CN109477834A - 目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒 - Google Patents

目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种目标分子的检测方法，其具备下述工序：准备用多个核酸片段标记且所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质、和多个种类的第一目标分子的工序，所述多个核酸片段具有产生互不相同的荧光波长的荧光信号的标记物质；使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序；分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及根据与所述多个种类的所述特异性结合物质对应的多个所述荧光信号来判断所述多个种类的所述第一目标分子的工序。

Description

目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒
技术领域
本发明涉及目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒。
本申请基于2016年5月19日在日本申请的日本特愿2016-100231号、以及2016年12月13日在日本申请的日本特愿2016-241023号来主张优先权，其内容援引至此。
背景技术
通过定量地检测生物试样中的目标分子，进行疾病的早期发现和用药的效果预测。以往，蛋白的定量通过酶联免疫吸附法(ELISA)等进行，核酸的定量通过实时PCR法等进行。
近年来，出于更早期发现疾病等目的，更高精度地检测目标分子的需求提高。作为高精度地检测目标分子的方法，例如在专利文献1、专利文献2、非专利文献1等中记载了在多个微小区域内进行酶反应的技术。
这些方法被称为数字测量。
数字测量时，将试样溶液分为极大量的微小溶液。然后，将来自各微小溶液的信号二值化，通过仅判别是否存在目标分子，测量目标分子数。根据数字测量，与以往的ELISA或实时PCR法等相比，能够显著提高检测灵敏度和定量性。
在数字测量中，有时使用针对目标分子的单克隆抗体等特异性结合物质对目标分子的存在进行检测。但是，在使用了特异性结合物质的目标分子的检测中，特异性结合物质有时会发生与目标分子具有类似结构的蛋白上的相同表位的误识别、非特异性识别等误识别，目标物质的检测精度降低。
为了解决该问题，例如在专利文献3中记载了下述靶分子的检测方法，该方法包含下述步骤：使靶分子、修饰有与上述靶分子特异性结合的第一抗体的载体、和与上述靶分子特异性结合且标记有具有底物剪切活性的酶的两种以上的第二抗体反应，在上述载体上形成由上述第一抗体、上述靶分子和上述第二抗体构成的复合物的复合物形成步骤，所述第二抗体的上述酶的底物特异性互不相同；使具有上述酶的剪切部位且在该剪切部位的一端侧结合有荧光物质、在另一端侧结合有消光物质的两种以上的底物与所述复合物反应，检测从所述荧光物质发出的荧光的检测步骤，所述底物的所述荧光物质的荧光波长互不相同；以及将荧光波长不同的两种以上的荧光的检测信号作为所述靶分子的检测信号进行处理的分析步骤。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5551798号公报
专利文献2：日本特表2014-503831号公报
专利文献3：国际公开第2016/047068号小册子
非专利文献
非专利文献1：Kim S.H.，et al.，Large-scale femtoliter droplet array fordigital counting of single biomolecules.，Lab on a Chip，12(23)，4986-4991，2012.
发明内容
发明所要解决的课题
但是，专利文献3所记载的方法存在改良的余地。例如，专利文献3所记载的方法中，酶将底物剪切，在检测荧光的过程中不包含信号放大反应。另外，能够在抗体分子上标记的酶分子的数量也取决于分子的大小，但大多是每1分子抗体数个。因此，为了通过专利文献3所记载的方法检测荧光，需要至少数十分钟的反应时间。
因此，本发明的目的在于提供一种能够迅速且高精度地检测目标分子的技术。
另外，本发明的另一目的在于提供一种即使在与目标分子特异性结合的物质发生误识别的情况下也能够高精度地检测目标分子的技术。
用于解决课题的手段
本发明的第一方式的目标分子的检测方法具备下述工序：准备用多个核酸片段标记且所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质、和多个种类的第一目标分子的工序，所述多个核酸片段具有产生互不相同的荧光波长的荧光信号的标记物质；使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序；分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及根据与所述多个种类的所述特异性结合物质对应的多个所述荧光信号来判断所述多个种类的所述第一目标分子的工序。
对于1分子所述特异性结合物质可以结合数个～数十个所述多个核酸片段。
所述特异性结合物质可以是抗体。
可以准备具有所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个的第二目标分子，并通过所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个的检测来检测所述第二目标分子。
所述第二目标分子可以是外泌体。
所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个可以存在于所述外泌体的膜表面上。
所述多个种类的所述第一目标分子可以是疾病标记蛋白。
准备具备基板的检测设备，所述基板具有多个孔，在使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序之后，还可以具备：在所述多个孔中向1个孔中导入1个所述第二目标分子的工序。
可以同时检测所述多个种类的所述第一目标分子。
本发明的第二方式的目标分子的检测方法具备下述工序：使所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质与目标分子结合的工序；分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及在检测出所述多个种类的所述特异性结合物质中的两种以上时，判断为存在所述目标分子的工序。
所述目标分子的检测可以以1个分子为单位进行。
所述多个种类的特异性结合物质中的至少1种可以用核酸片段标记。
分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序可以包含信号放大反应。
可以同时检测多个种类的目标分子。
本发明的第二方式的目标分子检测试剂盒具备：与目标分子特异性结合、所识别的表位互不相同且被可相互辨别地标记的多个种类的特异性结合物质。
所述多个种类的特异性结合物质可以用互不相同的核酸片段标记。
发明效果
根据本发明的上述方式，可提供能够迅速且高精度地检测目标分子的技术。
另外，根据本发明的上述方式，可提供在即使与目标分子特异性结合的物质发生误识别的情况下也能够高精度地检测目标分子的技术。
附图说明
图1A是说明在微小区域内检测目标分子的现有方法的示意剖视图。
