CN115919804A - 诱导Treg细胞分化的纳米载体系统及其在RA治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种诱导调节性T细胞(Treg)细胞分化的纳米载体系统及其在RA治疗中的应用。具体的，公开了一种纳米载体系统，所述纳米载体系统包括包裹有用于诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。该纳米载体系统不但在体外可以高效诱导Treg细胞分化，而且在体内可提高小鼠外周Treg细胞比例，降低Th1、Th17细胞比例，缓解CD4⁺T细胞分化亚群中Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡情况，从而使疾病症状得以改善。

Description

诱导Treg细胞分化的纳米载体系统及其在RA治疗中的应用

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种诱导Treg细胞分化的纳米载体系统及其在RA治疗中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病，其特征是持续的滑膜炎，肿胀和手脚小关节的逐渐恶化，导致严重的疼痛和关节功能障碍，并伴有功能性残疾。在患者关节部位大量的CD4⁺T细胞浸润滑膜组织，被激活分化为分泌炎症因子的Th1、Th17细胞，关节部位持续处于慢性炎症状态，引起滑膜增生、血管翳形成、RANKL表达、破骨细胞生成增多，最终导致软骨及软骨下骨破坏。目前针对类风湿性关节炎的常规治疗用药方案主要以提高人体免疫，延缓炎症反应的发生为主，如诱导Treg细胞分化的新型生物制剂，然而传统方式使用IL-2，TGF-β诱导iTreg细胞分化效率低且抑制功能受限。

在过去的几十年里，药物递送策略极大地促进了药物的治疗和应用，合理的“包装”药物，不仅能提高药物的溶解度和生物利用率，减少副作用，控制其释放率，优化药物活性，还能改善它们的药代动力学。一些案例研究表明，纳米材料可以解决当前生物医学和医疗保健领域原材料面临的挑战。药物可以通过多种物理或化学方法吸附到纳米粒表面，也可以直接在生产过程中装载到纳米粒上，形成粒径为1-1000nm的纳米给药系统，包括纳米粒、纳米囊和纳米脂质体等。白蛋白作为制作纳米药物递送系统的原料之一，由3个结构相似的α-螺旋结构域组成，能与难溶性或者外源性物质形成复合物。白蛋白分为人血清白蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白，其中BSA包含583个氨基酸残基，分子量为66kDa，与人血清白蛋白相似，因其良好的生物相容性、生物降解性和无毒，而被广泛用于药物递送技术。因此高效诱导Treg细胞及递送药物治疗类风湿性关节炎具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

鉴于现有的类风湿性关节炎治疗方案的不足，本发明创新性地提出了一种高效诱导Treg细胞分化的纳米载体系统，为类风湿性关节炎的临床治疗提供了新方向。

类风湿性关节炎患者滑膜及外周血CD4+T细胞异常扩增、分化失衡，主要表现为：Th1、Th17细胞增多，Treg细胞降低。因此，改善CD4+T细胞亚群分化失衡可能成为缓解类风湿性关节炎的一种有效策略。本发明建立纳米载体包裹诱导Treg细胞分化的药物，不但在体外可以高效诱导Treg细胞分化，而且在体内可提高小鼠外周Treg细胞比例，降低Th1、Th17细胞比例，缓解CD4+T细胞分化亚群中Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡情况，从而使疾病症状得以改善。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面提供了一种纳米载体系统，所述纳米载体系统包括包裹有用于诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

优选的，所述用于诱导Treg细胞分化的药物的包括5-15ng/mL IL-2、5-15ng/mLTGF-β和800-1200nM AS。

在本发明的一个较佳实施例中，所述用于诱导Treg细胞分化的药物的包括10ng/mL IL-2、10ng/mL TGF-β和1000nM AS。

优选的，所述纳米载体以牛血清蛋白为原材料制备而成。

优选的，所述AS为小分子周期蛋白依赖性激酶CDK8/19抑制剂。

本发明第二个方面公开了一种制备诱导Treg细胞分化的纳米载体系统的方法，包括：S1、筛选诱导Treg细胞分化的药物；

S2、制备包裹有诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

优选的，在S1中，分离小鼠脾脏后，研磨后获得单细胞悬液，磁珠分选出CD4⁺T细胞得到诱导体系，通过将IL-2、TGF-β和AS以不同的浓度组合加入到诱导体系中，筛选出诱导Treg细胞分化的药物。

