KR20170057241A - 타겟 분자의 검출 방법 및 이것에 사용되는 키트 - Google Patents

Abstract

타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서와, 상기 효소의 절단 부위를 갖고 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질과 상기 복합체를 반응시켜서, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출하는 검출 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법을 제공한다. 검출 항체의 담체에 대한 비특이적 흡착에 의해 발생하는 노이즈를 배제하여, 타겟 분자로부터의 시그널을 고감도 또한 고정밀도로 검출하는 것이 가능해진다.

Description

타겟 분자의 검출 방법 및 이것에 사용되는 키트{METHOD FOR DETECTING TARGET MOLECULE, AND KIT FOR USE IN SAID METHOD}

본 발명은 타겟 분자의 검출 방법 및 이것에 사용되는 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 타겟 분자를 담체 상에 있어서의 상기 타겟 분자와 항체의 항원항체 반응에 의거하여 검출하는 방법에 관한 것이다.

각종 질환의 조기 진단을 목적으로 하여, 생체 샘플 중에 저농도로 존재하는 질병 마커(바이오마커)를 고감도로 검출하기 위한 바이오 센셍 기술이 요구되고 있다. 예를 들면 체적 1㎣의 종상에 포함되는 100만개의 암 세포의 각각으로부터 바이오마커 100분자가 5L의 혈 중에 분비된 경우, 바이오마커의 혈 중 농도는 30aM 정도가 된다. 이러한 극히 저농도의 타겟 분자를 검출가능한 기술이 요구되고 있다.

비특허문헌 1에는, 1분자의 효소결합 면역흡착 어세이(ELISA)를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에서는 단백질 특이적인 항체로 덮여진 미세한 비즈에 의해 미량의 단백질을 포착하고, 비즈와 단백질의 복합체를 형광 표식시킨다. 이 복합체를 포함하는 비즈를 원심력에 의해 반응 챔버에 도입하고, 단백질을 포착하고 있는 비즈의 수를 카운팅함으로써, 단백질을 정량적으로 측정한다.

특허문헌 1에는, 「1분자 디지털 계수 디바이스」로서 초고밀도로 미소한 액적을 형성가능한 어레이 디바이스가 개시되어 있다. ELISA를 미소한 체적의 액적 중에서 행함으로써 타겟 분자로부터의 시그널을 2진화해서 측정을 행할 수 있다 (디지털 ELISA법). 구체적으로는, 우선 타겟 분자, 포착 항체를 표면 수식한 비즈,및 검출 항체를 반응시켜서, 비즈 표면 상에 「포착 항체-타겟 분자-검출 항체」의 복합체를 형성시킨다. 타겟 분자의 농도가 낮을 경우, 개개의 비즈는 복합체를 1분자만 결합하고 있는지, 전혀 결합하고 있지 않은지 중 어느 하나로 된다. 다음에, 어레이 디바이스에 형성한 다수의 미소 액적의 각각에 비즈를 1개씩 봉입한다. 그리고, 검출 항체로부터 유래하는 시그널을 발생하는 액적의 수를 타겟 분자의 수로서 카운팅한다. 이것에 의해, 타겟 분자로부터의 시그널을 0이나 1로 2진화하여, 타겟 분자의 검출 및 정량을 고감도 또한 고정밀도로 행할 수 있다.

본 발명에 관련하여 특허문헌 2에는, 효소 면역 검사법에 있어서 목적 물질과 반응하는 항체의 표식으로서 제한 효소를 사용하고, 제한 효소의 절단 염기서열을 갖는 DNA쇄를 복합체의 제한 효소에 의해 절단하고, 상기 절단된 DNA쇄 단편을 분석해서 측정함으로써 목적 물질을 검출하는 방법이 개시되어 있다.

국제 공개 제 2012/121310호 일본 특허공개 평 7-270418호 공보

David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641

상술한 바와 같이 타겟 분자를 ELISA에 의한 1분자 디지털 계수에 의해 측정할 경우, 비즈에 비특이적으로 흡착한 검출 항체로부터 유래하는 노이즈가 발생하면, 타겟 분자로부터의 시그널을 정확하게 2진화할 수 없어 정량성이 저하된다.

그래서, 본 발명은 검출 항체의 비특이적 흡착에 의해 발생하는 노이즈를 배제하여, 타겟 분자로부터의 시그널을 고감도 또한 고정밀도로 검출하기 위한 기술을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 이하의 [1]∼[8]을 제공한다.

[1] 타겟 분자와,

상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,

상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서와,

상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질과,

상기 복합체를 반응시켜서, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출하는 검출 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법.

[2] 형광 파장이 다른 2 이상의 형광 검출 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서를 포함하는 [1]의 검출 방법.

[3] 상기 복합체 형성 순서와 상기 검출 순서 사이에, 기판 상에 형성된 액적의 각각에 상기 담체를 하나씩 봉입하는 봉입 순서를 포함하는 [1] 또는 [2]의 검출 방법.

[4] 상기 담체가 마이크로비즈인 [1]∼[3] 중 어느 하나의 검출 방법.

