CN101158683A - 胶体金层析法半定量检测2,4-d的试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属免疫化学检测技术，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用以快速半定量检测环境水样中2，4－D残留量的试纸及制备方法。本发明所依据的原理是通过待检样品中的2，4－D与精确定量金标抗体反应，然后与呈横条状分布于免疫层析膜上的2，4－D－OVA发生竞争性的结合，通过显示于免疫层析膜上的条纹数量，来判定待检样品中2，4－D的含量，条纹数越多，待检样品中2，4－D的含量越高，对2，4－D的最小检出量为21ug/l，可在10分钟内完成，具有实质性特点和显著进步，改变了传统的农药残留多步繁琐检测问题，实现一步法快速半定量检测2，4－D残留的方法。该试纸条由底板、吸水滤纸、硝酸纤维膜、抗2，4－D抗体的金标垫、样品吸收垫组成，底板中部为作为实验反应区的硝酸纤维素膜，其上有含4条检测线和一条质控线，最左侧为样品区，底板另一端头为吸水滤纸。

Description

胶体金层析法半定量检测2，4-D的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫化学检测技术，具体来讲，是一种借助胶体金显色的免疫层析反应，用以快速检测农产品、水、土壤中的2，4-D农药残留。

背景技术

2，4-D是在生产上广泛使用的除草剂和植物生长调节剂，其在农产品、水和土壤中的残留危害不容忽视，如其在土壤、水中残留超标，易引起棉花、某些蔬菜、林木的毒害，对人类的健康造成较大危害，据报道，2，4-D具潜在的致癌性、致突变性，是一种内分泌干扰物质，对免疫系统和生育系统具不良影响，人体摄入吸收后对眼睛、皮肤也有刺激作用，反复接触后对肝、心脏有损害作用，能引起惊厥等。鉴于此，有些国家和世界组织都在环境标准中对2，4-D做出了严格的规定，世界卫生组织2003年8月颁布《饮用水水质指南》，规定饮用水中2，4-D的最大检出浓度30ug/l，我国2001年颁布的《饮用水水质卫生规范》的非常规检测项目中，将2，4-D的限制规定为0.03mg/l。迄今为止，对其残留量的常规检测分析主要是利用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器在试验室操作，方法繁琐、分析速度慢、成本高，要求仪器化程度高等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留分析技术。

通过大量资料检索，注意到：2，4-二氯苯氧乙酸完全抗原和抗体的制备(中国环境科学，2005，25(3)：288～292)，所列文献合成了2，4-D人工免疫抗原，并将该人工免疫抗原免疫家兔制备多克隆抗体，在此基础上建立了间接酶联免疫吸附测定检测2，4-D农药残留的技术。该技术较CG、HPLC有较大革新，使检测时间缩短、成本大大降低，灵敏度提高，有利于在食品、土壤、水和环境中2，4-D农药残留的快速检测并推广应用，但其方法还存在操作相对繁琐、需重复多次洗涤，需借助酶标仪读数等，不能实现真正意义上的一步法快速测定。还有Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for2，4-dichorophenoxyacetic acid.Biosen.& Bioelectro.2001，16：253-260.(2，4-D高灵敏度的压电式免疫传感器的研究，生物传感器与生物电学，2001，16，253-260)，生物传感器是一种以生物活性单元为敏感元件，结合化学、物理转换元件，对被分析物具有高度选择性的仪器，农药残留分析时灵敏度高，该法在即时检验领域可发挥很大作用，但因为该法仍需一定的仪器设备条件，不易进一步降低检测成本。

胶体金免疫层析技术是近些年来发展起来的一种简单、快速免疫学检测方法，具灵敏、简便、快速、无需设备和仪器、经济实用、具高度特异性和敏感性、结果直观可靠、试剂和样品用量极少、不需专业人员操作，易于推广使用，正可以满足这种需求。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种2，4-D农药免疫胶体金标记测定方法，改变2，4-D农药残留多步繁琐检测问题，实现廉价、一步法快速检测2，4-D农药残留的方法。

本发明通过以下技术方案解决技术问题，以改良EDC法将2，4-D半抗原2，4-DB与BSA偶联，即EDC介导的缩合反应，在Sulf-NHS同时存在时，效率大大提高；合成人工免疫抗原2，4-DB-BSA，免疫BALB/c小鼠或新西兰雄白兔，制备特异性高效价抗2，4-D抗体，抗体经分离纯化后，将纳米级的胶体金颗粒标记于抗2，4-D的特异性抗体上，并将此标记物、偶联卵清蛋白的2，4-D包被原、以及羊抗鼠(兔)IgG分别固化在同一载体上，根据竞争抑制免疫层析原理，进行2，4-D农药的半定量分析测定，建立的检测体系对2，4-D农药的最小检测量为21ug/l，且在10分钟内完成，方法简单、准确、稳定，是真正意义上的一步法农药残留快速测定。以下是本发明的具体实施步骤：

