CN101539578A - 一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条。该试纸条主要由支撑板、采样区、金标复溶区、显色区、吸水垫等部分组成。利用竞争法原理，使得样品中的三聚氰胺跟金标三聚氰胺包被抗原MEL－OVA竞争，从而与检测带上的抗三聚氰胺单克隆抗体结合显色，建立样品中三聚氰胺含量与检测带显色条数对应的关系，从而可以依据显色区中条带显色数量来判断样品中三聚氰胺含量。本项发明具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、操作简单、方便携带等优点，快速、灵敏地判断出所测样本如牛奶、饲料、畜产品、血液、尿液等中是否含有三聚氰胺或其含量是否超标，从而对食品安全和人们正常身体健康作出评估判断。适合食品或饲料等的现场快速筛查，也可以用于家庭日常生活自检和人自身的三聚氰胺含量检测。

Description

一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条

一、技术领域

本项发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，具体来说是一种关于三聚氰胺的半定量胶体金快速检测试纸条，主要用于人身健康及食品、饲料安全和畜产品内所含的三聚氰胺含量的检测。属于单克隆抗体技术、金标抗体技术和竞争法免疫层析技术领域。

二、背景技术

三聚氰胺(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，也是一种重要的氮杂环有机化工原料，在木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业中有广泛应用，是一种基本有机化工中间产品。

三聚氰胺本被禁止加入食品和动物饲料，原因是他在人体内会形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺，造成严重的肾结石。

2007年，美国爆发宠物食品受污染事件，造成部分宠物猫狗发生严重肾衰竭而死亡。事后经调查表明：导致宠物中毒的原因主要是因为宠物食品掺杂了三聚氰胺的。

2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其主要原因就是奶粉中含有严重超标的三聚氰胺。随后在奶糖、油条、鸡蛋等食品中也发现含有三聚氰胺。

研究表明，长期摄取三聚氰胺可能造成生殖能力损害、膀胱或肾结石、膀胱癌。因此食品及畜产品和人体内残留的三聚氰胺含量检测已经成为食品安全和人身健康的一项常规检测指标。

现有的检测三聚氰胺的方法主要是用色谱法如GC-MS、HPLC、LC-MS等，但是这些方法需要完备的实验室、专门的操作人员、昂贵的分析仪器、繁杂的检测步骤和不菲的检测费用，不适合现场进行大批量的快速检测，更不适合用于普通的家庭自检使用。因此亟需开发一种灵敏性高、检测迅速、特异性高、成本低廉、适合现场即时检测的三聚氰胺检测方法。而目前基于免疫学原理的ELISA三聚氰胺检测试剂盒，依旧没能摆脱仪器的束缚，费用也较高，耗时需要1-2个小时，再加上它用的是多克隆抗体，特异性并不高。

本项发明则是基于免疫学原理，研发出针对三聚氰胺的单克隆抗体，再研制成金标三聚氰胺快速检测试纸条。该试纸条具有特异性强、灵敏性高、检测速度快、不需要任何仪器设备、不需要专业人员操作、运行费用低廉、携带方便等特点，尤其适合现场样品的即时快速检测和家庭自检使用。

三、发明内容

本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条。该试纸条主要用抗三聚氰胺单克隆抗体检测待检样品中的三聚氰胺，从而提高了检测的特异性、灵敏性，避免了普通抗三聚氰胺多克隆抗体检测三聚氰胺时的特异性和灵敏性差的弊端。利用胶体纳米金颗粒标记三聚氰胺完全抗原(包被抗原MEL-OVA)，又提高了其检测结果可视性，进一步提高了灵敏性，摆脱了特定仪器的束缚，降低了成本，使得该试纸条的使用对象更加准确、方便、便宜、大众化。

