WO2016047068A1 - ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット - Google Patents

ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット Download PDF

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博行 野地
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target molecule and a kit used therefor. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a target molecule based on an antigen-antibody reaction between the target molecule and an antibody on a carrier.
  • a biosensing technique for detecting a disease marker (biomarker) present at a low concentration in a biological sample with high sensitivity is required.
  • biomarker disease marker
  • the blood concentration of the biomarker is about 30 aM.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for detecting a protein using a single molecule enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Patent Document 1 discloses an array device capable of forming ultra-high-density minute droplets as a “single molecule digital counting device”. By performing the ELISA in a small volume droplet, the signal from the target molecule can be binarized and measured (digital ELISA method). Specifically, first, a target molecule, a bead whose surface has been modified with a capture antibody, and a detection antibody are reacted to form a “capture antibody-target molecule-detection antibody” complex on the bead surface. When the concentration of the target molecule is low, individual beads will either bind only one molecule of the complex or not at all. Next, one bead is encapsulated in each of a large number of microdroplets formed on the array device.
  • the number of droplets that emit a signal derived from the detection antibody is counted as the number of target molecules.
  • the signal from the target molecule can be binarized to 0 or 1, and the target molecule can be detected and quantified with high sensitivity and high accuracy.
  • Patent Document 2 discloses that, in an enzyme immunoassay, a restriction enzyme is used as a label for an antibody that reacts with a target substance, and a DNA strand having a restriction base sequence of the restriction enzyme is conjugated with a complex restriction enzyme. A method of detecting a target substance by cleaving and analyzing and measuring the cleaved DNA strand fragment is disclosed.
  • the main object of the present invention is to provide a technology for detecting a signal from a target molecule with high sensitivity and high accuracy by eliminating noise caused by nonspecific adsorption of a detection antibody.
  • the present invention provides the following [1] to [8].
  • [2] The detection method according to [1], including an analysis procedure for processing two or more fluorescence detection signals having different fluorescence wavelengths as the detection signal of the target molecule.
  • [3] The detection according to [1] or [2], including a sealing procedure in which the carrier is sealed in each of the droplets formed on the substrate between the complex formation procedure and the detection procedure.
  • Method. [4] The detection method according to any one of [1] to [3], wherein the carrier is microbeads.
  • [5] The detection method according to any one of [1] to [4], wherein the first antibody and the second antibody bind to different epitopes of the target molecule.
  • [6] The detection method according to any one of [1] to [5], which is a digital ELISA method.
  • a target molecule [7] a target molecule; A carrier modified with a first antibody that specifically binds to the target molecule; Two or more second antibodies that specifically bind to the target molecule and are labeled differently from each other; To form a complex consisting of the first antibody, the target molecule and the second antibody on the carrier, and A detection procedure for detecting a signal from the label; An analysis procedure for processing the signals from two or more different labels as detection signals of the target molecule.
  • a carrier modified with a first antibody that specifically binds to a target molecule Two or more antibodies labeled with an enzyme that specifically binds to the target molecule and has a substrate-cleaving activity, the second antibody having different substrate specificities of the enzyme, and a cleavage site of the enzyme And two or more substrates having a fluorescent substance bonded to one end of the cleavage site and a decoloring substance bonded to the other end, wherein the fluorescent wavelengths of the fluorescent substances are different from each other;
  • An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit comprising:
  • the present invention in a method for detecting a target molecule based on an antigen-antibody reaction between the target molecule and an antibody on a carrier, noise caused by nonspecific adsorption of the detection antibody to the carrier is eliminated, and the target molecule is separated from the target molecule.
  • a technique for detecting the signal of the above with high sensitivity and high accuracy is provided.
  • the target molecule detection method includes the following procedures.
  • each procedure will be described by taking as an example an embodiment in which the method for detecting a target molecule according to the present invention is applied to single molecule digital counting by ELISA (digital ELISA method).
  • a target molecule a carrier modified with a first antibody that specifically binds to the target molecule, and two or more labeled with an enzyme that specifically binds to the target molecule and has a substrate cleavage activity
  • An antibody which reacts with a second antibody having different substrate specificities of the enzyme, to form a complex comprising the first antibody, the target molecule, and the second antibody on the carrier;
  • the complex formation procedure is described by taking as an example an embodiment in which the method for detecting a target molecule according to the present invention is applied to single molecule digital counting by ELISA (digital ELISA method).
  • the target molecule to be detected may be any substance that binds to an antibody by an antigen-antibody reaction, and in particular, microorganisms such as bacteria and fungi, viruses, proteins, nucleic acids, sugars, and the like. These are biomolecules such as composites.
  • the target molecule to be detected is not limited to one type, and two or more types of target molecules can be detected simultaneously. For example, by using four types of antibodies, a first antibody and a second antibody against protein A, and a first antibody and a second antibody against protein B, two types of target molecules, protein A and protein B, can be distinguished. Simultaneous detection is possible.
  • a target molecule In the complex formation procedure, a target molecule, a carrier modified with a first antibody that specifically binds to the target molecule, and an enzyme that specifically binds to the target molecule and has a substrate cleavage activity Is reacted with a second antibody labeled to form a complex composed of the first antibody, the target molecule and the second antibody on the carrier.
  • a second antibody two or more antibodies labeled with enzymes having different substrate specificities are used.
  • the “enzyme having substrate cleavage activity” is not particularly limited as long as it can realize dissociation (described in detail later) of the fluorescent substance and the decoloring substance by cleavage of the substrate.
  • Examples of the “enzyme having substrate cleavage activity” include a transferase classified as EC2 by an EC number (enzyme number, EnzymeEnCommission Number), a hydrolase classified as EC3, and an additional desorbase classified as EC4. Enzymes belonging to can be used. Examples of combinations of specific enzymes and their substrates (and cleavage sites in the substrates) include the following.
  • Fig. 1 shows the complex formed by the complex formation procedure.
  • the carrier 2 modified with the first antibody 3 that specifically binds to the target molecule 1 and the second antibody that specifically binds to the target molecule 1 and is labeled with the enzymes 51 and 52. 41 and 42 are prepared.
  • antibody specifically binds means that it can bind to an antigen (here, target molecule 1), but does not bind to other substances or is weakly bound. Further, “weak binding” means that the binding affinity to other substances is sufficiently low to be distinguishable as compared with the binding affinity to the antigen.
  • the binding affinity (affinity) of an antibody can be measured, for example, by a known method such as a surface plasma resonance (SPR) method.
  • the first antibody 3 functions to capture the target molecule 1 on the carrier 2.
  • the second antibodies 41 and 42 function in order to enable optical detection of the target molecule 1 captured on the carrier 2.
  • the first antibody 3 and the second antibody 41, 42 preferably bind to different epitopes of the target molecule 1.
  • the epitope of the first antibody 3, the epitope of the second antibody 41, and the epitope of the second antibody 42 are preferably all different.
  • the first antibody 3 is also referred to as “capture antibody 3”
  • the second antibody is also referred to as “detection antibodies 41 and 42”.
  • micro beads are widely used.