图1B是说明在微小区域内检测目标分子的现有方法的示意剖视图。
图2是说明通过数字测量来检测目标分子的情况的示意剖视图。
图3A是说明在微小区域内检测目标分子的方法的第一实施方式的示意剖视图。
图3B是说明在微小区域内检测目标分子的方法的第一实施方式的示意剖视图。
图4A是说明在微小区域内检测目标分子的方法的第二实施方式的示意剖视图。
图4B是说明在微小区域内检测目标分子的方法的第二实施方式的示意剖视图。
图5A是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5B是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5C是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5D是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5E是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5F是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5G是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5H是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图6是表示实施例2的结果的图表。
图7是表示比较例2的结果的图表。
图8是实施例4的利用数字侵入物的培养上清液中的外泌体检测结果。
图9是实施例4的利用数字侵入物的血清中的外泌体检测结果。
具体实施方式
以下，根据情况参照附图详细说明本发明的实施方式。需要说明的是，附图中，对相同或相当的部分标注相同或对应的符号，并省略重复的说明。另外，各图中的尺寸比是为了说明而夸张的部分，并不一定与实际的尺寸比一致。
[以往的检测方法]
首先，对以往的目标分子的检测方法的代表性例子进行说明。图1A和图1B是说明在微小区域内检测目标分子的现有方法的示意剖视图。图1A中，目标分子100、目标分子捕获粒子110和与目标分子100特异性结合的物质120的复合物130被收纳在形成于基板210的表面的孔240中。在目标分子捕获粒子110上固定化有特异性结合物质111。特异性结合物质120具有标记(标记分子)121。图1A中，固定于目标分子捕获粒子110的特异性结合物质111及特异性结合物质120可正确地识别目标分子100的表位。
与此相对，图1B中，特异性结合物质111或特异性结合物质120中的至少一个误识别不是目标分子的分子140，形成复合物150。
在此，在以标记121的存在为指标判断为存在目标分子100的情况下，由于特异性结合物质120具有标记121，因此判断为存在目标分子100。
这样，在以往的检测方法中，若与目标分子特异性结合的物质发生误识别，则有时无法准确地检测目标分子。
作为特异性结合物质发生的目标分子的误识别的原因，可以举出与目标分子具有类似结构的蛋白或肽上存在相同表位，其以一定的频率发生。在以往的检测方法ELISA中，即使一部分特异性结合物质发生误识别，测定误差也极小，但在数字测量中由于需要准确地测定目标分子的低浓度区域，因此抗体的误识别对测定误差造成影响。
[目标分子的检测方法]
本发明的一个实施方式提供一种目标分子的检测方法，其具备：使所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质与目标分子结合的工序；分别检测多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及当检测出多个种类的所述特异性结合物质中的两种以上时，判断为存在所述目标分子的工序。以下，对本实施方式的检测方法进行说明。
(使多个种类的特异性结合物质结合于目标分子的工序)
首先，使所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质与目标分子结合。该工序例如可以通过在样品管内使特异性结合物质与目标分子接触来进行。在此，特异性结合物质的种类数量为2种以上，可以为3种以上，也可以为4种以上，还可以为5种以上。
《目标分子》
作为目标分子没有特别限制，可以检测任意的分子。具体而言，可以举出例如生物试样中的疾病标记蛋白、环境试样中的特定化合物等。作为生物试样没有特别限制，可以举出血清、血浆、尿等。另外，作为环境试样，可以举出例如河川的水、工厂废水等。
《特异性结合物质》
作为特异性结合物质，可以举出抗体、抗体片段、配体等。抗体例如可以通过使目标分子或目标分子的片段作为抗原对小鼠等动物进行免疫反应来制作。或者，例如可以通过噬菌体文库的筛选来制作。作为抗体片段，可以举出Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二硫稳定化抗体(dsFv)、二聚体V区域片段(Diabody)、含CDR的肽等。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，也可以是市售的抗体。
配体是指具有与目标分子特异性结合的能力的物质。作为配体，可以举出核酸配体、肽配体等。具有与目标分子特异性结合的能力的核酸配体例如可以通过指数富集的配体系统进化(system evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)法等进行分选。另外，具有与目标分子特异性结合的能力的肽配体例如可通过使用了酵母的双杂交(Two-hybrid)法等进行分选。
(分别检测多个种类的特异性结合物质的工序)
接着，分别检测多个种类的所述特异性结合物质。图2是作为一个例子说明通过使用了检测设备200的数字测量来检测目标分子的情况的示意剖视图。
如图2所示，检测设备200具备基板210、流路220以及盖体230，在基板210的表面形成有多个孔240。
首先，将目标分子收纳在孔240中。将目标分子收纳在孔240中的方法没有特别限制，可以举出例如如下方法：通过使固定化有与目标分子特异性结合的物质的目标分子捕获粒子与上述目标分子接触，在目标分子捕获粒子上捕获目标分子，接着，将目标分子捕获粒子导入至检测装置200的流路220内并收纳在孔240中。
在此，可以使目标分子捕获粒子、目标分子、上述多个种类的特异性结合物质以任意的顺序接触。例如，可以使目标分子捕获粒子、目标分子和多个种类的特异性结合物质同时接触。或者，也可以在使目标分子捕获粒子与目标分子接触后，使多个种类的特异性结合物质接触。或者，也可以在使目标分子与多个种类的特异性结合物质接触后，使目标分子捕获粒子进一步接触。
在此，优选在1个目标分子捕获粒子上捕获0分子或1分子目标分子的条件下使目标分子捕获粒子与目标分子接触。更优选构成为在1个孔240中收纳0个或1个目标分子捕获粒子。由此，能够进行数字测量。即，在本实施方式的检测方法中，目标分子的检测可以以1个分子为单位进行。
《目标分子捕获粒子》
目标分子捕获粒子是能够捕获目标分子的粒子。可以举出例如将上述的与目标分子特异性结合的物质固定化而成的目标分子捕获粒子，但并不限定于此。
作为粒子，没有特别限制，可以利用聚合物粒子、磁粒子、玻璃粒子等。粒子优选为实施了用于避免非特异性吸附的表面处理的粒子。
作为将特异性结合物质固定化于粒子表面的方法，没有特别限制，可以举出利用物理吸附的方法、利用化学键合的方法、利用亲和素-生物素的结合的方法、利用蛋白G或蛋白A与抗体结合的方法等。其中，从稳定性高的方面考虑，优选化学键合。
