WO2018048195A1 - 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2018048195A1
WO2018048195A1 PCT/KR2017/009766 KR2017009766W WO2018048195A1 WO 2018048195 A1 WO2018048195 A1 WO 2018048195A1 KR 2017009766 W KR2017009766 W KR 2017009766W WO 2018048195 A1 WO2018048195 A1 WO 2018048195A1
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cancer
acid
quinacrine
salt
preventing
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PCT/KR2017/009766
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Inventor
박범준
정연진
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부산대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/473—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. acridines, phenanthridines

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating intractable cancer containing quinacrine as an active ingredient, and more particularly, for preventing refractory cancer including recurrent cancer, p53 deficiency cancer, p53 inactive cancer and terminal cancer Or to a therapeutic composition.
  • Cancer is a disease in which the cell cycle of human tissue generally causes abnormal cell division and continues cell division. It occurs through three stages of initiation, promotion, and progression. . Cancer is known to cause mutations in normal cell genes or cancer suppressor genes by carcinogens contained in the environment or food, and these cells proliferate abnormally as they are continuously stimulated by carcinogens to form cancer tissues. However, the cause of cancer is still not clear.
  • Cancer is divided into a benign tumor and a malignant tumor, whereas a benign tumor has a relatively slow growth rate and does not become metastasis that is transferred from the original site of the tumor to another tissue.
  • Malignant tumors are invasive to other tissues leaving the primary and are characterized by rapid growth, which is a life-threatening and very important cause of death.
  • the cell cycle includes S phase (DNA replication), M phase (mitosis) and two interphases between these S and M phases (G1 and G2 phases).
  • Checkpoints in the cell cycle ensure accurate progress through the cell cycle stage and include monitoring DNA integrity, DNA replication, cell size and environmental conditions. It is particularly important for multicellular organisms to maintain the integrity of the genome, and there are a number of checkpoints that monitor the state of the genome. Among them, G1 checkpoint and G2 checkpoint exist before DNA replication and mitosis, respectively. When damaged DNA replicates, it often causes mutations, so it is important to repair or correct DNA damage before entering S phase. Progression through G1 and G2 checkpoints without repairing massive DNA damage leads to mitotic catastrophe and / or apoptosis.
  • G1 checkpoint related proteins such as p53, Rb, MDM-2, p16 INK4 and p19 ARF .
  • mutations can cause overexpression and / or overactivation of tumor gene products such as Ras, MDM-2 and cyclin D, which reduces the stringency of the G1 checkpoint.
  • excessive growth factor signaling may be caused by overexpression of growth factors, thereby reducing the stringency of the G1 checkpoint.
  • Continuous activation by growth factor receptors or downstream signal transduction molecules, along with a malfunctioning mutation and a gaining mutation can lead to transformation of cells by overwhelming the G1 checkpoint.
  • destroyed or discarded G1 checkpoints contribute to higher mutation rates and many mutations observed in cancer cells. As a result, most cancer cells rely on G2 checkpoints for survival against excessive DNA damage.
  • Surgical therapy, radiation therapy and chemotherapy are used for the treatment of cancer, but despite many studies, more than 50% of all cancer patients are reported to die without healing. The reason for this is that even after surgical resection, the cancer cannot recur due to the removal of finely metastasized cancer cells, or despite the development of various anticancer drugs, the death of cancer cells against the anticancer drugs is not induced or early in the treatment of cancer using the anticancer drugs. Although the tumor seems to shrink in response to treatment, or after treatment, cancer cells that develop resistance to anticancer drugs proliferate rapidly.
  • the anticancer agents have a disadvantage in that the cancer cells lose the therapeutic effect by repeatedly obtaining long-term administration or cancer recurrence, thereby obtaining resistance to the anticancer agent.
  • most anticancer drugs are effective by inhibiting the synthesis of nucleic acid in the cell or by directly binding to the nucleic acid and impairing its function.
  • These anticancer drugs not only act selectively on cancer cells but also on normal cells, especially tissue cells with active cell division. Because of the damage, there are many side effects such as decreased bone marrow function, damage to the gastrointestinal tract, hair loss, and the like.
  • radiation therapy is difficult to cure because cancer cells appear to radiation.
  • Quinacrine is (RS) -N '-(6-Chloro-2-methoxyacridin-9-yl) -N, N-diethylpentane-1,4-diamine, first approved as an antimalarial agent in the 1930s. It was widely used during World War II and was approved for the treatment of flagella, a gut parasite. Quinacrine has also been studied as a phospholipase A2 inhibitor and has also been used as an antiparasitic, ie, tapeworm treatment. Quinacrine binds to prion proteins to prevent the formation of prion aggregates in vitro and is in clinical trials in the United Kingdom and the United States to treat Creutzfeldt Jacob disease.
  • Quinacrine is also used for non-surgical infertility in women and is known to be safer than surgical infertility.
  • no research has been reported to show that quinacrine has an anticancer effect on refractory cancers such as recurrent cancer, p53 deficient cancer, p53 inactive cancer and terminal cancer.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating refractory cancer.
  • Another object of the present invention to provide a health food composition for preventing or improving refractory cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of refractory cancer containing Quinacrine (Quinacrine) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving intractable cancer containing quinacrine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the composition containing the quinacrine as an active ingredient It can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating refractory cancer, including recurrent cancer, p53 deficient cancer, p53 inactive cancer, and terminal cancer, and a health food composition for preventing or improving refractory cancer.
  • Figure 1 shows the chemical structure of the antiprotozoal drug.
  • Figure 2 shows the results of chemical screening of anticancer drugs, confirming the effect of inhibiting cell viability by quinacrine in MDA-MB468 cells, which is an invasive breast cancer cell line, and the effect of apoptosis by quinacrine in p53 deficient cells.
  • Figure 3 confirms the anticancer effect of quinacrine in various small cell lung cancer cells.
  • Figure 4 confirms the anticancer effect of quinacrine in the p53 deficiency state.
  • Figure 5 confirms the effect of inhibiting p53 expression and quinacrine induced apoptosis by NF2 transfection.
  • Figure 6 confirms the inverse association of Chk1 / 2 expression with p53 status in various seal cancer tissues.
  • prevention means any action that inhibits cancer or delays the onset of quinacrine.
  • treatment refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of cancer using quinacrine.
  • quinacrine used in the present invention is (RS) -N ′-(6-Chloro-2-methoxyacridin-9-yl) -N, N-diethylpentane-1,4-diamine, wherein phospholipase A2 ( phospholipase A2).
  • Refractory cancer in the term “refractory cancer” as used herein, refractory is meant to fail to respond well to a specific anticancer treatment or to repeat or relapse after a good response to a specific anticancer treatment.
  • Refractory cancer in the present invention means recurrent cancer, p53 deficient cancer, p53 inactive cancer and terminal cancer.
  • Recurrent cancer means that the cancer recurs after conventional cancer treatment
  • terminal cancer means that the cancer has a very low or no cure rate by conventional cancer treatment.
  • Common cancer treatments here include, for example, surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormonal therapy, biological therapy, immunotherapy and the like.
  • p53 deficient cancer and p53 inactive cancer refers to a cancer in which the tumor suppressor gene p53 gene is deficient due to mutation or the activity of p53 is inactivated.
