CN103959064B - 一种测定样品中抗原含量的方法 - Google Patents

一种测定样品中抗原含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测定样品中抗原含量的方法，包括以下步骤:将抗原转移到固相上，用针对抗原的检测抗体在固相上形成免疫复合物，用竞争分子同抗原竞争检测抗体来打破免疫复合物，从中解放检测抗体，收集检测抗体，测量检测抗体来确定样品中抗原的含量。

Description

一种测定样品中抗原含量的方法
本专利要求基于美国临时专利申请，61/583,624，申请日期：2012年1月6号；美国专利申请13/459192，现为美国专利ＵＳ8293487，申请日期，2012年4月29号；美国专利继续申请，13/656715，申请日期，2012年10月21号，以及国际专利申请ＰＣＴ/ＵＳ2013/020138，出版号码，ＷＯ2013/103712的申请优先权。
技术领域
本发明涉及对包括化合物、多肽、蛋白质、RNA、DNA、细胞(在原位释放的蛋白质)、或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)等抗原的免疫检测处理。更重要的是，本发明包括，但不局限于免疫印迹分析、斑点印迹分析以及酶联免疫吸附测定法等免疫检测方法，提供了相应的创新，使之更简单，可定量测量，从而达到其在多孔板格式的应用的目的，以及实现蛋白质分析的自动化。
背景技术
蛋白质分析是现代生物学研究的重要基础。这项技术基于抗原-抗体相互作用的原理，来测量目标抗原在各种医疗或实验条件下的表达水平。抗原指当进入人体时，能够触发免疫系统产生特异抗体的外来分子。抗体由于其针对特定抗原的高特异性，成为临床、制药和生物医学研究中一个有力的工具。抗原包括，但不限于，一种化合物、多肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、细胞(在原位释放的蛋白质)或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)。完整或部分抗原分子，可被引入到包括驴、山羊、兔子等宿主动物体内，产生大量针对目标抗原的抗体。此外，导入的抗原或抗原的一部分，可能具有一个或几个抗原决定簇，因此，由于抗原决定簇数目的不同，宿主体内可能产生一个或多个针对目标抗原的特异性抗体。
一个典型的免疫检测过程可以分为三个主要步骤，其中包括：(i)，点样，将含有目标抗原的样品首先转移到膜上，如硝酸纤维素膜，PVDF膜或像具有结合蛋白质能力的多孔板一类的固相载体；(ⅱ)，阻塞/处理/洗涤步骤。这一过程又包括多个子步骤。首先，(a)点样后的膜被封闭缓冲液处理来避免抗体非特异性结合到膜上，然后在(b)中，膜和含有抗体的封闭缓冲液一起培育，从而在膜上形成抗原抗体复合物。而没有机会和目标抗原结合的抗体在这一过程中被洗掉。在这一步骤中，使用的抗体有的被标记酶直接标记，有的通过被标记酶标记的第二抗体间接标记。(iii)样品的检测，通过在膜上与抗体耦合的标记酶的酶促反应，与膜结合的免疫复合物的数量或者质量及其他相关信息得到检验。在斑点印迹分析和免疫印迹分析中，免疫检测分析的最终结果可以进一步通过光密度分析的方法间接进行量化处理。
在这个广义的检测过程中，每个步骤在实践中都可能有所变化。例如，在步骤(i)中，点样的方法有多种。这些方法包括斑点印迹分析中的直接点样，免疫印迹分析中样品通过凝胶转移，和酶联免疫吸附法中样品涂层的方法。在步骤(ii)，各种处理方法和不同成分的缓冲阻塞液在实践中被采用以达到最大限度地保存结合在膜上的免疫复合物的目的，并同时清除掉直接结合在膜上的抗体。在大多数情况下，标记酶并不被直接用来标记第一抗体。被标记酶标记的第二抗体通过与在膜表面上与目标抗原结合的第一抗体产生抗原抗体反应来间接标记第一抗体。在步骤(iii)中，除了标记酶标记，其他方法也被用于标记抗体，从而导致了不同的检测方法。例如，产生出深浅不同的颜色变化通过目视加以比较；或者产生化学发光信号，通过发光读数仪或X射线胶片进行检测。在检测过程中抗体也可以通过荧光加以标记，而形成的产物在特定的波长通过多孔板读数仪进行定量化分析。
当然，这个对广义的免疫检测过程的描述仅仅是被用来说明常规免疫检测分析的基本原理。它不可能涵盖了在这一过程中各种不同的方式方法。因而有所遗漏则在所难免。但是这些没有被包括进去的方式方法在原理上同这个广义的免疫检测过程是一致的。
斑点印迹分析则是上述免疫检测过程的一个典型应用。这种方法因为直接在膜上点样形成一个斑点而得名。这种方法虽然简单、快速，但由于缺乏特异性，导致其在生物医学，临床和制药研究中的应用受到了限制。在多数的情况下，用于免疫检测反应的抗体由于种种原因而与多个抗原产生抗原抗体反应。因此，在斑点免疫分析中的标记酶的酶促反应难以可靠地反映目标抗原在待测样品中的含量。正因为这个原因，无论是免疫印迹分析还是酶联免疫吸附法都由于其提高的特异性而在蛋白质分析中得到广泛应用。
在免疫印迹分析中，含有目标抗原的样品首先基于其分子量通过凝胶电泳加以分离。分离后的蛋白质通过电印迹转移的方式转移到硝酸纤维素膜或者PVDF膜。然后待测样品中的目标抗原的含量经过一个典型的免疫检测过程，通过典型的标记酶酶促反应在膜上得以显示，并通过光密度分析的方法间接进行数字化测量。在此过程中，免疫检测的特异性是通过抗原-抗体相互作用，以及预期的分子量得以保证，并避免了在斑点免疫分析中常见的虚假信号的干扰。然而，在斑点印迹分析和免疫印迹分析中，目标抗原的相对含量只能通过光密度分析的方法间接的进行定量化测量。此外，在免疫印迹分析中，过分复杂的步骤也导致其难以在临床、制药和实验研究中得到大规模的应用。
