CN103446155A - mTOR抑制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及化合物(1～17)和含有这些化合物的药用组合物的医疗用途，特别是作为mTOR抑制剂的用途。

Description

mTOR抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及17个化合物及含有这些化合物的，药用组合物以及它们的医疗用途，特别是作为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂的用途。

背景技术

近年来，肿瘤成为全球范围内导致人类死亡的主要原因之一。肿瘤普遍具有总体治愈率低且复发率高等特点，因此预防、治疗以及抑制肿瘤复发具有重要的科研价值，实现肿瘤的预防和治愈具有相当的紧迫性和挑战性。

信号转导通路异常是导致肿瘤发生的重要因素之一。最新研究发现，mTOR相关信号转导通路与肿瘤细胞增殖调亡密切相关。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target ofrapamycin，mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase，PIKK)蛋白家族中一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶。mTOR在生物体内以两种复合物形式存在，即mTORC1及mTORC2，其主要受PI3K/Akt/mTOR和AMPK/mTOR两条上游信号转导通路调控，同时通过磷酸化方式影响下游信号分子(主要是真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4EBP1)和核糖体S6蛋白激酶(S6K))的活化状态从而参与一系列细胞活动的调控，其处于该信号转导调控网络的中心节点。mTOR通过以上信号转导途径感受并传导生长因子和营养变化信号，从而实现对细胞生长、增殖、分化以及细胞周期调控的影响。一方面，生长因子结合于相应膜受体，激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，进而激活磷脂酰肌醇依赖性激酶-1(PDK-1)，从而使Akt的308位的Thr磷酸化，并在PDK-2的存在下，其473位的Ser再被磷酸化从而使Akt完全被激活。激活的Akt除通过抑制结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2的生成介导小GTP酶Rheb对mTOR的激活外，还可直接磷酸化激活mTOR蛋白。另一方面，AMPK对细胞内AMP水平变化及其敏感。能量较低时，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活性，促进TSC-1/TSC-2复合物形成，抑制Rheb活性从而间接抑制mTOR的活性。

与肿瘤密切相关的多项细胞功能如细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等均受控于mTOR的调节。现已发现多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌中都存在mTOR信号通路的异常。研究表明PI3K/Akt/mTOR通路在大量肿瘤中过度激活，激活状态的mTOR通过磷酸化激活4EBP1和S6K，从而影响了细胞周期中与G1-S转化有关的mRNAs的翻译，促进翻译调节相关蛋白、细胞周期调控相关蛋白以及癌蛋白的生成，引起肿瘤细胞的快速增殖和加速细胞周期进程。所以mTOR的抑制将会导致细胞分裂停留在G1期直至造成肿瘤细胞的凋亡。由于mTOR在调节肿瘤细胞的增殖中所起重要作用，通过选择性地抑制肿瘤组织中mTOR活性，可以对恶性肿瘤等恶性增生性疾病的治疗起到积极的作用，所以对mTOR小分子抑制剂的筛选与研究已成为肿瘤治疗和开发新型化疗药物的新兴领域。

雷帕霉素Sorilimus作为经典的第一代特异性mTOR抑制剂，直到近期才进入抗肿瘤临床研究阶段。其抗肿瘤活性虽强，但是存在稳定性差和水溶性差的严重缺陷，因此又陆续开发了多个雷帕霉素类似物。其中由Novartis公司开发的雷帕霉素半合成衍生物Everolimus(III期临床)，水溶性大大改善且可口服。惠氏公司在此基础上开发了mTOR靶向的丙酸酯类衍生物Temsirolimus(II期临床)。另外还有Ariad公司开发的Radiaforolimus(II期临床)，都是通过和靶蛋白FKBP12(FK506结合蛋白)形成复合物后，再与mTOR结合起到mTOR抑制活性。这类抑制剂靶向不仅作用较强，不良反应也较小。而直接作用于mTOR激酶区催化位点且活性较好的第二代抑制剂则相对较少。近来，一些mTOR小分子抑制剂已陆续公开发表，如吡咯并喹啉衍生物DK8G557；色酮衍生物LY303511；α-亚甲基-γ-丁内酯类衍生物；以及近期发表的苯并噻吩、吡唑并嘧啶衍生物、三唑类等具有一定选择性的高活性mTOR抑制剂。以上抑制剂都通过ATP竞争性抑制机制发挥mTOR抑制作用。但该类抑制剂结构类型不多，活性低且选择性较差，还有待进行大量的研究加以克服。因此mTOR抑制剂对恶性肿瘤的治疗有相当大的发展前景，寻找和开发新型结构选择性mTOR抑制剂是抗肿瘤药物研究的重要方向。

发明内容

本发明应用同源模建和经典分子动力学技术构建了mTOR激酶的蛋白模型，通过定量构效关系法研究抑制剂与mTOR蛋白的相互作用模式，分别构建了基于配体和基于结构的药效团模型，结合已建立的的Docking模型，对含300万个化合物的小分子库进行虚拟筛选，依据成药性及经验原则，从筛选结果中选择了多个结构系列的目标化合物，经体外酶活性和细胞活性筛选，获得了17个结构新颖的mTOR抑制剂。

