CN105505854A - 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。本发明的外泌体可用于制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长的药物，以及用于治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症等。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学，尤其涉及一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。
背景技术
近年的研究显示细胞移植治疗在修复各种组织器官损伤方面具有显著的效果和广阔的应用前景。但是，直接移植细胞用于人体疾病治疗还存在安全性、免疫排斥、成瘤隐患以及运输储存困难等诸多问题。近年的研究提示细胞发挥其修复组织损伤功能主要是通过旁分泌机制实现的，而旁分泌机制中细胞分泌的外泌体可能是细胞发挥功能的关键组分。
外泌体为真核细胞的多泡体和胞膜融合后分泌到胞外的双层膜包裹的结构，它含有类似其来源细胞的胞膜成分、蛋白质及各种RNA组分，通过与细胞膜发生融合或者以靶受体的方式结合，在细胞与细胞之间传递细胞因子、蛋白质或者RNA等一系列生物活性物质，从而使靶细胞发生一系列生物学效应。最近的研究证实，人体多种细胞可分泌外泌体，人体体液中(血液、尿液、唾液、乳液)都含有外泌体，体外培养细胞的条件培养液中都存在由细胞分泌的外泌体；高效液相色谱分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的蛋白质；芯片检测技术分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的信使RNA和小RNA。因此，不同细胞来源的外泌体所发挥的生物学功能是不相同的，各有其独特性。
从尿液中分离培养细胞，具有来源方便、可以大量获取、取材无创等优势。目前通过培养尿液来源细胞获得其外泌体并用于修复组织损伤及治疗疾病的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。
将外泌体浓缩液转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离；PBS洗涤3次，得到纯化的外泌体悬液。
所述离心除去细胞器是4℃、10000g离心30分钟。
所述离心截留上清中的外泌体是3500g离心15分钟。
所述蔗糖/重水密度垫的密度为1.210g/cm3，其中的蔗糖的重量百分含量为30％；所述转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离是4℃、100800g离心210分钟；所述转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离是4℃、3500g离心15分钟。
所述人尿液来源细胞包括直接从尿液中分离的细胞；从尿液中分离并在体外培养的细胞；从尿液中分离并在体外培养且经过基因改造或药物处理的细胞；以及通过药物刺激引发泌尿系统细胞激活、游离至尿液中而获得的细胞。
所述外泌体的标志物为CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物。
所述与人尿液来源细胞特性相应的标志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长药物。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的复合物，将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定、可供植入的复合物，复合物植入后，其中的外泌体缓释或可控释放；所述复合物包括各种假体或支架。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的敷料，将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定的敷料，敷料与组织粘附后，其中的外泌体可缓释、可控释放至组织内。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的细胞培养添加剂，将外泌体悬液制备为细胞培养添加剂，用于细胞状态的维持或诱导分化。
附图说明
图1是外泌体的TEM照片。
图2是可控电阻脉冲传感技术测定的外泌体粒度分布。
图3是WesternBlot检测到的外泌体表面标志物。
图4是复合人尿液来源细胞的外泌体的材料植入组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图5是对照组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图6是假手术组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图7、图8是各组大鼠尿量和UACR比较，与Normal组比较，*P<0.05；与Diabetes比较，#P<0.05。