  • carrier 2 is also referred to as “microbead 2”.
  • microbead is used synonymously with “particle” and is a technical term commonly used in the art.
  • the shape of the microbead is not particularly limited, but is usually a spherical shape.
  • the material of the microbead is not particularly limited, and may be glass, silica gel, polystyrene, polypropylene, a membrane, a magnetic material, and the like.
  • Specific materials include cellulose, cellulose derivatives, acrylic resins, glass, silica gel, polystyrene, gelatin, polyvinyl pyrrolidone, copolymers of vinyl and acrylamide, polystyrene cross-linked with divinylbenzene, polyacrylamide, latex gel, polystyrene dextran. , Rubber, silicon, plastic, nitrocellulose, cellulose, natural sponge, silica gel, glass, metal plastic, cellulose, crosslinked dextran (Sephadex TM) and agarose gel (Sepharose TM).
  • the beads may be porous.
  • the beads preferably have an average particle diameter of 5 ⁇ m or less, for example, about 1 ⁇ m to 4 ⁇ m. In addition, an average particle diameter can be measured using electron microscope observation or a dynamic light scattering method, for example.
  • the modification of the capture antibody 3 to the microbead 2 is performed by binding the capture antibody 3 to a modification group on the surface of the microbead 2 via a linker.
  • the capture antibody 3 is covalently bonded to an amino group on the surface of the amino group-modified bead via a cross-linking agent having N-hydroxysuccinimide or the like.
  • the enzymes 51 and 52 labeled with the detection antibodies 41 and 42 have different substrate specificities.
  • substrate specificity means that in the cleavage of a substrate catalyzed by an enzyme, the enzyme does not catalyze the cleavage of a substance other than the substrate, or the degree of the catalyst is sufficiently weak.
  • an esterase is used as the enzyme 51 as the “enzyme having different substrate specificities”, glucosidase, phosphatase, or the like, which is an enzyme that does not use an ester bond as a cleavage site, is used as the enzyme 52.
  • restriction enzymes having different recognition sequences (cleavage sites) are used as the enzymes 51 and 52 having different substrate specificities.
  • the restriction enzyme include AccI, AluI, ApaI, BamHI, BglII, BssHII, BstEII, ClaI, DdeI, DraI, EcoRI, EcoRV, HaeIII, HincII, HindIII, HpaI, HpaII, KpnI, NluI, KpnI, MluN, , NheI, NotI, PstI, PvuI, PvuII, RsaI, SacI, SalI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, SspI, StuI, XbaI, XhoI and the like.
  • the enzymes 51 and 52 two enzymes having different substrate specificities can be used in any combination. Below, the example which uses a restriction enzyme as the enzymes 51 and 52 is mainly demonstrated, and the enzymes 51 and 52 shall also be called "restriction enzymes 51 and 52.”
  • the detection enzymes 41 and 42 are labeled with the restriction enzymes 51 and 52 by forming a cross-linking structure between the detection antibodies 41 and 42 and the restriction enzymes 51 and 52 using a cross-linking agent (crosslinker reagent). Can do.
  • a cross-linking agent crosslinker reagent
  • the target molecule 1, the microbead 2 modified with the capture antibody 3, and the detection antibodies 41 and 42 labeled with the restriction enzymes 51 and 52 are reacted.
  • a complex composed of the capture antibody 3, the target molecule 1, and the detection antibodies 41 and 42 is formed on the microbead 2 (see FIG. 1A).
  • the reaction of the target molecule 1, the microbead 2 and the detection antibodies 41 and 42 may be performed in one step or in two steps. That is, the target molecule 1, the microbead 2 and the detection antibodies 41 and 42 may be reacted at the same time, or after the target molecule 1 and the microbead 2 are reacted, the target molecule 1 that has not bound to the capture antibody 3 is removed. For this purpose, the microbeads 2 may be washed and then reacted with the detection antibodies 41 and 42.
  • the reaction of the target molecule 1, the microbeads 2 and the detection antibodies 41 and 42 may be performed by bringing them into contact with each other in an appropriate solution, and can be performed under the same conditions as those of conventionally known enzyme-linked immunosorbent assays.
  • concentration of the target molecule 1 is low, the individual microbeads 2 after the reaction have only one molecule complex or none at all.
  • the restriction enzyme 51, 42 labeled with the detection antibody 41, 42 is brought into contact with the microbead 2 having the complex formed in this procedure on the surface and the substrate to which the fluorescent substance is bound. Fluorescence generated by cleavage of the substrate by 52 is detected. At this time, if non-specific adsorption of the detection antibodies 41 and 42 to the microbeads 2 occurs, the fluorescence due to the cleavage of the substrate is also emitted from the microbeads 2 having the nonspecifically adsorbed detection antibodies 41 and 42 on the surface. Will occur.
  • antibody adsorbs non-specifically means that the antibody adsorbs to a non-antigen portion of a substance containing an antigen or adsorbs to a substance that does not contain an antigen.
  • -It shall refer to adsorption to a substance regardless of antibody reaction.
  • FIGS. 1B and 1C show non-specific adsorption of the detection antibodies 41 and 42 to the microbeads 2 that can occur in the complex formation procedure.
  • FIG. 1B shows a state in which one of the detection antibody 41 and the detection antibody 42 is adsorbed nonspecifically on the surface of the microbead 2.
  • FIG. 1C shows a state where both the detection antibody 41 and the detection antibody 42 are adsorbed nonspecifically on the surface of the microbead 2.
  • non-specific adsorption of the detection antibodies 41 and 42 as shown in FIGS. 1B and 1C may occur in addition to the target complex formation shown in FIG. 1A.
  • the frequency at which non-specific adsorption of both the detection antibody 41 and the detection antibody 42 shown in FIG. 1C occurs is sufficiently smaller than the frequency at which non-specific adsorption of either one of the antibodies shown in FIG. Little impact on detection accuracy. For example, assuming that 1% of the microbead 2 causes non-specific adsorption of the detection antibody 41 and similarly 1% of the microbead 2 causes non-specific adsorption of the detection antibody 42, both the detection antibody 41 and the detection antibody 42 The frequency with which non-specific adsorption occurs is only 0.01%.
  • two or more fluorescence detection signals having different fluorescence wavelengths are processed as detection signals (signals) of the target molecule 1, thereby resulting from the fluorescence detection signals generated by non-specific adsorption shown in FIG. 1B. Eliminate noise.
  • the microbeads 2 are encapsulated in droplets formed on the substrate. This procedure is performed when the target molecule detection method according to the present invention is applied to the digital ELISA method, and is not an essential procedure of the detection method according to the present invention.
  • the microbeads 2 are enclosed one by one in a small volume droplet that can contain only one microbead 2.
  • a single-molecule digital counting device disclosed in Patent Document 1 can be suitably used to form microdroplets and enclose the microbeads 2 in the microdroplets.
  • microbeads 2 can be encapsulated in the droplets at the same time while forming microdroplets at an extremely high density on the substrate.
  • the microbeads 2 after the complex formation procedure may be washed in order to remove the detection antibodies 41 and 42 that have not bound to the target molecule 1, and then resuspended in an appropriate solvent and subjected to this procedure. .