[5] 상기 제 1 항체와 상기 제 2 항체가 상기 타겟 분자의 다른 에피토프에 결합하는 [1]∼[4] 중 어느 하나의 검출 방법.

[6] 디지털 ELISA법인 [1]∼[5] 중 어느 하나의 검출 방법.

[7] 타겟 분자와,

상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,

상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 서로 다른 표식이 된 2 이상의 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서와,

상기 표식으로부터의 신호를 검출하는 검출 순서와,

다른 2 이상의 상기 표식으로부터의 상기 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법.

[8] 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체와, 상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질을 포함해서 이루어지는 효소결합 면역흡착 어세이(ELISA) 키트.

본 발명에 의해, 타겟 분자를 담체 상에 있어서의 상기 타겟 분자와 항체의 항원항체 반응에 의거하여 검출하는 방법에 있어서, 검출 항체의 담체에의 비특이적 흡착에 의해 발생하는 노이즈를 배제하여, 타겟 분자로부터의 시그널을 고감도 또한 고정밀도로 검출하기 위한 기술이 제공된다.

도 1은 복합체 형성 순서로 형성되는 복합체를 설명하기 위한 도이다.
도 2는 봉입 순서에 있어서 미소 액적에 봉입된 마이크로비즈를 설명하기 위한 도이다.
도 3은 검출 순서에 있어서의 복합체와 프로브의 반응을 설명하기 위한 도이다.
도 4는 복합체 형성 순서로 형성되는 복합체를 설명하기 위한 도이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 적합한 형태에 대해서 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 것은 아니다.

본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법은 이하의 순서를 포함한다. 여기에서는, 본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법을 ELISA에 의한 1분자 디지털 계수(디지털 ELISA법)에 적용한 실시형태를 예로 해서 각 순서를 설명한다.

(1) 타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서.

(2) 기판 상에 형성된 액적의 각각에 상기 담체를 하나씩 봉입하는 봉입 순서.

(3) 상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질과 상기 복합체를 반응시켜서, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출하는 검출 순서.

(4) 형광 파장이 다른 2 이상의 형광 검출 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서.

본 발명에 관한 검출 방법에 있어서, 검출 대상으로 하는 타겟 분자는 항원-항체 반응에 의해 항체와 결합하는 물질이면 좋고, 특히는 세균 및 진균 등의 미생물, 바이러스, 단백질, 핵산, 당 및 이들 복합물 등의 생체 분자로 한다. 또한, 검출 대상으로 하는 타겟 분자는 1종류에 한정되지 않고, 2종류 이상의 타겟 분자를 동시에 검출할 수도 있다. 예를 들면 단백질 A에 대한 제 1 항체 및 제 2 항체와, 단백질 B에 대한 제 1 항체와 제 2 항체의 4종류의 항체를 사용함으로써 단백질 A와 단백질 B의 2종류의 타겟 분자를 구별 가능하게 동시 검출할 수 있다.

1. 복합체 형성 순서

복합체 형성 순서에서는 타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시킨다. 제 2 항체로는 기질 특이성이 서로 다른 효소가 표식된 2 이상의 항체가 사용된다.

「기질 절단 활성을 갖는 효소」는 기질의 절단에 의한 형광 물질과 소색 물질의 해리(상세하게 후술함)를 실현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 「기질 절단 활성을 갖는 효소」로서는, 예를 들면 EC 번호(효소 번호, Enzyme Commission Number)에서 EC2로 분류되는 전이 효소, EC3으로 분류되는 가수분해 효소 및 EC4로 분류되는 부가탈리 효소에 속하는 효소를 사용할 수 있다. 구체적인 효소와 그 기질(및 기질 중의 절단 부위)의 조합으로서는, 예를 들면 이하를 들 수있다.

효소	기질 (기질 중의 절단 부위)
에스테라아제	에스테르 결합 또는 에스테르 결합으로부터 유도되는 결합
글루코시다아제	글리코시드 결합 또는 글리코시드 결합으로부터 유도되는 결합
포스파타아제	인산 에스테르 결합 또는 인산 에스테르 결합으로부터 유도되는 결합
DNAase	DAN 또는 그 유도체
RNAase	RNA 또는 그 유도체
프로테아제	펩티드 결합 또는 펩티드 결합으로부터 유도되는 결합

도 1에 복합체 형성 순서로 형성되는 복합체를 나타낸다. 본 순서에서는, 우선 타겟 분자(1)에 특이적으로 결합하는 제 1 항체(3)가 수식된 담체(2)와, 타겟 분자(1)에 특이적으로 결합하고, 효소(51, 52)가 표식된 제 2 항체(41, 42)를 준비한다.

본 발명에 있어서, 「항체가 특이적으로 결합하는」이란, 항원(여기에서는 타겟 분자(1))에 결합할 수 있지만, 다른 물질과는 결합하지 않거나 결합이 약한 것을 의미한다. 또한 「결합이 약한」이란, 항원에 대한 결합 친화성에 비하여, 다른 물질에 대한 결합 친화성이 구별 가능하게 충분히 낮은 것을 의미한다. 항체의 결합 친화성(어피니티)은, 예를 들면 표면 플라즈몬 공명(SPR)법 등의 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다.

