Chk2의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 4A는 퀴나크린에 의한 Chk2의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 4B는 퀴나크린에 의한 Chk2의 발현 억제 효과를 면역형광법으로 확인한 것이다.
도 4C는 Chk2의 발현 억제에 있어서 퀴나크린의 선택적 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 4D 및 도 4E는 퀴나크린에 의한 Chk1/2의 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 5A는 퀴나크린에 의한 Chk2의 발현 억제가 야생형 p53을 HCT 116 p53-/- 세포에 형질전환 시킨 후 감소되는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 5B는 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제가 야생형 p53을 HCT 116 p53-/- 세포에 형질전환 시킨 후 감소되는 것을 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 5C는 p53 돌연변이 삽입 마우스로부터 얻은 MEF 세포에서 4-하이드록시타목시펜(4-Hydroxytamoxifen, 4-OHT)에 의한 p53 돌연변이 발현 유도 및 p21의 발현 감소를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 5D는 MEF 세포에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 6A는 다양한 소세포성 폐암 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 6B는 다양한 비소세포성 폐암 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 6C는 다양한 교모세포종 세포주에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 “예방”은 퀴나크린에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “치료”는 퀴나크린에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “퀴나크린”은 (RS)-N′-(6-Chloro-2-methoxy-acridin-9-yl)-N,N-diethylpentane-1,4-diamine로서, 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 억제제이며, p53의 활성 및 NF-Kb의 억제를 통한 항암 효과가 보고된 바 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “난치성 암”에서 난치성은, 특이적인 항암 치료에 대해 양호하게 반응하는데 실패하거나, 특이적인 항암 치료에 대해 양호하게 반응한 후 반복되거나 재발함을 의미한다. 본 발명에서 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 의미한다. 재발성 암은 통상의 암 치료 후 암이 재발하는 것을 의미하며, 말기 암은 통상의 암 치료에 의해 암이 완치율이 매우 낮거나 완치되지 못하는 것을 의미한다. 여기서 통상의 암 치료는 예를 들어, 수술, 화학치료, 방사선, 치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역치료 등을 포함한다. 또한, p53 결핍 암 및 p53 불활성 암은 종양 억제 유전자인 p53 유전자가 돌연변이로 인해 결핍되거나 p53의 활성이 불활성화 되는 암을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “형질 전환”은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입하거나, 원래 지니고 있는 유전자를 제거하여 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나 가장 많이 사용되는 방법으로는 지질 매개 유전자 도입(lipid mediated gene transfer), 정자 매개 유전자 도입(sperm mediated gene transfer), 전기천공법(electroporation), 상동성 재조합(homologous recombination), 미세주입법 등이 대표적이다.

본 발명에서 사용된 용어 “벡터(vector)”는 외래 유전자를 숙주세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 상기 벡터에 의하여 특정 유전자에 외래 유전자를 삽입시키거나 특정 유전자 형질발현을 붕괴(knock-out)시킬 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 통상적인 방법에 따라 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미하며, 또한, 인간화 항체 등 특수 항체도 포함한다.

또한, 본 발명에서 사용된 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상세하게는, 상기 난치성 암은 폐암, 뇌암, 유방암 및 신장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 퀴나크린은 암 세포의 생존율을 억제시키고, 암 세포의 세포사멸을 증가시킬 수 있다.

바람직하게는, 상기 퀴나크린은 Chk1/2의 발현을 억제할 수 있다.

바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염기성 염 또는 산성 염 중 어느 하나 이상일 수 있다. 염기성 염으로는 유기염기염, 무기염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염, 피리디늄염 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 산성 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학 조성물은 첨가제 및 보조제로서 충진제, 중량제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 방향제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 및 멸균 주사용액으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 흉골내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 경구 투여 및 흡입을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다

상기 약학 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품 조성물에 함유된 상기 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 세포 배양 및 시약 준비