  • transformation refers to altering some of the genetic traits of an organism by artificially inserting an external gene that is not originally possessed by an organism on the chromosome or by removing a gene that is originally possessed by the organism.
  • transformation There are several methods of transformation, but the most commonly used methods are lipid mediated gene transfer, sperm mediated gene transfer, electroporation, and homologous recombination. Homologous recombination) and microinjection are typical.
  • vector refers to a DNA molecule as a carrier that can stably transport foreign genes into a host cell. To be a useful vector, it must be able to replicate, enter into a host cell, and be equipped with means to detect its presence. The vector can insert a foreign gene into a specific gene or knock-out specific gene expression.
  • the term “antibody” refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site, and any one prepared according to a conventional method or purchased commercially can be used.
  • the antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and fragments capable of binding epitopes and the like.
  • the antibody refers to a complete form having two full-length light chains and two heavy chains, and also includes special antibodies such as humanized antibodies.
  • the kit used in the present invention is an antibody that specifically binds to a marker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a label that is developed by reaction with a substrate, a color substrate solution to be colored and reacted with the label, It may include a wash solution and an enzyme stopping solution, and may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components used.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating refractory cancer containing Quinacrine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the refractory cancer may be, but is not limited to, recurrent cancer, p53 deficient cancer, p53 inactive cancer, and terminal cancer.
  • the refractory cancer may be, but is not limited to, lung cancer, brain cancer, breast cancer and kidney cancer.
  • the quinacrine may inhibit the survival rate of cancer cells and increase apoptosis of cancer cells.
  • the quinacrine may inhibit the survival rate of cancer cells and induce cell death of cancer cells.
  • the quinacrine may inhibit the expression or activity of Chk1 / 2.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be at least one of basic salts or acid salts.
  • the basic salt can be used in the form of organic salt or inorganic salt, for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, lithium salt, magnesium salt, cesium salt, aluminum salt, ammonium salt , Triethylaminium salt, pyridinium salt, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • acid salts are useful acid addition salts formed by free acid.
  • the inorganic acid and organic acid may be used as the free acid, and hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, and methanesulfonic acid may be used.
  • Benzenesulfonic acid, camphorsulfonic acid, oxalic acid, malonic acid, glutaric acid, acetic acid, glyconic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid, aspartic acid Etc. may be used, but not limited thereto.
  • hydrochloric acid may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid may be used as the organic acid.
  • composition of the present invention when the composition of the present invention is a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient, such a pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in pharmaceutical formulations, lactose, dextrose, water Cross, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydride And may include, but are not limited to, oxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in pharmaceutical formulations, lactose, dextrose, water Cross, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, weighting agents, binders, lubricants, wetting agents, disintegrants, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, fragrances, preservatives and the like as additives and adjuvants.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and sterile injectable solutions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intrasternal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, topical administration, oral administration and inhalation. Can be administered in a conventional manner.
  • the pharmaceutical composition is determined by the degree of symptoms, the method of administration is usually preferred.
  • the effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition means the amount required to prevent or treat the disease.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health, sex and diet, sex and diet, time of administration, route of administration and composition of the patient It may be adjusted according to various factors including, but not limited to, the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving intractable cancer containing quinacrine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the refractory cancer may be, but is not limited to, recurrent cancer, p53 deficient cancer, p53 inactive cancer, and terminal cancer.
  • the refractory cancer may be, but is not limited to, lung cancer, brain cancer, breast cancer and kidney cancer.
  • the composition of the present invention is a health food composition
  • it may be provided in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrups or beverages
  • the health food composition is used with other food or food additives in addition to the active ingredient, and It may be appropriately used depending on the method.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of use thereof, for example, prophylactic, health or therapeutic treatment.
  • the effective dose of the active ingredient contained in the health food composition may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but in the case of prolonged intake for the purpose of health and hygiene or for health control,
  • the active ingredient may be used in an amount greater than the above range because there is no problem in terms of safety.
  • mice All procedures of animal testing were performed after approval of the animal management committee of Pusan National University. Athymic nude mice were maintained under temperature and light control conditions (20-23 ° C., light and dark cycles of 12 hours / 12 hours) and provided sterile food and water freely.
  • HCT 116 p53 ⁇ / ⁇ (1 ⁇ 10 7 ) and HCT 116 p53 + / + (1 ⁇ 10 7 ) cells were inoculated on the left and right sides of nude mice, respectively.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Intraperitoneal (ip) was injected three times a week, and then tumor size and weight were measured at intervals of two days a week.
  • Villin-Cre mice were crossed with LSL-p53 flox-R272H mice to make Villin-Cre; p53 flox - R272H mice.
  • A549, H1299, HEK 293, MCF7, MDA-MB231, and MDA-MB468 cell lines purchased from American Type Culture Collection (ATCC), Manassus, VA, USA, contain 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and antibiotics Cultured in RPMI-1640 or Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) medium.
  • ACHN cell lines were supplied from Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) and cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum and antibiotics.
  • HCT 116 p53 + / +, p53 +/- and p53 ⁇ / ⁇ cells were supplied from Vogelstein B (Johns Hopkins University, Baltimore) and cultured in McCoy's 5A (Modified) medium containing 10% fetal calf serum and antibiotics.
  • MEF cells were isolated from 14.5 day old embryos (Embryos) using standard protocols and cultured in MEM / EBSS medium containing 15% fetal calf serum and 1% antibiotic.
  • Quinacrine (QNC), SB202190, 5-Fluorouracil (5-Fu), 4,7-Dichloroquinoline and 4-hydroxytamoxifen (4-Hydroxytamoxifen; 4 -OHT) was purchased from Sigma, Missouri, USA.
  • Adriamycin, Pifithrin- ⁇ , LY294002, U0126 and MG132 were purchased from Calbiochem, Darmstadt, Hessen, Germany, Rapaamycin, Gefitinib And Erlotinib were provided by LC Laboratory (Woburn, Mass., USA).
  • PD98059 was purchased from StressGen (BC, Canada) and ABT-737, SB216763 and Imatinib were provided by Selleckchem, TX, USA.
  • proteins were extracted using RIPA buffer (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 10% sodium deoxycholate), and then quantified for each protein to SDS-PAGE. (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and Western blot was performed.
  • the protein isolated by electrophoresis was immobilon-P transfer membrane using a transfer buffer (20% methanol, 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine) for 120 minutes at 350 mA. PVDF transfer membrane, Port Washington, NY, USA.
  • the protein-transferred membrane was blocked with 3% non-fat dry milk (skim milk solution), then reacted with the primary antibody at 4 ° C. for 24 hours and then with tris-buffered saline and tween 20 (TBST). Wash three times. Thereafter, the HRP conjugated secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour and washed three times with TBST. After washing once more with distilled water, a mixed solution of ECL detection kit (Advansta) coloring reagents I and II 1: 1 was applied to the membrane, and an X-ray film (CP-G plus, Agfa) was applied. Healthcare Ltd, New La, LA, USA), and developed to observe the degree of expression of the protein on the film.