另一方面，酶联免疫吸附法成功地避免了斑点印迹分析和免疫印迹分析中的缺陷，提供了快速、简单、可定量化测量的多孔板格式的检测方法。酶联免疫吸附法的特异性通过选择专一与抗原反应的抗体来得以实现。高特异性的抗体也保证了这种方法可以以多孔板格式直接测量待测样品中的目标抗原的含量。这些优势保证了酶联免疫吸附法技术在生物医学和临床研究的广泛使用。然而，成功的酶联免疫吸附法对抗体的特异性要求很高，只有那些同目标抗原起专一反应的抗体才可以应用在这种检测方法中。这种原因导致了开发酶联免疫吸附法的成本很高，限制了其在生物医学研究领域的进一步应用。此外，酶联免疫吸附平板有限的蛋白质吸附能力也限制它在生物医学研究领域的使用。
发明内容
本发明公开的方法，可以快速、准确、定量的测量样品中的目标抗原的含量。所公开的方法免却了免疫印迹分析中的电泳步骤。同斑点免疫分析方法比较，本发明通过在免疫分析过程中包括了一步洗脱步骤，极大的提高了这种检测方法的特异性。新增加的这一步骤导致了在膜上的(即固定的)抗原-抗体免疫复合物致身于过量的竞争分子的包围之中。这些竞争分子包括分子内含有一个或多个拷贝的抗原(或抗原的一部分)的分子。其中，用于检测的抗体可以直接或间接被标记酶所标记。此外，竞争性分子存在于洗脱溶液中。竞争分子同与固定的抗原相结合的检测抗体之间的竞争，导致了抗体从结合在膜上的免疫复合物中释放出来，游离至洗脱液中。从膜上洗脱出来的抗体中的标记酶可以被定量测量。测量的结果可以用来反映待测样品中的目标抗原的含量。一方面，待测样品中的目标抗原的量与从固相中释放的检测抗体的量成正比。另一方面，该抗体也可以不预先标记，而在洗脱后，测量前进行标记。
在具体应用中，附加的洗脱步骤可提高检测的特异性，因为只有同目标抗原相结合的抗体才可以被竞争分子从膜上的免疫复合物中洗脱出来。与斑点印迹分析和免疫印迹分析相比，此处公开的方法可以直接定量地在溶液中测量免疫分析的结果并以多孔板的形式进行。这一特点在临床、制药、生物医学研究和诊断应用中都很受欢迎。此外，与酶联免疫吸附法相比，本发明大大降低了开发的成本，从而增加了其在临床、制药和生物医学研究和诊断中的应用。更重要的是，它为蛋白质阵列分析和蛋白质分析过程的自动化在临床，制药和生物医学研究和诊断中的应用提供了基础。这个公开的方法也可用于对蛋白质含量的自动测定。
在具体应用中，多单元板可以是多孔板。
在具体应用中，本专利公开了一项新的免疫检测过程。这个过程以斑点印迹分析和免疫印迹分析为基础，用来克服现有的免疫分析技术的缺陷。这项技术具有简单、快速、可定量化、特异性高的显著优势，适用于在临床、制药、科学研究和诊断中的大规模应用。
在具体应用中，公开的过程可包括以下步骤：抗原与固相相结合；在固相上通过用对抗原特异识别的抗体对抗原进行处理以形成抗原-抗体免疫复合物；运用竞争分子通过与抗原竞争检测抗体，从而破坏免疫复合物，将检测抗体从免疫复合物中解放出来；测量解放出来的检测抗体来测定待测样品中的抗原含量。该方法还可包括收集经洗脱解放的检测抗体。这个过程被命名为“Zestern”分析。
一方面，抗原可以通过将待测样品或部分待测样品转移到固相上，从而将抗原固定到固相上。另一方面，在形成免疫复合物后，在检测抗体被解放前，未同固定的抗原相结合的抗体可以通过清洗的步骤从固相上清除。
在具体应用中，竞争分子可以是一种多肽。在另一种具体应用中，竞争分子可以是包含有针对检测抗体的抗原决定簇的多肽。在另一种具体应用中，竞争分子可以是包含所有抗原决定簇的一种多肽，从而可以同固定的抗原有效的竞争检测抗体。在另一种具体应用中，该多肽可能含有抗原抗体相互作用的区域。在另一种具体应用中，竞争分子可含有多拷贝的抗原抗体相互作用的区域。在另一种具体应用中，多肽和检测抗体之间的亲和力大于待测抗原和抗体之间的亲合力，从而使该多肽可以有效地同固定的抗原竞争检测抗体。在另一种具体应用中，该多肽的数量至少两倍，三倍或多倍于固定抗原的摩尔量。
在另一种具体应用中，一种测量样品中多个抗原的含量的方法，其可以包括以下步骤：从待测样品中取出多个子样品，将每个子样本放置到单独的固相上，按照上述方法对每一个子样品进行“Zestern”分析。另一种替代方法则包括以下步骤：将多个抗原结合到固相上；用对应于每个待测抗原的多个检测抗体处理固相，在固相上形成多个抗原抗体复合物；用对应于一种抗原的竞争分子同该抗原竞争检测抗体，以破坏该抗原同检测抗体形成的免疫复合物，将结合在该抗原上的检测抗体洗脱出来；收集解放的检测抗体，测量检测抗体的含量以确定该抗原在检测样品中的含量。用对应于不同抗原的竞争分子一次或多次重复洗脱和收集的步骤。
在另一种具体应用中，一种测量样品中多个抗原的含量的方法，其可以包括以下步骤：从样品采取多个子样本，将每个子样本添加到单独的固相上，用多种检测抗体处理固相以形成多个抗原抗体免疫复合物，其中检测抗体所对应的待测抗原可能存在，也可能不存在于待测样品中；用一种竞争分子处理一个固相，来破坏同该分子相对应的待测抗原同检测抗体形成的免疫复合物，解放同该抗原结合的检测抗体。收集释放出的检测抗体，用另一种对应于不同的待测抗原的竞争分子处理另一个固相，来破坏该待测抗原同检测抗体形成的免疫复合物。分别收集来自不同固相的检测抗体来测定不同抗原在待测样品中的含量。