本发明的目的在于，提供上述化合物或其药学上可接受盐及其药用组合物的医疗用途，尤其是在预防、延缓或治疗mTOR参与或不参与介导的疾病，特别是肿瘤的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明提供具有如下所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：

以上化合物的合成方法可以从已发表的相关文献和专利中获取。

根据本发明，药学上可接受的盐包括化合物1～17与下列酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸。此外还包括无机碱的酸式盐，如：含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子盐。

生物活性测试结果表明，本发明所提供化合物具有mTOR抑制效果，同时对肿瘤细胞株的生长有一定的抑制作用。本发明化合物可用于治疗各种实质性器官癌，其中包括黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、睾丸癌、骨癌、脑癌、食管癌、胃肠道癌、软组织瘤、血癌、淋巴癌等，其中可以是由mTOR介导的癌症，也可以是不依赖于上述机制的癌症。因此，本发明提出，本发明化合物可用于抗癌药物的制备。

具体实施方式

实施例1

化合物1～化合物17对mTOR抑制活性和对肿瘤细胞株抑制活性的实验研究

1.mTOR抑制活性测试

1)实验材料：K-LISA^TM mTOR Activity Kit，Glutathione-Coated96孔板，mTORSubstrate，Anti-p70S6K-T389，mTOR Standard，2X Kinase Assay Buffer，ATP Solution，100mM DTT，Wortmannin50X，Kinase Stop Solution，10X Plate Wash Concentrate，AntibodyDiluent，HRP-Antibody Conjugate，TMB Substrate，ELISA Stop Solution，Plate Sealers。

2)实验步骤：

·溶液配制如上表所示：mTOR Substrate1ml。2X Kinase Assay Wash Buffer500μl。Anti-p70S6-T3891ml。HRP-Antibody conjugate1ml。Plate Wash(1X)20ml。以上溶液均为10孔测试所需试剂量。

·每孔加入50μl mTOR标准品，同时加入1μl的Wortmannin和待测样品的50倍稀释溶液，冰浴培养20min。

·每孔加入100μl mTOR Substrate，封板膜封住反应孔，室温培养1h。

·200μl TBS洗涤Glutathione-Coated96孔板。将板内液体轻拍打倒出，在吸水纸上拍干，如此洗板3次。

·按照下表加入成分：

·板膜封住反应孔，30秒混合均匀，在30℃下温育30分钟。

·每孔加入10μl Stop Solution终止反应。

·每孔用200μl Plate Wash(1X)洗板，洗时注意每孔均充满，洗后液体轻轻拍打倒出或者吸出，在吸水纸上拍干，如此洗板3次以上。

·每孔加入100μl Anti-p70S6K-T389，封板膜封住反应孔，室温培养1h。

·按照第8步的方式洗涤孔板4次。

·每孔加入100μl HRP-Antibody Conjugate，封板膜封住反应孔，室温培养1h。

·按照第10步的方式洗涤孔板。

·每孔加入100μl TMB Substrate封板膜封住反应孔，室温培养5-20min。

·每孔加入100μl ELISA Stop Solution。

·在加入Stop Solution30min之内，450nm波长下酶标仪读取每个孔的OD值，并计算抑制率。

4)实验结果

(表中化合物代号对应于前面的化合物代号)

2.体外肿瘤细胞抑制活性测试

本发明化合物在体外对肿瘤细胞株的抑制活性。

采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法测试本发明化合物对体外肿瘤细胞增殖的抑制活性，所选细胞株为人肺癌细胞A549，人低分化胃腺癌细胞BGC-823，阳性对照药为阿霉素。

测试时，取处于指数生长期、状态良好的细胞一瓶，加入浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×104个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO₂培养箱中培养24h。然后换液，加入受试药物，20μl/孔，培养48h。将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4h。吸去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇10min。

用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的光密度(OD值)，细胞抑制率＝(阴性对照组OD值-受试物组OD值)/阴性对照组OD值×100％。

部分结果如下表所示：

(表中化合物代号对应于前面的化合物代号)

3.结论

mTOR体外抑制活性表明，本发明所提供的化合物具有mTOR抑制活性及体外抑制肿瘤细胞株的活性。由于mTOR在肿瘤细胞生长增殖中具有关键性作用，且有体外肿瘤细胞抑制活性实验支持，本发明所提供的化合物可以用于预防或治疗与mTOR抑制剂有关的疾病的药物中，尤其是肿瘤的药物中。

Claims (4)

1.化合物1～化合物17(结构与编号如下)或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗与Polo样激酶1抑制剂有关的疾病的药物中的用途。

2.一种药物组合物，其中含有权利要求1所包含化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

3.权利要求1的用途，其中与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制剂有关的疾病是黑色素瘤、肝癌、肾癌、急性白血病、非小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨髓增生异常综合症、食管癌、胃肠道癌或间皮瘤。

4.权利要求1的用途，其中药学上可接受的盐是化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸等形成的酸加成盐。