  • ECL detection kit Advanced sta
  • X-ray film CP-G plus, Agfa
  • Antibodies Actin (sc-1616), GFP (sc-9996), Chk2 (sc-9064), His (sc-8036), GST (sc-138), NF2 (sc-331), ⁇ - used in Western blot catenin (sc-7963), HA (sc-7392), ⁇ -TrCP (sc-390629), Chk1 (sc-8408), ⁇ -tubulin (sc-8035) and p53DO1 (sc-126) are Santa Cruz (Santa) Cruz, California, USA), and p-Chk1 (2341), p-Chk2 (2661), p-Erk (9101) and t-p53 (9282) were purchased from Cell signaling (Massachusetts, USA) It was. Anti-Mre11 (gtx70212) was purchased from GeneTex, California, USA, and anti-FLAG (F3165) and anti-MyC (M5546) were from Sigma Aldrich, Mo, SA.
  • Cells were cultured in a cover glass and transformed with the vector, followed by chemical treatment. Cells were then fixed for 30 minutes with methanol, nuclei stained with DAPI, and washed with PBS. The cover glass was mounted using a mounting solution (Vector Laboratories, Burlingame, Calif., USA) and the image was observed through a fluorescence microscope.
  • a mounting solution Vector Laboratories, Burlingame, Calif., USA
  • peGFP-Chk1 pcDNA3 NF2-FLAG [isoform 1 of merlin], pcDNA3 NF2-NTERM-FLAG 1-332 AA, ⁇ -TrCP-Myc, ⁇ -TrCP WD2-7-Myc ( ⁇ - TrCP-DN), CDC4-Myc, CDC4 R465C-Myc (CDC4-DN), Siah1-FLAG, Skp2-Myc and VHL-FLAG were purchased from Addgene, Cambridge, MA, USA.
  • the HA-p53 vector was provided by Dr. Kim S (Seoul National University, Seoul, KOREA).
  • GFP-fusion Chk2 expression vectors were provided by Dr. Ha NC (Seoul National University, Seoul, KOREA).
  • jetPEI transfection reagent Polyplus Transfection, New York, NY.
  • Vector 1.5 ⁇ g was mixed with 1.5 ⁇ l of jetPEI reagent under 150 mM NaCl solution. After reacting for 20 minutes at room temperature, the mixture was treated with cells. After 3 hours, serum free medium was replaced with 10% fetal calf serum containing medium.
  • siRNA for ⁇ -TrCP is as follows: 5′-CGACATAGTTTACAGAGATTCAAGAGA TCTCTGTAAACTATGTCGC-3 ′
  • siRNA transfection For siRNA transfection, INTERFERin® transfection reagent (Polyplus New York, USA) was used. siRNA double strand 1.5 pmole (21 ng) was mixed with 4 ⁇ l of NTERFERin® reagent under 200 ⁇ l medium without serum. The mixture was vortexed to homogenize and reacted at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the mixture was treated with cells and incubated for at least 48 hours.
  • IP immunoprecipitation
  • GST-Chk1 or Ni- ⁇ -TrCP were incubated for 30 minutes at 4 ° C with cell lysates under RIPA buffer.
  • the cells were lysed in RIPA buffer, and then the whole lysates were incubated with the primary antibody for 1 hour at 4 ° C. and agarose beads bound to agarose beads for 1 hour. conjugated protein A / G, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After centrifugation, the beads with bound protein were washed with RIPA buffer and the precipitated protein was detected by Western blot.
  • MTT (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the NF- ⁇ B-luc vector was transfected into the cells for 24 hours and the cells were treated with the indicated chemicals. After washing with wash buffer (Promega, Wisconsin, USA), cells were lysed with lysis buffer (Promega, Wisconsin, USA). Luciferase activity was measured using a photometer (luminometer, MicroDigital, Gyeonggi-do, Korea).
  • Example 10 apoptosis ( apoptosis ) analysis
  • Cells were seeded in 6 well plates, treated with DMSO (control) or quinacrine and incubated for 12 hours. Subsequently, cells were stained using Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (B32117, Biotool, USA) and Propidium Iodide (PI), and cell death was measured by flow cytometry. .
  • Tissue samples were fixed with 4% Paraformaldehyde and embedded in paraffin. 5 mm thick tissue slide sections were made using paraffin blocks and stained with Haematoxylin and Eosin.
  • Immunohistochemistry was performed on paraffin blocks using polyclonal rabbit anti-Ki67 antibodies. Briefly, sections were gradually deparaffinized and rehydrated with xylene and alcohol and washed with PBS. Antigen retrieval was performed with sodium citrate (Ph 6) at 95 ° C.
  • Endogenous peroxidase activity was blocked with 3% hydrogen peroxide. Incubated overnight at 4 ° C. with primary antibody (1: 200) and for 4 hours with secondary antibody conjugated with HRP. Visualization was performed using a DAB peroxidase (HRP) substrate kit (Vector Labs).
  • HRP horseradish peroxidase
  • MTT analysis was performed using human breast cancer cell lines MDA-MB468 and MCF7.
  • quinacrine effectively inhibits cell viability in MDA-MB468 cells, while inhibiting cell viability in MCF7 cells, compared to conventionally well known anticancer agents or chemical inhibitors. Not shown. MDA-MB468 cells are a more aggressive type of breast cancer than MCF7 cells, assuming that quinacrine will be more effective in treating invasive types of cancer.
  • quinacrine actually inhibited the survival rate of MDA-MB468 cells more significantly than MCF7 cells, it was confirmed that quinacrine is sensitive to invasive cancer.
  • HCT116 p53 ⁇ / ⁇ cells were more sensitive to quinacrine than HCT116 cells.
  • inhibition of p53 promoted quinacrine induced apoptosis in p53-intact A549 and MCF7 cell lines.
  • mice were inoculated with HCT116 p53-/-cells and 10 mg / kg or 20 mg / kg of quinacrine three times per week intraperitoneally 8 Weekly injection.
  • HCT116 p53 ⁇ / ⁇ tumor growth was inhibited by quinacrine without weight loss.
  • the results indicate that quinacrine can inhibit tumor growth under p53 damage.
  • ACHN responds to quinacrine in spite of wild type p53.
  • p53 of ACHN is inactivated by NF2 deletion (Dalgliesh et al., 2010).
  • 5A and 5B transfection of NF2 induced p53 expression, and quinacrine induced apoptosis was also inhibited by NF2 transfection.
  • quinacrine may be useful for NF2 deficient cancers such as ACHN (RCC) or mesothelioma.
  • Chk1 / 2 is a major regulator of S-G2-M phase and is a well-conserved system in mammalian systems in single cell organisms.
  • inhibition of cell cycle checkpoint kinase may improve sensitivity to anticancer agents in p53 deficient states. Therefore, the effect of quinacrine on Chk1 / 2 activity was analyzed.

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Abstract

본 발명은 퀴나크린(Quinacrine)을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 퀴나크린(Quinacrine)은 암세포의 생존율을 억제하고 암세포의 세포사멸을 증가시키며, 특히 침략적 암(aggressive cancer) 세포에서 민감성을 가지므로, 상기 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 퀴나크린(Quinacrine)을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재 통계청 자료에 따르면, 한국인의 사망 원인 중 암으로 인한 사망이 1위를 차지하고 있다. 암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 세포분열을 계속하는 질병으로, 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생한다. 암의 원인은 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 일어나고, 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비정상적으로 증식하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있으나, 암의 발생 원인에 대해서는 아직도 명확하게 밝혀진 바가 없다.
암은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)로 구분되어지는데, 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되어지는 전이(metastasis)가 되지 않는 것에 반해, 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르는 아주 중요한 원인이 된다.