  • the microbeads 2 after the complex formation procedure are a mixture of microbeads that have formed a complex (see FIG. 1A) and microbeads that have not formed a complex. Furthermore, the microbeads that do not form a complex include microbeads (see FIGS. 1B and 1C) to which the detection antibodies 41 and 42 are adsorbed nonspecifically.
  • FIG. 2 shows the microbeads 2 encapsulated in microdroplets.
  • One microbead 2 is encapsulated in each droplet D formed on the substrate A.
  • each microbead 2 has only one molecule complex or not at all.
  • the microbead with the complex formed on the surface is denoted by reference numeral 21, and the microbead without the complex is denoted by reference numeral 22.
  • the microbeads 21 are in the state shown in FIG. 1A, and the microbeads 22 include beads in the state shown in FIG. 1B or C.
  • the microbead 2 in which the complex is formed is referred to as “microbead 21”
  • the microbead 2 in which the complex is not formed is referred to as “microbead 22”.
  • Detection Procedure In the detection procedure, a substrate (hereinafter referred to as “probe”) having a recognition sequence of restriction enzymes 51 and 52, a fluorescent substance bound to one end side of the recognition sequence serving as a cleavage site, and a decolorizing substance bound to the other end side. And the complex formed on the surface of the microbead 2 in the complex formation procedure, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance is detected.
  • a substrate hereinafter referred to as “probe” having a recognition sequence of restriction enzymes 51 and 52, a fluorescent substance bound to one end side of the recognition sequence serving as a cleavage site, and a decolorizing substance bound to the other end side.
  • FIG. 3 shows the reaction between the probe and the complex in this procedure.
  • the probe denoted by reference numeral 61 in the figure includes a cleavage site 71 of the restriction enzyme 51 labeled with the detection antibody 41, and a fluorescent substance 81 is bound to one region across the cleavage site 71, and the other A decoloring substance 91 is bonded to the region.
  • the probe denoted by reference numeral 62 in the figure includes a cleavage site 72 of the restriction enzyme 52 labeled on the detection antibody 42, and the fluorescent substance 82 is bound to one region across the cleavage site 72 and erased to the other region.
  • a color substance 92 is bound.
  • the fluorescent materials 81 and 82 of the probes 71 and 72 are fluorescent materials having different fluorescence wavelengths and optically distinguishable and detectable.
  • the probe 61 is connected to the detection antibody 41.
  • a substance containing a labeled esterase cleavage site 71 (ester bond), a fluorescent material 81 bound to one region across the cleavage site 71, and a decolorizing material 91 bound to the other region is used.
  • the probe 62 includes a glucosidase cleavage site 72 (glycoside bond) labeled with the detection antibody 42, and a fluorescent substance 82 is bound to one region across the cleavage site 72, and a decoloring material is disposed to the other region. A combination of 92 is used.
  • the decolorizable materials 91 and 92 block the emission of the fluorescent materials 81 and 82 while being located within a certain distance that allows energy transfer between the fluorescent materials 81 and 82 (quenching).
  • fluorescent materials 81 and 82 and the decoloring materials 91 and 92 fluorescent materials and quenchers that are widely used in nucleic acid optical detection techniques such as real-time quantitative PCR can be used.
  • Examples of combinations of fluorescent substances and quenchers include Alexa Fluor (registered trademark) 488 (manufactured by Invitrogen), ATTO 488 (manufactured by ATTO-TEC GmbH), Alexa Fluor (registered trademark) 594 (manufactured by Invitrogen) and Examples thereof include a combination of a fluorescent substance selected from the group consisting of ROX (Carboxy-X-rhodamine) and BHQ (registered trademark, Black hole quencher) -1 or BHQ (registered trademark) -2. Moreover, the combination of a fluorescein and DABCYL etc. are mentioned. The combinations of commonly used fluorescent substances and quenchers are shown in the table below.
  • the reaction is performed by bringing the probes 61 and 62 into contact with the microbeads 2 enclosed in the microdroplet D.
  • the microbeads 2 that have been washed after the complex formation procedure are resuspended in a solution containing the probes 61 and 62, thereby bringing them into contact with each other.
  • the reaction is preferably performed using a buffer having a composition suitable for the types of restriction enzymes 51 and 52, and it is preferable to form microdroplets using such a buffer in the encapsulation procedure. Note that buffers optimized for various restriction enzymes are commercially available in combination with restriction enzymes.
  • the cleavage site 71 of the probe 61 is cleaved by the restriction enzyme 51 labeled on the detection antibody 41 that forms a complex.
  • the probe 61 is cleaved into the fragment 61a and the fragment 61b, and the fluorescent material 81 is dissociated from the decolorizable material 91 and becomes ready for light emission.
  • the fluorescent material 82 is also dissociated from the decolored material 92 and becomes capable of emitting light.
  • Fluorescence is detected by detecting fluorescence from each microdroplet in which the microbeads 2 are enclosed, using a fluorescence microscope, an image sensor, or the like.
  • the detection can be performed, for example, by observing the presence or absence of the microbead 2 under a microscope, and can also be performed by a method of detecting scattered light by the microbead 2 or a method using potential measurement by a field effect transistor (FET). It can be carried out.
  • FET field effect transistor
  • the microbeads 2 enclosed in the individual microdroplets D are the microbeads 21 having only one molecule complex, or not at all. Therefore, the number of microdroplets D that generate a detection signal of the target molecule 1 can be regarded as the number of target molecules 1. Further, the target molecule 1 is selected from the total number of microbeads 2 by using the number of microdroplets D enclosing the microbeads 21 and 22 and the number of microdroplets D enclosing the microbeads 21. The ratio of the number captured can be calculated. This makes it possible to quantify the concentration of the target molecule.
  • the fluorescence from the fluorescent material 81 and the fluorescence from the fluorescent material 92 having a wavelength different from that of the fluorescence are detected.
  • the detection antibody 41 or the detection antibody 42 as shown in FIG. 1B is adsorbed nonspecifically on the surface of the microbeads 2 but does not form a complex, the fluorescent substance 81 Only the fluorescence from one of the fluorescent material 92 and the fluorescent material 92 is detected.
  • both the detection antibody 41 and the detection antibody 42 as shown in FIG. 1C are adsorbed nonspecifically on the surface of the microbead 2, fluorescence of both the fluorescent substance 81 and the fluorescent substance 92 is generated.
  • this fluorescence hardly affects the quantification of the target molecule 1.
  • the microbeads 2, detection antibodies 41 and 42 (see FIG. 1), and probes 71 and 72 (see FIG. 3) used in this embodiment are kits for carrying out the target molecule detection method according to the present invention. It can be suitably implemented. That is, the present invention in one aspect, (I) a carrier modified with a first antibody that specifically binds to a target molecule; (Ii) two or more antibodies that specifically bind to the target molecule and are labeled with an enzyme having a substrate cleavage activity, wherein the enzymes have different substrate specificities; (Iii) two or more substrates having a cleavage site of the enzyme, a fluorescent substance bonded to one end of the cleavage site, and a decoloring substance bonded to the other end, wherein the fluorescent wavelength of the fluorescent substance is Different substrates, An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit is also provided.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the microbead 2 may be one obtained by modifying the capture antibody 3 (first antibody) in advance, and the antibody is bound to the modifying group on the surface of the bead at the time of use via a linker. May be.