제 1 항체(3)는 타겟 분자(1)를 담체(2) 상에 포착하기 위해서 기능한다. 제 2 항체(41, 42)는 담체(2) 상에 포착된 타겟 분자(1)를 광학적으로 검출 가능하게 하기 위해서 기능한다. 제 1 항체(3)와 제 2 항체(41, 42)는 타겟 분자(1)의 다른 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 환언하면, 제 1 항체(3)의 에피토프, 제 2 항체(41)의 에피토프 및 제 2 항체(42)의 에피토프는 모두 다른 것이 바람직하다. 이하, 제 1 항체(3)를 「포착 항체(3)」, 제 2 항체를 「검출 항체(41, 42)」이라고도 칭한다.

담체(2)로서는 마이크로비즈가 범용되고 있다. 이하, 「담체(2)」를 「마이크로비즈(2)」라고도 칭하는 것으로 한다. 본 발명에 있어서, 「마이크로비즈」는 「입자」와 동의로 사용되고, 당기술분야에 있어서 관용의 기술 용어이다. 마이크로비즈의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 보통 구형으로 한다. 마이크로비즈의 재료도 특별히 한정되지 않고, 유리, 실리카겔, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 멤브레인 및 자성체 등이어도 좋다. 구체적인 재료로서, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아크릴 수지, 유리, 실리카겔, 폴리스티렌, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 비닐과 아크릴아미드의 코폴리머, 디비닐벤젠 등과 가교된 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스겔, 폴리스티렌덱스트란, 고무, 규소, 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 천연 스폰지, 실리카겔, 유리, 금속 플라스틱, 셀룰로오스, 가교 덱스트란(Sephadex(상표)) 및 아가로오스겔(Sepharose(상표)) 등을 들 수 있다. 비즈는 다공성이어도 좋다. 비즈는 평균 입자지름 5㎛ 이하인 것이 바람직하고, 예를 들면 1㎛∼4㎛ 정도로 한다. 또한, 평균 입자지름은, 예를 들면 전자현미경 관찰 또는 동적 광산란법을 이용하여 측정할 수 있다.

마이크로비즈(2)에의 포착 항체(3)의 수식은 마이크로비즈(2)의 표면에 있는 수식기에 링커를 통해서 포착 항체(3)를 결합시킴으로써 행한다. 예를 들면 아미노기 수식 비즈의 표면에 있는 아미노기에 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 등을 갖는 가교제를 통해서 포착 항체(3)를 공유결합시킨다.

검출 항체(41, 42)에 표식되는 효소(51, 52)는 기질 특이성이 서로 다른 것으로 된다. 여기에서, 「기질 특이성」이란, 효소에 의해 촉매되는 기질의 절단에 있어서, 상기 효소가 상기 기질 이외의 물질의 절단을 촉매하지 않거나 촉매의 정도가 충분히 약한 것을 의미한다. 「기질 특이성이 서로 다른 효소」로서, 예를 들면 효소(51)로서 에스테라아제를 사용할 경우, 효소(52)로는 에스테르 결합을 절단 부위로 하지 않는 효소인 글루코시다아제나 포스파타아제 등을 사용한다.

또한, 효소와 기질의 조합으로서 제한 효소와 핵산쇄를 채용할 경우에는, 기질 특이성이 서로 다른 효소(51, 52)로서 인식서열(절단 부위)이 서로 다른 효소를 사용한다. 제한 효소로서는, 예를 들면 AccI, AluI, ApaI, BamHI, BglII, BssHII, BstEII, ClaI, DdeI, DraI, EcoRI, EcoRV, HaeIII, HincII, HindIII, HpaI, HpaII, KpnI, MluI, NarI, NcoI, NdeI, NheI, NotI, PstI, PvuI, PvuII, RsaI, SacI, SalI, ScaI, SmaI, SpeI, SphI, SspI, StuI, XbaI, XhoI 등을 들 수 있다. 효소(51, 52)로는 이들 중 기질 특이성이 다른 2개의 효소를 임의로 조합시켜서 사용할 수 있다. 이하에서는, 효소(51, 52)로서 제한 효소를 사용하는 예를 주로 설명하고, 효소(51, 52)를 「제한 효소(51, 52)」라고 칭하는 것으로 한다.

검출 항체(41, 42)에 대한 제한 효소(51, 52)의 표식은 가교제(크로스 링커 시약)를 이용하여 검출 항체(41, 42)와 제한 효소(51, 52) 사이에 가교 구조를 형성시킴으로써 행할 수 있다.