세포 주기는 S기(DNA 복제), M기(유사분열) 및 이러한 S기와 M기 사이의 2개의 간기(G1기 및 G2기)를 포함한다. 세포 주기 중 체크포인트(check point)는 세포 주기 스테이지를 통해 정확한 진행이 이루어지게 하며, DNA 완전성, DNA 복제, 세포 크기 및 주위 환경 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 다세포 생물체는 게놈의 완전성을 유지하는 것이 특히 중요하며, 게놈의 상태를 모니터링 하는 다수의 체크포인트가 존재한다. 그 중에서, G1 체크포인트와 G2 체크포인트는 각각 DNA 복제와 유사분열 전에 존재한다. 손상된 DNA가 복제되면 이는 종종 돌연변이를 유발하기 때문에 S기에 진입하기 전에 DNA 손상을 복구하거나 교정하는 것이 중요하다. 대규모의 DNA 손상을 복구하지 않고 G1 및 G2 체크포인트를 통해 진행되면 유사분열 대변동(catastrophe) 및/또는 세포사멸(apoptosis)이 유도된다.
대부분의 암세포는 G1 체크포인트 관련 단백질, 예컨대 p53, Rb, MDM-2, p16INK4 및 p19ARF에 이상을 가지고 있다. 또한, 돌연변이는 종양 유전자 산물, 예컨대 Ras, MDM-2 및 사이클린 D의 과잉 발현 및/또는 과다 활성화를 일으킬 수 있으며, 이는 G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킨다. 이러한 돌연변이 외에도, 과도한 성장 인자 시그널링이 성장인자의 과잉 발현으로 유발되어, G1 체크포인트의 엄격도를 감소시킬 수 있다. 기능상실 돌연변이 및 기능획득 돌연변이와 함께, 성장 인자 수용체 또는 다운스트림 시그널 전달 분자에 의한 연속 활성화는 G1 체크포인트를 압도함으로써 세포의 형질전환을 일으킬 수 있다. 또한, 파괴되거나 폐기된 G1 체크포인트는 보다 높은 돌연변이율 및 암세포에서 관찰되는 다수의 돌연변이에 기여한다. 결과적으로, 대부분의 암세포는 과도한 DNA 손상에 대한 생존을 위해 G2 체크포인트에 의존한다.
암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학 요법 등이 사용되고 있으나, 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그에 따른 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하더라도 미세하게 전이된 암세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 다양한 항암제의 개발에도 불구하고 항암제를 이용한 암 치료 시, 항암제에 대한 암세포의 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료 도중이나 치료가 끝난 후, 항암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증식하기 때문이다.
오늘날에는 약 60여 종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 암 발생 및 암 세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라, 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 항암제들은 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다. 또한, 대부분의 항암제는 세포 내 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로 효과를 나타내는데, 이들 항암제는 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직 세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위장관 점막 손상, 탈모 등 여러 부작용이 나타나는 단점이 있다. 또한, 방사선 치료도 방사선에 대한 암세포가 나타나게 되어 완치가 어렵다.
퀴나크린(Quinacrine)은 (RS)-N′-(6-Chloro-2-methoxyacridin-9-yl)-N,N-diethylpentane-1,4-diamine로서, 1930년대에 항말라리아제로서 최초 승인되어 2차 세계대전 동안 널리 사용되었으며, 장내 기생충인 편모충증 치료제로서도 승인되었다. 또한, 퀴나크린은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 억제제로서 연구되어 왔으며, 구충제 즉, 촌충 감염 치료제로서도 사용되어 왔다. 퀴나크린은 프리온 단백질과 결합하여 in vitro 상에서 프리온 응집 형성을 예방할 수 있으며, 크로이츠펠트 야곱병 치료를 위해 영국과 미국 등에서 임상 진행 중에 있다. 또한, 퀴나크린은 여성의 비수술적 불임을 위해 사용되며, 수술적 불임보다 안전하다고 알려져 있다. 그러나, 퀴나크린이 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암과 같은 난치성 암에 항암 효과를 나타낸다는 연구 결과는 현재까지 보고된 바가 없다.
본 발명의 목적은 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 퀴나크린(Quinacrine)은 암세포의 생존율을 억제하고 암세포의 세포사멸을 증가시키며, 특히 침략적 암(aggressive cancer) 세포에서 민감성을 가지므로, 상기 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 포함하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 항 원생동물 약물의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 2는 항암 약물의 화학적 스크리닝 결과로, 침략적 유방암 세포주인 MDA-MB468 세포에서 퀴나크린에 의한 세포 생존율 억제 효과 및 p53 결핍 세포에서 퀴나크린에 의한 세포사멸 효과를 확인한 것이다.
도 3은 다양한 소세포성 폐암 세포에서 퀴나크린에 의한 항암 효과를 확인한 것이다.
도 4는 p53 결핍 상태에서 퀴나크린에 의한 항암 효과를 확인한 것이다.
도 5는 NF2 형질주입에 의한 p53 발현 유도 및 퀴나크린 유도 세포사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 6은 다양한 인감 암 조직에서 Chk1/2 발현과 p53 상태의 역의 연관성을 확인한 것이다.
도 7 및 도 8은 Chk1/2를 통한 퀴나크린의 항암 효과를 확인한 것이다.
도 9는 퀴나크린에 의한 β-TrCP 활성을 확인한 것이다.
도 10은 p53 돌연변이 암 모델에서 퀴나크린에 의한 항암 효과를 확인한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 “예방”은 퀴나크린을 이용하여 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “치료”는 퀴나크린을 이용하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “퀴나크린”은 (RS)-N′-(6-Chloro-2-methoxyacridin-9-yl)-N,N-diethylpentane-1,4-diamine로서, 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 억제제이다.
본 발명에서 사용된 용어 “난치성 암”에서 난치성은, 특이적인 항암 치료에 대해 양호하게 반응하는데 실패하거나, 특이적인 항암 치료에 대해 양호하게 반응한 후 반복되거나 재발함을 의미한다. 본 발명에서 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암을 의미한다. 재발성 암은 통상의 암 치료 후, 암이 재발하는 것을 의미하며, 말기 암은 통상의 암 치료에 의해 암이 완치율이 매우 낮거나 완치되지 못하는 것을 의미한다. 여기서 통상의 암 치료는 예를 들어, 수술, 화학 치료, 방사선 치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역 치료 등을 포함한다. 또한, p53 결핍 암 및 p53 불활성 암은 종양 억제 유전자인 p53 유전자가 돌연변이로 인해 결핍되거나 p53의 활성이 불활성화 되는 암을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “형질 전환”은 어떤 생물이 원래는 지니고 있지 않은 외부 유전자를 염색체상에 인위적으로 삽입하거나, 원래 지니고 있는 유전자를 제거하여 그 생물의 유전적 형질 일부를 변화시키는 것이다. 형질전환의 방법은 여러 가지가 있으나, 가장 많이 사용되는 방법으로는 지질 매개 유전자 도입(lipid mediated gene transfer), 정자 매개 유전자 도입(sperm mediated gene transfer), 전기천공법(electroporation), 상동성 재조합(homologous recombination), 미세주입법 등이 대표적이다.