  • the detection antibodies 41 and 42 may be those in which an enzyme is labeled in advance, and may be those in which an enzyme is bound to the antibody using a cross-linking agent at the time of use.
  • the kit according to the present invention is a reagent such as a cross-linking agent used for modification of the capture antibody 3 on the microbead 2 or labeling of the enzyme on the detection antibodies 41 and 42, and a complex formation procedure and a detection procedure.
  • a reagent such as a cross-linking agent used for modification of the capture antibody 3 on the microbead 2 or labeling of the enzyme on the detection antibodies 41 and 42, and a complex formation procedure and a detection procedure.
  • Various buffers used, and a substrate A (see FIG. 2) used in the encapsulation procedure may be further included.
  • two detection antibodies and two corresponding probes are used, and two fluorescence detection signals with different fluorescence wavelengths are used as target molecule detection signals, resulting in non-specific adsorption of the detection antibody.
  • An embodiment for reducing noise is described.
  • three or more pairs of detection antibodies and probes may be used.
  • three or more fluorescence detection signals having different fluorescence wavelengths are used as the target molecule detection signals. That's fine. The greater the number of detection antibodies and probes used, the higher the noise reduction effect derived from non-specific adsorption of detection antibodies.
  • a detection antibody labeled with an enzyme having a substrate cleavage activity is used as the second antibody, and fluorescence is generated by cleaving the cleavage site in the probe with the enzyme.
  • a detection antibody labeled with an enzyme conventionally used for chemical color development or a detection antibody labeled with a fluorescent dye can be applied as the second antibody.
  • this invention also includes the detection method of the target molecule
  • A a target molecule, a carrier modified with a first antibody that specifically binds to the target molecule, and two or more second antibodies that specifically bind to the target molecule and have different labels And forming a complex comprising the first antibody, the target molecule, and the second antibody on the carrier.
  • B A detection procedure for detecting a signal from the label.
  • C An analysis procedure for processing the signals from two or more different labels as detection signals of the target molecule.
  • the “signal from the sign” includes a signal generated directly and indirectly from the sign.
  • the “signal from the label” refers to fluorescence generated from the fluorescent dye when the detection antibody labeled with the fluorescent dye is applied as the second antibody (see FIG. 4B).
  • the “signal from the label” refers to chemical coloration catalyzed by the enzyme when the detection antibody labeled with the enzyme used for chemical coloration is applied as the second antibody (see FIG. 4A).
  • the procedure (A) is the same as that in the above-described embodiment (first embodiment) except that the second antibody is an enzyme conventionally used for chemical color development such as alkaline phosphatase or galactosidase, or a detection antibody labeled with various fluorescent substances. This can be performed in the same manner as in the procedure (1) of the embodiment. Moreover, when this embodiment is implemented as a digital ELISA method, the encapsulation procedure described as the procedure (2) in the first embodiment may be included.
  • the detection antibody can be labeled with an enzyme or a fluorescent dye by the above-described known method. Various commercially available antibodies labeled with enzymes or fluorescent dyes may be used.
  • step (B) the signal from the label of the detection antibody forming a complex on the surface of the carrier is detected.
  • FIG. 4A shows that when the antibody labeled with alkaline phosphatase and the antibody labeled with galactosidase are used as the detection antibodies 41 and 42, “capture antibody 3-target substance 1-second antibody 41 formed on the microbead 2”. , 42 ".
  • the signal can be detected by a coloring method using a substrate of the enzyme.
  • BCIP Bis-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate
  • NBT non-Nitro blue tetrazolium chloride
  • X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • Two or more antibodies labeled with different enzymes are used as the detection antibody, and two or more compounds are used as the chromogenic substrate depending on the enzyme labeled with each antibody.
  • signals derived from the respective enzymes can be detected.
  • FIG. 4B shows that when a detection antibody 41 or 42 is labeled with FITC and an antibody labeled with Texas Red (registered trademark), the “capture antibody 3-target substance 1-second” formed on the microbead 2 is used. A complex of two antibodies 41, 42 "is shown. Two or more antibodies labeled with fluorescent substances having different fluorescence wavelengths are used as detection antibodies. By detecting the fluorescence from the fluorescent substance for each wavelength band, signals derived from the respective fluorescent substances can be detected.
  • step (C) signals from two or more different labels (alkaline phosphatase and galactosidase, or FITC and Texas Red in the above example) are processed as detection signals for the target molecule.
  • the detection antibody is adsorbed nonspecifically on the surface of the carrier and does not form a complex, only the signal from one of the two or more labels is used. Not detected (see FIG. 1). Therefore, by processing signals from two or more different labels as detection signals for the target molecule, noise resulting from nonspecific adsorption of the detection antibody to the carrier can be greatly reduced. Thereby, it is possible to improve the detection accuracy of the target molecule, and further its quantitativeness.