在本项发明中，首先使三聚氰胺和载体蛋白耦连，从而合成三聚氰胺的人工完全抗原(免疫抗原MEL-KLH，即三聚氰胺耦联血蓝蛋白；包被抗原MEL-OVA，即三聚氰胺耦联鸡卵清蛋白)，通过用免疫抗原MEL-KLH免疫小鼠，获得能分泌能抗三聚氰胺抗体的小鼠脾细胞，让其与事先驯化好的SP2/0细胞融合，采用有限稀释法进行单克隆细胞筛选并扩大培养，然后将筛选出来的分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的融合细胞注射小鼠，使其产生腹水。采集腹水，进行抗体提纯即可获得抗三聚氰胺单克隆抗体。同时用鸡卵清蛋白免疫小鼠，以获得小鼠抗鸡卵清蛋白抗体。

用柠檬酸三钠还原法制得胶体纳米金颗粒，探索胶体纳米金标记三聚氰胺完全抗原的最佳浓度和最佳条件。按照最佳条件将包被抗原MEL-OVA进行胶体纳米金标记，同时准备试纸条所需原料和器材。

将金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA喷涂在结合垫区的玻璃纤维上，将不同浓度(10μg/L、100μg/L、500μg/L)的抗三聚氰胺单克隆抗体喷涂包被在硝酸纤维素滤膜上的三条检测带上，将鼠抗鸡卵清蛋白抗体喷涂包被在硝酸纤维素滤膜上的质控带上。

最后，将支撑板、附带检测带和质控带的硝酸纤维素滤膜、喷涂有金标三聚氰胺包被抗原的玻璃纤维、吸水滤纸和位于采样区的玻璃纤维按照说明书附图1的顺序组装好。

当该试纸条用来检测样品时，把样品(牛奶或血清、尿液)滴于该试纸条的采样区，样品由于毛细作用进行侧向层析作用，首先经过金标结合区，样品会将金标三聚氰胺包被抗原复溶，然后一起进行侧向层析作用。当经过硝酸纤维素滤膜上的检测带区域时，金标三聚氰胺包被抗原会和检测带上的抗三聚氰胺单克隆抗体及质控带上的鼠抗鸡卵清蛋白抗体进行抗原抗体特异反应显色。若样品中含有三聚氰胺或其含量超过一定浓度(10μg/L、100μg/L、500μg/L)时，其会跟金标三聚氰胺包被抗原竞争而与检测带上包被的抗三聚氰胺单克隆抗体结合，由于样品中三聚氰胺与金标三聚氰胺包被抗原相比分子量小很多，层析时空间位阻也很小，从而使得样品中三聚氰胺比金标三聚氰胺完全抗原更快更容易与抗三聚氰胺单克隆抗体结合，因而使得金标三聚氰胺包被抗原不能够和检测带抗三聚氰胺单克隆抗体结合显色，这样金标三聚氰胺包被抗原会继续层析与其余抗三聚氰胺单克隆抗体和抗鸡卵清蛋白抗体结合显色。这样通过几条检测带显色与否，就可以便捷、快速、灵敏地检测出样品中三聚氰胺的含量水平。该种方法具有半定量、便捷化、灵敏化、特异化、适时化、快速化、大众化等特点，非常适合现场样品的即时快速检测。也适合家庭日常生活中人体体液中三聚氰胺残留检测和食品自检等。

四、附图说明

图1为一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条的结构示意图。由左至右，依次为①支撑板，主要成分为PVC板；②采样区，主要成分为滤纸或玻璃纤维；③金标复溶区，主要成份为包被过金标三聚氰胺包被抗原的玻璃纤维；④反应显色区，主要成分为硝酸纤维素滤膜，上面包括三条分别喷涂有不同浓度的抗三聚氰胺单克隆抗体的检测带和喷涂有鼠抗鸡卵清蛋白抗体的质控带；⑤为包被有浓度为10μg/L的抗三聚氰胺单克隆抗体的检测带；⑥为包被有浓度为100μg/L的抗三聚氰胺单克隆抗体的检测带；⑦为包被有浓度为500μg/L的抗三聚氰胺单克隆抗体的检测带；⑧为包被有一定浓度的鼠抗鸡卵清蛋白抗体的质控带；⑨为吸水垫，主要成分为滤纸。