检测抗体在处理固相前可以被标记。或者，检测抗体可以未被标记，而在洗脱后，测量前才被标记。检测抗体可以直接被标记，也可以通过第二抗体间接标记。标记检测抗体的方法可包括，但不限于同位素标记、红外标记、荧光标记或标记酶标记。
在另一种具体应用中，检测抗体可以被一种荧光分子所标记，而竞争分子被另一种荧光分子所标记。两种荧光分子的发射波长和激发波长可以选择，这样，当检测抗体和竞争分子经洗脱步骤形成免疫复合物时，当一种荧光分子或另一种荧光分子被激活时，可以导致荧光共振能量转移的(FRET)发生。比如说，第一种荧光标记的发射波长可能与第二种荧光的激发波长相近，这样，当第一种荧光标记被激发时，从第一种荧光标记激发的发射波长又激发了第二种荧光标记。这样，当两种荧光标记之间的距离很近时，荧光共振能量转移就可以发生。当然，第二种荧光标记的发射波长也可以与第一种荧光标记的激发波长相近。比如说，两种荧光标记可以包括，但不限于Alexa488与Alexa555，FITC(520nm)与TRITC(550nm)，以及Cy3(566nm)与Cy5(649nm)。只有当两种荧光标记之间的距离足够接近，比如共存于同一个免疫复合物时，荧光共振能量转移才可以发生。这一特点提高了反应的特异性，因为只有来自与竞争分子相结合的，被解放的检测抗体的信号才得到测量并被用于计算样品中待测抗原的含量。
在另一种具体应用中，竞争分子和洗脱液中的检测抗体之间的复合物的检测可以通过放大发光邻近均质检测的方法(ALPHA测定)来实现。检测抗体和竞争分子用不同的荧光信号或者化学发光信号来标记。只有当两种分子之间的距离足够接近时才会产生强烈信号，从而避免了非特异的信号的干扰。
在另一种具体应用中，公开的方法包括以下步骤：将竞争分子结合到固相上，用针对竞争分子的特异抗体处理固相以形成免疫复合物，用可能含有目的抗原的样品或者部分样品处理固相，通过样品中的抗原同竞争分子竞争以打破免疫复合物，从而释放标记抗体，通过测量释放的检测抗体的数量来确定样品中抗原的含量。该过程也可以命名为反向Zestern。一方面，反向Zestern中样品中目的抗原的含量同固相上释放的检测抗体的数量成比例，另一方面，样品中目的抗原同检测抗体的亲和力等于或者大于固相上的竞争分子同检测抗体的亲和力，从而允许样品中的抗原将固相上的检测抗体洗脱出来。此外，样品中的抗原可以有效的同固相上的竞争分子竞争来显示目的抗原在样品中是否存在。
附图说明
图1为广义上的常规的免疫检测过程的流程图；其中100：免疫检测过程；101：含有待测抗原的样品；102：膜；103：检测抗体；104：标记方法；
图2为广义上的“Zestern”分析，改进的免疫检测过程的流程图；其中200：免疫检测过程；201：含有待测抗原的样品；202：膜；203：检测抗体；204：标记方法；205：竞争分子。
具体实施方式
在本公开中，除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本专利所属领域的科技人员的理解并无不同。本文提及的所有出版物和专利被引入作为参考。
本发明提供了一种可用于检验和定量测量样品中的抗原或抗体的方法。本发明改进了传统的免疫印迹分析技术(Burnette，WN，1981)，斑点印迹分析技术(Hawkes，R等，1982)，和免疫酶联吸附技术(Engvall等，1971a，1971b，1972年)，提供了一种简单、快速、特异性高、可定量化的对样品中的待测抗原的免疫分析测定的方法。公开的方法也提供了在临床，制药和生物医学研究中大规模的测定待测抗原的含量的方法。
常规免疫检测分析，如在图1所示，可概括为三部分。本领域的技术人员知道如何准备样品用于免疫检测分析100(公知常识)。101可以包含，但不限于，一种化合物，一种多肽分子，一种蛋白质分子，一种RNA分子，一种DNA分子，一种传统的含有两条重链和两条轻链的抗体，一种重组抗体或其片段，一种细菌细胞，一种病毒颗粒，一种细胞，一种颗粒，或一种包括由上述的任何两种或多种分子通过交联产生的分子。
本领域的技术人员知道如何向膜102转移样品101。这些方法可以包括，但不限于，在斑点印迹分析中直接点样，在免疫印迹分析中的凝胶电泳和印迹转移，以及在免疫酶联吸附反应中对多孔板的涂层。
在本领域中的技术人员知道如何对膜102进行阻塞处理。这些方法包括，但并不限于，用含有5％无脂乳，或2％BSA的PBS或TBS缓冲液中添加0.1％Tween-20的阻塞缓冲液处理膜。阻塞缓冲液的组分和浓度存在一定的变化。
在本领域中的技术人员知道如何用抗体103对样品进行处理。虽然常规方法包括用第一抗体进行处理，清洗并用第二抗体对膜进行处理等步骤，这些步骤在实践中也存在一些已知的变化，而这些变化与本发明在广义上的概念并无本质的不同。
在本领域中的技术人员知道如何检测常规免疫检测过程100的结果。有多种标记方法或者通过直接对第一抗体进行标记104，或者通过第二抗体间接进行标记104来显示在免疫分析过程中结合在膜上的免疫复合物的数量。比如说，对抗体用标记酶进行标记，用放射性元素进行标记，或用荧光分子进行标记。而检测的方法也包括通过颜色反应直接观察，或者当抗体被放射性物质标记时，用X射线胶片进行检测。虽然标记的方法千变万化，但这些变化与本发明在广义上的概念并无本质的不同。
如图2所示，本发明在常规的免疫检测分析过程中增加了一个洗脱步骤。该步骤在阻塞、处理、清洗步骤之后，检测步骤之前。通过阻塞、处理、清洗步骤后形成的免疫复合物201/203暴露在含有单拷贝或多拷贝的竞争分子205的洗脱液中。标记酶标记的抗体203同竞争分子205结合，从抗原抗体免疫复合物201/203中被置换出来，从膜上被释放到洗脱液中。在检测步骤中，标记酶反应发生在洗脱液中，而不是膜的表面上。从而可以直接测量标记酶的酶促反应结果。