  • 1 target molecule
  • 2 microbead (carrier)
  • 3 capture antibody (first antibody)
  • 41, 42 detection antibody (second antibody)
  • 51, 52 restriction enzyme
  • 61, 62 probe
  • 71, 72 cleavage site
  • 81, 82 fluorescent substance
  • 91, 92 decoloring substance

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Abstract

　ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、前記複合体と、を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含むターゲット分子の検出方法を提供する。検出抗体の担体への非特異的吸着により生じるノイズを排除して、ターゲット分子からのシグナルを高感度かつ高精度に検出することが可能となる。

Description

ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット
　本発明は、ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキットに関する。より詳しくは、ターゲット分子を、担体上における該ターゲット分子と抗体との抗原抗体反応に基づいて検出する方法に関する。
　種々の疾患の早期診断を目的として、生体サンプル中に低濃度に存在する疾病マーカー（バイオマーカー）を高感度に検出するためのバイオセンシング技術が求められている。例えば、体積１ｍｍ3の腫瘍に含まれる１００万個の癌細胞のそれぞれからバイオマーカー１００分子が５Ｌの血中に分泌された場合、バイオマーカーの血中濃度は３０ａＭ程度となる。このような非常に低濃度のターゲット分子を検出可能な技術が求められている。
　非特許文献１には、一分子の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてタンパク質を検出する方法が記載されている。この方法では、タンパク質特異的な抗体で覆われた微細なビーズによって微量のタンパク質を捕捉し、ビーズとタンパク質との複合体を蛍光標識させる。この複合体を含むビーズを遠心力によって反応チャンバーに導入し、タンパク質を捕捉しているビーズの数を数えることによって、タンパク質を定量的に測定する。
　特許文献１には、「一分子デジタル計数デバイス」として、超高密度に微小な液滴を形成可能なアレイデバイスが開示されている。ＥＬＩＳＡを微小な体積の液滴中で行うことで、ターゲット分子からのシグナルを２値化して測定を行うことができる（デジタルＥＬＩＳＡ法）。具体的には、まず、ターゲット分子、捕捉抗体を表面修飾したビーズ、及び検出抗体を反応させ、ビーズ表面上に「捕捉抗体－ターゲット分子－検出抗体」の複合体を形成させる。ターゲット分子の濃度が低い場合、個々のビーズは、複合体を１分子のみ結合しているか、全く結合していないかのどちらかになる。次に、アレイデバイスに形成した多数の微小液滴のそれぞれにビーズを１つずつ封入する。そして、検出抗体に由来するシグナルを発する液滴の数をターゲット分子の数としてカウントする。これにより、ターゲット分子からのシグナルを０か１に２値化して、ターゲット分子の検出及び定量を高感度かつ高精度に行うことができる。
　本発明に関連して、特許文献２には、酵素免疫検査法において、目的物質と反応する抗体の標識として制限酵素を用い、制限酵素の切断塩基配列を有するＤＮＡ鎖を複合体の制限酵素により切断し、該切断されたＤＮＡ鎖断片を分析して測定することにより目的物質を検出する方法が開示されている。
国際公開第２０１２／１２１３１０号 特開平７－２７０４１８号公報
David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641
　上述のようにターゲット分子をＥＬＩＳＡによる一分子デジタル計数によって測定する場合、ビーズへ非特異的に吸着した検出抗体に由来するノイズが生じると、ターゲット分子からのシグナルを正確に２値化できず、定量性が低下する。
　そこで、本発明は、検出抗体の非特異的吸着により生じるノイズを排除して、ターゲット分子からのシグナルを高感度かつ高精度に検出するための技術を提供することを主な目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明は、以下の［１］～［８］を提供する。
［１］ターゲット分子と、
前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、
を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
　前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
前記複合体と、
を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含むターゲット分子の検出方法。
［２］蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順を含む、［１］の検出方法。
［３］前記複合体形成手順と前記検出手順との間に、基板上に形成された液滴のそれぞれに前記担体を一つずつ封入する封入手順を含む、［１］又は［２］の検出方法。
［４］前記担体がマイクロビーズである［１］～［３］のいずれかの検出方法。
［５］前記第一の抗体と前記第二の抗体が前記ターゲット分子の異なるエピトープに結合する［１］～［４］のいずれかの検出方法。
［６］デジタルＥＬＩＳＡ法である［１］～［５］のいずれかの検出方法。
［７］ターゲット分子と、
前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、互いに異なる標識がされた二以上の第二の抗体と、
を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
前記標識からの信号を検出する検出手順と、
異なる二以上の前記標識からの前記信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法。
［８］ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
を含んでなる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ)キット。
　本発明により、ターゲット分子を、担体上における該ターゲット分子と抗体との抗原抗体反応に基づいて検出する方法において、検出抗体の担体への非特異的吸着により生じるノイズを排除して、ターゲット分子からのシグナルを高感度かつ高精度に検出するための技術が提供される。
複合体形成手順で形成される複合体を説明するための図である。 封入手順において微小液滴に封入されたマイクロビーズを説明するための図である。 検出手順における複合体とプローブとの反応を説明するための図である。 複合体形成手順で形成される複合体を説明するための図である。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　本発明に係るターゲット分子の検出方法は、以下の手順を含む。ここでは、本発明に係るターゲット分子の検出方法を、ＥＬＩＳＡによる一分子デジタル計数（デジタルＥＬＩＳＡ法）に適用した実施形態を例として、各手順を説明する。
（１）ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順。
（２）基板上に形成された液滴のそれぞれに前記担体を一つずつ封入する封入手順。
（３）前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、前記複合体と、を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順。
（４）蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順。
　本発明に係る検出方法において、検出対象とするターゲット分子は、抗原－抗体反応により抗体と結合する物質であればよく、特には、細菌及び真菌等の微生物、ウイルス、タンパク、核酸、糖及びにこれらの複合物等の生体分子とされる。また、検出対象とするターゲット分子は、１種類に限られず、２種類以上のターゲット分子を同時に検出することもできる。例えば、タンパクＡに対する第一抗体及び第二抗体と、タンパクＢに対する第一抗体と第二抗体の、四種類の抗体を用いることで、タンパクＡとタンパクＢの二種類のターゲット分子を区別可能に同時検出できる。
１．複合体形成手順
　複合体形成手順では、ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二の抗体とからなる複合体を形成させる。第二の抗体には、基質特異性が互いに異なる酵素が標識された二以上の抗体が用いられる。