다음에, 본 순서에서는 타겟 분자(1)와, 포착 항체(3)가 수식된 마이크로비즈(2)와, 제한 효소(51, 52)가 표식된 검출 항체(41, 42)를 반응시킨다. 반응에 의해, 마이크로비즈(2) 상에 포착 항체(3)와 타겟 분자(1)와 검출 항체(41, 42)로 이루어지는 복합체가 형성된다(도 1(A) 참조). 타겟 분자(1), 마이크로비즈(2) 및 검출 항체(41, 42)의 반응은 1단계로 행해도 2단계로 행해도 좋다. 즉, 타겟 분자(1), 마이크로비즈(2) 및 검출 항체(41, 42)는 동시에 반응시켜도 좋고, 타겟 분자(1)와 마이크로비즈(2)를 반응시킨 후, 포착 항체(3)에 결합하지 않은 타겟 분자(1)를 제거하기 위해서 마이크로비즈(2)를 세정하고 나서, 마이크로비즈(2)와 검출 항체(41, 42)를 반응시켜도 좋다.

타겟 분자(1), 마이크로비즈(2) 및 검출 항체(41, 42)의 반응은 적당한 용액중에서 이들을 접촉시킴으로써 행하면 좋고, 종래 공지의 효소결합 면역흡착 어세이와 같은 조건에서 행할 수 있다. 타겟 분자(1)의 농도가 낮을 경우, 반응 후의 개개의 마이크로비즈(2)는 1분자의 복합체만을 갖거나, 전혀 갖지 않거나 중 어느 하나로 된다.

후술하는 검출 순서에 있어서는, 본 순서로 형성된 복합체를 표면에 갖는 마이크로비즈(2)와 형광 물질이 결합된 기질을 접촉시키고, 검출 항체(41, 42)에 표식된 제한 효소(51, 52)에 의해 상기 기질이 절단되어 발생하는 형광을 검출한다. 이 때, 검출 항체(41, 42)의 마이크로비즈(2)에의 비특이적인 흡착이 발생하면, 비특이적으로 흡착한 검출 항체(41, 42)를 표면에 갖는 마이크로비즈(2)로부터도 기질의 절단에 의한 형광이 발생하게 된다.

여기에서, 「항체가 비특이적으로 흡착하는」이란, 항체가 항원을 포함하는 물질 중 항원이 아닌 부분에 흡착하거나, 항원을 포함하지 않는 물질에 흡착하거나 하는 것을 의미하고, 항원-항체 반응에 의하지 않고 물질에 흡착하는 것을 가리키는 것으로 한다.

도 1(B), (C)은 복합체 형성 순서에서 발생할 수 있는 검출 항체(41, 42)의 마이크로비즈(2)에의 비특이적인 흡착을 나타낸다. 도 1(B)에는 검출 항체(41) 및 검출 항체(42) 중 어느 일방이 마이크로비즈(2)의 표면에 비특이적으로 흡착하고 있는 상태를 나타낸다. 또한, 도 1(C)에는 검출 항체(41) 및 검출 항체(42)의 양방이 마이크로비즈(2)의 표면에 비특이적으로 흡착하고 있는 상태를 나타낸다. 복합체 형성 순서에서는 도 1(A)에 나타내는 목적으로 하는 복합체 형성 이외에도, 도 1(B), (C)에 나타나 있는 바와 같은 검출 항체(41, 42)의 비특이적 흡착이 발생할 수 있다.

도 1(C)에 나타내는 검출 항체(41) 및 검출 항체(42)의 양방의 비특이적 흡착이 발생하는 빈도는 도 1(B)에 나타내는 어느 일방의 항체의 비특이 흡착이 발생하는 빈도에 비해서 충분히 작아서, 타겟 분자(1)의 검출 정밀도에 거의 영향을 주지 않는다. 예를 들면 마이크로비즈(2)의 1%에서 검출 항체(41)의 비특이 흡착이 발생하고, 마찬가지로 마이크로비즈(2)의 1%에서 검출 항체(42)의 비특이 흡착이 발생한다고 가정하면, 검출 항체(41) 및 검출 항체(42)의 양방의 비특이 흡착이 발생하는 빈도는 0.01%에 지나치지 않는다. 후술하는 해석 순서에서는 형광 파장이 다른 2 이상의 형광 검출 신호를 타겟 분자(1)의 검출 신호(시그널)로서 처리함으로써, 도 1(B)에 나타내는 비특이적 흡착에 의해 발생하는 형광 검출 신호에 기인하는 노이즈를 배제한다.

2. 봉입 순서

봉입 순서에서는 기판 상에 형성된 액적에 마이크로비즈(2)를 봉입한다. 본 순서는 본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법을 디지털 ELISA법에 적용했을 경우에 행해지는 순서이며, 본 발명에 관한 검출 방법의 필수적인 순서가 되는 것은 아니다.

본 순서에서는, 해석 순서에 있어서 타겟 분자(1)로부터의 시그널을 0이나 1로 2진화하기 위해서, 마이크로비즈(2)를 1개만 수용가능한 미소 체적의 액적 중에 마이크로비즈(2)를 하나씩 봉입한다. 미소 액적의 형성 및 미소 액적에의 마이크로비즈(2)의 봉입은, 예를 들면 특허문헌 1에 개시된 1분자 디지털 계수 디바이스를 적합하게 사용할 수 있다. 이 1분자 디지털 계수 디바이스에 의하면, 기판 상에 있어서 초고밀도로 미소한 액적을 형성하면서, 동시에 액적 중에 마이크로비즈(2)를 봉입시킬 수 있다. 복합체 형성 순서 후의 마이크로비즈(2)는 타겟 분자(1)에 결합하지 않은 검출 항체(41, 42)를 제거하기 위해서 세정을 행한 후, 적당한 용매에 재현탁하고, 본 순서에 제공해도 좋다.