作为利用物理吸附的方法，可以举出通过疏水相互作用、静电相互作用将特异性结合物质固定化于粒子表面的方法。作为利用化学键合的方法，可列举使用交联剂的方法。例如，在粒子的表面具有羟基时，通过使交联剂与特异结合物质所具有的羧基反应而进行活性酯化，然后使羟基与该酯基反应，能够使特异性结合物质固定化于粒子表面。另外，为了不阻碍特异性结合物质对目标分子的识别能力，优选在特异性结合物质与粒子表面之间设置间隔物。
(使多个种类的特异性结合物质结合的工序的一例)
图2中，孔240收纳0个或1个目标分子捕获粒子110或112。另外，流路220被密封液填满，收纳在各孔240中的溶液形成液滴(独立的反应小室)。图1A及图1B中，目标分子捕获粒子110捕获了1分子目标分子，目标分子捕获粒子112未捕获目标分子。另外，在目标分子上结合有所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质。
接着，分别检测上述多个种类的特异性结合物质。作为分别检测多个种类的所述特异性结合物质的方法，没有特别限制，例如可以对多个种类的特异性结合物质可相互辨别地进行标记，通过分别检测该标记，分别检测与目标分子结合的多个种类的特异性结合物质。
特异性结合物质可以直接标记，也可以间接标记。例如，可以将固定化有特异性结合物质及标记分子的粒子作为经标记的特异性结合物质使用。在此，作为粒子，可以使用与上述粒子同样的粒子。
作为可相互辨别的标记分子，可以举出例如互不相同的核酸片段、互不相同的酶、互不相同的荧光色素等。这些标记也可以组合使用。
为标记分子互不相同的核酸片段时，可以利用核酸片段的碱基序列的差异来检测特异性结合物质。例如，可以利用LAMP法、PCR法、侵入物法等将核酸片段的碱基序列的差异变换为信号来检测特异性结合物质。作为用核酸片段标记特异性结合物质的方法，没有特别限制，可以列举利用亲和素-生物素结合的方法、使用交联剂的方法等。
作为信号没有特别限制，例如可以利用荧光、发光、显色、pH的变化、电位变化等。
另外，在为标记分子互不相同的酶时，可以使与各个酶对应的荧光底物等反应来检测特异性结合物质。另外，在为标记分子互不相同的荧光色素时，可以通过1分子荧光检测等直接检测特异性结合物质。
检测特异性结合物质的工序包含信号放大反应时，能够提高检测灵敏度，能够缩短检测所需的时间。作为信号放大反应，可以举出例如酶反应。
如果使多个种类的特异性结合物质结合于1分子目标分子，分别检测多个种类的特异性结合物质，当检测出两种以上、优选全部种类的特异性结合物质时，判断为存在所述目标分子，则能够高精度地检测目标分子。这是因为多个该特异性结合物质中的2种以上误识别的概率低。
也可以用核酸片段标记多个种类的特异性结合物质全部。另外，也可以为利用侵入物法检测多个种类的特异性结合物质的构成。在这种情况下，可以使用一种酶(裂解酶)检测全部核酸片段的碱基序列的差异。通过这样的方法，由于所使用的酶1种即可，因此能够将反应体系调整为所使用的酶的最适条件。
另外，由于侵入物法包含信号放大反应，因此能够将检测多个种类的特异性结合物质所需的时间缩短到几分钟以内。
另外，例如在将核酸片段标记于抗体分子的情况下，由于核酸片段的分子较小，因此能够对每1分子抗体例如标记数个～数十个核酸片段。通过增加每1分子抗体的核酸片段的数量，能够进一步缩短检测多个种类的特异性结合物质所需的时间。另外，在将核酸片段标记于抗体分子的情况下，也可以对每1分子抗体标记数个～数百个核酸片段。
根据本实施方式，例如，核酸检测反应(例如侵入反应)的时间为1分钟～30分钟左右，能够进行迅速的核酸检测。
与此相对，例如专利文献3所记载的方法中，使用底物特异性互不相同的两种酶。因此，在这些酶的最适反应条件不同的情况下，难以将反应体系调整为全部所使用的酶的最适条件。
另外，专利文献3所记载的方法中，酶将底物剪切，在检测荧光的过程中不包含信号放大反应。另外，能够在抗体分子上标记的酶分子的数量也取决于分子的大小，但大多是每1分子抗体数个。因此，为了通过专利文献3所记载的方法检测荧光，需要至少数十分钟的反应时间。
图2中，各孔240收纳0个或1个目标分子捕获粒子。而且，从收纳有捕获了目标分子的目标分子捕获粒子110的孔中，检测到来自多个种类的特异性结合物质的信号250。信号250表示检测出多个种类的所述特异性结合物质的全部种类。
与此相对，从未收纳有目标分子捕获粒子的孔240或收纳有未捕获目标分子的目标分子捕获粒子112的孔240未检测到信号250。因此，通过对检测出信号250的孔240的数量进行计数，能够准确地测定目标分子的浓度。
这里，对检测设备200的结构更详细地进行说明。孔240排列配置于基板210的表面，例如，可以是直径为5μm、深度为5μm的有底圆柱形状的空间。
例如，孔240也可以在基板210表面的纵横5mm的矩形的区域沿着该区域的各边排列成格子状。各孔240间的间隙的大小根据可独立检测各孔240的信号的分辨率来设定即可。
孔240的容积可适当设定，但在检测特异性结合物质的工序伴随信号放大反应的情况下，能够缩短孔240的容积小的一方到可检测到信号为止的反应时间。例如，孔240的容积可以是100皮升或100皮升以下。
例如，为了缩短产生足够强度的信号所需的时间，可以基于目标分子在1个孔中达到1个以下的液量来设定孔240的容积。
此时，可以按照1个孔240的大小为目标分子的体积的3倍以下的方式构成检测设备200。
另外，除了按照使目标分子1个孔导入1个的方式制造检测设备200以外，也可以按照1个孔中导入1个以下的具有目标分子(第一目标分子)的其他目标分子(第二目标分子)(例如，作为具有作为后述的第一目标分子的蛋白的第二目标分子的外泌体等)的方式制造检测设备200。另外，除了按照使目标分子1个孔中达到1个以下的方式制造检测设备以外，也可以通过稀释目标分子的浓度，按照使目标分子在1个孔中达到1个以下的方式导入孔中。
准备具备具有多个孔240的基板210的检测设备200，在使多个种类的所述特异性结合物质与多个第一目标分子结合的工序之后，还可以具备：在多个孔中向1个孔中导入1个第二目标分子(具有第一目标分子的第二目标分子)的工序。
此时，孔240的容积可以是100皮升或100皮升以下。
另外，孔240的大小可以根据所选择的第二目标分子按照导入1个第二目标分子的方式构成，例如，可以按照1个孔240的大小为第二目标分子的体积的3倍以下的方式构成检测设备200。
例如，通过具备如在1个设备的各孔中被细分地捕获第一目标分子或具有第一目标分子的第二目标分子这样的(例如，在1个孔中导入1个第二目标分子的)构成，即使存在多个被荧光标记的核酸，被标记的核酸彼此的荧光信号也不会发生干涉，能够高精度地检测目标分子(第一目标分子、第二目标分子)。
基板210例如使用树脂形成。树脂的种类没有特别限定，优选使用对试剂和形成液滴时的密封液具有耐性的树脂。另外，在对信号进行荧光观察时，优选选择自体荧光少的树脂。例如，可以选择环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、氟树脂等。
(第1实施方式)
对第1实施方式的目标分子的检测方法进行说明。图3A和图3B是说明在微小区域内检测目标分子的本实施方式的方法的示意剖视图。图3A中，目标分子100、目标分子捕获粒子110、与目标分子100特异性结合的物质120、和与特异性结合物质120所识别的表位互不相同的特异性结合物质122的复合物160被收纳在形成于基板210的表面的孔240中。特异性结合物质120具有标记121。特异性结合物质122具有标记123。图3A中，固定化于目标分子捕获粒子110的特异性结合物质111、特异性结合物质120及特异性结合物质122正确地识别目标分子100的表位。标记121以及标记123能够相互辨别。例如，标记121以及标记123能够产生互不相同的荧光波长的荧光信号。