A549, H1299, HEK 293, MCF7, MDA-MB231 및 MDA-MB468 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassus, VA, USA)에서 구입하여 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 또는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다. ACHN 세포주는 한국 세포주 은행(Korea cell line bank, KCLB, Seoul, Korea)으로부터 제공 받아 10% 소태아혈청 및 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. HCT 116 p53+/+, p53+/- 및 p53-/- 세포는 Vogelstein B(Johns Hopkins University, Baltimore)로부터 제공 받아 10% 소태아혈청 및 항생제가 포함된 McCoy's 5A(modified) 배지에서 배양하였다. MEF 세포는 14.5일된 배아(embryos)에서 표준 프로토콜을 이용하여 분리하였으며, 15% 소태아혈청 및 1% 항생제 포함된 MEM/EBSS 배지에서 배양하였다. 퀴나크린(Quinacrine)과 4-하이드록시타목시펜(4-Hydroxytamoxifen, 4-OHT)은 시그마(Sigma, Missouri, USA)에서 구입하였으며, 아드리아마이신(adriamycin), 피피트린-α(Pifithrin-α) 및 MG132은 칼바이오켐(Calbiochem, Darmstadt, Hessen, Germany)에서 구입하였고, 라파마이신(Rapamycin), 게피티닙(Gefitinib) 및 엘로티닙(Erlotinib)는 LC 연구소(LC Laboratory, Woburn, MA, USA)에서 제공 받았다.

실시예 2 : 유방암 세포주 MDA -MB 468에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과

유방암 세포주인 MDA-MB 468과 MCF7에서 MTT 분석을 수행하여 다양한 항암제에 의한 암 세포 생존율을 분석하였다. MDA-MB 468과 MCF7 세포주에 각각의 항암제를 처리하고 24시간 동안 배양한 후, MTT 용액을 0.5 mg/ml 농도로 처리하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 침전물을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1A 및 도 1B를 참조하여 보면, 퀴나크린은 MDA-MB 468 세포주에서 암 세포 생존율을 효과적으로 억제하였으나, MCF7 세포주에서는 억제 효과를 보이지 않았다. 또한, 도 1C 및 도 1D를 참조하여 보면, 퀴나크린은 MDA-MB 468 세포주에서 비슷한 화학 구조를 갖는 프리마퀸(primaquine)과 비교했을 때, 암 세포의 생존율을 효과적으로 억제하였으나, MCF7 세포주에서는 억제 효과를 보이지 않았다. MDA-MB 468 세포주는 MCF7 세포주보다 더 침략적인(aggressive) 유방암의 종류로, 퀴나크린은 일반적인 암이 아닌 침략적 암에서 민감성을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 유방암 세포주 MDA -MB 468과 MCF7에서 퀴나크린에 의한 세포사멸 효과

퀴나크린에 의한 암 세포 생존율의 억제가 세포사멸에 의한 유도인지를 확인하기 위해, MDA-MB 468과 MCF7 세포주를 DMSO 또는 퀴나크린으로 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 아넥신 V(Annexin V)-FITC 세포사멸 검출 키트(B32117, Biotool, USA)와 프로피디움 요오드화물(propidium Iodide, PI)을 이용하여 세포를 염색하고, 유세포분석으로 세포사멸을 측정하였다.

그 결과, 도 1E를 참조하여 보면, 퀴나크린은 침략적 유방암 세포주인 MDA-MB 468에서 세포사멸을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 4 : p53 결핍 암 세포에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과

p53 결핍 암 세포에서 퀴나크린의 항암 효과를 분석하기 위해, HCT 116 세포주와 p53이 결핍되어 있는 HCT 116 p53-/- 세포주에 퀴나크린을 농도 별로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, MTT 분석을 수행하여 암 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과, 도 2A를 참조하여 보면, 암 세포의 생존율은 퀴나크린의 농도가 증가할수록 억제되는 것을 확인하였고, 특히 HCT 116 p53-/- 세포주가 HCT 116 세포주에 비해 퀴나크린에 더 민감성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 도 2B를 참조하여 보면, p53의 억제제인 PFE-α의 선처리는 퀴나크린에 의해 유도되는 암 세포의 사멸을 증가시키는 것을 확인하였다. 즉, 퀴나크린에 의해 유도되는 암 세포의 사멸은 p53이 손상된 상태에서 증가하였다.

실시예 5 : 퀴나크린에 의한 세포사멸과 세포주기와의 연관성 확인

퀴나크린에 의한 암 세포의 사멸이 세포주기와 연관되어 있는지를 확인하기 위해, MTT 분석을 수행하여 시간에 따른 세포 생존율을 모니터링하였다.