图9-图15是流式细胞术检测HPDC凋亡结果。
图16是HPDC在高糖诱导72小时后Caspase-3的蛋白表达水平。
具体实施方式
申请人已经建立从尿液中分离、扩增细胞的方法，并收集人尿液来源细胞(Urine-derivedCells,UCs)的技术体系。本发明人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是使用不同孔径的膜结构、通过离心截留UCs培养基中的外泌体。培养基首先通过0.22微米孔径滤膜过滤，以去除大的细胞残片、以及其它可能存在的杂质；然后，4℃10000g离心30分钟，除去细胞器，留取上清；使用可截留100KD分子量的膜、通过离心(3500g，15min)截留上清中的外泌体。截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。将浓缩液转移至6ml30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100800g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液，分装保存至-80℃环境中。
外泌体可由透射电子显微镜观察(参见图1)，其粒度分布由可控电阻脉冲传感技术测定(参见图2)，直径范围50-150nm。其在悬液中可聚集为二聚体、乃至多聚体，因而粒度分布检测结果中亦包含200-300nm数据。其膜结构表面含有CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82等标志物(参见图3)，以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物(可包含但不限于CD146，CD34，CD24，CD133，SIX2，PAX2，WT1，LHX1，OSR1)。其膜结构内包含蛋白、肽段、核酸等具有生物活性的分子。其膜结构内可以包含分子量大于100KD的分子及复合物。
外泌体可以制备成悬液，通过静脉注射，或直接在组织损伤部位注射。
外泌体可以与载体结合，制备成为缓释释放外泌体的复合物，植入组织损伤部位。
被以各种方式植入的外泌体，通过局部释放生物活性分子，或被损伤部位细胞内吞，达到传递信号、促进修复的作用。
被以各种方式植入的外泌体，可以用于治疗以下疾病或损伤——创伤、缺血性损伤、退行性病变，包括但不限于：皮肤缺损，经久不愈的皮肤溃疡，褥疮，骨缺损，骨不连，股骨头坏死，肾损伤(包括肾缺血，肾衰，等)，缺血性损伤(包括心肌缺血，下肢缺血，坏疽，等)，脊髓损伤，胰岛损伤，糖尿病及其并发症(包括糖尿病肾病，糖尿病足，等)，阿尔茨海默氏症，等。
实施例1
复合人尿液来源细胞的外泌体的材料修复皮肤缺损
建立新西兰大白兔皮肤缺损模型，随机将其分为对照组和治疗组。治疗组采用人尿液来源细胞的外泌体局部注射移植皮肤缺损处，4、8、12、14天分别从大体观察、组织切片、免疫组织化学等进行研究，分析人尿液来源细胞的外泌体对新西兰大白兔皮肤缺损处伤口愈合的作用。结果发现治疗组创面愈合时间比对照组短，两组新西兰大白兔伤口愈合时间分别为16天和20天，结果显示局部移植人尿液来源细胞的外泌体的新西兰大白兔创面面积在4、8、12、14天明显小于对照组的(p<0.05)。组织切片结果亦显示复合人尿液来源细胞的外泌体的材料植入14天后对皮肤各部分组织的修复情况明显好于对照组(参见图4、图5、图6)。结果证实人尿液来源细胞的外泌体能促进新西兰大白兔皮肤全层缺损后伤口的愈合。
实施例2
复合人尿液来源细胞的外泌体的组织工程骨修复大段骨缺损
制作30只SD大鼠5mm股骨缺损模型，并随机分为A、B组：A组，单纯植入β-TCP；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体的β-TCP。术后4、8、12周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测骨折愈合情况，比较各组修复骨缺损的效果。结果显示复合人尿液来源细胞的外泌体材料组的骨缺损能完全愈合，能明显促进大段骨缺损的修复。
实施例3
复合人尿液来源细胞的外泌体的水凝胶修复软骨缺损
制作30只新西兰大白兔后腿股骨髁关节面缺损模型，缺损直径为4.5mm，深度为3mm，并随机分为A、B组：A组，单纯植入水凝胶；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体的水凝胶。术后4、12、18周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测骨折愈合情况，比较各组修复骨缺损的效果。结果显示复合人尿液来源细胞的外泌体材料组的软骨缺损能完全愈合，能明显促进软骨缺损的修复。
实施例4
人尿液来源细胞的外泌体治疗股骨头缺血坏死
建立30只新西兰大白兔激素性股骨头缺血性坏死模型，并随机分为A、B、C三组，A组为对照组无任何治疗措施，B组行单纯髓芯减压组，C组行单纯髓芯减压联合植入人尿液来源细胞的外泌体组。术后4周、8周和12周对股骨头行组织学检查。结果：组织形态学检测发现术后8周和12周C组坏死修复区新骨面积比和新生血管数量显著高于两个对照组，差异有统计学意义(P<0.05，p＝0.034)。结论：人尿液来源细胞的外泌体可促进股骨头缺血性坏死的骨修复，对股骨头缺血性坏死有治疗作用。