与此相对，图3B中，特异性结合物质111或特异性结合物质120中的至少一个误识别不是目标分子的分子140，形成复合物150。
在此，由于分子140上未结合有特异性结合物质122，因此复合物150中不存在标记123。因此，复合物150中，虽然检测到来自标记121的信号，但未检测到来自标记123的信号。
因此，复合物150中的特异性结合物质能够确定为误识别了目标分子。其结果，通过仅测量容纳了正确识别目标分子的复合物160的孔的数量，即使在与目标分子特异性结合的物质发生误识别的情况下，也能够高精度地检测目标分子。
(第2实施方式)
对第2实施方式的目标分子的检测方法进行说明。本实施方式的检测方法是同时高精度地检测多个种类的目标分子(多个种类的第一目标分子)的方法。图4A和图4B是说明在微小区域内检测目标分子的本实施方式的方法的示意剖视图。图4A中，目标分子100、目标分子捕获粒子110、与目标分子100特异性结合的物质120、和与特异性结合物质120所识别的表位互不相同的特异性结合物质122的复合物160被收纳在形成于基板210的表面的孔240中。特异性结合物质120具有标记121。特异性结合物质122具有标记123。图4A中，固定化于目标分子捕获粒子110的特异性结合物质111、特异性结合物质120及特异性结合物质122正确地识别目标分子100的表位。标记121以及标记123能够相互辨别。例如，标记121以及标记123能够产生互不相同的荧光波长的荧光信号。本实施方式中，例如，若从多个标记分别得到的荧光信号为可见光，则能够进行利用了各种颜色的检测(多色检测)。
另外，图4B中，目标分子180、目标分子捕获粒子113、与目标分子180特异性结合的物质124、和与特异性结合物质124所识别的表位互不相同的特异性结合物质125的复合物170被收纳在形成于基板210的表面的孔240中。特异性结合物质124具有标记121。特异性结合物质125具有标记126。图4B中，固定化于目标分子捕获粒子113的特异性结合物质114、特异性结合物质124及特异性结合物质125正确地识别目标分子180的表位。标记121以及标记126能够相互辨别。例如，标记121及标记126能够产生互不相同的荧光波长的荧光信号。
在此，图4A和图4B中，能够辨别检测出的信号。即，从图4A的复合物160检测到来自标记121的信号以及来自标记123的信号。另外，从图4B的复合物170检测到来自标记121的信号以及来自标记126的信号。
因此，根据本实施方式的检测方法，能够辨别、同时高精度地检测混合存在于试样中的目标分子100和目标分子180。
接着，对同时检测多个种类的目标分子时的特异性结合物质及标记的组合的例子进行说明。图5A～图5H是说明能够同时检测多个种类的目标分子的特异性结合物质及标记的组合的例子的图。
图5A中，为了检测目标分子100，使特异性结合物质120和特异性结合物质122与目标分子100结合。特异性结合物质120具有标记121。特异性结合物质122具有标记123。特异性结合物质120和特异性结合物质122所识别的表位互不相同。另外，标记121以及标记123能够相互辨别。
图5B是表示目标分子捕获粒子110进一步结合于图5A的复合物的例子的图。在目标分子捕获粒子110上固定化有与特异性结合物质120和特异性结合物质122所识别的表位互不相同的特异性结合物质111。
如上所述，通过使用目标分子捕获粒子，例如在形成微小区域的孔中各收纳0分子或1分子目标分子，容易进行数字测量。
图5C中，为了检测目标分子180，使特异性结合物质124和特异性结合物质125与目标分子180结合。特异性结合物质124具有标记121。特异性结合物质125具有标记126。特异性结合物质124和特异性结合物质125所识别的表位互不相同。另外，标记121以及标记126能够相互辨别。
图5D是表示目标分子捕获粒子113进一步结合于图5C的复合物的例子的图。在目标分子捕获粒子113上固定化有与特异性结合物质124和特异性结合物质125所识别的表位互不相同的特异性结合物质114。
如上所述，通过使用目标分子捕获粒子，例如在形成微小区域的孔中各收纳0分子或1分子目标分子，容易进行数字测量。
图5E中，为了检测目标分子182，使特异性结合物质190和特异性结合物质191与目标分子182结合。特异性结合物质190具有标记123。另外，特异性结合物质191具有标记126。特异性结合物质190和特异性结合物质191所识别的表位互不相同。另外，标记123以及标记126能够相互辨别。
图5F是表示目标分子捕获粒子115进一步结合于图5E的复合物的例子的图。在目标分子捕获粒子115上固定化有与特异性结合物质190和特异性结合物质191所识别的表位互不相同的特异性结合物质116。
如上所述，通过使用目标分子捕获粒子，例如在形成微小区域的孔中各收纳0分子或1分子目标分子，容易进行数字测量。
图5G中，为了检测目标分子184，使特异性结合物质192、特异性结合物质193及特异性结合物质194与目标分子184结合。特异性结合物质192具有标记121。另外，特异性结合物质193具有标记123。另外，特异性结合物质194具有标记126。特异性结合物质192、特异性结合物质193和特异性结合物质194所识别的表位互不相同。另外，标记121、标记123以及标记126能够相互辨别。
图5H是表示目标分子捕获粒子117进一步结合于图5G的复合物的例子的图。在目标分子捕获粒子117上固定化有与特异结合物质192、特异性结合物质193和特异性结合物质194所识别的表位互不相同的特异性结合物质118。如上所述，通过使用目标分子捕获粒子，例如在形成微小区域的孔中各收纳0分子或1分子目标分子，容易进行数字测量。
这样，图5A、图5C、图5E以及图5G(或者图5B、图5D、图5F以及图5H)中，由于与目标分子结合的标记的组合分别不同，因此能够辨别、同时高精度地检测混合存在于试样中的目标分子100、180、182以及184。能够同时辨别的目标分子的种类数量依赖于可辨别的标记的组合的种类数，也可以进一步增加。
另外，上述第2实施方式的目标分子的检测方法的图5A～图5H的例示中，示出了使2个以上的标记与1个目标分子结合的例子，但也可以使用考虑了对1个目标分子结合1个标记的情况。
本实施方式的目标分子的检测方法能够提供具备下述工序的目标分子的检测方法：准备用多个核酸片段标记且所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质、和多个种类的第一目标分子的工序，所述多个核酸片段具有产生互不相同的荧光波长的荧光信号的标记物质；使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序；分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及根据与所述多个种类的所述特异性结合物质对应的多个所述荧光信号来判断所述多个种类的所述第一目标分子的工序。
另外，本实施方式的目标分子的检测方法中，也可以准备具有所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个的第二目标分子，并通过所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个检测来检测所述第二目标分子。