그 결과, 도 2C를 참조하여 보면, MDA-MB 468 세포주에서 12시간 내지 24시간에 암 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 세포주기를 고려해 볼 때, 퀴나크린에 의한 세포 사멸은 세포주기, 특히 S 내지 M기와 연관되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 도 2D를 참조하여 보면, 탁솔(taxol)을 이용하여 G1기의 세포주기 억제한 후 세포 생존율을 측정하였을 때, G1-S기의 억제는 퀴나크린에 의해 유도되는 암 세포의 사멸을 감소시켰다. 따라서, 퀴나크린에 의해 유도되는 세포 사멸은 S-G2/M기 조절 메커니즘과 연관되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 6 : 퀴나크린에 의한 p- Chk2의 발현 억제 효과

HCT 116 세포주는 UV 비처리 또는 처리 후, 다양한 항암제와 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 단백질 분석을 위해, RIPA 버퍼(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 10% sodium deoxycholate)를 이용하여 단백질을 추출한 후 정량하여 각각의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 전기영동으로 분리한 단백질은 트렌스퍼 버퍼(transfer buffer; 20% methanol, 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine)를 이용하여 350 mA에서 120분간 이모빌론-피-트렌스퍼 멤브레인(immobilon-P transfer membrane; PVDF transfer membrane, Port Washington, NY, USA)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 3% 탈지유(non-fat dry milk; skim milk solution)로 블로킹(blocking)시킨 후, 4℃에서 일차 항체로 24시간 동안 반응시키고 TBST(tris-buffered saline and tween 20)로 3회 세척하였다. 그 후, HRP가 접합된 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척하였다. 증류수로 한 번 더 세척한 후, 멤브레인에 ECL 검출 kit(Advansta)의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 혼합액을 도포하고, X-선 필름(X-ray film; CP-G plus, Agfa Healthcare Ltd, New Orleans, LA, USA)에 노출하여 현상한 다음 필름 상에서 단백질의 발현 정도를 관찰하였다. 웨스턴 블롯에 사용된 Actin(sc-1616), GFP(sc-9996), Chk2(sc-9064) 및 p53DO1(sc-126)에 대한 항체는 산타 크루즈(Santa Cruz, California, USA)에서 구입하였고, p-Chk1(2341), p-Chk2(2661) 및 p-Erk(9101)에 대한 항체는 셀 시그널링(Cell signaling, Massachusetts, USA)에서 구입하였다.

도 3A는 c-바이오포털 프로그램(c-Bioportal program)을 이용하여 암 유전체학(genomics)을 분석하여 나타낸 것으로, Chk1/2의 발현은 p53과 역관계인 것을 보여준다. 그래프에서 X축에서 왼쪽은 변형된 p53, 오른쪽은 변형되지 않은 p53, Y축은 Chk1/2의 발현을 나타낸다. Chk1/2 활성은 p53 불활성 상태에서 암 세포 성장을 위해 요구되며, 실제로 Chk1/2는 S-G2-M기의 조절자로 알려져 있다.

도 3B는 p-Chk1 및 p-Chk2의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정한 것으로, 퀴나크린은 농도 의존적으로 p-Chk2의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7 : 퀴나크린에 의한 Chk1 /2 발현의 선택적 억제 효과

퀴나크린에 의한 p-Chk1/2 발현 억제를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 및 면역형광법(immunofluorescence)을 이용하여 Chk2의 발현을 분석하였다. 벡터(Chk2, Mre11, P18, Chk1-GFP 또는 Chk2-GFP)를 HEK 293 세포로 형질전환 시킨 후, 퀴나크린을 4시간 동안 처리하였다.

그 결과, 도 4A를 참조하여 보면, 퀴나크린이 Chk2의 발현을 감소시켰으나, Chk2의 업스트림(upstream) 조절자인 MRE11 또는 ATM의 활성자 p18에는 영향이 없는 것을 확인하였다.

도 4B는 Chk2의 발현 감소를 면역형광법으로 확인한 것이다. 세포를 커버 글라스(cover glass)에서 배양하고 벡터로 형질전환 시킨 후 퀴나크린을 처리하였다. 그 후, 세포를 메탄올로 30분 동안 고정시키고 DAPI로 핵을 염색한 후, 인산완충식염수(posphate buffered saline, PBS)로 세척하였다. 커버 글라스는 마운팅 솔루션(mounting solution) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 이용하여 마운팅 하고, 형광 현미경을 통해 이미지를 관찰하였다.