　「基質切断活性を有する酵素」は、基質の切断による蛍光物質と消色物質の解離（詳しく後述する）を実現し得るものであれば特に限定されない。「基質切断活性を有する酵素」としては、例えば、EC番号（酵素番号、Enzyme Commission Number）でEC2に分類される転移酵素、EC3に分類される加水分解酵素及びEC4に分類される付加脱離酵素に属する酵素を用いることができる。具体的な酵素とその基質（及び基質中の切断部位）の組み合せとしては例えば以下が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１に複合体形成手順で形成される複合体を示す。本手順では、まず、ターゲット分子１に特異的に結合する第一の抗体３が修飾された担体２と、ターゲット分子１に特異的に結合し、酵素５１，５２が標識された第二の抗体４１，４２を用意する。
　本発明において、「抗体が特異的に結合する」とは、抗原（ここではターゲット分子１）に結合することができるが、他の物質とは結合しないか結合が弱いことを意味する。また、「結合が弱い」とは、抗原に対する結合親和性に比して、他の物質への結合親和性が区別可能に十分低いことを意味する。抗体の結合親和性（アフィニティー）は、例えばＳｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）法等の公知の手法によって測定できる。
　第一の抗体３は、ターゲット分子１を担体２上に捕捉するために機能する。第二の抗体４１，４２は、担体２上に捕捉されたターゲット分子１を光学的に検出可能とするために機能する。第一の抗体３と第二の抗体４１，４２は、ターゲット分子１の異なるエピトープに結合することが好ましい。換言すると、第一の抗体３のエピトープ、第二の抗体４１のエピトープ及び第二の抗体４２のエピトープは全て異なることが好ましい。以下、第一の抗体３を「捕捉抗体３」、第二の抗体を「検出抗体４１，４２」とも称する。
　担体２としては、マイクロビーズが汎用されている。以下、「担体２」を「マイクロビーズ２」とも称するものとする。本発明において、「マイクロビーズ」は、「粒子」と同義に用いられ、当技術分野において慣用の技術用語である。マイクロビーズの形状は、特に限定されないが、通常球形とされる。マイクロビーズの材料も、特に限定されず、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレン及び磁性体などであってよい。具体的な材料として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ジビニルベンゼンン等と架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレンデキストラン、ゴム、ケイ素、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））およびアガロースゲル（セファロース（商標））などが挙げられる。ビーズは、多孔性であってもよい。ビーズは、平均粒子径５μｍ以下であることが好ましく、例えば１μｍ～４μｍ程度とされる。なお、平均粒子径は、例えば電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定することができる。
　マイクロビーズ２への捕捉抗体３の修飾は、マイクロビーズ２の表面にある修飾基にリンカーを介して捕捉抗体３を結合させることにより行う。例えば、アミノ基修飾ビーズの表面にあるアミノ基に、Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（Ｎ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等を持つ架橋剤を介して捕捉抗体３を共有結合させる。
　検出抗体４１，４２に標識される酵素５１，５２は、基質特異性が互いに異なるものとされる。ここで、「基質特異性」とは、酵素によって触媒される基質の切断において、当該酵素が当該基質以外の物質の切断を触媒しないか触媒の程度が十分に弱いことを意味する。「基質特異性が互いに異なる酵素」として、例えば、酵素５１としてエステラーゼを用いる場合、酵素５２には、エステル結合を切断部位としない酵素であるグルコシダーゼやフォスファターゼなどを用いる。
　また、酵素と基質の組み合わせとして制限酵素と核酸鎖を採用する場合には、基質特異性が互いに異なる酵素５１，５２として、認識配列（切断部位）が互いに異なる酵素を用いる。制限酵素としては、例えば、ＡｃｃＩ、ＡｌｕＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ等を挙げることができる。酵素５１，５２には、これらのうち基質特異性が異なる２つの酵素を任意に組み合わせて用いることができる。以下では、酵素５１，５２として制限酵素を用いる例を主に説明し、酵素５１，５２を「制限酵素５１，５２」とも称するものとする。
　検出抗体４１，４２への制限酵素５１，５２の標識は、架橋剤（クロスリンカー試薬）を用いて検出抗体４１，４２と制限酵素５１，５２との間に架橋構造を形成させることにより行うことができる。
　次に、本手順では、ターゲット分子１と、捕捉抗体３が修飾されたマイクロビーズ２と、制限酵素５１，５２が標識された検出抗体４１，４２と、を反応させる。反応により、マイクロビーズ２上に捕捉抗体３とターゲット分子１と検出抗体４１，４２とからなる複合体が形成される（図１Ａ参照）。ターゲット分子１、マイクロビーズ２及び検出抗体４１，４２の反応は一段階で行っても二段階で行ってもよい。すなわち、ターゲット分子１、マイクロビーズ２及び検出抗体４１，４２は同時に反応させてもよいし、ターゲット分子１とマイクロビーズ２を反応させた後、捕捉抗体３に結合しなかったターゲット分子１を除去するためにマイクロビーズ２を洗浄してから、マイクロビーズ２と検出抗体４１，４２を反応させてもよい。
　ターゲット分子１、マイクロビーズ２及び検出抗体４１，４２の反応は、適当な溶液中でこれらを接触させることによって行えばよく、従来公知の酵素結合免疫吸着アッセイと同様の条件で行うことができる。ターゲット分子１の濃度が低い場合、反応後の個々のマイクロビーズ２は、１分子の複合体のみを有するか、全く有さないかのどちらかになる。
　後述する検出手順においては、本手順で形成された複合体を表面に有するマイクロビーズ２と、蛍光物質が結合された基質と、を接触させ、検出抗体４１，４２に標識された制限酵素５１，５２により該基質が切断されて生じる蛍光を検出する。この際、検出抗体４１，４２のマイクロビーズ２への非特異的な吸着が生じると、非特異的に吸着した検出抗体４１，４２を表面に有するマイクロビーズ２からも、基質の切断による蛍光が生じることとなる。
　ここで、「抗体が非特異的に吸着する」とは、抗体が、抗原を含む物質のうち抗原ではない部分に吸着したり、抗原を含まない物質に吸着したりすることを意味し、抗原－抗体反応によらず物質に吸着することを指すものとする。
　図１Ｂ，Ｃは、複合体形成手順で生じ得る、検出抗体４１，４２のマイクロビーズ２への非特異的な吸着を示す。図１Ｂには、検出抗体４１及び検出抗体４２のいずれか一方がマイクロビーズ２の表面に非特異的に吸着している状態を示す。また、図１Ｃには、検出抗体４１及び検出抗体４２の両方がマイクロビーズ２の表面に非特異的に吸着している状態を示す。複合体形成手順では、図１Ａに示す目的とする複合体形成以外にも、図１Ｂ，Ｃに示すような検出抗体４１，４２の非特異的吸着が生じ得る。
　図１Ｃに示す検出抗体４１及び検出抗体４２の両方の非特異的吸着が生じる頻度は、図１Ｂに示すいずれか一方の抗体の非特異吸着が生じる頻度に比べて十分に小さく、ターゲット分子１の検出精度にほとんど影響を与えない。例えば、マイクロビーズ２の１％で検出抗体４１の非特異吸着が生じ、同様にマイクロビーズ２の１％で検出抗体４２の非特異吸着が生じると仮定すると、検出抗体４１及び検出抗体４２の両方の非特異吸着が生じる頻度は０．０１％に過ぎない。後述する解析手順では、蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号をターゲット分子１の検出信号（シグナル）として処理することによって、図１Ｂに示す非特異的吸着により生じる蛍光の検出信号に起因するノイズを排除する。
２．封入手順
　封入手順では、基板上に形成された液滴にマイクロビーズ２を封入する。本手順は、本発明に係るターゲット分子の検出方法をデジタルＥＬＩＳＡ法に適用した場合に行われる手順であり、本発明に係る検出方法の必須の手順となるものではない。
　本手順では、解析手順においてターゲット分子１からのシグナルを０か１で２値化するため、マイクロビーズ２を１つのみ収容可能な微小体積の液滴中に、マイクロビーズ２を一つずつ封入する。微小液滴の形成及び微小液滴へのマイクロビーズ２の封入は、例えば、特許文献１に開示された一分子デジタル計数デバイスを好適に用いることができる。この一分子デジタル計数デバイスによれば、基板上において、超高密度に微小な液滴を形成しながら、同時に液滴中にマイクロビーズ２を封入させることができる。複合体形成手順後のマイクロビーズ２は、ターゲット分子１に結合しなかった検出抗体４１，４２を除去するために洗浄を行った後、適当な溶媒に再懸濁し、本手順に供してもよい。
