CN111264469B

CN111264469B - 一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的应用

Info

Publication number: CN111264469B
Application number: CN202010125422.7A
Authority: CN
Inventors: 王悦; 施秉银; 张萌; 伍丽萍
Original assignee: First Affiliated Hospital of Medical College of Xian Jiaotong University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Medical College of Xian Jiaotong University
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111264469A

Abstract

本发明公开了一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的应用。构建方法为：1)将表达人促甲状腺激素受体的腺病毒的母液按照1：50的体积比用PBS稀释，得到Ad‑TSHR稀释液；2)在第0周的第1天，给实验动物左、右臀大肌分别注射25uL的Ad‑TSHR稀释液；3)在第3、6、10、14、18、22、26、30周均重复步骤2)的操作，直至诱发实验动物产生甲状腺相关性眼病，即成功构建基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型。本发明是对甲状腺相关眼病模型领域的空白的填补，也是雷帕霉素类对甲状腺相关眼病的治疗的一项新的探索。

Description

一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的应用。

背景技术

Graves’病(Graves’Disease，GD)是又称毒性弥漫性甲状腺肿，是一种器官特异性自身免疫性疾病，其发病机制为机体产生了针对促甲状腺激素受体 (thyroidstimulating hormone receptor，TSHR)的抗体(thyrotropin receptor antibody，TRAb)。

甲状腺相关性眼病，又称Graves’眼病(Graves’Ophthalmopathy，GO)是Graves’病的一种常见的甲状腺外并发症，在Graves’病患者中的发病率达到了20％-50％。作为一种自身免疫介导的炎症反应性疾病，GO的发生是机体在遗传与环境共同作用下打破T细胞对自身抗原的免疫耐受，进而抗原特异性T细胞在甲状腺和眼眶组织进行特异性交叉反应，启动眼眶纤维母细胞的活化，产生眼眶内透明质酸沉积、新生脂肪形成、眼外肌增粗等特征性病理改变，从而导致眼球突出、眼裂增大、复视、视力下降等临床表现。目前临床上针对Graves’眼病治疗方法主要为大剂量糖皮质激素静脉注射、球后放疗、I131治疗以及手术治疗等，这些技术都是针对已产生明确病理改变的患者的治疗，有效率低、复发率高、副作用大，严重影响患者的生活质量。

动物模型作为临床前研究的重要手段，既可以全面阐述疾病的发病机制，还可以评估新的治疗方法。近年来GD动物模型的研究取得了重要进展，其中TSHR- 腺病毒模型无论是成功率还是可复制性等方面均受到广泛推崇；GO动物模型也在不断的探索和尝试中，包括TSHR-质粒辅助电穿孔和TSHR-腺病毒多次注射的方案，但分别在重现甲亢状态和眼病状态存在不足。

雷帕霉素(rapamycin)，又名西罗莫司(sirolimus)，是由吸水链霉菌FC904发酵产生的大环内酯类化合物，主要作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)，通过抑制mTOR通路，整合体内微环境的不同反应信号发挥免疫稳态调节作用，功能主要包括调节细胞生长、增殖与代谢。目前临床上，雷帕霉素主要作为器宫移植的抗排斥反应和抗肿瘤的治疗药物，具有活性高、用量小，以及毒性低等优点。研究发现，雷帕霉素可以通过单用和与其他药物合用参与自身免疫性疾病的治疗。其通过抑制mTOR通路，促进CD4+T细胞向调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)分化，并使CD8+T细胞增殖降低，更趋向于记忆性CD8+T细胞分化，从而干预自身免疫性疾病的发生与发展。目前，雷帕霉素对自身免疫性疾病的作用主要集中于系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)及其并发症狼疮性肾病的研究，对于其他免疫性疾病，尤其是甲状腺相关自身免疫性疾病领域内还是空白。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的药物应用，通过该构建方法可以成功构建甲状腺相关性眼病动物模型，并且雷帕霉素类药物对于甲状腺相关性眼病动物不仅能有效改善其球后纤维化和脂肪沉积，还能有效改善其甲亢状态。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，包括以下步骤：

1)将表达人促甲状腺激素受体的腺病毒的母液按照1：50的体积比用PBS 稀释，得到Ad-TSHR稀释液；

2)在第0周的第1天，给实验动物左、右臀大肌分别注射25uL的Ad-TSHR 稀释液；

3)在第3、6、10、14、18、22、26、30周均重复步骤2)的操作，直至诱发实验动物产生甲状腺相关性眼病，即成功构建基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型。