복합체 형성 순서 후의 마이크로비즈(2)는 복합체를 형성한 마이크로비즈(도 1(A) 참조)와 복합체를 형성하지 않은 마이크로비즈의 혼합물이다. 또한, 복합체를 형성하지 않은 마이크로비즈에는 검출 항체(41, 42)가 비특이적으로 흡착한 마이크로비즈(도 1(B), (C) 참조)가 포함된다.

도 2에 미소 액적에 봉입된 마이크로비즈(2)를 나타낸다. 기판(A) 상에 형성된 액적(D)의 각각에 마이크로비즈(2)가 하나씩 봉입되어 있다. 복합체 형성 순서에 있어서의 반응시, 타겟 분자(1)의 농도가 낮을 경우에는 개개의 마이크로비즈(2)는 1분자의 복합체만을 갖거나, 전혀 갖지 않거나 중 어느 하나로 된다. 도면에서는 표면에 복합체가 형성된 마이크로비즈를 부호 21로, 복합체가 형성되어 있지 않은 마이크로비즈를 부호 22로 나타냈다. 마이크로비즈(21)는 도 1(A)에 나타내는 상태의 비즈이며, 마이크로비즈(22)에는 도 1(B) 또는 도 1(C)에 나타낸 상태의 비즈가 포함된다. 이하, 복합체를 형성한 마이크로비즈(2)를 「마이크로비즈(21)」, 복합체를 형성하지 않은 마이크로비즈(2)를 「마이크로비즈(22)」라고 표기한다.

3. 검출 순서

검출 순서에서는 제한 효소(51, 52)의 인식서열을 갖고, 절단 부위가 되는 상기 인식서열의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 기질(이하 「프로브」라고도 칭함)과, 복합체 형성 순서에 있어서 마이크로비즈(2)의 표면에 형성된 복합체를 반응시켜서, 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출한다.

도 3에 본 순서에 있어서의 프로브와 복합체의 반응을 나타낸다. 반응에는 다른 형광 파장의 형광 물질이 결합된 2 이상의 프로브를 사용한다. 구체적으로는, 도면 중 부호 61로 나타내는 프로브는 검출 항체(41)에 표식된 제한 효소(51)의 절단 부위(71)를 포함하고, 절단 부위(71)를 사이에 두고 일방의 영역에 형광 물질(81)이 결합되고, 타방의 영역에 소색 물질(91)이 결합되어 있다. 또한, 도면 중부호 62로 나타내는 프로브는 검출 항체(42)에 표식된 제한 효소(52)의 절단 부위(72)를 포함하고, 절단 부위(72)를 사이에 두고 일방의 영역에 형광 물질(82)이 결합되고, 타방의 영역에 소색 물질(92)이 결합되어 있다.

제한 효소(51, 52)는 기질 특이성이 다르기 때문에, 절단 부위(71, 72)도 서로 다른 염기서열로 된다. 또한, 프로브(71, 72)의 형광 물질(81, 82)에는 서로 형광 파장이 달라서 광학적으로 구별하여 검출가능한 형광 물질이 사용된다.

여기에서, 효소와 기질의 조합으로서 제한 효소와 핵산쇄의 조합 이외의 것을 채용할 경우에 있어서, 예를 들면 효소(51)로 에스테라아제, 효소(52)로 글루코시다아제를 사용할 경우에는, 프로브(61)로는 검출 항체(41)에 표식된 에스테라아제의 절단 부위(71)(에스테르 결합)를 포함하고, 절단 부위(71)를 사이에 두고 일방의 영역에 형광 물질(81)이 결합되고, 타방의 영역에 소색 물질(91)이 결합된 것을 사용한다. 또한, 프로브(62)로는 검출 항체(42)에 표식된 글루코시다아제의 절단 부위(72)(글리코시드 결합)를 포함하고, 절단 부위(72)를 사이에 두고 일방의 영역에 형광 물질(82)이 결합되고, 타방의 영역에 소색 물질(92)이 결합된 것을 사용한다.

소색 물질(91, 92)은 형광 물질(81, 82)과의 사이에서 에너지 이동이 가능한 일정한 거리 내에 위치하는 상태에서 형광 물질(81, 82)의 발광을 저지한다(퀀칭). 형광 물질(81, 82) 및 소색 물질(91, 92)로는 리얼타임 정량 PCR 등의 핵산의 광학검출 기술에 있어서 범용되고 있는 형광 물질과 퀀처를 사용할 수 있다. 형광 물질과 퀀처의 조합으로서는, 예를 들면 Alexa Fluor(등록상표) 488(Invitrogen사 제품), ATTO 488(ATTO-TEC GmbH사 제품), Alexa Fluor(등록상표) 594(Invitrogen사 제품) 및 ROX(카르복시-X-로다민)로 이루어지는 군에서 선택되는 형광 물질과 BHQ(등록상표, Black hole quencher)-1 또는 BHQ(등록상표)-2의 조합 등을 들 수 있다. 또한, 플루오레세인과 DABCYL의 조합 등을 들 수 있다. 범용되고 있는 형광 물질과 퀀처의 조합을 이하의 표에 나타낸다.