本实施方式的目标分子的检测方法可应用于例如作为目标分子的蛋白、细胞外囊泡(Exosome，外泌体)、内质网、病毒、细胞等的分析，也可应用于内质网、病毒、病毒、细胞等的表面膜蛋白的分析等。
具体而言，本实施方式的目标分子的检测方法也可应用于作为液体活检中的代表性的生物标记物的细胞外囊泡(Exosome、外泌体)等的检测、以及外泌体的膜表面上的蛋白的检测。
外泌体是与以癌为代表的疾病的发病、恶化、发展及转移等各种情况深度关联的生物标记物。
另外，外泌体是由大部分细胞分泌的直径为40nm～150nm左右的膜囊泡。
在生物体中，在唾液、血液、尿、羊水、恶性腹水等体液中可观察到，也从培养细胞分泌。近年来，外泌体被指出有承担用于向分离的细胞和组织传递信息的作用的可能性。外泌体包含各种蛋白、脂质、核酸，认为通过搬运到其他细胞而引起功能性变化或生理变化。作为其具体例子，启示具有承担针对感染性病原体或肿瘤的自适应性免疫应答的介质、组织修复、神经传递、病原性蛋白的搬运等作用。
另外，在近年的研究中，已知外泌体的膜表面上存在的蛋白根据人或癌的种类的不同而变化，已知生物试样中的这些蛋白的分布也根据癌的种类的不同而变化。另外，作为外泌体的膜表面上存在的蛋白，例如已知存在作为外泌体的生物标记物的CD9、CD63、CD81等蛋白。
因此，通过研究这些外泌体膜表面上的CD9、CD63、CD81等蛋白的分布、行为，有可能应用于癌的种类、癌发生的可能性、癌的发展程度的研究、检查等。
根据本实施方式的目标分子的检测方法，通过利用与在1个外泌体的膜表面上出现的CD9、CD63、CD81等蛋白特异性结合的、经标记的特异性结合物质(例如抗体)，能够检测外泌体膜表面上的蛋白。
例如，通过构成为：在识别CD9的表位的抗体、识别CD63的表位的抗体、以及识别CD81的表位的抗体中，结合于各抗体的标记发出不同的荧光信号，能够检测外泌体的存在，并且通过多个颜色按颜色不同判定外泌体膜表面上的CD9、CD63及CD81有无存在及分布。
例如，能够根据色差分析、判定具有CD9、CD63及CD81中的1个的外泌体、具有CD9、CD63和CD81中的2个的外泌体、或具有CD9、CD63和CD81中的3个的外泌体，能够根据色差观察各外泌体的分布。
即，根据本实施方式的目标分子的检测方法，能够观察成为存在于生物试样中的外泌体的膜表面上的生物标记物的蛋白的分布、行为，能够迅速且精度良好地应用于各蛋白的定性分析、定量分析。
关于本实施方式的目标分子的检测方法，例示了上述那样的外泌体表面上的蛋白的分析，但不限于上述的例示，还可应用于病毒、细胞等膜表面上存在的蛋白的分析、表示癌的可能性的生物标记物的评价及检测等。
[目标分子检测试剂盒]
本发明的一个实施方式提供一种目标分子检测试剂盒，其具备：与目标分子特异性结合的多个种类的特异性结合物质，这些物质所识别的表位互不相同且被可相互辨别地标记。
本实施方式的试剂盒中，关于目标分子、特异性结合物质、标记，与上述相同。特异性结合物质可以用互不相同的核酸片段标记。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行更详细的说明。本发明并不受这些实施例的任何限定。
[实验例1]
(目标分子捕获粒子的制作(PSA))
制作捕获作为目标分子的、作为前列腺癌标记之一的前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)的目标分子捕获粒子。
首先，将抗PSA单克隆抗体(型号“1H12”，Hytest公司)生物素化。生物素化使用市售的试剂盒(商品名“EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin”，Thermo Scientific公司)。具体而言，在1.5mL试管中，在用磷酸缓冲液(PBS)稀释的抗PSA单克隆抗体中添加抗体的50倍摩尔量的Sulfo-NHS-LC-Biotin(0.2mg/mL，500μL)。接着，在冰上静置2小时，进行抗体的生物素化。
接着，为了从反应后的混合液中除去未反应的Sulfo-NHS-LC-Biotin及反应副产物，使用凝胶过滤柱(型号“Zeba Spin Desalting Column”，Thermo Scientific公司)精制生物素化抗体。柱精制后，通过BCA(二辛可宁酸)分析进行蛋白量的测定，求出产量。
接着，在经生物素化的抗PSA抗体中混合经分散的链霉亲和素标记珠粒(型号“Magnosphere”，JSR公司)，在室温下混合10分钟，在1×结合缓冲液中使生物素和链霉亲和素结合。接着，在磁性架(Magnetic Stand)中放置1分钟，收集珠粒、弃去上清液，并用1×结合缓冲液清洗3次，得到目标分子捕获粒子。
[实验例2]
(目标分子捕获粒子的制作(CEA))
制作捕获作为目标分子的、作为消化器官系癌标记物之一的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的目标分子捕获粒子。除了使用抗CEA单克隆抗体(型号“10-1392”、Fitzgerald公司)作为抗体以外，与实验例1同样地制作目标分子捕获粒子。
[实验例3]
(核酸标记抗PSA抗体的制作)
使具有序列号1所示的碱基序列的DNA片段(DNA片段1)和具有序列号2所示的碱基序列的DNA片段(DNA片段2)分别与抗PSA单克隆抗体(型号“5A6”、Hytest公司)、抗PSA单克隆抗体(型号“8A6”、Hytest公司)结合，制作核酸标记抗PSA抗体。DNA片段的结合使用市售的试剂盒(商品名“Protein-Oligo Conjugation Kit”、Solulink公司)。另外，按照相对于抗体(抗体一分子)修饰5～20倍量的核酸的方式制备核酸标记抗PSA抗体。
[实验例4]
(核酸标记抗CEA抗体的制作)
与实验例3同样地，使具有序列号3所示的碱基序列的DNA片段(DNA片段3)和具有序列号4所示的碱基序列的DNA片段(DNA片段4)分别与抗CEA单克隆抗体(型号“10-1393”、Fitzgerald公司)和抗CEA单克隆抗体(型号“10-7883”、Fitzgerald公司)结合，制作核酸标记抗CEA抗体。
另外，按照相对于抗体(抗体一分子)修饰5～20倍量的核酸的方式制备核酸标记抗CEA抗体。
[实验例5]
(含有目标分子的试样的制备)
作为目标分子，用5％牛血清白蛋白(BSA)-1×PBS溶液分别将PSA(型号“PSAcalibrator”、sysmex公司)及CEA(型号“HISCL CEA calibrator”，Kaynos公司)稀释成0、0.01、0.05、0.1、0.5ng/mL的浓度，制备含有目标分子的试样。
[实验例6]
(检测设备的制作)
在0.5mm厚的玻璃制基板上旋涂CYTOP(注册商标)(旭硝子制)后，在180℃下烘烤1小时。所形成的CYTOP的厚度为3μm。
接着，涂布正性光致抗蚀剂，使用光掩模形成孔图案。然后，利用O2等离子体对CYTOP进行干性蚀刻。接着，为了除去残留在表面的光致抗蚀剂，用丙酮和乙醇清洗表面并漂洗。
通过上述操作，在基板上的规定区域内形成了100块的孔阵列。另外，各个块具有10000个孔。因此，在上述区域内形成有合计100万个孔。另外，由CYTOP形成的孔(微小区域)的直径为5μm，具有能够在几分钟内检测侵入反应所产生的信号的体积。
接着，使用具有100μm的厚度且加工成流路形状的双面胶带将具有送液口的玻璃制的板(盖体)和上述基板粘接，制作出检测设备。玻璃制的板和上述基板按照形成有上述孔的区域配置在流路内的方式粘接。