본 발명에서 사용된 용어 “벡터(vector)”는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 상기 벡터에 의하여 특정 유전자에 외래 유전자를 삽입시키거나 특정 유전자 형질발현을 붕괴(knock-out)시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “항체”는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 통상적인 방법에 따라 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미하며, 또한, 인간화 항체 등 특수 항체도 포함한다.
또한, 본 발명에서 사용된 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상세하게는, 상기 난치성 암은 폐암, 뇌암, 유방암 및 신장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 퀴나크린은 암 세포의 생존율을 억제시키고, 암 세포의 세포사멸을 증가시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 퀴나크린은 암세포의 생존율을 억제하고, 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있다.
바람직하게는, 상기 퀴나크린은 Chk1/2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염기성 염 또는 산성 염 중 어느 하나 이상일 수 있다. 염기성 염으로는 유기염기염, 무기염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염, 피리디늄염 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 산성 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학 조성물은 첨가제 및 보조제로서 충진제, 중량제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 붕해제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 방향제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 및 멸균 주사용액으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 흉골내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 국소 투여, 경구 투여 및 흡입을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다
상기 약학 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 발명은 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상세하게는, 상기 난치성 암은 폐암, 뇌암, 유방암 및 신장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 상기 유효성분의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 마우스
동물실험의 모든 절차는 부산대학교 동물 관리위원회의 승인을 받은 후, 수행하였다. 흉선 누드 마우스(Athymic nude mice)는 온도 및 광 조절 조건(20 내지 23℃, 12시간/12시간의 명암주기) 하에 유지시키고, 멸균된 음식 및 물을 자유롭게 제공하였다.
실시예 2 : in vitro 치료
이종 이식(Xenograft)을 위해, HCT 116 p53-/-(1 × 107) 및 HCT 116 p53+/+(1 × 107) 세포를 누드 마우스의 좌우 측면에 각각 접종하였다. 일주일 후, 종양을 가지는 마우스를 무작위로 골라 대조군으로 인산완충식염수(Phosphated buffered saline; PBS)(n=3)를, 실험군으로 퀴나크린(10 mg/kg 또는 20 mg/kg, 각각 n=4)을 복강 내로(Intraperitoneal; ip) 주 3회 주입한 후, 일주일에 2일 간격으로 종양의 크기 및 체중을 측정하였다.
Villin-Cre;p53flox - R272H 마우스를 제작하기 위해, Villin-Cre 마우스를 LSL-p53flox-R272H 마우스와 교차시켰다. Villin-Cre;p53flox - R272H 마우스는 대조군으로 PBS(n=2)를, 실험군으로 퀴나크린(20 mg/kg, n=3)을 복강 내로 주 3회, 22주 동안 주입한 후, 일주일에 2일 간격으로 체중을 측정하였다.
실시예 3 : 세포 배양 및 시약
A549, H1299, HEK 293, MCF7, MDA-MB231 및 MDA-MB468 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassus, VA, USA)에서 구입하여 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS) 및 항생제가 포함된 RPMI-1640 또는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다. ACHN 세포주는 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank; KCLB, Seoul, Korea)으로부터 제공받아 10% 우태아혈청 및 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. HCT 116 p53+/+, p53+/- 및 p53-/- 세포는 Vogelstein B(Johns Hopkins University, Baltimore)로부터 제공받아 10% 우태아혈청 및 항생제가 포함된 McCoy's 5A(Modified) 배지에서 배양하였다. MEF 세포는 14.5일 된 배아(Embryos)에서 표준 프로토콜을 이용하여 분리하였으며, 15% 우태아혈청 및 1% 항생제 포함된 MEM/EBSS 배지에서 배양하였다. 퀴나크린(Quinacrine; QNC), SB202190, 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil; 5-Fu), 4,7-디클로로퀴놀린(4,7-Dichloroquinoline) 및 4-하이드록시타목시펜(4-Hydroxytamoxifen; 4-OHT)은 시그마(Sigma, Missouri, USA)에서 구입하였다. 아드리아마이신(Adriamycin), 피피트린-α(Pifithrin-α), LY294002, U0126 및 MG132은 칼바이오캠(Calbiochem, Darmstadt, Hessen, Germany)에서 구입하였고, 라파마이신(Rapamycin), 게피티닙(Gefitinib) 및 엘로티닙(Erlotinib)는 LC 연구소(LC Laboratory, Woburn, MA, USA)에서 제공받았다. PD98059는 StressGen(BC, Canada)에서 구입하였고, ABT-737, SB216763 및 이마티닙(Imatinib)은 셀레캠(Selleckchem, TX, USA)에서 제공받았다.
실시예 4 : 웨스턴 블롯 분석
단백질 분석을 위해, RIPA 완충액(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 10% sodium deoxycholate)을 이용하여 단백질을 추출한 후, 정량하여 각각의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 전기영동으로 분리한 단백질은 트렌스퍼 완충액(transfer buffer; 20% methanol, 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine)을 이용하여 350 mA에서 120분간 이모빌론-피-트렌스퍼 멤브레인(immobilon-P transfer membrane; PVDF transfer membrane, Port Washington, NY, USA)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 3% 탈지유(non-fat dry milk; skim milk solution)로 블로킹(blocking)시킨 후, 4℃에서 일차 항체로 24시간 동안 반응시키고 TBST(tris-buffered saline and tween 20)로 3회 세척하였다. 그 후, HRP가 접합된 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척하였다. 증류수로 한 번 더 세척한 후, 멤브레인에 ECL 검출 kit(Advansta)의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 혼합액을 도포하고, X-선 필름(X-ray film; CP-G plus, Agfa Healthcare Ltd, New Orleans, LA, USA)에 노출하여 현상한 다음 필름 상에서 단백질의 발현 정도를 관찰하였다.
웨스턴 블롯에 사용된 항체 Actin(sc-1616), GFP(sc-9996), Chk2(sc-9064), His(sc-8036), GST(sc-138), NF2(sc-331), β-catenin(sc-7963), HA(sc-7392), β-TrCP(sc-390629), Chk1(sc-8408), α-tubulin(sc-8035) 및 p53DO1(sc-126)은 산타 크루즈(Santa Cruz, California, USA)에서 구입하였고, p-Chk1 (2341), p-Chk2 (2661), p-Erk (9101) 및 t-p53(9282)은 셀 시그널링(Cell signaling, Massachusetts, USA)에서 구입하였다. Anti-Mre11(gtx70212)은 진텍스(GeneTex, California, USA)에서 구입하였고, anti-FLAG(F3165) 및 anti-MyC(M5546)는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, Mo, SA)에서 구입하였다.
실시예 5 : 면역형광법 ( Immunofluorescence ; IF) 분석
세포를 커버 글라스(cover glass)에서 배양하고 벡터로 형질전환 시킨 후, 화학물질을 처리하였다. 그 후, 세포를 메탄올로 30분 동안 고정시키고, DAPI로 핵을 염색한 후, PBS로 세척하였다. 커버 글라스는 마운팅 솔루션(mounting solution) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 이용하여 마운팅 하고, 형광 현미경을 통해 이미지를 관찰하였다.
