CN110865060A - 一种“一步法”检测甘胆酸的方法 - Google Patents

一种“一步法”检测甘胆酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一步法检测甘胆酸的方法。该方法利用了激光诱导荧光的原理，利用一定波长的光激发与光波导表面特异性结合的甘胆酸抗体携带的荧光分子，实时监测荧光信号的强度，实现甘胆酸的实时检测。本发明利用冻干的荧光标记的甘胆酸抗体粉末与甘胆酸进行反应后直接进行检测，具有试剂易保存、操作简便、可便携等优点，实现了“一步法”检测血清中的甘胆酸含量。

Description

一种“一步法”检测甘胆酸的方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及一种检测甘胆酸的方法，具体涉及一种一步法检测甘胆酸的方法。
背景技术
甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，在医学领域中甘胆酸的含量可以反映肝脏的健康状况。血清中的甘胆酸可以反映肝细胞功能以及肝胆系物质的循环功能，在正常情况下，血清中甘胆酸的含量较少，正常人无论空腹或餐后，体内的甘胆酸含量水平都较低。当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时，就会使代谢紊乱，细胞摄取甘胆酸的含量下降，引起血液中甘胆酸含量上升，上升程度与肝脏细胞的受损程度相关。
目前定量检测甘胆酸含量的主要方法有放射免疫法，ELISA等方法，放射免疫法会释放放射物质危害环境与操作人员，而ELISA检测时间较长，且甘胆酸目前的检测方法无法达到简单的“一步法”检测。因此，开发一种无放射性，操作简单且可实现“一步法”检测的方法在检测甘胆酸的领域中具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于激光诱导荧光原理，操作简单，特异性强的“一步法”快速检测甘胆酸的方法。
本发明提供的“一步法”快速检测甘胆酸的方法，包括：
1)在光波导表面修饰甘胆酸包被抗原，得到修饰后的光波导；
2)在甘胆酸抗体上标记荧光分子，得到荧光标记的甘胆酸抗体溶液，冻干，得到甘胆酸抗体冻干粉末；
3)标准曲线的绘制：
将步骤2)所得甘胆酸抗体冻干粉末与一系列不同浓度的含有甘胆酸标准品的溶液混合进行预反应，反应完毕后通入步骤1)所得修饰后的光波导表面进行荧光反应，得到一系列溶液；应用激光诱导光波导表面的荧光标记抗体发出荧光，收集所得荧光信号；以荧光强度为纵坐标，以甘胆酸标准品溶液的浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线；
4)待测血清中甘胆酸浓度的测定：
将步骤2)所得甘胆酸抗体冻干粉末与待测血清混合进行预反应，反应完毕后通入步骤1)所得修饰后的光波导表面进行荧光反应，应用所述步骤3)所述激光诱导光波导表面的荧光标记抗体发出荧光，收集所得荧光信号，将所得荧光强度与步骤3)所得标准曲线对比，即可得到所述待测血清中甘胆酸浓度；
所述步骤4)预反应和荧光反应步骤的反应条件与所述步骤3)相同。
上述方法的步骤1)中，所述修饰的方法均为常规方法；如可包括硅烷化和双功能化；
具体的，所述硅烷化步骤中，所用羟基化试剂为浓硫酸和双氧水，所用体积比为浓硫酸：双氧水＝3:1；硅烷化试剂为3-巯丙基甲基二甲氧基硅烷，其溶于甲苯之中，所得浓度为2％；温度为室温；时间为2h；所用双功能试剂为N—琥珀酰亚胺基—4—马来酰亚胺—丁酸酯，将该试剂溶于乙醇中，浓度为2mM；反应时间为1h；最后在浓度为0.5mg/Ml的包被抗原中4℃反应过夜。
所述步骤2)中，荧光分子为Cy5.5；
冻干后每支抗体的质量为0.25μg。
所述步骤3)和步骤4)中，所述含有甘胆酸标准品的溶液和待测血清的用量相同，均为100μL；
所述甘胆酸抗体冻干粉末在由所述甘胆酸抗体冻干粉末与含有甘胆酸标准品的溶液组成的混合液中的浓度为5μg/mL；
所述含有甘胆酸标准品的溶液中，溶剂为PBS缓冲液或稀释5倍人血清；
所述含有甘胆酸标准品的溶液的浓度为0.25μg/mL-20μg/mL；具体为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL；
所述预反应步骤中，时间为4min；
所述荧光反应步骤中，时间为200s。
所述步骤3)和4)中，所述激光能够激发所述荧光分子发出荧光。
所述方法还包括：在所述步骤3)和/或步骤4)之后，用SDS清洗所述光波导的探头表面。
所述清洗步骤中，清洗时间为300s；
所述SDS溶液的质量百分浓度为0.5％；pH为1.9。
本发明由于采用以上技术方案，具有以下优点：1.利用了激光诱导荧光的原理，利用一定波长的光激发与光波导表面特异性结合的甘胆酸抗体携带的荧光分子，实时监测荧光信号的强度，实现甘胆酸的实时检测。2.本发明利用冻干的荧光标记的甘胆酸抗体粉末与甘胆酸进行反应后直接进行检测，具有试剂易保存、操作简便、可便携等优点，实现了“一步法”检测血清中的甘胆酸含量。
附图说明
图1为检测原理图；