优选的，在S2中，包括：

S21、将用于诱导Treg细胞分化的药物加入BSA溶液中混匀得到混合液；

S22、将无水乙醇泵入混合液中至溶液成胶体状态；

S23、接着将壳聚糖乙酸溶液泵入溶液中；

S24、将无水乙醇泵入溶液中，搅拌后离心、洗涤，即得到包裹有诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

本发明第三个方面公开了一种用于研究诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体系统疗效的动物模型，利用鸡二型胶原免疫DBA/1小鼠建立胶原诱导的关节炎模型。

本发明第四个方面公开了上述的纳米载体系统或上述方法制备得到的纳米载体系统在类风湿性关节炎领域中的应用。

本发明主要内容包括：(1)经筛选获得高效诱导Treg细胞分化的药物组合方案，将AS与IL-2、TGF-β作为iTreg细胞的诱导体系，培养CD4+T细胞48小时，提高Treg细胞比例至(68.83±1.37)％；(2)制备了以牛血清白蛋白为原料、大小分散均匀、形态完整、具有良好生物相容性的纳米级载体；(3)利用纳米载体包裹IL-2、TGF-β和AS，缓慢释放药物，延长药物停留时间，避免药物浓度过高产生的副作用以及避免多次给药造成的机械损伤。

该纳米载体包裹药物不仅能促进Treg细胞比例的增加，抑制Th1、Th17细胞分化，降低炎症因子产生，改善CD4+T细胞亚群分化失衡，并且纳米载体可延长药物的半衰期，控制药物释放速度，实现药物的长期发挥作用且避免了药物浓度过高带来的不利影响。

该纳米载体包裹药物治疗的优势：与传统方法相比，使用IL-2、TGF-β联合AS可高效诱导具有免疫抑制功能的iTreg细胞；使用纳米载体包裹药物，缓慢释放药物，避免药物浓度过高产生的副作用。

附图说明

图1为实施例2的实验流程图。

图2为本发明高效诱导Treg细胞分化结果，图中：(A)流式细胞术检测不同AS浓度诱导Treg细胞的情况；(B)各组Treg细胞的比例。a组：空白对照组；b组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)；c组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(10nM)；d组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(100nM)；e组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(1000nM)。(n＝3，***P<0.001，****P<0.0001)；

图3为本发明诱导产生的Treg细胞抑制PBMCs增殖结果，图中：(A)流式细胞术检测加入不同比例Treg细胞后PBMCs增殖情况；(B)各组PBMCs的比例。(n＝3，****P<0.0001)；

图4为本发明纳米载体包裹药物电镜结果，图中：(A)纳米粒SEM、TEM和粒径分布结果；(B)纳米给药系统SEM、TEM和粒径分布结果。NPs：Nanoparticles，纳米粒；NDDS：Nanodrug delivery system，纳米给药系统；

图5为本发明纳米载体包裹药物膝关节局部注射，改善小鼠脾脏CD4⁺T细胞亚群分化失衡结果，图中：(A)流式细胞术检测小鼠脾脏Th1细胞占CD4⁺T细胞比例；(B)流式细胞术检测小鼠脾脏Th2细胞占CD4⁺T细胞比例；(C)流式细胞术检测小鼠脾脏iTreg细胞占CD4⁺T细胞比例；(D)流式细胞术检测小鼠脾脏Th17细胞占CD4⁺T细胞比例；(E)小鼠脾脏中Th1/Th2细胞比值；(F)小鼠脾脏中Treg/Th17细胞比值。CIA：造模组；Free：游离给药组；NPs：纳米粒组；NDDS：纳米给药系统组。(n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图6说明CIA造模成功，其中：(A)第40天小鼠脚趾红肿情况；(B)第40天膝关节H&E染色；(C)获得小鼠血清，检测血清中IgG2c含量。(n＝6，***P<0.001)Ctr：正常小鼠；CIA：胶原诱导关节炎模型小鼠。

图7为纳米给药系统对小鼠体重、关节炎评分和TNF-α分泌的影响。图中：(A)小鼠体重变化情况；(B)小鼠关节指数变化情况；(C)小鼠血清中TNF-α含量。CIA：造模组；Free：游离给药组；NPs：纳米粒组；NDDS：纳米给药系统组。(n＝6，*P<0.05，**P<0.01)

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例公开了CIA模型的建立方法，包括：

(1)正常饲养DBA/1小鼠一周后造模，造模后高脂饮食提高造模成功率；

(2)胶原乳化：将装有弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)的装置放于冰水浴中，使用均质器混合，保证混合过程中保持乳液冷却状态，因为热量会使蛋白质变性；