[实施例1]
(PSA的检测1)
将PSA作为目标分子进行实验。在样品管(蛋白非吸附、Eppendorf公司)中分别添加含有各种浓度的PSA的溶液50μL。接着，在各管中分别添加106个目标分子捕获粒子、用具有序列号1所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗PSA抗体50μL、及用具有序列号2所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗PSA抗体50μL，一边在振荡器上搅拌，一边在室温下使其反应1小时，形成复合物。
接着，为了除去未反应的核酸标记抗PSA抗体，重复离心、除去上清液及添加含有0.05％Tween的PBS(PBS-T)的操作3次并清洗，最后除去上清液，得到复合物。
接着，向实验例6中制作的检测设备的送液口送液混合有上述复合物和侵入反应试剂的溶液20μL。由此，20μL的溶液的一部分被分配到基板上的孔内。侵入反应试剂含有：1μM等位基因探针1(序列号5)、1μM等位基因探针2(序列号6)、1μM invader oligo 1(序列号7)、1μM FRET Cassette(FAM)(Hologic公司制)、1μM FRET Cassette(Redmond RED)(Hologic公司制)、10mM MOPS(pH为7.5)、6.25mM MgCl2、50U/μL裂解酶以及Tween20。
等位基因探针1与结合于核酸标记抗PSA抗体的序列号1的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素FAM发出荧光。
另外，等位基因探针2与结合于核酸标记抗PSA抗体的序列号2的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素Redmond RED发出荧光。
在检测装置的孔中观察到FAM和Redmond RED这两者的荧光表示在该孔中含有至少1分子的PSA。
接着，送液作为密封液的氟系油FC-40(Sigma公司)100μL。由此，孔的上部被密封液覆盖。其结果是，各孔成为封入有上述复合物及侵入反应试剂的独立的反应小室。接着，在63℃的加热板上加热15分钟，实施侵入反应。
接着，使用荧光显微镜(奥林巴斯制)，检测各孔中的FAM及Redmond RED的荧光。曝光时间为2000毫秒。
其结果可知，能够检测到用5％BSA-1×PBS溶液稀释至0.01ng/mL的浓度的PSA。另外，本实施例中的侵入反应所需的加热时间为15分钟，可知能够迅速地检测PSA。
[比较例1]
使用实施例1中使用的PSA溶液进行同样的实验，但作为核酸标记PSA抗体，仅使用用具有序列号1所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗PSA抗体。
其结果可知，由于抗PSA抗体的误识别，与实施例1中可检测的PSA浓度的下限相比，可检测的PSA浓度的下限为高值。
[实施例2]
(PSA的检测2)
将PSA作为目标分子进行实验。除了使试样中的PSA的浓度为0pg/mL(0fM)、0.1pg/mL(3fM)、1pg/mL(30fM)、10pg/mL(300fM)以外，进行与实施例1同样的反应，检测FAM和Redmond RED这两者的荧光。
如上所述，在检测装置的孔中观察到FAM和Redmond RED这两者的荧光表示在该孔中含有至少一个PSA。
图6是表示使各浓度的PSA样品反应，测量观察到FAM及Redmond RED这两者的荧光的孔的数量的结果的曲线图。其结果可知，能够明确地区分0pg/mL(0fM)及0.1pg/mL(3fM)浓度的PSA溶液。
另外，本实施例中，侵入反应所需要的加热时间为15分钟，还可知能够迅速地检测PSA。
[比较例2]
对于实施例2中检测到PSA的设备的孔，仅测量观察到FAM的荧光的孔的数量。由此，可以得到与仅使用一种抗PSA抗体检测PSA时同样的结果。
图7是表示使各浓度的PSA样品反应，测量观察到FAM的荧光的孔的数量的结果的曲线图。其结果，难以明确区别0pg/mL(0fM)、0.1pg/mL(3fM)及1pg/mL(30fM)浓度的PSA溶液。
该结果表示，由于抗PSA抗体的误识别，与实施例2中可检测的PSA浓度的下限相比，可检测的PSA浓度的下限变成远远地高的值。换言之，通过使多个种类的特异性结合物质与目标分子结合，检测2种以上的特异性结合物质，即使在与目标分子特异性结合的物质发生误识别的情况下，也能够显著提高目标分子的检测精度。另外，通过本实施例可知，与以往的方法相比，能够迅速地检测PSA。考虑这是因为按照相对于抗体(抗体一分子)修饰作为荧光信号的反应起点的多个核酸的方式制备了核酸标记抗PSA抗体。进一步考虑，通过具备在设备的各孔中细分地捕获目标分子的构成，即使存在大量经标记的核酸，经标记的核酸彼此之间也不发生干扰，能够进行目标分子的检测。
[实施例3]
(PSA和CEA的检测)
将PSA和CEA的混合物作为目标分子进行实验。在样品管(蛋白非吸附、Eppendorf公司)中添加以1：2的体积比混合有0.01ng/mL的PSA和0.01ng/mL的CEA的溶液50μL。接着，在上述的试管中分别添加106个目标分子捕获粒子、用具有序列号1所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗PSA抗体50μL、用具有序列号2所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗PSA抗体50μL、用具有序列号3所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗CEA抗体50μL、用具有序列号4所示的碱基序列的DNA片段标记了的10μg/mL的核酸标记抗CEA抗体50μL，在搅拌器上一边搅拌一边在室温下使其反应1小时，形成复合物。
其中，核酸标记抗PSA抗体按照相对于抗体(抗体一分子)修饰5～20倍量的核酸的方式制备。
其中，核酸标记抗CEA抗体按照相对于抗体(抗体一分子)修饰5～20倍量的核酸的方式制备。
接着，向实验例6中制作的检测设备的送液口送液混合有上述复合物和侵入反应试剂的溶液20μL。侵入反应试剂含有：1μM等位基因探针1(序列号5)、1μM等位基因探针2(序列号6)、1μM等位基因探针3(序列号8)、1μM等位基因探针4(序列号9)、1μM invader oligo1(序列号7)、1μM invader oligo 2(序列号10)、1μM FRET Cassette(FAM)(Hologic公司制)、1μM FRET Cassette(Redmond RED)(Hologic公司制)、1μM FRET Cassette(TAMRA)(Hologic公司制)、10mM MOPS(pH为7.5)、6.25mM MgCl2、50U/μL裂解酶以及Tween20。
等位基因探针1与结合于核酸标记抗PSA抗体的序列号1的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素FAM发出荧光。
另外，等位基因探针2与结合于核酸标记抗PSA抗体上的序列号2的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素Redmond RED发出荧光。
另外，等位基因探针3与结合于核酸标记抗CEA抗体的序列号3的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素FAM发出荧光。