图2为“一步法”检测血清中甘胆酸含量的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
该检测方法的原理如图1所示。该检测方法的原理是将光波导通过化学修饰的方法修饰包被抗原用于后续检测。将一定量的荧光标记的甘胆酸抗体冻干制成冻干粉末，将100μL的样品加入到冻干粉末中，充分震荡，溶解冻干粉末，并预反应一段时间，令抗体与样品中的甘胆酸充分反应，之后将100μL的混合液通入到光波导表面反应一段时间，未与混合液中的甘胆酸标品反应的剩余抗体就会与光波导探头表面的包被抗原特异性结合。激光器发射出的激光诱导激发抗体上标记的荧光，荧光通过光波导传播，经过滤光片最终被探测器探测，进计算机系统可读出荧光强度。由于抗体上的荧光会与被检测的甘胆酸存在线性定量关系，通过检测荧光强度就可以实现甘胆酸的定量检测。
实施例1
1)光波导传感界面的修饰
将光波导传感界面浸泡在HF：HNO3＝1:3的溶液30min，去除杂质并使其表面连接羟基，用超声清洗后烘干，在硅烷化后连接双功能试剂修饰甘胆酸的包被抗原。
2)甘胆酸抗体标记荧光
采用Cy5.5染料对甘胆酸抗体进行标记，将透析袋放入烧杯中，用超纯水淹没后利用微波炉加热10min，将热水倒出，该操作重复三次。在透析袋中加入一定浓度的抗体，在1L的0.15M NaCl溶液中常温透析4h。在4℃中用新鲜的1L的0.15M NaCl溶液中透析过夜。第二天用1L 0.1NaHCO3溶液中透析4h。用DMSO溶液配制Cy5.5，将抗体和染料混合后在暗处搅拌45min，之后用1L的0.15M NaCl溶液透析4h，利用0.01M PBS溶液透析4h之后在4℃中透析过夜。之后用PBS稀释抗体在在紫外中测量吸光度，计算抗体浓度。
3)荧光标记甘胆酸抗体的冷冻干燥
将标记Cy5.5的甘胆酸抗体分装，且每支分装的含量相同，之后加入浓度为10mg/mL的BSA溶液，充分震荡，混合。后将甘胆酸抗体与BSA溶液的混合液在-80℃下冷冻过夜，冷冻过夜时需对上述混合溶液进行避光处理，之后将预冷冻的混合液放入冷冻干燥机中冻干8-12h，直至观察到管底有白色蓬松粉末后取出。将冻干好的荧光标记甘胆酸抗体放置在-20℃避光保存。实验时取出。
4)“一步法”检测甘胆酸
a、抗体浓度的优化
将2μg，1.5μg，1μg，0.5μg，0.25μg荧光标记的甘胆酸抗体分装到500μL的离心管中，加入浓度为10mg/mL的BSA溶液，冻干制成冻干粉末。
分别向上述含量的冻干粉末中加入100μL稀释五倍的人血清溶液，通入到光波导表面，观察其荧光信号，选取荧光信号为100左右的含量为最优抗体含量。最终选取抗体含量为0.25μg。
b、荧光标记抗体与样品中甘胆酸预反应时间优化
将上述优化的荧光标记的甘胆酸抗体含量中加入100μL的浓度为1mg/mL的甘胆酸样品，分别反应1min，2min，4min，6min，8min，之后通入到光波导表面，观察其荧光信号的强度，选取信号值不降低的最短时间为最优预反应时间。最终选取最优预反应时间为4min。
5)“一步法”检测血清中甘胆酸含量标准曲线的建立
首先将磷酸缓冲溶液连续通入持续600s得到背景基线值。
利用稀释5倍人血清作为缓冲溶液，配置浓度为0μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL的甘胆酸标准品溶液。利用上述优化条件建立甘胆酸的标准曲线。
将0.25μg冻干后的荧光标记甘胆酸抗体中加入100μL的含有不同浓度的甘胆酸标准品的人血清，将100μL的甘胆酸抗体与甘胆酸标准品的混合液充分震荡，令冻干粉充分溶解，混匀，之后室温预反应4min后通入光波导表面，令混合液与光波导表面的包被抗原充分反应200s，后用0.5％的SDS溶液(pH＝1.9)冲洗探头表面300s，使光波导表面再生，可用于下一次检测。
将检测所得稀释5倍血清中空白对比值和不同甘胆酸浓度下的荧光信号进行归一化处理，制作甘胆酸的标准曲线(如图2)；所得标准曲线对应的一元线性方程为y＝0.125+(0.907-0.125)/(1+(x/2.81)^2.46)；相关系数为0.936。线性范围1.6-4.9μg/mL。
通过读取实际样品中的所检测到的荧光信号，并与空白荧光信号值进行归一化处理，(空白荧光信号值为1，归一化信号值＝实际样品荧光信号值/空白荧光信号值)归一化信号值为标准曲线中的y值，代入y＝0.125+(0.907-0.125)/(1+(x/2.81)^2.46)计算出x值。
如通入空白后读取的荧光信号值为90.4，通入1号样品后所读取的荧光信号值为61.2，将其进行归一化处理,空白信号值为1，1号样品所得归一化结果即是61.2/90.4，计算得0.677，该值为标准曲线的y值，利用该值计算标准曲线中的x值，即为样品1中甘胆酸的浓度，为1.96μg/mL，因为该样品是稀释5倍后进行检测，所得结果乘5为实际样品值，为11.05μg/mL。样品2、3的计算方式与样品1相同。
检测实际样品的结果如表1所示。
表1、检测实际样品的结果
Figure BDA0002295640760000051
从1可知，该方法的准确度较高。