通过在常规免疫检测过程中增加洗脱步骤，本发明同斑点印迹分析比较，提高了反应的特异性，并得到量化的检测结果。此外，本发明保留了斑点印迹分析的快速，简单的优点，使其得以应用于大规模分析中去，并可以以多孔板的方式进行。
此外，本发明同常规免疫检测过程相比，有一个附加的优点。在常规免疫检测分析中，检测信号显示在“现场”，换句话说，被检测到的免疫复合物，通过与固定在膜上的待测抗原的紧密结合，保留在膜的表面。而在本发明中，与常规免疫检测分析不同的是，标记的抗体被从保留在膜上的免疫复合物中解放出来，释放到洗脱液中去，从而避免了在检测过程中可能由膜引起的物理限制。例如，在斑点印迹分析和免疫印迹分析中一个常见的做法是用辣根过氧化物酶来标记检测抗体。辣根过氧化物酶在膜的“现场”将ECL底物转换成化学发光信号。化学发光信号的强度在对化学发光敏感的胶片的帮助下显示出来，并间接地通过光密度分析的方法进行定量化处理。整个过程由于内在的原因，繁琐而且不准确。在本发明中，这一过程不再需要胶片和光密度计的帮助来对分析结果进行定量化处理，相反，这一过程可以在洗脱液中用酶标仪对解放出来的辣根过氧化物酶标记检测抗体直接测定。这个特定的例子仅仅用于说明本发明的优点，需要理解的是，本发明的优点并不仅限于此。
此外，本发明同免疫酶联吸附测定方法相比，保留了免疫酶联吸附测定分析方法的优点，提高了对含有抗原的样品的结合能力，并降低了对抗体的特异性的要求。在洗脱液中运用过量的竞争分子保证了只有那些同待测抗原相结合的检测抗体才能被从膜上释放出来，避免了在当前生物学研究中常见的非特异性的反应造成的干扰。相应的，适于在多单元板上进行免疫检测的抗体的数目也显著提高。
在本公开说明中，固相可以指膜、载玻片、平板、多单元板或多个珠状物。多单元板的一种实例为多孔板。在本发明中使用的“膜”的定义涵盖了最广泛的范围。这里的膜指的是任何具有足够表面孔隙以允许检测抗体通过，和足够的表面亲和力以结合抗原的材料。所有这些材料可以以恰当的形状，如膜、片、或平板状加以使用。或者，他们也可以涂抹，或粘合，或层压到适当的载体上，如纸张、玻璃、塑料或织物。例如，膜可以指的是，但不限于硝酸纤维素膜、PVDF膜、或用于酶联免疫吸附试验的多孔板。
这里的“标记酶”的定义也覆盖最广泛的范围。标记酶可以指任何在免疫检测分析中对抗体的修饰以达到对抗体的检测的目的。例如，标记酶可以指，但不限于，抗体被放射性同位素，如碘离子125直接标记，或者被碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶加以标记。对被标记的抗体的标记酶数量的检测是通过形成可检测的产物得以完成。该产物可以具有放射性、或产生发光、或产生荧光；或产生在可见光或者可见光之外具有特征的吸收或反射光谱的产物。当补体被用于检测相互结合的抗原-抗体复合物时，它或者可被上述方式中的任一种加以标记，或通过特定的抗补体的抗体来加以检测。
本文所用的“抗原”和“抗体”的定义也涵盖最广泛的范围。“抗原”可以指一种化合物、细胞、病毒或一种粒子。科学术语“抗原”可以指一种化合物、肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、细胞(在原位释放的蛋白质)、或病毒颗粒(在原地释放的蛋白)、或任何可导致在宿主动物，包括人类，产生一种或多种抗体的分子。抗原也可以指由上述的分子或基团中的任何两种或多种交联在一起的产物。抗原可以单独存在，也可以存在于混合物中。抗原可以以未修饰的形式存在，也可以以修饰后的形式存在(例如，被化学分子修饰)。
本文的“抗体”的定义也涵盖最广泛的范围。“抗体”是同“抗原”结合的多肽。抗体包括，但不限于，传统的抗体，含有抗原结合位点的传统抗体的一部分，含有抗原结合位点的重组抗体，同抗原结合的蛋白质，或者由上述情况中的任何两种或多种形式交联在一起的产物。抗体可以在纯的形式存在，或存在于混合物中。抗体可以以未修饰的形式存在，也可以以修饰后的形式存在(例如，被化学分子修饰)。
本文中的“洗脱步骤”的定义也涵盖最广泛的范围。“洗脱”是用竞争分子，或者任何具有与待测抗原相同的与抗体作用的一个或多个结合位点的分子，从结合在膜上的免疫复合物中，将直接被标记酶标记的，或者间接通过被标记酶标记的第二抗体来标记的第一抗体，解放出来。这一过程还包括，但不限于，用那些同抗原并不共享相同的与抗体的结合位点，但可以破坏与膜结合的免疫复合物，同时保持免疫检测过程的特异性的分子，将抗体从膜上解放出来。竞争分子可以以单拷贝形式存在，也可以在单个分子中以多拷贝的形式存在。
本文中的“竞争分子”的定义也涵盖最广泛的范围。一个“竞争性分子”指一种化合物、多肽、蛋白质、RNA、DNA、细胞(原位释放的蛋白)、或病毒颗粒(原位释放的蛋白)或任何可用于通过竞争破坏抗原与检测抗体分子之间形成的免疫复合物的分子。竞争分子也可以是由上述的任何两种或多种分子或基团交联在一起的分子。竞争分子可以单独存在，也可以存在于混合物中。竞争分子抗体可以以未修饰的形式存在，也可以以修饰后的形式存在(例如，被化学分子修饰)。竞争性分子可以是完整的抗原分子，或者是抗原的一部分，如果这部分的分子同抗原-抗体免疫复合物中的待测抗原存在已知的竞争关系。在针对某个抗体的抗原决定基已知的情况下，竞争分子可以是含有单个或多个拷贝的抗原决定簇的多肽。