另外，等位基因探针4与标记于核酸标记抗CEA抗体上的序列号4的DNA片段杂交，侵入反应的结果是，荧光色素TAMRA发出可检测的荧光。
在检测装置的孔中观察到FAM和Redmond RED这两者的荧光表示在该孔中含有至少1分子的PSA。另外，观察到FAM和TAMRA这两者的荧光表示在该孔中包含至少1分子的CEA。
接着，送液作为密封液的氟系油FC-40(Sigma公司)100μL。接着，在63℃的加热板上加热15分钟，实施侵入反应。
接着，使用荧光显微镜(奥林巴斯公司)，检测各孔中的FAM、Redmond RED和TAMRA的荧光。曝光时间为2000毫秒。
其结果算出：根据观察到FAM及Redmond这两者的荧光的小室的数量和观察到FAM及TAMRA这两者的荧光的小室的数量算出的PSA及CEA的浓度比为1∶2。另外，本实施例中的侵入反应所需的加热时间为15分钟，可知能够迅速地检测PSA和CEA。
[实施例4]
<试剂制备>
(含有外泌体的试样)
含有外泌体的培养上清液使用将结肠癌细胞株HCT116在以90∶10∶1混合有McCoy’s 5A Medium(Lonza公司)：Exo-FBS(SBI公司)：青霉素链霉素溶液(和光纯药公司)的培养基中培养3天得到的培养上清液。将培养上清液以300×g、10分钟除去细胞。进而，将培养上清液以2000×g、10分钟除去残渣。进而，将培养上清液以10000×g、30分钟进一步除去细渣。最后，将培养上清液用0.22μm的过滤器单元(millipore公司)过滤。
含有外泌体的血清使用了人血清(human serum AB、Cosmo Bio公司制)。
(抗体固定化磁性珠的制备)
为了将抗体固定化在磁性珠上，向羧基修饰磁性珠(Magnosphere，LC300，JSR公司)溶液中添加抗外泌体抗体(型号“CD9”、Cosmo Bio公司)，混合至100μL，在旋转器中使其反应30分钟，进一步加入缩合剂EDC使其反应3小时，进行抗体在羧基磁性珠上的固定化。
为了除去反应后未反应的抗体和试剂，使用磁性架对抗体固定化羧基磁性珠进行磁捕集、并利用PBS-T(含有0.1％Tween20的PBS)清洗，重复3次，制备抗体固定化羧基磁性珠(CD9珠)。
(抗体修饰用核酸和检测用核酸)
作为抗体修饰用及核酸检测反应用的核酸，使用以下所示的核酸。
·DNA片段5：具有序列号11所示的碱基序列。
·DNA片段6：具有序列号12所示的碱基序列。
·等位基因探针3：具有序列号8所示的碱基序列。
·等位基因探针5：具有序列号13所示的碱基序列。
·invader oligo 2：具有序列号10所示的碱基序列。
(核酸修饰抗体的制备)
与实验例3同样地，使DNA片段5、6分别与2种抗外泌体抗体(型号“CD63”、型号“CD81”、Cosmo Bio公司)结合，制备核酸修饰抗体(DNA片段5-CD63、DNA片段6-CD81)。
核酸修饰抗体按照DNA片段5-CD63、DNA片段6-CD81均相对于抗体(抗体一分子)修饰5～20倍量的核酸的方式制备。
(核酸检测试剂的制备)
为了通过数字侵入反应检测核酸修饰抗体，作为核酸检测试剂，制备了侵入反应试剂。本实施例中的侵入反应试剂的试剂组成如下。
实施例4中的侵入反应试剂含有：0.1μM等位基因探针3(序列号8)、0.1μM等位基因探针5(序列号13)、1μM invader oligo 2(序列号10)、2μM FRET Cassette(FAM)(Hologic公司制)、2μM FRET Cassette(Redmond RED)(Hologic公司制)、10mM MOPS(pH为7.9)、10mMMgCl2以及1000U/μL裂解酶。
其中，这些侵入反应试剂中的各成分的浓度是实施例4的侵入反应试剂中的终浓度。
<抗原、抗体固定化珠及核酸修饰抗体的反应>
在样品管中，将106个抗体固定化羧基磁性珠(CD9珠)、分别调整至0或50％的培养上清液或血清、调整至0.1ng/mL的核酸修饰抗体2种(DNA片段5-CD63、DNA片段6-CD81)以总量达到100μL的方式混合，在旋转器上使其在室温下反应3小时，形成复合物。
反应后，重复使用磁性架对得到的磁性珠进行磁捕集、除去上清液及添加含有0.1％Tween的PBS(PBS-T)的操作5次并清洗，最后除去上清液，得到复合物。
将得到的复合物清洗后用PBS稀释，制备反应混合液1。
<流式细胞仪(flow cell)的组装>
按照流路的高度为100μm、宽度为6～7mm的方式组装下述3个部件。
·COP小室(形成φ5μm、深度为3.5μm的微孔，STRATEC公司)
·双面胶带(膜厚为100μm，宝洋公司)
·COP送液用流路条(炭黑添加着色、带有送液及废液口，荒川树脂公司)
<反应混合溶液的送液>
向流式细胞仪中送液混合有上述复合物和侵入反应试剂的溶液20μL。接着，送液密封液FC-40(Sigma公司)100μL，将各小室密封。
<核酸检测反应>
将上述流式细胞仪设置在热板上，在66℃使其反应15分钟。
<小室的观察>
将上述流式细胞仪冷却后，用荧光显微镜BZ-710(KEYENCE公司)检测各孔中的FAM、Redmond RED的荧光。作为曝光时间，FAM为1200毫秒，Redmond RED为1000毫秒。
用荧光显微镜观察含血清50％的样品溶液中的反应，将各荧光图像重合后的结果示于图9的右侧。另外，图9的左侧是不添加血清时(血清为0％)的图像。
其结果确认，根据样品中的培养上清液和血清的含有比例，荧光小室数发生变化。
由这些结果启示，通过使用了外泌体抗体的数字侵入物识别外泌体膜表面蛋白，能够检测培养上清液以及血清中含有的外泌体。
另外，将使用了含有各样品的溶液的反应中的、在1块内封入有磁性珠的小室数、检测出磁性珠和荧光信号这两者的小室数、仅检测出荧光信号的小室数的结果示于表1。
表1
如表1所示，对于培养上清液、血清，均是检测的荧光信号的大部分与珠粒重合，启示在磁性珠上检测到外泌体。
另外，等位基因探针3与结合于CD63上的序列号11的DNA片段5杂交，侵入反应的结果是，荧光色素FAM发出荧光。
例如，在图8的右侧、图9的右侧，FAM发出绿色荧光。
另外考虑，观察到FAM的荧光是因为检测到了存在于外泌体膜表面上的蛋白CD63。
另外，等位基因探针5与结合于CD81上的序列号12的DNA片段6杂交，侵入反应的结果是，荧光色素Redmond RED发出荧光。
例如，在图8的右侧和图9的右侧，Redmond RED发出红色荧光。
另外考虑，观察到Redmond RED的荧光是因为检测到了存在于外泌体膜表面上的蛋白CD81。
另外，在图8的右侧、图9的右侧，观察到黄色荧光，其被认为是得到来自FAM的荧光的绿色和来自Redmond RED的红色荧光这两种荧光时的荧光信号。
另外，观察到来自FAM和Redmond RED这两者的荧光(黄色)认为是因为检测到了外泌体中的在外泌体膜表面上存在CD63、CD81这2种蛋白的外泌体。
此外考虑，根据图8的右侧的荧光图像以及图9的右侧的荧光图像的结果，通过绿色、红色、黄色的荧光信号，能够确认存在膜表面上具有CD63的外泌体、膜表面上具有CD81的外泌体、以及膜表面上具有CD63和CD81这两者的外泌体。
即确认，通过作为多个种类的第一目标分子的CD63、CD81的检测，能够检测作为第二目标分子的外泌体。
另外，根据本实施例，考虑通过检测绿色、红色、黄色这样的多个荧光信号，能够判定生物试样中的外泌体上存在的CD63、CD81的分布。