Claims (7)

1.一种“一步法”快速检测甘胆酸的方法，包括：
1)在光波导表面修饰甘胆酸包被抗原，得到修饰后的光波导；
2)在甘胆酸抗体上标记荧光分子，得到荧光标记的甘胆酸抗体溶液，冻干，得到甘胆酸抗体冻干粉末；
3)标准曲线的绘制：
将步骤2)所得甘胆酸抗体冻干粉末与一系列不同浓度的含有甘胆酸标准品的溶液混合进行预反应，反应完毕后通入步骤1)所得修饰后的光波导表面进行荧光反应，得到一系列溶液；应用激光诱导光波导表面的荧光标记抗体发出荧光，收集所得荧光信号；以荧光强度为纵坐标，以甘胆酸标准品溶液的浓度为横坐标，进行线性拟合，得到标准曲线；
4)待测血清中甘胆酸浓度的测定：
将步骤2)所得甘胆酸抗体冻干粉末与待测血清混合进行预反应，反应完毕后通入步骤1)所得修饰后的光波导表面进行荧光反应，应用所述步骤3)所述激光诱导光波导表面的荧光标记抗体发出荧光，收集所得荧光信号，将所得荧光强度与步骤3)所得标准曲线对比，即可得到所述待测血清中甘胆酸浓度；
所述步骤4)预反应和荧光反应步骤的反应条件与所述步骤3)相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述修饰的方法包括硅烷化和双功能化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，荧光分子为Cy5.5；
冻干后每支抗体的质量为0.25μg。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中，所述含有甘胆酸标准品的溶液和待测血清的用量相同，均为100μL；
所述甘胆酸抗体冻干粉末在由所述甘胆酸抗体冻干粉末与含有甘胆酸标准品的溶液组成的混合液中的浓度为5μg/mL；
所述含有甘胆酸标准品的溶液中，溶剂为PBS缓冲液或稀释5倍人血清；
所述含有甘胆酸标准品的溶液的浓度为0.25μg/mL-20μg/mL；
所述预反应步骤中，时间为4min；
所述荧光反应步骤中，时间为200s。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)和4)中，所述激光能够激发所述荧光分子发出荧光。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：在所述步骤3)和/或步骤4)之后，用SDS清洗所述光波导的探头表面。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述清洗步骤中，清洗时间为300s；
所述SDS溶液的质量百分浓度为0.5％；pH为1.9。
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