　複合体形成手順後のマイクロビーズ２は、複合体を形成したマイクロビーズ（図１Ａ参照）と、複合体を形成してないマイクロビーズの混合物である。さらに、複合体を形成していないマイクロビーズには、検出抗体４１，４２が非特異的に吸着したマイクロビーズ（図１Ｂ，Ｃ参照）が含まれる。
　図２に、微小液滴に封入されたマイクロビーズ２を示す。基板Ａ上に形成された液滴Ｄのそれぞれにマイクロビーズ２が一つずつ封入されている。複合体形成手順における反応の際、ターゲット分子１の濃度が低い場合には、個々のマイクロビーズ２は、１分子の複合体のみを有するか、全く有さないかのどちらかになる。図では、表面に複合体が形成されたマイクロビーズを符号２１で、複合体が形成されていないマイクロビーズを符号２２で示した。マイクロビーズ２１は図１Ａに示す状態のビーズであり、マイクロビーズ２２には図１Ｂ又はＣに示した状態のビーズが含まれる。以下、複合体を形成したマイクロビーズ２を「マイクロビーズ２１」、複合体を形成していないマイクロビーズ２を「マイクロビーズ２２」と表記する。
３．検出手順
　検出手順では、制限酵素５１，５２の認識配列を有し、切断部位となる該認識配列の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された基質（以下「プローブ」とも称する）と、複合体形成手順においてマイクロビーズ２の表面に形成された複合体とを反応させて、蛍光物質から発せられる蛍光を検出する。
　図３に、本手順におけるプローブと複合体との反応を示す。反応には、異なる蛍光波長の蛍光物質が結合された２以上のプローブを用いる。具体的には、図中符号６１で示すプローブは、検出抗体４１に標識された制限酵素５１の切断部位７１を含み、切断部位７１を挟んで一方の領域に蛍光物質８１が結合され、他方の領域に消色物質９１が結合されている。また、図中符号６２で示すプローブは、検出抗体４２に標識された制限酵素５２の切断部位７２を含み、切断部位７２を挟んで一方の領域に蛍光物質８２が結合され、他方の領域に消色物質９２が結合されている。
　制限酵素５１，５２は基質特異性が異なるので、切断部位７１，７２も互いに異なる塩基配列とされる。また、プローブ７１，７２の蛍光物質８１，８２には、互いに蛍光波長が異なり、光学的に区別して検出可能な蛍光物質が用いられる。
　ここで、酵素と基質の組み合わせとして制限酵素と核酸鎖の組み合せ以外を採用する場合であって、例えば酵素５１にエステラーゼ、酵素５２にグルコシダーゼを用いる場合には、プローブ６１には、検出抗体４１に標識されたエステラーゼの切断部位７１（エステル結合）を含み、切断部位７１を挟んで一方の領域に蛍光物質８１が結合され、他方の領域に消色物質９１が結合されたものを用いる。また、プローブ６２には、検出抗体４２に標識されたグルコシダーゼの切断部位７２（グリコシド結合）を含み、切断部位７２を挟んで一方の領域に蛍光物質８２が結合され、他方の領域に消色物質９２が結合されたものを用いる。
　消色物質９１，９２は、蛍光物質８１，８２との間でエネルギー移動が可能な一定の距離内に位置する状態で、蛍光物質８１，８２の発光を阻止する（クエンチング）。蛍光物質８１，８２及び消色物質９１，９２には、リアルタイム定量ＰＣＲなどの核酸の光学検出技術において汎用されている蛍光物質とクエンチャーを用いることができる。蛍光物質とクエンチャーの組みわせとしては、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ　４８８（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ　ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される蛍光物質とＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ　ｈｏｌｅ　ｑｕｅｎｃｈｅｒ）－１又はＢＨＱ（登録商標）－２との組み合わせ等が挙げられる。また、フルオレセインとＤＡＢＣＹＬとの組み合わせ等が挙げられる。汎用されている蛍光物質とクエンチャーの組み合わせを以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　反応は、微小液滴Ｄに封入されたマイクロビーズ２に、プローブ６１，６２を接触させることにより行う。具体的には、例えば、複合体形成手順後に洗浄を行ったマイクロビーズ２を、プローブ６１，６２を含む溶液に再懸濁することで、これらを接触させる。また、反応は、制限酵素５１，５２の種類に応じて適した組成のバッファーを用いて行うことが好ましく、封入手順においてこのようなバッファーを用いて微小液滴を形成しておくことが好ましい。なお、各種制限酵素に最適化されたバッファーは、制限酵素と組み合わされて市販されている。
　微小液滴Ｄにマイクロビーズ２１が封入されている場合、複合体を形成する検出抗体４１に標識された制限酵素５１によりプローブ６１の切断部位７１が切断される。切断部位７１が切断されると、プローブ６１が断片６１ａと断片６１ｂとに切断され、蛍光物質８１が消色物質９１から解離して発光可能な状態となる。同様に、複合体を形成する検出抗体４２に標識された制限酵素５２によりプローブ６２の切断部位７２が切断されると、蛍光物質８２も消色物質９２から解離して発光可能な状態となる。
　蛍光の検出は、マイクロビーズ２が封入された各微小液滴からの蛍光を蛍光顕微鏡、イメージセンサ等を用いて検出することによって行う。
　また、本手順においては、各微小液滴にマイクロビーズ２が収容されているか否かをも検出することが好ましい。当該検出は、例えば顕微鏡下においてマイクロビーズ２の有無を観察することにより行うことができ、マイクロビーズ２による散乱光を検出する方法、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）による電位計測を利用する方法などによっても行うことができる。
４．解析手順
　解析手順では、蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号をターゲット分子１の検出信号として処理し、ターゲット分子１の検出信号を発する微小液滴Ｄの数をターゲット分子の数としてカウントする。
　複合体形成手順における反応の際、ターゲット分子１の濃度が低い場合には、個々の微小液滴Ｄに封入されたマイクロビーズ２は、１分子の複合体のみを有するマイクロビーズ２１か、全く有さないマイクロビーズ２２かのどちらかであるので、ターゲット分子１の検出信号を発する微小液滴Ｄの数はターゲット分子１の数とみなすことができる。また、マイクロビーズ２１及びマイクロビーズ２２が封入された微小液滴Ｄの数と、マイクロビーズ２１が封入された微小液滴Ｄの数とを用いて、マイクロビーズ２の全数のうちターゲット分子１を捕捉した数の割合を算出することができる。これにより、ターゲット分子の濃度を定量化することが可能となる。
　上述の通り、微小液滴Ｄにマイクロビーズ２１が封入されていれば、蛍光物質８１からの蛍光と、当該蛍光と波長が異なる蛍光物質９２からの蛍光が検出される。図１Ｂに示したような検出抗体４１又は検出抗体４２がマイクロビーズ２の表面に非特異的に吸着しているのみで、複合体を形成していないようなマイクロビーズ２２からは、蛍光物質８１及び蛍光物質９２のいずれか一方からの蛍光しか検出されない。従って、蛍光物質８１及び蛍光物質９２の両方の蛍光の検出信号をターゲット分子１の検出信号として処理することで、複合体を形成していないマイクロビーズ２２から生じる蛍光の検出信号に起因するノイズを大幅に低減できる。これにより、ターゲット分子１の検出信号の２値化を高精度に行うことができ、ターゲット分子１の定量性を向上させることが可能となる。
　なお、図１Ｃに示したような検出抗体４１及び検出抗体４２の両方がマイクロビーズ２の表面に非特異的に吸着している場合にも、蛍光物質８１及び蛍光物質９２の両方の蛍光が生じ得るが、既に説明した通り、検出抗体４１及び検出抗体４２の両方の非特異吸着が生じる頻度は十分に小さいため、この蛍光はターゲット分子１の定量性にはほとんど影響を与えない。
　本実施形態で用いられる、マイクロビーズ２と検出抗体４１，４２（図１参照）、及びプローブ７１，７２（図３参照）は、本発明に係るターゲット分子の検出方法を実施するためのキットとして好適に実施され得る。すなわち、本発明は、一側面において、
（ｉ）ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
（ｉｉ）前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、
（ｉｉｉ）前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
を含んでなる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットをも提供するものである。