一方面，本发明提供了一种新的斑点印迹分析的方法。这个过程开始于将含有待测抗原的样品转移到膜上去，最好以多单元板的形式。膜的非特异性蛋白结合位点被阻塞，然后通过加入标记酶直接标记的抗体，或者加入第一抗体后，经过连续清洗，再加入被标记酶标记的第二抗体。没有同抗原结合的抗体在清洗步骤中被去掉，而已经形成的抗原-抗体之间的相互作用则不受清洗步骤的影响。结合在膜上的抗体，经过抗原-抗体的相互作用，被含有竞争分子的洗脱液洗脱出来。在洗脱液中被解放的，被标记酶标记的抗体通过标记酶促反应可以被直接测量，而不需要其他介质，比如说X射线胶片的帮助。
一方面，本发明是通过省略凝胶电泳步骤，简化了常规的免疫印迹分析技术，以允许大规模蛋白质样品分析在试验，临床和药物开发中的应用。蛋白质分析的结果也可以被直接定量化分析，从而避免了常规方法中这一过程中内在的不准确性。
本发明的另一个目的是简化了免疫酶联吸附反应复杂的开发过程。本发明在被引入不同剂量的竞争分子作为标准时，可以很容易地转化为典型的免疫酶联吸附反应，并且具有与免疫酶联吸附反应相同的精度，并且提高了对抗原结合能力以及可供选择的抗体数量。
本发明的另一个目的是提高了常规的蛋白质分析技术的效率。这个过程起始于将含有多个待测抗原的样品转移到膜上，然后经过阻塞步骤，以及用含有针对不同待测抗原的多个检测抗体对膜的同步处理。本发明中增加的洗脱步骤通过用含有针对特定抗原的特定竞争分子专一的从特定抗原与检测抗体形成的免疫复合物中将与之结合的检测抗体(直接或间接被标记酶所标记)洗脱下来，而不影响膜上由其他的检测抗体形成的免疫复合物。通过直接测量在洗脱液中与特定抗体偶联的标记酶的数量来决定在样品中某个待测抗原的含量。逐步的用不同的竞争分子重复洗脱步骤就可以在短时间内测量出每个待测抗原在样品中的含量。
本发明的另一个目的在于其在蛋白质微阵列分析中的应用。这个过程起始于将样品转移到一个多单元板上；然后，结合有待测抗原的多单元板通过阻塞步骤的处理来除掉多单元板上的任何非特异性蛋白结合位点；多单元板经过多个由标记酶直接或间接标记的检测抗体的同步处理；多单元板的每个单元由含有针对不同抗原的竞争分子的洗脱液的处理，根据竞争分子的不同，洗脱液将检测抗体从每个单元内的免疫复合物中解放出来；洗脱液与多单元板的固相分离，并经过由标记酶介导的反应同步定量每个单元内的不同抗原的相对含量。
本发明简单的分析过程也有助于其在自动化分析的应用。与传统方法相比，本发明的免疫检测分析过程中必需的步骤仅仅限于更换溶液和与溶液的培育过程，显著的简化了传统的免疫检测分析过程，为其在临床、实验、药学研究、以及诊断过程中的自动化应用提供了基础。
该发明的另一个目的是极大地缩短了免疫分析的时间。传统的免疫分析过程的以充分的清洗，培育和更换缓冲液为典型特征，是一个漫长的过程。虽然经过了种种努力，该技术的内在特点导致这一过程不可避免。在该发明中描叙的反向Zestern通过预先培育竞争分子和检测抗体以形成免疫复合物，从而大大缩短这一过程。其结果是，真正的实验过程仅仅局限于洗脱过程这一步，以可能含有目的抗原的样品作为洗脱液。样品中的目的抗原可以相同或者更强的亲和力同检测抗体相结合。根据检测目的的不同，样品中的目的抗原含量可以大于、少于或者等于固相上结合的竞争分子的含量。
本发明的另一个目的是通过荧光共振能量转移(FRET)(Sekar etal,2003)，或类似于荧光共振能量转移的技术，包括放大后的发光接近同质检测技术(ALPHA法)(Bosse et al,PerkinElmer application note)，显着地提高了反应的特异性。在洗脱过程中，部分检测抗体不可避免地，或单独、或者与免疫复合物一起、从固相上洗脱下来。而这个过程同洗脱液中的竞争分子的处理无关。这种现象可以笼统的定义为背景洗脱。虽然背景洗脱在传统的免疫印迹分析过程从来也没有成为一个大问题，却可能显著地干扰本发明的分析结果。这种情形在待测抗原在样品中含量低的时候尤为严重。可以想象的是，随着竞争分子在洗脱液中的浓度的增加，背景洗脱的这种趋势由于各种因素的影响可能会增加。
只有当两个分子非常接近时，以荧光共振能量转移效应为基础的检测技术和放大后的发光接近同质检测技术才能得以有效的应用。通过对检测抗体和竞争分子用配对的发光或荧光染料来达到荧光共振能量转移效应或放大后的发光接近同质检测效应，可以大大地提高本发明的特异性，因为只有那些通过竞争才得以洗脱的检测抗体才可被记录为有效的信号。而在检测过程中来自背景洗脱的干扰也将显著地降低。
本领域技术人员应该理解，在本领域中可能存在其他的技术可以达到像荧光共振能量转移或者像放大后的发光接近同质检测技术同样的目的，而不背离本发明广泛的发明构思。不言而喻，本发明并不局限于荧光共振能量转移或类似于荧光共振能量转移技术。更确切地说，荧光共振能量转移技术仅仅被用来说明在本发明的精神和范围之内的可能存在的修改。
本领域的技术人员应该理解，可能存在着对上述的发明构思的改进，但这些改进并不背离本发明的主旨。因此，本发明并不局限于在这里所披露的种种具体应用。这些具体应用仅仅是被用来举例说明由所附的权利要求书所界定的，在本发明的精神和范围之内的可能的改进。
本发明方法的下列实例是用来进一步说明本发明的性质。不言而喻，本发明并不仅限于此。
实施例1：用改进方法(Zestern)的方法分析FLAG标记的IRS-2蛋白在HEK-293细胞系内的表达。