(3)低速(2000rpm)搅拌同时使用注射泵缓慢滴加等量的鸡二型胶原(CollagenII,CII)溶液，高速(20000rpm)混合乳液2min，将注射器放于冰水浴中5min，冷却乳剂，重复搅拌和冷却3遍，不同位置搅拌保证混合均匀；

(4)吸取少量乳液滴加于水中，乳液在水面上保持固体团块，不会消散为稳定状态，若形态易散，则再滴入几滴CFA，高速搅拌。制备完成后一小时内注射胶原蛋白乳液，保持低温；

(5)使用1mL汉密尔顿玻璃注射器吸取乳液，柱塞部朝下，用力将手臂向下甩动，去除乳液中的气泡；

(6)小鼠固定器固定小鼠，碘伏擦拭小鼠尾部，距离尾部2厘米处插入针尖，直至针尖距离尾部0.5厘米，避开尾部静脉，皮下注射100μL乳化后的胶原蛋白乳液，注射成功可见尾部皮下呈球状样肿胀；

(7)第21天加强注射弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant,IFA)时与初始注射部位不同位置进行，IFA无需与胶原溶液混合。

纳米粒制备方法包括：

随着搅拌使用注射泵将20mL无水乙醇以2mL/min速度泵入搅拌均匀的BSA溶液中，可观察到溶液变白，溶质分布均匀，类似胶体状态；8小时后，称取20mg壳聚糖，溶于20mL1％乙酸溶液中，随着搅拌使用注射泵将20mL壳聚糖乙酸溶液以2mL/min速度泵入溶液中；随着搅拌使用注射泵将5mL无水乙醇以0.5mL/min速度泵入溶液中，搅拌8小时后，得到稳定的纳米粒；收集溶液，利用高速离心机12000rpm离心20分钟，弃上清，50％乙醇溶液重复洗涤3遍，12000rpm离心20分钟弃上清得到纳米粒。

实施例2

本实施例筛选诱导Treg细胞分化的药物组合，包括以下步骤：

(1)分离小鼠脾脏，研磨后获得单细胞悬液，磁珠分选出CD4⁺T细胞(分选纯度高于99.6％)，将细胞因子IL-2，TGF-β和AS(AS2863619，AS)以不同组合加入诱导体系中，筛选出诱导iTreg细胞的最佳体系：IL-2(10ng/mL)，TGF-β(10ng/mL)，AS(1000nM)；

(2)纳米载体系统的制备：称取50mg的BSA溶于5mL的去离子水中，置于磁力搅拌器上不断搅拌，制备纳米给药系统时，将诱导iTreg细胞的药物按配方组合用量加入BSA溶液中混匀，剩下步骤与纳米粒制备步骤一致。随着搅拌使用注射泵将20mL无水乙醇以2mL/min速度泵入搅拌均匀的BSA溶液中，可观察到溶液变白，溶质分布均匀，类似胶体状态；8小时后，称取20mg壳聚糖，溶于20mL 1％乙酸溶液中，随着搅拌使用注射泵将20mL壳聚糖乙酸溶液以2mL/min速度泵入溶液中；随着搅拌使用注射泵将5mL无水乙醇以0.5mL/min速度泵入溶液中，搅拌8小时后，得到稳定的纳米粒；收集溶液，利用高速离心机12000rpm离心20分钟，弃上清，50％乙醇溶液重复洗涤3遍，12000rpm离心20分钟弃上清得到纳米粒。

(3)纳米载体系统的应用：向实施例1中构建的CIA小鼠的膝关节局部注射纳米粒组、纳米给药系统组和游离给药组，实验流程如下图1所示，第0天造模初次免疫，第21天再次免疫，第28天和第33天关节腔注射给药，第38天取材。得到的实验结果如图2-图5所示。

图2为本发明高效诱导Treg细胞分化结果，图中：(A)流式细胞术检测不同AS浓度诱导Treg细胞的情况；(B)各组Treg细胞的比例。a组：空白对照组；b组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)；c组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(10nM)；d组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(100nM)；e组：IL-2(10ng/mL)+TGF-β(10ng/mL)+AS(1000nM)。(n＝3，***P<0.001，****P<0.0001)；

图3为本发明诱导产生的Treg细胞抑制PBMCs增殖结果，图中：(A)流式细胞术检测加入不同比例Treg细胞后PBMCs增殖情况；(B)各组PBMCs的比例。(n＝3，****P<0.0001)；