실시예 6 : 형질주입( Transfection ) 및 si - RNAs 분석
peGFP-Chk1, pcDNA3 NF2-FLAG[멀린(merlin)의 아이소폼(isoform) 1], pcDNA3 NF2-NTERM-FLAG 1-332 AA, β-TrCP-Myc, β-TrCP WD2-7-Myc(β-TrCP-DN), CDC4-Myc, CDC4 R465C-Myc(CDC4-DN), Siah1-FLAG, Skp2-Myc 및 VHL-FLAG은 애드진(Addgene, Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. HA-p53 벡터는 Kim S 박사(Seoul National University, Seoul, KOREA)로부터 제공받았다. GFP-융합 Chk2 발현 벡터는 Ha NC 박사(Seoul National University, Seoul, KOREA)로부터 제공받았다.
형질주입을 위해, jetPEI 형질주입 시약(Polyplus Transfection, New York, NY)을 이용하여 제조사에서 제공한 프로토콜을 따라 실험을 수행하였다. 벡터(1.5 μg)를 150 mM NaCl 용액 하에서 jetPEI 시약 1.5 μl와 혼합하였다. 실온에서 20분 동안 반응시킨 후, 혼합물을 세포에 처리하였다. 3시간 후, 무혈청 배지를 10% 우태아혈청 함유 배지로 대체하였다.
β-TrCP에 대한 siRNA의 표적 서열은 다음과 같다: 5'-CGACATAGTTTACAGAGATTCAAGAGA TCTCTGTAAACTATGTCGC-3 '
siRNA 형질주입을 위해, INTERFERin® 형질주입 시약(Polyplus New York, USA)을 이용하였다. siRNA 이중 가닥 1.5 pmole(21 ng)을 혈청이 없는 200 μl 배지 하에서 NTERFERin® 시약 4 μl와 혼합하였다. 혼합물을 볼텍싱(vortexing) 하여 균질화시키고, 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후, 혼합물을 세포에 처리하고 48시간 이상 배양하였다.
실시예 7 : 면역침강법 및 풀-다운 분석
단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위해, 면역침강법(Immunoprecipitation; IP) 및 풀-다운(Pull-down) 분석을 수행하였다.
풀다운 분석을 위해, GST-Chk1 또는 Ni-β-TrCP를 RIPA 완충액 하에 세포 용해물과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다.
면역침강법을 위해, 세포를 RIPA 완충액에서 용해시킨 후, 전체 용해물을 4℃에서 1시간 동안 1차 항체와 함께 배양하고, 1시간 동안 아가로오즈 비드가 결합된 단백질 A/G(agarose bead conjugated protein A/G, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 반응시켰다. 원심 분리 후, 결합된 단백질을 갖는 비드를 RIPA 완충액으로 세척하고, 침전된 단백질을 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
실시예 8 : 세포 생존율 분석
세포 생존율을 측정하기 위해, MTT(3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하였다. 세포에 MTT 용액(Calbiochem)을 0.5 mg/ml 농도로 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거한 후, 침전물을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 녹인 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
실시예 9 : 루시퍼라제 ( Luciferase ) 분석
NF-κB 프로모터의 활성을 분석하기 위해, NF-κB-luc 벡터를 세포에 24시간 동안 형질주입시키고, 세포를 지시된 화학물질로 처리하였다. 세척 완충액(Promega, Wisconsin, USA)으로 세척한 후, 세포를 용해 완충액(Promega, Wisconsin, USA)을 이용하여 용해시켰다. 루시퍼라제 활성은 광도계(luminometer, MicroDigital, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 측정하였다.
실시예 10 : 세포사멸( apoptosis ) 분석
세포를 6 웰 플레이트(6 well plate)에 접종하고, DMSO(대조군) 또는 퀴나크린을 처리한 다음 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 아넥신 V(Annexin V)-FITC 세포사멸 검출 키트(B32117, Biotool, USA)와 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide; PI)을 이용하여 세포를 염색하고, 유세포 분석으로 세포사멸을 측정하였다.
실시예 11 : 조직학 및 면역염색 분석
조직 샘플을 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)로 고정시키고, 파라핀에 포매하였다. 파라핀 블록을 이용하여 5 mm 두께의 조직 슬라이드 절편을 만들고, 헤마톡실린(Haematoxylin) 및 에오신(Eosin)으로 염색을 수행하였다.
면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC)는 다클론 rabbit anti-Ki67 항체를 이용하여 파라핀 블록에서 수행하였다. 간략하게, 절편을 점진적으로 탈 파라핀화 시키고 자일렌 및 알코올을 이용하여 재수화시킨 다음 PBS로 세척하였다. 95℃에서 구연산 나트륨 용액(Sodium citrate, pH 6)으로 항원 복구(Antigen retrieval)를 수행하였다.
내인성 퍼옥시다제(Endogenous peroxidase) 활성은 3% 과산화수소(Hydrogen peroxide)로 차단하였다. 1차 항체(1:200)로 4℃에서 밤새 배양하고, HRP가 접합된 2차 항체로 4시간 동안 배양하였다. 시각화는 DAB 퍼옥시다제(HRP) 기질 키트(Vector Labs)를 이용하여 수행하였다.
실시예 12 : [18F] FDG PET/CT 이미지 분석
[18F] FDG PET/CT 이미지를 획득하기 위해, 각 마우스를 최소 6시간 동안 금식시켰다. [18F] FDG (500 ± 23 uCi)를 마우스 꼬리 정맥 내로 투여한 후, 마우스를 어두운 케이지에 60분 동안 방치하였다. 각 마우스는 스캔 기간 동안 이소플루레인(isoflurane, 2.5% 유속)으로 마취 하에 유지하였다. 마우스를 표준 마우스 침대에 놓고, 균일한 CT 이미지를 얻기 위해 사지를 신체의 측면에 위치시켰다. 전체 뇌 CT 이미지는 Micro-PET/CT 스캐너(nanoPET/CT, Bioscan Inc., ashington DC, USA)로 획득하였다. CT 이미지 획득을 위해, X-선원은 0.5 mm, 200 μA 및 45 kVp로 설정하였다. CT 이미지는 Nyquist frequency, 4 binning factor, cutoff, Shepp filter, cone-beam을 이용하여 재구성하였고, 480 × 480 × 632 및 복셀(voxel) 크기 125 μm의 이미지 매트릭스에 기록하였다.
실험예 1 : 화학물질 스크리닝
도 1의 항 원생동물(anti-protozoa) 약물의 항암 효과를 확인하기 위해, 인간 유방암 세포주인 MDA-MB468 및 MCF7을 이용하여 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2A 및 도 2B를 참조하여 보면, 종래에 잘 알려진 항암제 또는 화학적 억제제와 비교하였을 때, 퀴나크린은 MDA-MB468 세포에서 세포 생존율을 효과적으로 억제하는 반면, MCF7 세포에서는 세포 생존율 억제 효과를 나타내지 않았다. MDA-MB468 세포는 MCF7 세포보다 더 침략적(aggressive) 유방암의 종류로, 퀴나크린이 침략적 유형의 암 치료에 더 효과적일 것으로 가정하였다.