用FuGENE6转染方法将FLAG标记的IRS-2表达载体在以2μg/60毫米培养皿的浓度转染到HEK-293细胞系中。经过48小时转染后，HEK-293细胞被含有蛋白酶抑制剂的裂解液裂解(Zhang.J，2007)。细胞的全部裂解物经4XSDS样品缓冲液(Laemmli缓冲液)处理，并被在75℃加热5分钟，然后经过标准的斑点印迹程序被转移到各个单元的PVDF膜上，每个单元的PVDF膜被阻塞液[在Tris缓冲盐水及0.1％Tween-20(俗称“TBST”)中加入5％的无脂牛奶]处理1小时，然后用含有1:1000稀释的M2FLAG抗体(Sigma公司，St.Louis)的阻塞液处理2小时。随后，经过3次，每次5分钟的TBST缓冲液清洗，PVDF膜继续被用含驴抗小鼠的二抗按1:5000稀释的阻塞液中处理2个小时。再经过3次，每次5分钟的TBST缓冲液清洗。这些单元的PVDF膜用100微升洗脱溶液(1XPBS溶液含有终浓度为150纳克/微升的3XFLAG肽(Sigma公司，St.Louis，MO)处理1小时，从而将抗体(同标记酶标记的第二抗体结合的第一抗体)从每个单元PVDF膜上解放出来。洗脱后，50μl的洗脱被转移到一个96孔黑色多孔板内，并用50μl准备好的ECL溶液(GE Healthcare)与之混合，在一个标准的化学发光光度计中进行定量测量。结果如表1所示。
表1显示化学发光发光计读数(任意单位)
其结果是三次试验的平均值。
实施例2：反向Zestern的过程(反向Zestern)
第一步，合成的ＦＬＡＧ多肽结合到单独的膜单元上。每个膜单元被阻塞缓冲液处理(ＴＢＳＴ缓冲液加上5％的牛奶)，然后同Ｍ2初级抗体在4℃温度下整夜培育。膜单元又被ＴＢＳＴ缓冲液清洗三次，每次5分钟。清洗后的膜单元同针对初级抗体的二级抗体共同培育3个小时。在一个实验中驴抗鼠抗体被采用。膜单元再次被ＴＢＳＴ缓冲液清洗三次，每次5分钟。此时，ＦＬＡＧ多肽、ＦＬＡＧ初级抗体和二级抗体在膜上形成免疫复合物。所有的步骤都是在持续晃动中进行。此时的膜单元可以进行进一步的处理。
第二步，细胞裂解液稀释在200微升的ＴＢＳＴ中，并同第一步中的膜单元在晃动的条件下共同培育30分钟，以洗脱膜上的免疫复合物。从每个样品中取出50微升洗脱液，转移到96孔板中，同超级西式微升试剂盒混合，根据制作商的操作手册用化学发光光度计进行测量。
实施例3：提高Zestern分析的特异性。
HEK-293细胞如例1所述被FLAG-IRS-2质粒转染。细胞的全部裂解物被转移到单元膜上。单元膜首先被阻塞液(含5％脱脂奶粉的TBST)处理一小时，然后被抗FLAG抗原决定簇的M2第一抗体处理3小时。单元膜被TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。然后与被Alexa488标记的驴抗小鼠抗体处理2小时。单元膜在TBST缓冲液再次被洗涤3次，每次5分钟。
单元膜被过量的由Alexa555标记的3XFLAG肽处理30分钟。洗脱液被转移到多孔板中，在适于产生荧光共振能量转移的条件下进行分析。竞争分子和检测抗体之间的距离确保了荧光共振能量转移的效果和检测的特异性。

Claims (28)

1.一种测定样品中抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将抗原转移到固相上；
B.用针对抗原的特异检测抗体处理固相，以形成抗原-抗体免疫复合物；
C.用竞争分子通过与抗原竞争检测抗体来打破免疫复合物，从免疫复合物中解放出检测抗体；
D.收集解放出的检测抗体；
E.测量解放出的检测抗体来测定样品中的抗原含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少部分的样品随抗原转移到固相上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在形成免疫复合物之前，所述固相先进行阻塞处理，以防止检测抗体不通过抗原的介导而结合到固相上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在形成免疫复合物之后，检测抗体被解放之前，将未与抗原结合的检测抗体从固相上除去。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原由多肽、化合物、RNA分子、DNA分子、细胞或病毒颗粒中的一种组成。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述竞争分子由一种多肽组成。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽由抗原组成。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽由一个针对特定的检测抗体的抗原决定簇组成。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽由抗原内同检测抗体相互作用的区域组成。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽由多拷贝的抗原内同检测抗体相互作用的区域组成。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽由一种同检测抗体结合的比抗原更紧密的多肽组成。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测抗体需要被标记。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述检测抗体被标记的标记方法为同位素标记、红外标记、荧光标记或标记酶标记中的一种。