또한, 도 4C를 참조하여 보면, 항 원생동물 약인 프리마퀸은 Chk2의 발현을 억제하지 못했고, Chk2의 발현의 감소는 퀴나크린에서만 특이적으로 나타났다. 또한, 도 4D 및 도 4E를 참조하여 보면, 퀴나크린에 의한 Chk1의 발현을 분석한 결과, Chk2의 발현과 유사하게, Chk1의 발현은 퀴나크린에 의해 농도 및 시간 의존적으로 감소되었다. 따라서, 퀴나크린은 Chk1/2의 선택적 억제제임을 확인하였다.

실시예 8 : p53 돌연변이 암 세포에서 퀴나크린에 의한 세포사멸 활성 효과

퀴나크린에 의한 Chk2 발현의 감소와 p53과의 연관성을 분석하기 위해, 야생형 p53, p53 R175H 또는 Chk2-GFP를 HCT 116 p53-/- 세포에 형질전환 시킨 후, 퀴나크린을 농도 별로 처리하고 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 5A를 참조하여 보면, 퀴나크린에 의한 Chk2의 감소는 야생형 p53 형질전환에 의해 억제되었다.

도 5B는 p53을 p53 null H1299 세포로 형질전환 시킨 후, 퀴나크린을 24시간 동안 처리하고 MTT 분석을 수행하여 세포 생존율을 분석한 결과로, 퀴나크린에 의해 유도된 세포 사멸이 p53의 형질전환에 의해 억제되는 것을 확인 하였다.

또한, p53 돌연변이 삽입 마우스로부터 얻은 MEF 세포를 4-OHT로 선처리하고 퀴나크린을 농도 별로 처리한 후, 6시간(도 5C) 또는 12시간(도 5D) 동안 배양하였다. 그 후, 웨스턴 블롯 및 MTT 분석을 수행한 결과, 도 5C를 참조하여 보면, p53 돌연변이는 UBC-Cre-ER의 조절 하에 발현되기 때문에 4-OHT의 처리는 p53 돌연변이의 발현을 유도하고 p21의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 5D를 참조하여 보면, p53 돌연변이 상태에서 퀴나크린은 세포사멸을 유도하였다. 따라서, 퀴나크린은 p53 손상 상태에서 암 세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 9 : p53 결핍 또는 불활성 암 세포에서 퀴나크린의 세포 생존율 억제 효과

p53 결핍 세포에서 퀴나크린의 선택적 효과를 확인하기 위해, 다양한 암 세포주를 이용하여 세포 생존율을 비교하였다.

그 결과, 도 6A를 참조하여 보면, p53 돌연변이율이 90%로 알려져 있는 소세포성 폐암(small cell lung cancer, SCLC)인 H69, H128, H146 및 H209 세포주 모두 퀴나크린에 반응하여 세포 생존율이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 도 6B를 참조하여 보면, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인 A549, H1299, H23 및 거대 T 유도 불멸 폐 배아 상피세포(large T induced immortalized lung embryonic epithelial cell)인 L132 세포주에서 프리마퀸과 비교했을 때, 퀴나크린은 p53 결핍 H1299 세포주와 L132 세포주에서 세포 사멸을 유도하였다. 또한, 도 6C를 참조하여 보면, p53에 높은 돌연변이율을 가지는 것으로 알려져 있는 교모세포종(Glioblastoma multiform, GBM)인 U87MG, U373MG 및 T89G 세포주 모두 퀴나크린에 반응하여 세포 생존율이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 퀴나크린은 p53 결핍 또는 불활성 암 치료에 유용할 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 상기 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 Chk1/2의 발현을 억제하여 종양 억제 유전자인 p53 유전자가 돌연변이로 인해 결핍되거나, p53의 활성이 불활성화된 소세포성 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 난치성 암을 예방하거나 치료하는 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기성 염인 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산성 염인 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 상기 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 Chk1/2의 발현을 억제하여 종양 억제 유전자인 p53 유전자가 돌연변이로 인해 결핍되거나, p53의 활성이 불활성화된 소세포성 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 난치성 암을 예방하거나 개선하는 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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