图4为本发明纳米载体包裹药物电镜结果，图中：(A)纳米粒SEM、TEM和粒径分布结果；(B)纳米给药系统SEM、TEM和粒径分布结果。NPs：Nanoparticles，纳米粒；NDDS：Nanodrug delivery system，纳米给药系统；

图5为本发明纳米载体包裹药物膝关节局部注射，改善小鼠脾脏CD4⁺T细胞亚群分化失衡结果，图中：(A)流式细胞术检测小鼠脾脏Th1细胞占CD4⁺T细胞比例；(B)流式细胞术检测小鼠脾脏Th2细胞占CD4⁺T细胞比例；(C)流式细胞术检测小鼠脾脏iTreg细胞占CD4⁺T细胞比例；(D)流式细胞术检测小鼠脾脏Th17细胞占CD4⁺T细胞比例；(E)小鼠脾脏中Th1/Th2细胞比值；(F)小鼠脾脏中Treg/Th17细胞比值。CIA：造模组；Free：游离给药组；NPs：纳米粒组；NDDS：纳米给药系统组。(n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。其中，纳米粒组(NPs)与纳米给药系统组(NDDS)的唯一区别在于，制备纳米给药系统组时，将诱导iTreg细胞的药物按配方组合用量加入BSA溶液中混匀，剩下步骤与纳米粒制备步骤一致。所述诱导iTreg细胞的药物的组合为：IL-2(10ng/mL)，TGF-β(10ng/mL)，AS(1000nM)。

游离给药组(Free)与纳米给药系统组(NDDS)的唯一区别在于，药物没有通过纳米载体进行包裹。

实施例3

本实施例研究诱导Treg细胞分化的功能性给药系统对小鼠CIA的生物学作用。

一、实验方法

1.实验分组

(1)按上述实施例方法制备纳米粒、纳米给药系统组及CIA模型。第28天造模小鼠随机分组，每组六只：CIA组；Free游离给药组；NPs：Nanoparticles，纳米粒组；NDDS：Nanodrug delivery system，纳米给药系统组；

(2)给药方式：每只小鼠两侧膝关节每侧关节腔注射20μL液体；

(3)CIA组每侧关节腔注射20μLPBS溶液干预，Free组每侧关节腔注射20μL包含IL-2(24.68μg/mL)、TGF-β(24.68μg/mL)、AS(2.47mM)的PBS溶液，NPs组每侧关节腔注射20μL包含纳米粒的PBS溶液，NDDS组每侧关节腔注射20μL PBS稀释的纳米给药系统，包含IL-2(35.25μg/mL)、TGF-β(35.25μg/mL)和AS(3.41mM)。

(4)实验流程如下图1所示，第0天造模初次免疫，第21天再次免疫，第28天和第33天关节腔注射给药，第38天取材。

2.关节指数评分标准

第20天开始，每3天测一次关节指数。观察小鼠前后四肢红肿情况，一只小鼠最高16分。评分系统如下表1所示。

表1

3.实验取材

(1)第38天，按上述方法获取小鼠血清，分装后冻存于-80℃；

(2)对小鼠实施安乐死，剪开小鼠皮肤获取腹股沟、腋下及颈部淋巴结，剪开腹膜，暴露腹腔，获取小鼠脾脏，将淋巴结及脾脏放置于含2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，研磨成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液得到PBMCs，流式细胞术分析小鼠淋巴结、脾脏CD4₊T细胞亚群所占比例；

(3)小心取下小鼠股骨及胫骨，保留膝关节完整，去除腓骨，剥离骨组织上的肌肉组织，放置于4％多聚甲醛中固定，24小时内进行Micro-CT扫描。

4.小鼠血清TNF-α检测

(1)取出试剂平衡至室温，40摄氏度水浴加热溶解液体中的结晶，蒸馏水稀释洗涤液；

(2)标准品10000g离心1min，加入标准品稀释液1mL，静置10min，上次颠倒充分溶解，避免起泡，配置成最高浓度；

(3)吸取500μL标准品液体到第二个离心管中，加入500μL标准品稀释液，按此步骤往后配置倍比稀释的标准品液体，重复五次；

(4)800g离心浓缩生物素化抗体或浓缩辣根过氧化物酶结合物1min，加入99份生物素化抗体稀释液或酶结合物稀释液；

(5)酶标板中加入标准品和样品稀释液100μL，加样不触碰孔壁，避免产生气泡，覆膜，37摄氏度孵育90min；

(6)倒扣酶标板，尽量甩干液体，加入100μL生物素抗体工作液，覆膜，37摄氏度孵育60min，甩干孔板内液体，滤纸吸干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1min后甩干孔板内液体，重复洗板3次；