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述检测抗体通过第二抗体被标记。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述竞争分子与检测抗体的标记分子有所不同。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述竞争分子与检测抗体用相匹配的不同标记分子来提高本方法的特异性。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述检测抗体通过第二抗体被标记。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述相匹配的标记方法选自于荧光共振能量转移的和放大发光邻近均质检测的方法的一种。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相是一种多孔性材料。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多孔材料的孔径足以允许检测抗体的渗透。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相选自膜或一个多单元板。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相选自薄膜、片或板。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相由纸张、玻璃、塑料或织物组成。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相为免疫酶联吸附板。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量检测抗体的方法为自动化测定。
26.一种测定样品中多种抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.从样本中取出多个子样本；
B.采用至少下列步骤处理每个子样品：
(1)将抗原转移到固相上；
(2)用针对抗原的特异检测抗体处理固相，以形成抗原-抗体免疫复合物；
(3)用竞争分子通过与抗原竞争检测抗体来打破免疫复合物，从免疫复合物中解放出检测抗体；
(4)收集解放出的检测抗体；
(5)测量解放出的检测抗体来测定样品中的抗原含量。
27.一种测定样品中多种抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将多个抗原转移到固相上；
B.用针对多个抗原中不同抗原的多个特异检测抗体处理固相，以形成多个抗原-抗体免疫复合物；
C.用针对一个抗原的竞争分子通过与抗原竞争检测抗体来打破免疫复合物，从免疫复合物中解放出检测抗体；
D.收集解放出的检测抗体；
E.重复步骤C和D来收集至少另外一种的检测抗体；
F.测量每个解放出的检测抗体来测定样品中相应的抗原含量。
28.一种测定样品中多种抗原含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.从样品中取出多个子样品；
B.将每一个子样品转移到不同的固相上；
C.将子样品中的抗原结合到子样品的固相上；
D.用针对多个抗原中不同抗原的特异检测抗体处理每一个子样品固相，以形成多个抗原-抗体免疫复合物；
E.采用下列步骤处理一个子样品；
(1)在固相上用针对一个抗原的竞争分子通过与该抗原竞争同其相对应的检测抗体来打破免疫复合物；
(2)从该抗原形成的免疫复合物中解放出检测抗体；
F.用针对不同抗原的竞争分子在另外的子样品上重复步骤E的两个步骤；
G.收集解放出的检测抗体；
H.测量解放出来的检测抗体来测定样品中不同的抗原含量。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8722345B2 (en) 2012-01-06 2014-05-13 Jiandi Zhang Methods for measuring protein content
US9063134B2 (en) 2012-07-09 2015-06-23 Yantai Zestern Biotechnique Co. LTD Multi-unit plate for immunoblot analysis
CN105606815A (zh) * 2015-05-18 2016-05-25 烟台载通生物技术有限公司 一种用于免疫检测的多单元装置
US9933418B2 (en) 2015-05-26 2018-04-03 Quanticision Diagnostics Inc. Multi-unit plate for electroblotting and immunoblot analysis
WO2017035343A1 (en) * 2015-08-26 2017-03-02 Access Medical Systems, Ltd. Immunoassay with enhanced sensitivity
KR20170099737A (ko) 2016-02-23 2017-09-01 노을 주식회사 접촉식 염색 패치 및 이를 이용하는 염색 방법