优选地，在第34周对实验动物的离体眶骨进行病理学观察，小鼠眼眶球后纤维化体积增大，球后脂肪沉积增多，出现球后组织淋巴细胞浸润，个别小鼠出现眼球的突出、球结膜红肿及眼睑增生增厚。

优选地，所述表达人促甲状腺激素受体的腺病毒所表达的人促甲状腺激素受体cDNA为TSHR289片段，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

优选地，所述表达人促甲状腺激素受体的腺病毒的母液的浓度≥10¹⁰pfu/ml。

优选地，所述实验动物为具有免疫活性的啮齿类动物。

进一步优选地，所述啮齿类动物为小鼠。

更进一步优选地，所述小鼠为6～8周雌性BALB/C小鼠。

本发明还公开了雷帕霉素类药物作为治疗上述的构建方法构建得到的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病的应用。

优选地，雷帕霉素类药物为雷帕霉素、雷帕霉素药学上可接受的盐、雷帕霉素衍生物或雷帕霉素衍生物药学上可接受的盐。

优选地，雷帕霉素类药物为胃肠道给药和胃肠道外给药中的任一临床上可接受的剂型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，该动物模型的构建方法操作简单，评价模型成功与否，从组织形态，生理功能，细胞类型等多方面，全面且精确的做出了评价。采用本发明所述制备方法得到的甲状腺相关性眼病动物模型，动物反应性好，适合研究甲状腺相关性眼病动物模型发生过程中体内T细胞亚群水平的变化，为甲状腺相关性眼病发病机理研究，和发现及评估新的治疗方法提供新的途径。

本发明还提供了一种雷帕霉素类药物在甲状腺相关性眼病动物模型上的应用。雷帕霉素类药物对于甲状腺相关性眼病动物不仅能有效改善其球后纤维化和脂肪沉积，还能有效改善其甲亢状态。

附图说明

图1为实施案例1中第34周造模组和对照组小鼠的球后纤维化体积及脂肪沉积面积与对照组的比较图；其中，A为球后纤维化体积比较图；B为脂肪沉积面积比较图。

图2为实施案例1中第34周出现的两只出现突眼的小鼠的正面观和粗侧面观以及对照小鼠；其中，A及C为对照小鼠；B及D为造模小鼠。

图3为实施案例1中第34周造模组小鼠在球后不同组织的淋巴细胞浸润图；其中，A为眼外肌肌束之间；B为视神经周围；C为脂肪组织中；D为框内结缔组织。

图4为实施案例1中造模期间的对照组小鼠和造模组小鼠甲状腺功能评估的比较图；其中，A为摄食体重比的变化图；B为自身免疫性抗体TRAb的比较图； C为总T4水平的比较图。

图5为实施案例1中造模期间的对照组小鼠和造模组小鼠甲状腺病理比较图；其中，A为对照组；B为造模组第11周；C为造模组第23周；D为造模组第34 周。

图6为实施案例2中三组小鼠的球后纤维化体积及脂肪沉积面积与对照组的比较图；其中，A为球后纤维化体积比较图；B为脂肪沉积面积比较图。

图7为实施案例2中三组小鼠甲状腺功能评估的比较图；其中，A为摄食体重比的变化图；B为自身免疫性抗体TRAb的比较图；C为总T4水平的比较图。

图8为实施案例2中三组小鼠甲状腺病理比较图；其中，A为对照组；B为造模组；C为雷帕霉素组。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、 “第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有” 以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供的一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，具体建立过程如下：

(1)将表达人促甲状腺激素受体的腺病毒(Ad-TSHR)母液按照1：50的体积比例用PBS稀释；

(2)在第0周的第1天，给小鼠左右臀大肌分别注射25ul的稀释后Ad-TSHR 溶液；

(3)在第3、6、10、14、18、22、26、30周分别重复上述步骤2)操作；

(4)实验过程中持续观察小鼠眼部变化，有无眼睛突出，水肿，眼睑增生，眼角分泌物增多等相应临床表现。

(5)在第34周取小鼠眶骨，脱钙后行石蜡包埋，行冠状面切片，①取跨越整个眼眶的间隔1mm的切片四张，行马森三色(Masson’s)染色，胶原纤维被染成蓝色；②以视神经为解剖标志选取冠状面切片层面，行苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin，HE)染色，球后脂肪被染成白色；③进行CD3免疫组化染色。通过奥林帕斯显微镜采集图像后，通过PhotoshopCS5软件分析色素块后，分析眼眶球后纤维化体积和脂肪面积。