(7)加入100μL酶结合物，覆膜，37摄氏度孵育30min，甩干孔板内液体，滤纸吸干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1min后甩干孔板内液体，重复洗板5次；

(8)每孔加入底物溶液90μL，覆膜，37摄氏度孵育15min，标准品孔出现明显颜色梯度，每孔加入终止液50μL；

(9)提前15min预热酶标仪，450nm波长处测量OD值。

5.流式细胞术分析小鼠淋巴结、脾脏CD4₊T淋巴细胞亚群

使用无菌剪刀镊子获得小鼠脾脏和淋巴结，放置于含有2％血清的PBS的培养皿中，注射器活塞轻轻研磨脾脏或淋巴结，滤网过滤得到单细胞悬液，使用小鼠淋巴细胞分离液获得PBMCs，计数染色。流式分组：Th1：CD4(FITC)，IFN-γ(APC)；Th2：CD4(FITC)，IL-4(PE)；Th17：CD4(FITC)，IL-17(PE-Cy7)；Treg：CD4(FITC)，CD25(APC)，FOXP3(PE)。

6.Micro-CT扫描及分析

6.1Micro-CT扫描

(1)PBS清洗骨组织，扫描后放置于慢速脱钙液中，当骨组织变软，针尖可刺穿骨组织表示脱钙完成；

(2)石蜡包埋骨组织；

(3)从4％多聚甲醛中取出小鼠骨组织，剔除多余肌肉组织，PBS洗涤3次，滤纸擦拭多余液体；

(4)打开SkyScan 1176Micro-CT仪器，设置参数，X射线电流200μA，空间分辨率为9μm，过滤片0.5mmAI，X射线电压为50kv，相机分辨率high，帧平均值为1，层析旋转180°；

(5)打开舱门，放入骨组织，关闭舱门开始扫描，扫面结束，舱门自动开舱，换下一组样本。

6.2Micro-CT数据二维重建

(1)打开NRecon软件，点击reconstruction，open打开原始数据，鼠标左键拖动绿线到样本感兴趣部位，点击preview；

(2)取消scales on，设置重建阈值：0～0.075，保存文件夹。

6.3Micro-CT数据分析

(1)打开Dataview软件，ctrl加鼠标左键旋转图片，调整位置，左上角冠状图股骨直立位，长轴与Z轴平行，右下角矢状图，股骨水平位，左下角轴状图，左右髁骨对称，保存文件；

(2)再次使用Dataview软件打开刚保存的文件，绿线和蓝线移至股骨干中心，红线点击生长板突起位置，记下左下角轴状图中该层标号；

(3)使用CTan软件打开文件，根据标号选择分析层面，沿皮质骨内缘鼠标左键圈取感兴趣区域，逐层检查，区域不正确重新圈取，保存文件；

(4)打开Minics软件，点击Load stl导入相应文件，调整图片角度及颜色，ctrl加H键快速截图，保存文件。

7.组织形态学染色

7.1H&E染色

H&E染色包含苏木素和伊红两种染料，细胞核被苏木精染成蓝色，细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色。

(1)石蜡切片烤片，60℃一小时；

(2)二甲苯脱蜡15min，2次，观察到切片上无石蜡留存；

(3)无水乙醇浸没5min，2次；

(4)70％乙醇浸没5min，2次；

(5)去离子水复水1min；

(6)苏木素染色液浸没5min；

(7)慢速分化液30秒；

(8)流水冲洗10min洗去分化液，小水流冲洗，避免组织脱落；

(9)伊红染液浸没2min；

(10)70％乙醇浸没3min，2次；

(11)无水乙醇浸没3min，2次；

(12)二甲苯浸没透明2min，2次；

(13)湿润状态下滴加中性树脂，完全覆盖组织，盖玻片压片时避免产生气泡。

7.2番红O-固绿染色

番红O-固绿包含番红O、固绿两种染料，软骨组织由软骨细胞、软骨基质和纤维组成，嗜碱性的软骨组织与碱性染料番红O结合呈现红色，当软骨组织受到损伤时，导致番红O染色淡或不着色，嗜酸性的骨与酸性染料固绿结合显示蓝色或绿色。