此外，根据本实施例，考虑通过检测绿色、红色、黄色这样的多个荧光信号的分布，能够观察生物试样中膜表面上具有CD63的外泌体、膜表面上具有CD81的外泌体、以及膜表面上具有CD63和CD81这两者的外泌体的分布。
通过利用核酸修饰抗体进行的数字侵入反应，能够识别且检测外泌体膜表面上的多个蛋白，并且由此启示，在具有大量反应起始物质的情况(如本实施例那样对抗体修饰大量核酸片段这样的情况，结合有大量成为荧光信号的基点的物质这样的情况)下，能够通过数字测量在短时间内进行多个项目的定量检测。
这是因为使大量经荧光标记的核酸片段结合在识别蛋白的抗体上。
另外考虑，本实施例中，由于按照1个孔中导入1个以下的外泌体(具有作为第一目标分子的蛋白的第二目标分子)的方式构成了孔的尺寸，因此即使在流式细胞仪中存在大量具有经荧光标记的核酸片段的抗体，也能够不受来自过量抗体的荧光的干扰等而检测出外泌体所具有的蛋白。
另一方面，在以往的扩增目标核酸的数字PCR中，检测所需的反应时间较多，因此难以在短时间内进行检测。
另外，在以往的对抗体进行荧光标记的流式细胞术中，由于成为目标的外泌体或蛋白小，为了检测必须使用荧光标记珠等，因此难以进行高灵敏度的检测。
此外，在以往的使用了核酸修饰抗体的免疫PCR中，为了检测必须控制核酸的标记量，因此难以进行定量检测。
如此认为，通过以往的方法，难以迅速且高精度地检测目标分子。
根据本实施例的目标分子的检测方法，即使在使生物试样流过一个流式细胞仪的情况下，通过同时检测多个荧光信号的多色检测，也能够在短时间内进行多个项目的目标分子的定量检测。
另外认为，通过本实施例的目标分子的检测方法，能够检测存在于外泌体等生物试样的表面上的蛋白等，通过多色检测，也能够用于观察这些蛋白等的分布、研究作为与癌相关的生物标记物的蛋白等的行为或分布等定性的分析。
产业上的可利用性
通过本发明，能够提供即使在与目标分子特异性结合的物质发生误识别的情况下也能够高精度地检测目标分子的技术。
符号说明
100、180、182、184 目标分子
110、112、113、115、117 目标分子捕获粒子
111、114、116、118、120、122、124、125、190、191、192、193、194 特异性结合物质
121、123、126 标记(标记分子)
130、150、160、170 复合物
140 不是目标分子的分子
200 检测设备
210 基板
220 流路
230 盖体
240 孔
250 信号
序 列 表
<110> 凸版印刷株式会社
<120> 目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒
<130> PC-23705
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<170> PatentIn version 3.5
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gcaatttcac ccaaattgga accatgctgt atacagtttg gtagctggct ttttatgtct 120
taccattat 129
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taccattat 129
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Claims (16)

1.一种目标分子的检测方法，其具备下述工序：
准备用多个核酸片段标记且所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质、和多个种类的第一目标分子的工序，所述多个核酸片段具有产生互不相同的荧光波长的荧光信号的标记物质；
使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序；
分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及
根据与所述多个种类的所述特异性结合物质对应的多个所述荧光信号来判断所述多个种类的所述第一目标分子的工序。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
对于1分子所述特异性结合物质，所述多个核酸片段结合数个～数十个。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，
所述特异性结合物质为抗体。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，
准备具有所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个的第二目标分子，
通过检测所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个，检测所述第二目标分子。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，
所述第二目标分子为外泌体。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，
所述多个种类的所述第一目标分子中的至少一个存在于所述外泌体的膜表面上。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，
所述多个种类的所述第一目标分子是疾病标记蛋白。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的检测方法，其中，
准备具备基板的检测设备，所述基板具有多个孔，
在使所述多个种类的所述特异性结合物质与所述多个种类的所述第一目标分子结合的工序之后，还具备：在所述多个孔中向1个孔中导入1个所述第二目标分子的工序。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，
同时检测所述多个种类的所述第一目标分子。
10.一种目标分子的检测方法，其具备下述工序：
使所识别的表位互不相同的多个种类的特异性结合物质与目标分子结合的工序；
分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序；以及
在检测出所述多个种类的所述特异性结合物质中的两种以上时，判断为存在所述目标分子的工序。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其中，
以1个分子为单位进行所述目标分子的检测。
12.根据权利要求10或11所述的检测方法，其中，
所述多个种类的特异性结合物质的至少1种用核酸片段标记。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的检测方法，其中，
分别检测所述多个种类的所述特异性结合物质的工序包含信号放大反应。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的检测方法，其中，
同时检测多个种类的目标分子。
15.一种目标分子检测试剂盒，其具备：
与目标分子特异性结合、所识别的表位互不相同且被可相互辨别地标记的多个种类的特异性结合物质。
16.根据权利要求15所述的目标分子检测试剂盒，其中，
所述多个种类的特异性结合物质用互不相同的核酸片段标记。
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