实施例5
复合人尿液来源细胞的外泌体的神经组织工程修复脊髓损伤
将1×108个人尿液来源细胞的外泌体种植入30ul水凝胶，制成外泌体-水凝胶复合物。制作30只SD大鼠脑脊髓缺损模型。并随机分为A、B组：A组，单纯植入水凝胶；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体-水凝胶复合物。2、8、24周后进行组织切片，HE染色，免疫荧光检测脊髓修复情况。结果显示植入外泌体-水凝胶复合物的大鼠脊髓修复情况明显好于对照组。
实施例6
人尿液来源细胞的外泌体治疗糖尿病肾病
通过注射链脲佐菌素(STZ)制做制作30只SD大鼠糖尿病肾病模型，随机分为糖尿病组和外泌体治疗组。对照组为健康大鼠。外泌体治疗组采用含10-200ug人尿液来源细胞的外泌体尾静脉注射，糖尿病组注射等体积生理盐水。每周注射一次。4周后，治疗组大鼠的尿量、尿微量白蛋白/肌酐(urinarymicroalbumin-to-creatinineratio，UACR)明显好于对照组(参见图7、图8)。12周后处死大鼠，PAS染色进行肾组织病理学检查，明显好于对照组；组织切片现实，治疗组大鼠肾脏基质增生显著弱于对照组；TUNEL检测显示治疗组大鼠肾脏内细胞凋亡明显少于对照组。结果证实人尿液来源细胞的外泌体能够治疗糖尿病肾病。
实施例7
人尿液来源细胞的外泌体抵抗高糖诱导足细胞损伤
培养人足细胞(HPDC)，并使用高糖培养基(HG)诱导其产生损伤。将细胞随机分成正常葡萄糖对照组(NG组)，甘露醇高渗对照组(MA组)，高糖组(HG)，高糖及不同浓度尿液来源细胞外泌体(HG+Exo5ug/ml，HG+Exo10ug/ml，HG+Exo50ug/ml)处理组。对照组加入等体积生理盐水。诱导一定时间后，使用流式细胞术及WesternBlot检测细胞凋亡情况及凋亡信号通路相关蛋白，发现处理组凋亡水平明显弱于对照组(参见图9-图16)。结果显示人尿液来源细胞的外泌体可以减轻足细胞在高糖环境中产生的凋亡，降低其早期凋亡率，抵抗高糖诱导足细胞损伤。
Claims (10)
1.一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，其特征在于，首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。
2.如权利要求1所述的来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，其特征在于：将外泌体浓缩液转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤离心管中离心分离；PBS洗涤3次，得到纯化的外泌体悬液。
3.如权利要求1或2所述的来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，其特征在于：所述人尿液来源细胞包括直接从尿液中分离的细胞；从尿液中分离并在体外培养的细胞；从尿液中分离并在体外培养且经过基因改造或药物处理的细胞；以及通过药物刺激引发泌尿系统细胞激活、游离至尿液中而获得的细胞。
4.如权利要求1所述的来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，其特征在于：所述外泌体的标志物为CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物。
5.如权利要求4所述的来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，其特征在于：所述与人尿液来源细胞特性相应的标志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。
6.来源于人尿液细胞的外泌体在制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长药物中的应用。
7.来源于人尿液细胞的外泌体在治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症中的应用。
8.含有来源于人尿液细胞的外泌体的复合物，其特征在于：将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定、可供植入的复合物，复合物植入后，其中的外泌体缓释或可控释放；所述复合物包括各种假体或支架。
9.含有来源于人尿液细胞的外泌体的敷料，其特征在于：将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定的敷料，敷料与组织粘附后，其中的外泌体可缓释、可控释放至组织内。
10.含有来源于人尿液细胞的外泌体的细胞培养添加剂，其特征在于：将外泌体悬液制备为细胞培养添加剂，用于细胞状态的维持或诱导分化。
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