分析数据观察可见：小鼠眼眶球后纤维化体积增大，球后脂肪沉积增多，出现球后组织淋巴细胞浸润，个别小鼠出现眼球的突出、球结膜红肿及眼睑增生增厚，即成功构建基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病的动物模型。

优选地，本发明中所说地基因免疫诱导指的是表达人促甲状腺激素受体的腺病毒(Ad-TSHR)诱导的。

进一步的，在一些实施方案中，所述Ad-TSHR为Ad-TSHR289，表达的蛋白质序列为：(如SEQ.ID.NO.1所示)

MRPADLLQLVLLLDLPRDLGGMGCSSPPCECHQEEDFRVTCKDIQRIPSLPPST QTLKLIETHLRTIPSHAFSNLPNISRIYVSIDVTLQQLESHSFYNLSKVTHIEIRNT RNLTYIDPDALKELPLLKFLGIFNTGLKMFPDLTKVYSTDIFFILEITDNPYMTSI PVNAFQGLCNETLTLKLYNNGFTSVQGYAFNGTKLDAVYLNKNKYLTVIDKDAFGGVYSGPSLLDVSQTSVTALPSKGLEHLKELIARNTWTLKKLPLSLSFLHL TRADLSYPSHCCAFKNQ

进一步的，在一些实施方案中，所述Ad-TSHRAd-TSHR每只小鼠每次注射的计量≥10⁷pfu。

目前用于制备甲状腺相关性眼病模型的动物为小鼠。其中，在一些实施方案中，本发明所述小鼠为雌性6～8周BLAB/C。

本发明还提供了一种雷帕霉素类药物在甲状腺相关性眼病动物模型治疗中的应用。包括以下步骤：

(1)设置正常对照组、普通造模组、雷帕霉素组；

(2)对普通造模组和雷帕霉素组采用基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型激发，正常对照组以表达绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)注射激发；

(3)对正常对照组和普通造模组喂食正常普通小鼠饲料；对雷帕造模组第 11周喂食正常普通小鼠饲料，从第11周开始喂食含雷帕霉素的饲料。

(4)按照鼠笼为单位，从第0周开始，每两周称量一次小鼠体重和小鼠饲料重量，计算小鼠每公斤体重每天消耗的饲料重量。

(5)在第34周，取血并分离血清，测定血液中的总甲状腺素(TT4)水平和促甲状腺素受体抗体(TRAb)。取得甲状腺腺体，石蜡包埋并切片，进行HE 染色，镜下观察病理变化。取小鼠眶骨，脱钙后行石蜡包埋，行冠状面切片，① 取跨越整个眼眶的间隔1mm的切片四张，行马森三色(Masson’s)染色，胶原纤维被染成蓝色；②以视神经为解剖标志选取冠状面切片层面，行HE染色，球后脂肪被染成白色。通过奥林帕斯显微镜采集图像后，通过Photoshop CS5软件分析色素块后，分析眼眶球后纤维化体积和脂肪面积。

(6)分析步骤(4)及(5)得到的数据，对比普通造模组小鼠，雷帕霉素组小鼠用药后，每公斤体重每日摄食量降低，TT4升高比率降低，甲状腺滤泡细胞增生改善，眼眶球后纤维化体积和脂肪面积减少。

所述雷帕霉素类药物包括雷帕霉素、雷帕霉素药学上可接受的盐、雷帕霉素衍生物和/或雷帕霉素衍生物药学上可接受的盐。本案例中，其中，在一些实施方案中，本发明所用的药物为雷帕霉素。

所述雷帕霉素类药物为胃肠道给药和胃肠道外给药中的任一临床上可接受的剂型。其中，在一些实施方案中，本发明所用的剂型为胃肠道给药。

实验案例1、甲状腺相关性眼病动物模型的制备

实验器材：Ad-TSHR(购自深圳市百恩维生物科技有限公司)，PBS，雌性 6～8周近交系BALB/C小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)