반응은 미소 액적(D)에 봉입된 마이크로비즈(2)에 프로브(61, 62)를 접촉시킴으로써 행한다. 구체적으로는, 예를 들면 복합체 형성 순서 후에 세정을 행한 마이크로비즈(2)를 프로브(61, 62)를 포함하는 용액에 재현탁함으로써 이들을 접촉시킨다. 또한, 반응은 제한 효소(51, 52)의 종류에 따라 적당한 조성의 버퍼를 사용하여 행하는 것이 바람직하고, 봉입 순서에 있어서 이러한 버퍼를 사용하여 미소 액적을 형성해 두는 것이 바람직하다. 또한, 각종 제한 효소에 최적화된 버퍼는 제한 효소와 조합되어 시판되어 있다.

미소 액적(D)에 마이크로비즈(21)가 봉입되어 있을 경우, 복합체를 형성하는 검출 항체(41)에 표식된 제한 효소(51)에 의해 프로브(61)의 절단 부위(71)가 절단된다. 절단 부위(71)가 절단되면, 프로브(61)가 단편(61a)와 단편(61b)으로 절단되고, 형광 물질(81)이 소색 물질(91)로부터 해리되어 발광가능한 상태가 된다. 마찬가지로, 복합체를 형성하는 검출 항체(42)에 표식된 제한 효소(52)에 의해 프로브(62)의 절단 부위(72)가 절단되면, 형광 물질(82)도 소색 물질(92)로부터 해리되어 발광가능한 상태가 된다.

형광의 검출은 마이크로비즈(2)가 봉입된 각 미소 액적으로부터의 형광을 형광 현미경, 이미지 센서 등을 이용하여 검출함으로써 행한다.

또한, 본 순서에 있어서는, 각 미소 액적에 마이크로비즈(2)가 수용되어 있는지의 여부도 검출하는 것이 바람직하다. 상기 검출은, 예를 들면 현미경 하에 있어서 마이크로비즈(2)의 유무를 관찰함으로써 행할 수 있고, 마이크로비즈(2)에 의한 산란광을 검출하는 방법, 전계 효과 트랜지스터(FET)에 의한 전위 계측을 이용하는 방법 등에 의해서도 행할 수 있다.

4. 해석 순서

해석 순서에서는, 형광 파장이 다른 2 이상의 형광 검출 신호를 타겟 분자(1)의 검출 신호로서 처리하고, 타겟 분자(1)의 검출 신호를 생성하는 미소 액적(D)의 수를 타겟 분자의 수로서 카운트한다.

복합체 형성 순서에 있어서의 반응시, 타겟 분자(1)의 농도가 낮을 경우에는 개개의 미소 액적(D)에 봉입된 마이크로비즈(2)는 1분자의 복합체만을 갖는 마이크로비즈(21)이거나 전혀 갖지 않는 마이크로비즈(22)이거나 중 어느 하나이므로, 타겟 분자(1)의 검출 신호를 생성하는 미소 액적(D)의 수는 타겟 분자(1)의 수라고 간주할 수 있다. 또한, 마이크로비즈(21) 및 마이크로비즈(22)가 봉입된 미소 액적(D)의 수와 마이크로비즈(21)가 봉입된 미소 액적(D)의 수를 이용하여, 마이크로비즈(2)의 전체 수 중 타겟 분자(1)를 포착한 수의 비율을 산출할 수 있다. 이것에 의해, 타겟 분자의 농도를 정량화하는 것이 가능해진다.

상술한 바와 같이, 미소 액적(D)에 마이크로비즈(21)가 봉입되어 있으면, 형광 물질(81)로부터의 형광과, 상기 형광과 파장이 다른 형광 물질(92)로부터의 형광이 검출된다. 도 1(B)에 나타나 있는 바와 같은 검출 항체(41) 또는 검출 항체(42)가 마이크로비즈(2)의 표면에 비특이적으로 흡착하고 있을 뿐이어서, 복합체를 형성하고 있지 않은 마이크로비즈(22)로부터는 형광 물질(81) 및 형광 물질(92) 중 어느 하나로부터의 형광밖에 검출되지 않는다. 따라서, 형광 물질(81) 및 형광 물질(92)의 양방의 형광 검출 신호를 타겟 분자(1)의 검출 신호로서 처리함으로써, 복합체를 형성하지 않은 마이크로비즈(22)로부터 발생하는 형광 검출 신호에 기인하는 노이즈를 대폭 저감할 수 있다. 이것에 의해, 타겟 분자(1)의 검출 신호의 2진수를 고정밀도로 행할 수 있어서, 타겟 분자(1)의 정량성을 향상시키는 것이 가능해진다.