图2为该试纸条检测结果说明图。如图所示，①检测结果为阴性，三条检测带和质控带均显红色，说明样品中不含有三聚氰胺或其含量水平小于10μg/L；②检测结果为阳性，检测带⑤不显红色，其余两条检测带和质控带均显红色，说明样品中含有三聚氰胺且其含量水平在10μg/L-100μg/L之间；③检测结果为阳性，检测带⑤、⑥不显色，而检测带⑦和质控带都显红色，说明样品中三聚氰胺含量在100μg/L-500μg/L之间；④检测结果为阳性，即三条检测带均不显色，而只有质控带显色，说明样品中三聚氰胺含量达到或超过500μg/L；⑤为试纸条失效时的情况，即三条检测带不显色，质控带也不显色，说明该试纸条已经失效，须更换一个新的试纸条重新检测。

五、具体实施方式

实施例1抗三聚氰胺单克隆抗体的制备

(1)将三聚氰胺用琥珀酸羧化成羧基三聚氰胺，再用碳二亚胺法使其与分别与血蓝蛋白KLH、鸡卵清蛋白OVA耦联，用透析法纯化三聚氰胺耦联蛋白，用紫外扫描法鉴定其耦联效果。最终制成三聚氰胺完全抗原(免疫抗原MEL-KLH，包被抗原MEL-OVA)。

(2)用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH免疫BALB/C小鼠，经过三次免疫后，测小鼠血清抗体效价，经过加强免疫后，取效价高那只小鼠为脾细胞提供者。

(3)用8-杂氮鸟嘌呤驯化SP2/0细胞，待其驯化好后，按照经典动物细胞融合法将SP2/0细胞与体内产生高的抗体水平的小鼠脾细胞进行融合。

(4)然后用三聚氰胺包被抗原MEL-OVA包被酶标版，间接ELISA法检测能够分泌抗三聚氰胺抗体的融合细胞，并按照有限稀释法进行亚克隆，直到筛选出能够成功分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的稳定的融合细胞株。

(5)将筛选出的稳定的能够分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，并将其注射进事先经过石蜡驯化的纯系BALB/C小鼠腹腔内，使其产生大量含有分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的腹水。

(6)将收集到的腹水进行浓缩、提纯，进而得到抗三聚氰胺单克隆抗体。

实施例2鼠抗鸡卵清蛋白(OVA)抗体的制备

(1)将鸡卵清蛋白按照常规免疫程序免疫BALB/C小鼠，三次免疫后ELISA法测定小鼠抗体效价，以确定小鼠抗体水平。

(2)将效价最高的那只小鼠进行眼球摘除法采血，分离得其血清，按照辛酸-硫酸铵法纯化得到其中鼠抗鸡卵清蛋白OVA抗体。

实施例3胶体纳米金颗粒的制备

(1)在洁净的烧杯中加入一定量(100mL)的0.01％的氯金酸水溶液，然后加热至沸腾。

(2)在搅拌状态下加入一定浓度(1％)的柠檬酸三钠水溶液1mL，继续煮沸10分钟，反应体系颜色从金黄色逐渐变为紫红色。

(3)静置冷却后，用去离子水恢复至原有体积，最终制成符合条件的(直径约为40nm)胶体纳米金颗粒。

实施例4胶体金标记三聚氰胺包被抗原MEL-OVA

(1)系列预实验确定胶体金标记三聚氰胺包被抗原MEL-OVA的最佳PH值和最佳浓度。

(2)将制得的胶体金溶液通过用0.1mol/L碳酸钾调整至最佳PH值(PH8.5)。

(3)将三聚氰胺包被抗原MEL-OVA经过进一步透析、过滤等处理，尽可能去除一些影响金标过程的离子和粒子等杂质。

(4)电磁搅拌条件下，将经过处理的三聚氰胺包被抗原MEL-OVA按照探索好的条件浓度(2.5ml)逐滴加入100ml的胶体金溶液中。

(5)10分钟后，加入10％BSA至其浓度为1％，以稳定其反应体系，继续搅拌均匀。

(6)将制得的金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA溶液经过离心(15000g，4℃，30min)后，小心吸弃上清，用含1％BSA的PBS恢复原体积重悬后，再离心，即进行洗涤3次。