制备方法：

1.将表达人促甲状腺激素受体的腺病毒(Ad-TSHR)母液按照1：50的体积比例用PBS稀释；

2.将6周龄健康雌性的BALB/C小鼠随机分为两组，对照组(8只)和造模组(22只)。

3.对照组小鼠接受表达绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)注射；造模组小鼠接受TSH受体细胞外片段的腺病毒(Ad-TSHR)注射。每次注射的剂量为10^8pfu，左右臀大肌分别注射25ul，注射时间分别为实验开始的第0，3，6，10，14，18， 22，26，30周。造模组小鼠于第11周和第23周随机处死6只小鼠。剩下的造模组小鼠和所有的对照组小鼠于第34周处死。

4.观察指标：

(1)摄食体重比：按照鼠笼为单位，从第0周开始，每两周称量一次小鼠体重和小鼠饲料重量，计算小鼠每公斤体重每天消耗的饲料重量。

(2)总甲状腺素(TT4)水平和促甲状腺素受体抗体(TRAb)的水平：在第11，23，34周小鼠处死后取血并分离血清后，测定血液中的总甲状腺素(TT4) 水平和促甲状腺素受体抗体(TRAb)。其中TSHR自身抗体(TRAb)通过tsh结合抑制(TBI)试验测定。

(3)甲状腺病理检测：小鼠处死解剖后，自上至喉部下至气管第七软骨水平切断取得甲状腺腺体，石蜡包埋，切片，进行HE染色和CD3免疫组化染色，并在镜下观察病理变化。

(4)眼睛外观观察：持续观察小鼠眼部变化，有无眼睛突出，水肿，眼睑增生，眼角分泌物增多等。

(5)眼眶病理检测：取小鼠眶骨，脱钙后石蜡包埋，行冠状面切片，①取跨整个眼眶的间隔1mm的切片四张，行马森三色染色，胶原纤维被染成蓝色； ②以视神经为解剖标志选取冠状面切片层面，行HE染色，球后脂肪被染成白色； ③进行CD3免疫组化染色。通过奥林帕斯显微镜采集图像后，通过Photoshop CS5 软件分析色素块后，分析眼眶球后纤维化体积和脂肪面积。

5.实验结果：

由图1中的A图和B图可见，造模组小鼠相对于正常组小鼠球后纤维化体积和脂肪沉积的体积均显著增加；

由图2可见，与正常对照组相比，造模组小鼠B一只小鼠出现了眼球的突出 (B图中左眼球)和球结膜红肿，造模组小鼠D出现了眼睑的增生增厚；

由图3可见，造模组出现了小鼠眶后不同部位的淋巴细胞浸润，说明有炎症存在。

由图4可见，图4中A显示：从实验开始，造模组的小鼠摄食体重比迅速升高，显著高于同时期对照组，并在第10-20周处于较高的水平。B显示：造模组第11、23、34周小鼠的TRAb水平均明显高于对照组；C显示：造模组三个时间点的小鼠TT4水平升高均达到了67％-80％。

由图5可见，光镜下(40X)，对照小鼠甲状腺上皮细胞呈低立方状或扁平状，滤泡中胶质含量比较丰富。造模组11、23、34周的小鼠甲状腺病理小鼠甲状腺滤泡细胞增生肥大，呈立方状或高柱状，滤泡大小不一，滤泡腔中胶质含量减少，在增生的甲状腺滤泡中可见乳头状折叠凸入滤泡腔。

根据上述图1-5，可以得出如下结论：通过基因免疫的方法可以成功构建甲状腺相关性眼病的小鼠模型，表现为眶后纤维化体积增加，脂肪沉积增加，炎症产生。且此模型还伴有甲状腺功能亢进的相关血清学和病理改变。

实验案例2、雷帕霉素干预甲状腺相关性眼病动物模型疗效评价

实验器材：Ad-TSHR(购自深圳市百恩维生物科技有限公司)，PBS，雌性 6～8周近交系BALB/C小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，雷帕霉素(购自上海笛柏生物科技有限公司)

实验方法：

1.将雷帕霉素粉末以肠溶微粒的形式加入小鼠饲料中(14ppm)；

2.将6周龄健康雌性的BALB/C小鼠随机分为三组：正常对照组、普通造模组、雷帕霉素组；

3.对普通造模组和雷帕霉素组采用基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型激发，正常对照组以表达绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)注射激发。对正常对照组和普通造模组喂食正常普通小鼠饲料；对雷帕造模组第11周喂食正常普通小鼠饲料，从第11周开始喂食含雷帕霉素的饲料。并于34周处死所有小鼠。