(1)石蜡切片烤片，60摄氏度一小时；

(2)二甲苯脱蜡15min，2次，观察到切片上无石蜡留存；

(3)无水乙醇浸没5min，2次；

(4)70％乙醇浸没5min，2次；

(5)去离子水复水1min；

(6)苏木素染色液染色4min；

(7)慢速分化液30秒；

(8)流水冲洗10min洗去分化液，小水流冲洗，避免组织脱落；

(9)固绿染液浸没5min；

(10)0.5％盐酸乙醇浸没10秒，去除残留的固绿；

(11)番红O染色液浸没5min；

(12)95％乙醇3秒；

(13)无水乙醇3秒；

(14)无水乙醇1min；

(15)二甲苯浸没透明2min，2次；

(16)湿润状态下滴加中性树脂，完全覆盖组织，盖玻片压片时避免产生气泡。

二、统计学分析

所有数据以均数±标准差

表示。统计分析使用GraphPadPrism 7.0软件，t检验分析两组数据，单向方差分析(One-wayANOVE)，P<0.05认为有统计学差异。

三、实验结果

3.1胶原诱导关节炎(CIA)造模

第0天在DBA/1小鼠尾部皮下注射CFA乳化的胶原，第21天注射IFA佐剂。第40天拍下小鼠脚趾图片，观察到与对照组相比，造模组小鼠脚趾有明显肿胀(图6A)；对小鼠实施安乐死，取下完整膝关节，骨组织经固定、脱钙、包埋后切片，膝关节H&E染色观察到与正常小鼠相比，CIA模型组小鼠滑膜增生，炎症细胞浸润(图6B)；眼眶静脉取血获得小鼠血液，离心去杂质后得到小鼠血清检测IgG2c含量，

结果显示，对照组小鼠血清中IgG2c含量为(0.05±0.02)μg/mL，CIA模型组IgG2c含量为(0.45±0.04)μg/mL，两组血清IgG2c含量具有显著性差异(图6C)，表明类风湿性关节炎模型造模成功。

3.2小鼠关节炎疗效评估

在初次免疫后第28天和第33天膝关节给药，第38天收取样品。第20天开始，每3天测一次体重及关节指数。结果显示，CIA组体重在第38天时体重最低，其次分别是Free组、NPs组和NDDS组(图7A)；关节指数反应疾病发展情况，分数越高，类风湿性关节炎越严重，NDDS组评分最低，其次分别是Free组、NPs组和CIA组(图7B)。NDDS组比对照组血清中TNF-α浓度明显降低，具有显著性差异；Free组比CIA组血清中TNF-α浓度低，差异具有统计学意义(图7C)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米载体系统，其特征在于，所述纳米载体系统包括包裹有用于诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

2.根据权利要求1所述的纳米载体系统，其特征在于，所述用于诱导Treg细胞分化的药物的包括5-15ng/mL IL-2、5-15ng/mL TGF-β和800-1200nM AS。

3.根据权利要求1所述的纳米载体系统，其特征在于，所述纳米载体以牛血清蛋白为原材料制备而成。

4.根据权利要求1所述的纳米载体系统，其特征在于，所述AS为小分子周期蛋白依赖性激酶CDK8/19抑制剂。

5.一种制备诱导Treg细胞分化的纳米载体系统的方法，其特征在于，包括：

S1、筛选诱导Treg细胞分化的药物；

S2、制备包裹有诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S1中，分离小鼠脾脏后，研磨后获得单细胞悬液，磁珠分选出CD4⁺T细胞得到诱导体系，通过将IL-2、TGF-β和AS以不同的浓度组合加入到诱导体系中，筛选出诱导Treg细胞分化的药物。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S2中，包括：

S21、将用于诱导Treg细胞分化的药物加入BSA溶液中混匀得到混合液；

S22、将无水乙醇泵入混合液中至溶液成胶体状态；

S23、接着将壳聚糖乙酸溶液泵入溶液中；

S24、将无水乙醇泵入溶液中，搅拌后离心、洗涤，即得到包裹有诱导Treg细胞分化的药物的纳米载体。

8.一种用于研究诱导Treg细胞分化药物的纳米载体系统疗效的动物模型，其特征在于，利用鸡二型胶原免疫DBA/1小鼠建立胶原诱导的关节炎模型。

9.根据权利要求1-4所述的纳米载体系统或权利要求5-7任一项所述方法制备得到的纳米载体系统在炎症性关节炎领域中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为类风湿性关节炎领域中的应用。

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