또한, 도 1(C) 에 나타나 있는 바와 같은 검출 항체(41) 및 검출 항체(42)의 양방이 마이크로비즈(2)의 표면에 비특이적으로 흡착하고 있을 경우에도, 형광 물질(81) 및 형광 물질(92)의 양방의 형광이 발생할 수 있지만, 이미 설명한 바와 같이, 검출 항체(41) 및 검출 항체(42)의 양방의 비특이 흡착이 발생하는 빈도는 충분히 작기 때문에, 이 형광은 타겟 분자(1)의 정량성에는 거의 영향을 주지 않는다.

본 실시형태에서 사용되는 마이크로비즈(2)와 검출 항체(41, 42)(도 1 참조), 및 프로브(71, 72)(도 3 참조)는 본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법을 실시하기 위한 키트로서 적합하게 실시될 수 있다. 즉, 본 발명은 일측면에 있어서,

(i) 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,

(ii) 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체와,

(iii) 상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질을 포함해서 이루어지는 효소결합 면역흡착 어세이(ELISA) 키트도 제공하는 것이다.

상기 키트에 있어서, 마이크로비즈(2)는 포착 항체(3)(제 1 항체)가 미리 수식된 것이어도 좋고, 사용 시에 비즈의 표면에 있는 수식기에 링커를 통해서 항체를 결합시키는 것이어도 좋다. 또한, 검출 항체(41, 42)(제 2 항체)는 효소가 미리 표식된 것이어도 좋고, 사용 시에 가교제를 이용하여 항체에 효소를 결합시키는 것 이어도 좋다.

또한, 본 발명에 관한 키트는 마이크로비즈(2)에의 포착 항체(3)의 수식 또는 검출 항체(41, 42)에의 효소의 표식을 위해서 사용되는 가교제 등의 시약이나, 복합체 형성 순서 및 검출 순서에서 사용되는 각종 버퍼, 봉입 순서에서 사용하는 기판(A)(도 2 참조) 등을 더 포함하고 있어도 좋다.

상기에서는 검출 항체를 2개, 이것에 대응하는 프로브를 2개 사용하고, 형광 파장이 다른 2개의 형광 검출 신호를 타겟 분자의 검출 신호로 함으로써, 검출 항체의 비특이적 흡착으로부터 유래하는 노이즈를 저감하는 실시형태를 설명했다. 본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법에 있어서, 검출 항체 및 프로브는 3조 이상 을 이용해도 좋고, 이 경우에는 형광 파장이 다른 3개 이상의 형광 검출 신호를 타겟 분자의 검출 신호로 하면 좋다. 사용하는 검출 항체 및 프로브의 수가 많을수록 검출 항체의 비특이적 흡착으로부터 유래하는 노이즈의 저감 효과를 높일 수 있다.

또한, 상기에서는 제 2 항체로서 기질 절단 활성을 갖는 효소를 표식한 검출 항체를 이용하여 프로브 중의 절단 부위를 상기 효소에 의해 절단시킴으로써 형광을 발생시키는 실시형태를 설명했다. 본 발명에 관한 타겟 분자의 검출 방법에서는 제 2 항체로서 종래 화학 발색에 사용되어 온 효소가 표식된 검출 항체나 형광 색소가 표식된 검출 항체를 적용하는 것도 가능하다.

즉, 본 발명은 그 제 2 실시형태로서 이하의 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법도 포함한다.

(A) 타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와, 상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 서로 다른 표식이 된 2 이상의 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서.

(B) 상기 표식으로부터의 신호를 검출하는 검출 순서.

(C) 다른 2 이상의 상기 표식으로부터의 상기 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서.

여기에서, 순서(C)에 있어서, 「표식으로부터의 신호」에는 상기 표식으로부터 직접 및 간접으로 발생하는 신호가 포함된다. 구체적으로는, 「표식으로부터의 신호」는 형광 색소가 표식된 검출 항체를 제 2 항체로서 적용할 경우에는 상기 형광 색소로부터 발생하는 형광을 가리킨다(도 4(B) 참조). 또한, 「표식으로부터의 신호」는 화학 발색에 사용되는 효소가 표식된 검출 항체를 제 2 항체로서 적용할 경우에는 상기 효소에 의한 촉매되는 화학 발색을 가리킨다(도 4(A) 참조).

순서(A)는 제 2 항체로서 알칼리 포스파타아제나 갈락토시다아제 등의 종래 화학 발색에 사용되어 온 효소나, 각종 형광 물질이 표식된 검출 항체를 사용하는 것 이외에는, 상술한 실시형태(제 1 실시형태)의 순서(1)와 같은 방법으로 행할 수 있다. 또한, 본 실시형태를 디지털 ELISA법으로 해서 실시할 경우에는, 제 1 실시형태에서 순서(2)로서 설명한 봉입 순서가 포함될 수 있다. 검출 항체에의 효소 또는 형광 색소의 표식은 상술한 공지 수법에 의해 행할 수 있다. 또한, 효소나 형광색소를 표식한 항체는 각종의 시판되어 있는 것을 이용해도 좋다.