US10371610B2 (en) 2016-02-23 2019-08-06 Noul Co., Ltd. Contact-type patch, staining method using the same, and manufacturing method thereof
US10295544B2 (en) * 2017-02-15 2019-05-21 Quanticision Diagnostics Inc. Apparatus and method for high trhoughput immunobloting
US10788484B2 (en) 2017-06-29 2020-09-29 Quanticision Diagnostics Inc. Apparatus and method for absolute quantification of biomarkers for solid tumor diagnosis
JP7153054B2 (ja) * 2017-07-13 2022-10-13 マグアレイ，インコーポレイテッド 自己抗体の定量方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4446232A (en) * 1981-10-13 1984-05-01 Liotta Lance A Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens
US6020209A (en) * 1997-04-28 2000-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microcapillary-based flow-through immunosensor and displacement immunoassay using the same
CN101310186A (zh) * 2005-11-18 2008-11-19 日东纺绩株式会社 测定抗原的方法和用于其的试剂盒
CN101539578A (zh) * 2009-02-17 2009-09-23 李红玉 一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条
CN101799469A (zh) * 2010-03-17 2010-08-11 北京阿匹斯生物技术有限公司 检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPN991796A0 (en) * 1996-05-17 1996-06-13 Women's And Children's Hospital Early detection of lysosomal storage disorders
JP3098970B2 (ja) * 1997-02-07 2000-10-16 日本碍子株式会社 タンパクのペプチド溶離免疫測定方法
FI20065152L (fi) * 2006-03-07 2007-09-08 Schering Oy Uusi määritysmenetelmä solumembraanireseptoreihin sitoutuneiden vasta-aineiden havaitsemiseksi
SG135990A1 (en) * 2006-03-16 2007-10-29 Nat Environment Agency Competitive enzyme linked immunosorbent assay (c-elisa) for the detection of a flavivirus specific antibody

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4446232A (en) * 1981-10-13 1984-05-01 Liotta Lance A Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens
US6020209A (en) * 1997-04-28 2000-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microcapillary-based flow-through immunosensor and displacement immunoassay using the same
CN101310186A (zh) * 2005-11-18 2008-11-19 日东纺绩株式会社 测定抗原的方法和用于其的试剂盒
CN101539578A (zh) * 2009-02-17 2009-09-23 李红玉 一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条
CN101799469A (zh) * 2010-03-17 2010-08-11 北京阿匹斯生物技术有限公司 检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法

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CA2857762C (en) 2015-05-12

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