4.观察指标：

(3)甲状腺病理检测：小鼠处死解剖后，自上至喉部下至气管第七软骨水平切断取得甲状腺腺体，石蜡包埋，切片，进行HE染色并在镜下观察病理变化。

(4)眼眶病理检测：取小鼠眶骨，脱钙后石蜡包埋，行冠状面切片，①取跨整个眼眶的间隔1mm的切片四张，行马森三色染色，胶原纤维被染成蓝色； ②以视神经为解剖标志选取冠状面切片层面，行HE染色，球后脂肪被染成白色。通过奥林帕斯显微镜采集图像后，通过Photoshop CS5软件分析色素块后，分析眼眶球后纤维化体积和脂肪面积。

5.实验结果：

由图6可见，与造模组相比，干预组的眼眶纤维化体积和脂肪体积明显降低；

由图7可见，A：从实验开始，干预组的小鼠摄食体重比迅速升高，与造模组相似，显著高于同时期对照组；随着第11周开始用药，干预组小鼠摄食体重比逐渐下降，并逐渐与对照组水平相似。B：与对照组相比，造模组、干预组均显著性增高。C：以对照组95％置信区间为范围(平均值±2x标准差)为范围，造模组及干预组小鼠TT4水平分别为8/10、2/10，有显著性差异。

由图8可见：光镜下(40X)，对照小鼠甲状腺上皮细胞呈低立方状或扁平状，滤泡中胶质含量比较丰富。造模组小鼠甲状腺病理小鼠甲状腺滤泡细胞增生肥大，呈立方状或高柱状，滤泡大小不一，滤泡腔中胶质含量减少，在增生的甲状腺滤泡中可见乳头状折叠突入滤泡腔。干预组小鼠甲状腺上皮细胞恢复扁平状，滤泡胶质含量丰富。

根据上述图6-8，可以得出如下结论：雷帕霉素干预甲状腺相关眼病的小鼠模型，不仅能够改善球后纤维化和脂肪沉积，还能够有效改善其伴随的甲亢的相关指标。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学医学院第一附属医院

<120> 一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法及雷帕霉素类药物的应用

<141> 2020-02-25

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro

1 5 10 15

Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His

20 25 30

Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro

35 40 45

Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu

50 55 60

Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg

65 70 75 80

Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser

85 90 95

Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg

100 105 110

Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu

115 120 125

Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu

130 135 140

Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp

145 150 155 160

Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys

165 170 175

Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val

180 185 190

Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn

195 200 205

Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val

210 215 220

Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala

225 230 235 240

Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn

245 250 255

Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu

260 265 270

Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn

275 280 285

Gln

Claims

1.一种基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将表达人促甲状腺激素受体的腺病毒的母液按照1：50的体积比用PBS稀释，得到Ad-TSHR稀释液；

所述表达人促甲状腺激素受体的腺病毒的母液的浓度≥10¹⁰pfu/ml，表达人促甲状腺激素受体的腺病毒母液按照1：50的体积比例用PBS稀释得到；

2)在第0周的第1天，给实验动物左、右臀大肌分别注射25uL的Ad-TSHR稀释液；

3)在第3、6、10、14、18、22、26、30周均重复步骤2)的操作，直至诱发实验动物产生甲状腺相关性眼病，在第34周对实验动物的离体眶骨进行病理学观察，小鼠眼眶球后纤维化体积增大，球后脂肪沉积增多，出现球后组织淋巴细胞浸润，个别小鼠出现眼球的突出、球结膜红肿及眼睑增生增厚，即成功构建基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型。

2.根据权利要求1所述的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，其特征在于，所述表达人促甲状腺激素受体的腺病毒所表达的人促甲状腺激素受体cDNA为TSHR289片段，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，其特征在于，所述实验动物为具有免疫活性的啮齿类动物。

4.根据权利要求3所述的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小鼠。

5.根据权利要求4所述的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为6～8周雌性BALB/C小鼠。

6.雷帕霉素类药物作为治疗权利要求1～5中任意一项所述的构建方法构建得到的基因免疫诱导的甲状腺相关性眼病的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，雷帕霉素类药物为雷帕霉素、雷帕霉素药学上可接受的盐、雷帕霉素衍生物或雷帕霉素衍生物药学上可接受的盐。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，雷帕霉素类药物为胃肠道给药和胃肠道外给药中的任一临床上可接受的剂型。