순서(B)에서는 담체의 표면에서 복합체를 형성하고 있는 검출 항체의 표식으로부터의 신호를 검출한다. 도 4(A)에 검출 항체(41, 42)로서 알칼리 포스파타아제를 표식한 항체와 갈락토시다아제를 표식한 항체를 사용한 경우에 있어서, 마이크로비즈(2) 상에 형성된 「포착 항체(3)-타겟 물질(1)-제 2 항체(41, 42)」의 복합체를 나타낸다. 효소가 표식된 검출 항체를 사용할 경우, 신호의 검출은 상기 효소의 기질을 사용한 발색법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면 알칼리 포스파타아제가 표식된 검출 항체의 경우에는, 제 1 실시형태에서 사용한 프로브로 변경하여 알칼리 포스파타아제의 발색 기질인 BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)나 NBT(4-Nitro blue tetrazolium chloride)를 복합체와 반응시킴으로써 행할 수 있다. 또한, 갈락토시다아제가 표식된 검출 항체의 경우에는, 발색 기질로서 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-갈락토피라노시드) 등을 사용한다. 검출 항체로는 서로 다른 효소가 표식된 2 이상의 항체가 사용되고, 발색 기질로는 각 항체에 표식된 효소에 따라 2 이상의 화합물이 사용된다. 각 발색 기질의 발색을 흡광도 계측에 의해 측정함으로써 각각의 효소로부터 유래하는 신호를 검출할 수 있다.

또한, 형광 물질이 표식된 검출 항체를 사용할 경우, 신호의 검출은 형광 현미경이나 이미지 센서를 이용하여 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출함으로써 행한다. 도 4(B)에 검출 항체(41, 42)로서 FITC를 표식한 항체와 Texas Red(등록상표)를 표식한 항체를 사용한 경우에 있어서, 마이크로비즈(2) 상에 형성된 「포착 항체(3)-타겟 물질(1)-제 2 항체(41, 42)」의 복합체를 나타낸다. 검출 항체로는 서로 형광 파장이 다른 형광 물질이 표식된 2 이상의 항체가 사용되고, 형광 물질로부터의 형광을 파장 대역마다 검출함으로써 각각의 형광 물질로부터 유래하는 신호를 검출할 수 있다.

순서(C)에서는 다른 2 이상의 표식(상술한 예에서는 알칼리 포스파타아제와 갈락토시다아제, 또는 FITC와 Texas Red)으로부터의 신호를 타겟 분자의 검출 신호로서 처리한다. 상술한 바와 같이, 검출 항체가 담체의 표면에 비특이적으로 흡착하고 있을 뿐이어서, 복합체를 형성하고 있지 않은 경우에는 2 이상의 표식 중 어느 하나의 표식으로부터의 신호밖에 검출되지 않는다(도 1 참조). 따라서, 다른 2 이상의 표식으로부터의 신호를 타겟 분자의 검출 신호로서 처리함으로써, 검출 항체의 담체에의 비특이적으로 흡착에 기인하는 노이즈를 대폭 저감할 수 있다. 이것에 의해, 타겟 분자의 검출 정밀도, 더욱이는 그 정량성을 향상시키는 것이 가능하다.

1: 타겟 분자 2: 마이크로비즈(담체)
3: 포착 항체(제 1 항체) 41, 42: 검출 항체(제 2 항체)
51, 52: 제한 효소 61, 62: 프로브
71, 72: 절단 부위 81, 82: 형광 물질
91, 92: 소색 물질

Claims (7)

1. 타겟 분자와,
   상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,
   상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서와,
   상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질과,
   상기 복합체를 반응시켜서, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 검출하는 검출 순서와,
   형광 파장이 다른 2 이상의 형광 검출 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 복합체 형성 순서와 상기 검출 순서 사이에, 기판 상에 형성된 액적의 각각에 상기 담체를 하나씩 봉입하는 봉입 순서를 포함하는 검출 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 담체가 마이크로비즈인 검출 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 제 1 항체와 상기 제 2 항체가 상기 타겟 분자의 다른 에피토프에 결합하는 검출 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   디지털 ELISA법인 검출 방법.
6. 타겟 분자와,
   상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,
   상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 서로 다른 표식이 된 2 이상의 제 2 항체를 반응시켜서, 상기 담체 상에 상기 제 1 항체와 상기 타겟 분자와 상기 제 2 항체로 이루어지는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 순서와,
   상기 표식으로부터의 신호를 검출하는 검출 순서와,
   다른 2 이상의 상기 표식으로부터의 상기 신호를 상기 타겟 분자의 검출 신호로서 처리하는 해석 순서를 포함하는 타겟 분자의 검출 방법.
7. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 수식된 담체와,
   상기 타겟 분자에 특이적으로 결합하고, 기질 절단 활성을 갖는 효소가 표식된 2 이상의 항체로서, 상기 효소의 기질 특이성이 서로 다른 제 2 항체와, 상기 효소의 절단 부위를 갖고, 상기 절단 부위의 일단측에 형광 물질이 결합되고 타단측에 소색 물질이 결합된 2 이상의 기질로서, 상기 형광 물질의 형광 파장이 서로 다른 기질을 포함해서 이루어지는 효소결합 면역흡착 어세이 키트.

Images