그 결과, 도 2C 및 도 2D를 참조하여 보면, 실제로 퀴나크린은 MCF7 세포보다 MDA-MB468 세포의 생존율을 더 유의하게 억제함으로써, 퀴나크린이 침략적 암에 민감성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
퀴나크린에 의한 암세포 생존율의 억제 효과가 세포사멸에 의한 유도인지를 확인하기 위해, 초기 세포사멸 표지자인 아넥신 V-FITC와 PI를 이용하여 세포를 염색하고, 유세포 분석을 통해 염색 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 2E를 참조하여 보면, MCF7 세포와 비교하였을 때, 퀴나크린은 MDA-MB468 세포에서 아넥신 V-양성 세포의 수를 증가시키는 것으로 보아 침략적 암세포의 세포사멸을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 다양한 인간 악성 종양에 대한 퀴나크린의 항암 효과를 분석하기 위해, 추가 세포주를 이용하여 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 3을 참조하여 보면, 소세포성 폐암 세포주에서도 퀴나크린에 의해 암세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 침략적 암에서 퀴나크린의 효과를 확인하기 위해, 두 종류의 중피종 세포주(H28 및 H2452), ACHN(RCC 세포주) 및 다른 침략적 인간 유방암 세포주인 MDA-MB231을 이용하여 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 2F를 참조하여 보면, 실험에 사용된 모든 세포주에서 퀴나크린에 의해 암세포의 생존율이 감소하였으며, 반면 Her2/neu 억제제(Iressa 및 Tarceva) 및 mTOR 억제제(Rapamycin)와 같은 다른 종류의 항암 약물은 상기 암 세포주의 세포 생존율을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
실험예 2 : 퀴나크린 및 p53 상태에 따른 항암 효과
침략적 암에 있어서, 퀴나크린의 민감성 반응의 원인을 입증하기 위해, HCT 116 및 동종의 HCT 116 p53-/- 세포주에서 퀴나크린의 민감성을 비교하였다. 종래 문헌에서 퀴나크린에 의한 p53 유도가 보고된 바 있다(Guo et al., 2009; Gurova et al., 2005).
그 결과, 도 4A를 참조하여 보면, HCT116 p53-/- 세포가 HCT116 세포보다 퀴나크린에 더 민감성을 가지는 것을 확인하였다. 실제로, 도 4B를 참조하여 보면, p53의 억제는 p53-intact A549 및 MCF7 세포주에서 퀴나크린 유도 세포사멸을 촉진하였다.
퀴나크린 유도 세포사멸에서 p53의 효과를 분석하기 위해, 조건부 UBC-Cre-ER; p53flox - R272H 넉-인(knock-in) 마우스(Olive et al., 2004)로부터 얻은 MEF 세포를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 4C를 참조하여 보면, p53 돌연변이는 UBC-Cre-ER의 조절 하에 발현되기 때문에, 4-OHT 처리는 53 돌연변이 발현을 유도하였고, 지속적으로 p21의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4D를 참조하여 보면, p53 돌연변이가 발현된 상태에서 퀴나크린은 현저하게 세포사멸을 유도하였다.
퀴나크린의 생체 내(in vivo) 항종양 효과를 분석하기 위해, 흉선 누드 마우스에 HCT116 p53-/- 세포를 접종하고, 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 퀴나크린을 주 3회 복강 내로 8주간 주입하였다.
그 결과, 도 4E를 참조하여 보면, HCT116 p53-/- 종양 성장이 체중 감소 없이 퀴나크린에 의해 억제되었다. 상기 결과는 퀴나크린이 p53 손상 상태 하에서 종양 성장을 억제할 수 있음을 의미한다.
흥미로운 결과 중 하나는 야생형 p53에도 불구하고 ACHN(RCC)이 퀴나크린에 반응하는 것이다. 이와 관련하여, ACHN의 p53이 NF2 결실에 의해 불활성화된다는 보고가 있다(Dalgliesh et al., 2010). 도 5A 및 도 5B를 참조하여 보면, NF2의 형질주입은 p53 발현을 유도하였고, 또한, 퀴나크린 유도 세포사멸은 NF2 형질주입에 의해 억제되었다. 상기 결과는 퀴나크린이 ACHN(RCC) 또는 중피종과 같은 NF2 결핍 암에도 유용할 수 있음을 시사한다.
퀴나크린에 의한 세포사멸 메커니즘을 분석하기 위해, 시간 의존 세포 생존율을 관찰하였고, 그 결과, 도 4F를 참조하여 보면, 퀴나크린이 MBA-MB468 세포에서 12시간 내지 24시간에 세포사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 세포주기 진행(약 12 내지 24시간)을 고려하면, 퀴나크린에 의한 세포사멸은 세포주기의 진행, 특히 S 내지 M기와 연관되어 있었다. 다른 종류의 세포주(ACHN 및 MDA-MB231)에서는 32시간 내지 36시간에 세포사멸이 검출되었다. 그러나 MCF7 세포에서는 계단 모양의 드롭 다운(dropped-down) 단계가 관찰되지 않았다. 대신, 세포 생존율이 점차 감소 되었다.
세포주기에 의존적인 세포사멸을 분석하기 위해, 탁솔(Taxol)을 이용하여 M기에서 세포주기 억제 후, 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 5C를 참조하여 보면, 세포주기 진행 차단은 퀴나크린 유도 세포사멸을 감소시키는 것을 확인하였다. 상기 결과는 퀴나크린 유도 세포사멸이 S-G2/M기 조절 기전과 관련이 있음을 시사한다.
실험예 3 : 퀴나크린에 의한 Chk1 /2 활성 감소 효과
퀴나크린 유도 세포사멸이 p53의 상태 및 세포주기와 관련되어 있기 때문에, TCGA 데이터베이스(www.cbioportal.org), 단백질 발현 농축(Gao et al., 013)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 6을 참조하여 보면, 여러 종류의 인간 암 조직에서 p-Chk1/2 또는 총 Chk2 발현이 p53 상태와 역의 연관성을 가지는 것을 발견하였다. 상기 결과는 Chk1/2 활성이 p53 불활성화 조건 하에서 적절한 암세포 성장에 필요하다는 것을 시사한다. 실제로 Chk1/2는 S-G2-M기의 주요 조절 인자이며, 단일 세포 유기체에서 포유류 시스템으로 잘 보존된 시스템이다. 또한, 세포주기 체크 포인트 키나아제의 억제가 p53 결핍 상태에서 항암제에 대한 민감성을 향상시킬 수 있다고 제안되어왔다. 따라서, Chk1/2 활성에 있어서 퀴나크린의 효과를 분석하였다.
그 결과, 도 7A를 참조하여 보면, UV 처리된 조건에도 불구하고 p-Chk1/2는 퀴나크린에 의해 현저하게 억제되었다. 도 8A를 참조하여 보면, 아드리아마이신(Adriamycin)으로 처리한 HCT 116 세포에서도 동일한 결과를 관찰할 수 있었다.
다음으로, p-Chk1/2의 농도 의존 감소를 관찰하였다. 도 7B를 참조하여 보면, 활성화된 chk1 및 2는 퀴나크린에 의해 현저하게 감소되었다. 또한, 도 7C를 참조하여 보면, 총 Chk1 감소와 비교하였을 때, p-Chk1 및 2가 급격하게 감소되었다. 상기 결과는 퀴나크린의 주요 타겟이 p-Chk1/2임을 의미한다.