　当該キットにおいて、マイクロビーズ２は、捕捉抗体３（第一の抗体）が予め修飾されたものであってよく、用時にビーズの表面にある修飾基にリンカーを介して抗体を結合させるものであってもよい。また、検出抗体４１，４２（第二の抗体）は、酵素が予め標識されたものであってよく、用時に架橋剤を用いて抗体に酵素を結合させるものであってもよい。
　また、本発明に係るキットは、マイクロビーズ２への捕捉抗体３の修飾あるいは検出抗体４１，４２への酵素の標識のために用いられる架橋剤等の試薬や、複合体形成手順及び検出手順で用いられる各種のバッファー、封入手順で用いる基板Ａ（図２参照）などをさらに含んでいてもよい。
　上記では、検出抗体を２つ、これに対応するプローブを２つ用いて、蛍光波長の異なる２つの蛍光の検出信号をターゲット分子の検出信号とすることにより、検出抗体の非特異的吸着に由来するノイズを低減する実施形態を説明した。本発明に係るターゲット分子の検出方法において、検出抗体及びプローブは３組以上を用いてもよく、この場合には、蛍光波長の異なる３つ以上の蛍光の検出信号をターゲット分子の検出信号とすればよい。用いる検出抗体及びプローブの数が多い程、検出抗体の非特異的吸着に由来するノイズの低減効果を高めることができる。
　また、上記では、第二の抗体として、基質切断活性を有する酵素を標識した検出抗体を用いて、プローブ中の切断部位を該酵素により切断させることによって蛍光を生じさせる実施形態を説明した。本発明に係るターゲット分子の検出方法では、第二の抗体として、従来化学発色に用いられてきた酵素が標識された検出抗体や、蛍光色素が標識された検出抗体を適用することも可能である。
　すなわち、本発明は、その第二実施態様として、以下の手順を含むターゲット分子の検出方法をも包含する。
（Ａ）ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、互いに異なる標識がされた二以上の第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順。
（Ｂ）前記標識からの信号を検出する検出手順。
（Ｃ）異なる二以上の前記標識からの前記信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順。
　ここで、手順（Ｃ）において、「標識からの信号」には、当該標識から直接及び間接に発生する信号が含まれる。具体的には、「標識からの信号」は、蛍光色素が標識された検出抗体を第二の抗体として適用する場合には、該蛍光色素から発生する蛍光を指す（図４Ｂ参照）。また、「標識からの信号」は、化学発色に用いられる酵素が標識された検出抗体を第二の抗体として適用する場合には、該酵素による触媒される化学発色を指す（図４Ａ参照）。
　手順（Ａ）は、第二の抗体として、アルカリフォスファターゼやガラクトシダーゼ等の従来化学発色に用いられてきた酵素や、各種蛍光物質が標識された検出抗体を用いる以外は、上述の実施形態（第一実施形態）の手順（１）と同様にして行うことができる。また、本実施形態をデジタルＥＬＩＳＡ法として実施する場合には、第一実施形態で手順（２）として説明した封入手順が含まれ得る。検出抗体への酵素又は蛍光色素の標識は、上述の公知手法により行うことができる。また、酵素や蛍光色素を標識した抗体は、各種市販されているものを利用してもよい。
　手順（Ｂ）では、担体の表面で複合体を形成している検出抗体の標識からの信号を検出する。図４Ａに、検出抗体４１，４２としてアルカリフォスファターゼを標識した抗体とガラクトシダーゼを標識した抗体を用いた場合において、マイクロビーズ２上に形成された「捕捉抗体３－ターゲット物質１－第二の抗体４１，４２」の複合体を示す。酵素が標識された検出抗体を用いる場合、信号の検出は、該酵素の基質を用いた発色法により行うことができる。例えば、アルカリフォスファターゼが標識された検出抗体の場合には、第一実施形態で用いたプローブに替えてアルカリフォスファターゼの発色基質であるＢＣＩＰ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）やＮＢＴ（4-Nitro blue tetrazolium chloride）を複合体と反応させることによって行うことができる。また、ガラクトシダーゼが標識された検出抗体の場合には、発色基質としてＸ－Ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)等を用いる。検出抗体には互いに異なる酵素が標識された二以上の抗体が用いられ、発色基質には各抗体に標識された酵素に応じて二以上の化合物が用いられる。各発色基質の発色を吸光度計測によって測定することで、それぞれの酵素に由来する信号を検出できる。
　また、蛍光物質が標識された検出抗体を用いる場合、信号の検出は、蛍光顕微鏡やイメージセンサを用いて蛍光物質から発せられる蛍光を検出することよって行う。図４Ｂに、検出抗体４１，４２としてＦＩＴＣを標識した抗体とＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）を標識した抗体を用いた場合において、マイクロビーズ２上に形成された「捕捉抗体３－ターゲット物質１－第二の抗体４１，４２」の複合体を示す。検出抗体には互いに蛍光波長が異なる蛍光物質が標識された二以上の抗体が用いられ、蛍光物質からの蛍光を波長帯域ごとに検出することで、それぞれの蛍光物質に由来する信号を検出できる。
　手順（Ｃ）では、異なる二以上の標識（上述の例ではアルカリフォスファターゼとガラクトシダーゼ、あるいはＦＩＴＣとＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ）からの信号をターゲット分子の検出信号として処理する。上述の通り、検出抗体が担体の表面に非特異的に吸着しているのみで、複合体を形成していないような場合には、二以上の標識のうちいずれか一つの標識からの信号しか検出されない（図１参照）。従って、異なる二以上の標識からの信号をターゲット分子の検出信号として処理することで、検出抗体の担体への非特異的に吸着に起因するノイズを大幅に低減できる。これにより、ターゲット分子の検出精度、さらにはその定量性を向上させることが可能である。
１：ターゲット分子、２：マイクロビーズ（担体）、３：捕捉抗体（第一の抗体）、４１，４２：検出抗体（第二の抗体）、５１，５２：制限酵素、６１，６２：プローブ、７１，７２：切断部位、８１，８２：蛍光物質、９１，９２：消色物質

Claims (7)

  1. 　ターゲット分子と、
    前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
    前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、
    を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
    　前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
    前記複合体と、
    を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、
    　蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法。
  2. 　前記複合体形成手順と前記検出手順との間に、基板上に形成された液滴のそれぞれに前記担体を一つずつ封入する封入手順を含む、請求項１記載の検出方法。
  3. 　前記担体がマイクロビーズである、請求項１又は２記載の検出方法。
  4. 　前記第一の抗体と前記第二の抗体が前記ターゲット分子の異なるエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　デジタルＥＬＩＳＡ法である、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　ターゲット分子と、
    前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
    前記ターゲット分子に特異的に結合し、互いに異なる標識がされた二以上の第二の抗体と、
    を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
    　前記標識からの信号を検出する検出手順と、
    　異なる二以上の前記標識からの前記信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法。
  7. 　ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
    前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
    を含んでなる酵素結合免疫吸着アッセイキット。
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