(7)将沉淀最终用含稳定剂(1％BSA或0.3mg/mLPEG)的PBS重悬至合适浓度。加入一定量的0.5mg/mL叠氮钠可长期4℃保存。

实施例5三聚氰胺的半定量快速检测试纸条的装配

(1)将玻璃纤维经过含1％BSA和1％吐温-20的PBS(PH7.4，0.01mol/L)活化处理后，浸在金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA溶液中40min，自然晾干，即将金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA溶液包被于玻璃纤维膜上。

(2)在硝酸纤维素滤膜上间隔0.2厘米依次喷涂上三条梯度浓度的抗三聚氰胺单克隆抗体溶液带作为检测带，其浓度依次为10μg/L、100μg/L、500μg/L。鼠抗鸡卵清蛋白OVA抗体为质控带。然后将硝酸纤维素膜用含1％BSA的PBS(PH7.4，0.01mol/L)封闭2h，自然晾干。

(3)按照说明书附图1的顺序依次组装各个部分，组装好后保持干燥待用。

实施例6试纸条使用方法

(1)将牛奶，人和动物的体液包括血液和尿液等样品进行预处理：

体液(血清或尿液)，不用进行预处理，或者用蒸馏水进行等倍稀释即可。

食品(奶粉等)或动物食品(饲料或宠物食品)，将样品混匀后称取少量样品(1g)于离心管中管中，加入DMSO溶液约10mL，震荡混匀，以10000rpm/min超速离心10min。取上清液1ml，备用。

(2)将微量样本滴入采样区，或将试纸条伸入样品中即可开始检测。5-10分钟后即可观察结果。

(3)结果判定(结合说明书附图2)：

如果三条检测带和质控带均显色，则说明样品呈阴性，样品中不含有三聚氰胺或三聚氰胺含量低于10μg/L，如图2中①所示；

如果检测带⑤不显色，而其他两条检测带和质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中三聚氰胺的含量在10μg/L-100μg/L，如图2中②所示；

如果检测带⑤和检测带⑥均不显色，检测带⑦和质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中三聚氰胺含量在100μg/L-500μg/L，如图2中③所示；

如果检测带⑤、⑥、⑦都不显色，只有质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中三聚氰胺含量已达到或超过500μg/L，如图2中④所示；

如果检测带均不显色，质控带也不显色，则说明该试纸条已经失效，不能使用，须更换新的试纸条后重新检测，如图2中⑤所示。

Claims (6)

1.本发明为一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，主要结构包括支撑板、采样区、金标复溶区、反应显色区、吸水垫等部分组成。其特征在于：其反应显色区设有三条检测带和一条质控带，金标复溶区包被有金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA，利用竞争法原理，使得样品中的三聚氰胺跟金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA竞争，进而与检测带上的抗三聚氰胺单克隆抗体结合显色，建立样品中三聚氰胺含量与检测带显色条数对应的关系，从而可以依据显色区中条带显色数量来判断样品中三聚氰胺含量。

2.根据权利要求1中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，其特征在于：所述的三条检测带包被有不同浓度梯度的抗三聚氰胺单克隆抗体，其中检测带⑤包被了10μg/L的抗三聚氰胺单克隆抗体，检测带⑥包被浓度为100μg/L，检测带⑦包被浓度为500μg/L。

3.根据权利要求1中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，其特征在于：所述的一条质控带包被有一定浓度的鼠抗鸡卵清蛋白(OVA)抗体。

4.根据权利要求1中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，其特征在于：所述的三聚氰胺包被抗原MEL-OVA是由三聚氰胺和大分子蛋白如鸡卵清蛋白OVA人工偶联而成，其偶联方法主要是先将三聚氰胺进行羧化，然后通过碳二亚胺法与鸡卵清蛋白OVA偶联。

5.根据权利要求1中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，其特征在于：所述的金标三聚氰胺包被抗原MEL-OVA由胶体纳米金颗粒标记三聚氰胺包被抗原MEL-OVA而成。

6.根据权利要求1中所述的一种检测三聚氰胺含量的胶体金试纸条，其特征在于：该试纸条可用于快速检测牛奶等食品、饲料及血液或尿液等体液中是否含有三聚氰胺，并进行半定量测定，从而为人体健康及畜产品的合格与否作出快速评估。

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