다음으로, 퀴나크린 유도 Chk1/2 감소에 대한 p53의 연관성을 분석하였다. 그 결과, 도 7D를 참조하여 보면, HCT 116 세포와 비교하였을 때, p-Chk1 및 2는 HCT 116 p53-/- 세포에서 급속히 감소되는 것을 확인하였다. 이를 확인하기 위해, MCF7 세포에서 p-Chk2를 측정하였다. 그 결과, 도 8B를 참조하여 보면, 퀴나크린 50 μM는 p-Chk2를 억제하였지만, PFT-α가 처리된 세포에서는 퀴나크린 10 μM 가 현저하게 p-Chk2를 억제하였다. 유사하게, 도 8C를 참조하여 보면, PFT-α 처리된 MCF7에서 p-Chk2의 급속한 감소를 관찰할 수 있었다. 실제로, 도 7E 및 도 8D를 참조하여 보면, 돌연변이 p53이 아닌 야생형 p53의 형질주입은 Chk2 및 퀴나크린 유도 세포사멸의 감소를 차단할 수 있었다. 상기 결과는 퀴나크린이 활성화된 Chk1/2의 선택적 억제제임을 시사한다.
실험예 4 : 퀴나크린에 의한 Chk1 /2 불안정 촉진 효과
퀴나크린에 의한 p-Chk1/2 억제 메커니즘을 분석하기 위해, Chk2의 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 7F를 참조하여 보면, 퀴나크린은 p53 불활성화된 HEK293 세포에서 Chk2 발현을 감소시킨 반면, ChK2의 상류 조절자인 MRE11 또는 ATM 키나아제 활성제인 p18의 발현은 감소시키지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 7G를 참조하여 보면, IF를 통해 Chk2의 감소를 관찰할 수 있었다. 그러나 도 8E를 참조하여 보면, 다른 항 원생동물 약물인 프리마퀸(Primaquine)은 Chk2 발현을 억제하지 못하였고, Chk2의 감소는 퀴나크린의 특이적인 현상임을 알 수 있었다.
퀴나크린에 의한 Chk2 억제 메커니즘을 분석하기 위해, 단백질 안정성을 확인하였다. 그 결과, 도 7H를 참조하여 보면, 퀴나크린 유도 Chk2 전환(turnover)은 프로테아좀 억제제 MG132에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 퀴나크린에 의한 GFP 단백질(대조 단백질)의 감소는 관찰되지 않았다. 또한, Rad50 및 Mre11은 퀴나크린에 의해 감소되지 않았으며, 이는 퀴나크린이 Chk2 단백질 반감기를 선택적으로 감소시킬 수 있음을 시사한다.
다음으로, Chk1 발현에 있어서 퀴나크린의 효과를 분석하였다. 그 결과, 도 S6A 및 도 S6B를 참조하여 보면, Chk2와 유사하게, Chk1 발현은 퀴나크린 농도 및 처리 시간에 따라 감소하는 것을 확인하였다.
프로테아좀 매개 분해를 통한 Chk1/2의 감소를 확인하기 위해, 유비퀴틴화(ubiquitylation) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 7I를 참조하여 보면, 퀴나크린의 처리는 전반적인 유비퀴틴화 없이, Chk1/2의 유비퀴틴화를 촉진하였다. 상기 결과는 퀴나크린이 선택적으로 프로테아좀을 통해 Chk1/2 분해를 촉진함을 시사한다.
실험예 5 : 퀴나크린에 의한 Chk1 /2 분해 촉진 효과
더 자세한 메커니즘을 조사하기 위해, 다양한 E3 리가아제(ligase)로 형질주입된 세포에서 chk2의 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 9A를 참조하여 보면, 실험에 사용된 E3 리가아제 중 β-TrCP, CDC4 및 Siah1이 Chk2 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
다음으로, GST-풀 다운 분석을 통해 3종류의 E3 리가아제와 Chk1의 상호 작용을 분석하였다. 그 결과, 도 9B를 참조하여 보면, 프리마퀸 뿐만 아니라 퀴나크린이 Chk1과 β-TrCP 또는 CDC4 사이의 결합을 향상시킨 반면, Siah1은 Chk1과 연관성이 없는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 Siah1이 퀴나크린 유도 Chk1 감소에 대해 연관성이 없음을 의미한다.
다음으로, β-TrCP를 넉-다운시키고, Chk1/2 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 9C를 참조하여 보면, β-TrCP의 제거는 퀴나크린 유도 내인성 Chk1/2 뿐만 아니라 외인성 Chk2의 감소를 차단하였다.
이를 확인하기 위해, 재조합 β-TrCP를 이용하여 풀다운 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 9D를 참조하여 보면, 퀴나크린이 Chk1/2 및 β-TrCP 사이의 결합을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 2A 내지 도 2D에서 프리마퀸이 세포사멸 없이 Chk1과 β-TrCP의 결합을 촉진함을 확인하였다. 따라서 프리마퀸이 퀴나크린에 대해 경쟁적 억제제가 될 것으로 가정하였다. 실제로 도 1를 참조하여 보면, 퀴나크린과 프리마퀸은 매우 유사한 화학 구조를 가지는 것을 확인할 수 있다. 도 9E를 참조하여 보면, 상기 가설과 일치하게, 프리마퀸의 전처리는 퀴나크린 유도 p-Chk2 감소를 차단하는 것을 확인하였다. 그러나 도 9F를 참조하여 보면, 고농도의 퀴나크린은 프리마퀸 효과를 극복하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 퀴나크린이 Chk1/2에 매우 선택적으로 프로테아좀 분해를 촉진함을 시사한다.
실험예 6 : 장 종양 모델에서 퀴나크린의 항암 효과
생체 내 모델에서 퀴나크린에 의한 항종양 효과를 분석하기 위해, Villin-Cre X p53flox - R272H 마우스(VP 마우스)의 교차 번식에 의한 장 종양 모델을 제작하였다. 4개월 후, 20 mg/kg 농도의 퀴나크린을 복강 내로 주 3회, 22주 동안 주입하였다.
그 결과, 도 10A 및 도 10B를 참조하여 보면, PET-CT 분석 결과, 대조군(VP13 및 VP17)에서 검출된 종양이 퀴나크린에 의해 사라진 것을 확인하였다. 다음으로, 쥐를 희생시킨 후, 장의 조직학을 분석한 결과, 도 10C를 참조하여 보면, 대조군에서는 2 내지 3지점에서 종양을 발견하였으며, 실제로, 침습성 또는 확산 암세포가 대조군 VP 마우스 조직에서 검출되었다. 대조적으로, 퀴나크린을 처리한 마우스에서는 과 성장하는 장 상피세포를 관찰할 수 있었다. 또한, 도 10D를 참조하여 보면, 퀴나크린 처리는 장내 융모의 세포 증식을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 도 10E는 퀴나크린의 제안된 동작 모드를 도시하여 나타낸 것이다. 상기 결과는 퀴나크린 치료가 p53 음성 암에 대한 치료 전략이 될 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 난치성 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 난치성 암은 폐암, 뇌암, 유방암 및 신장암으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 퀴나크린은 Chk1/2의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기성 염인 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산성 염인 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 퀴나크린(Quinacrine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 암은 재발성 암, p53 결핍 암, p53 불활성 암 및 말기 암으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 난치성 암은 폐암, 뇌암, 유방암 및 신장암으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 난치성 암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
PCT/KR2017/009766 2016-09-07 2017-09-06 퀴나크린을 유효성분으로 함유하는 난치성 암 예방 또는 치료용 조성물 WO2018048195A1 (ko)

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