(1)半抗原的选择：

制备2，4-D抗体可方便选择2，4-D或2，4-DB为半抗原，但通过比较，2，4-DB为半抗原较2，4-D做半抗原更具科学性，因2，4-DB分子结构与2，4-D结构类似，都具类似苯环的管能团和做为活性基团的羧基，二者由一定碳链长度的间隔臂组成，2，4-DB较2，4-D天然具有较长碳链间隔臂(增加2个碳的碳链长)，更易使半抗原的分子独特部位暴露(即突出抗原决定簇)而增强免疫性，因此本项选择2，4-DB为合成人工免疫抗原的半抗原，而为了提高检测灵敏度，人工包被抗原合成选择的半抗原为2，4-D。

(2)人工抗原的合成：

选择2，4-DB为2，4-D抗体制备的半抗原，牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，然后通过改良EDC法合成人工抗原2，4-DB-BSA。称取2，4-DB 60mg，加入0.05M PB(PH 11以上)，搅拌使其缓慢溶解，之后调节PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS，充分混合，再加入EDC，再加入90mgEDC，搅匀，静置片刻，并将此反应液1小时内缓慢滴加到事先配好的60mg 9ml BSA溶液中，并4℃下搅拌反应过夜，0.15M NaCl液透析3天，5-6次左右，紫外分光光度计测紫外法测定和计算偶联物的结合比，得到适当结合比的2，4-DB-BSA偶联物，-20℃下冻存。制备人工免疫抗原过程中，同时进行人工包被抗原的合成，以2，4-D为半抗原，卵清蛋白OVA为载体蛋白，改良EDC法合成包被抗原2，4-D-OVA。

(3)动物免疫试验制备2，4-D的特异性抗体：

获得的人工抗原(偶联物)免疫BALB/c小鼠或新西兰白雄兔。免疫BALB/c小鼠采用腹部皮下注射，初次免疫剂量300ug/鼠，与佛氏完全佐剂等量混合充分乳化，加强免疫时剂量为首免的1/4，与等量不完全佐剂混合充分乳化后注射，上下2次免疫间隔2-3周。采用ELISA法检测抗血清效价，待抗血清效价达一定值后，再加强一次。通过外科手术取免疫鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞系P3/X63-Ag8融合，HAT筛选并克隆化，筛选出能稳定分泌抗2，4-D单克隆抗体的细胞株，该细胞株注入小鼠腹腔，取腹水制备单抗。分离纯化抗体，然后用ELISA法做抗体效价和亲合性、特异性的测定。

若免疫新西兰白兔，采用背部皮下多点法注射。初次免疫人工抗原与等量佛氏完全佐剂充分乳化，加强免疫与等量不完全佐剂乳化，初次免疫的免疫剂量为0.9mg/兔，加强免疫的免疫剂量为0.45mg/兔，每次免疫时间间隔为2周，共免疫6次，最后一次免疫后10天采血收集血清，以ELISA法测定抗血清的效价，待抗血清达到一定效价后，采取兔心脏采血法获取血液，析出抗血清加入0.01％硫柳汞，分装后于-20℃冻存，或获得的抗血清立即分离纯化抗体，然后用ELISA做抗体效价和亲合性、特异性的测定。

(4)纳米胶体金颗粒的制备

纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％。煮沸后每100ml加入1％柠檬酸三钠水溶液3ml，继续煮沸3min。待冷却后用0.2M的K₂CO₃调至PH 8.2。冷却后4℃保存备用，取样进行透射电镜观察粒子大小。

(5)免疫胶体金的制备

在磁力搅拌下，将1.4mg纯化的抗2，4-D特异性抗体IgG，快速搅拌下加入上述100ml胶体金溶液中，室温搅拌30min后，加10％牛血清白蛋白4ml，再搅拌5min，加10％聚乙二醇(PEG2000)2ml(终浓度为0.2％)，室温下搅拌5min，12000rpm离心50min，吸去上清后所得沉淀即为纯化的金标记抗体，将其贮存于保存液中，4℃冰箱中保存。

(6)金标垫的制备

由保存液稀释金标抗体至工作浓度，按50ul/cm²的量均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，并由此确定单位面积上附着金标抗体的量，使其与下步处理硝酸纤维素膜上4条检测条线包被原的量刚好完全中和，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。

(7)硝酸纤维素膜的处理

硝酸纤维膜上用微量点膜头将2，4-D-OVA包被原固相化喷涂检测区内4条检测线，每条检测线宽度1-1.5mm，在0.5cm宽的试纸条上点样量为25ul，各条带间隔2mm，如图所示自左至右依次为第1、2、3、4线，4条线中2，4-DB-OVA偶联物溶液浓度按照4、3、2、1的次序依次递增，点样液浓度依次为60ng/ml、600ng/ml、6ug/ml、60ug/ml。且1、2、3、4检测线上包被原的总量刚好可与金标垫上的金标抗体完全中和。羊抗兔IgG(或羊抗鼠IgG)1.0mg/ml喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线。用含1％BSA、0.5％Tween-20的PBS封闭30min，洗涤3次，自然风干。

(8)胶体金免疫层析试纸条的制备

由底板、吸水滤纸、硝酸纤维膜、抗2，4-D抗体的金标垫、样品吸收垫组成(如图)。底板中部为作为实验反应区的硝酸纤维素膜，其上有含4条涂有2，4-D-OVA偶联物线的检测区和一条指示试纸条质量的质控带C，最左侧为样品区，底板另一端头为吸水滤纸，硝酸纤维素膜二端分别与吸水滤纸和抗体金标垫相互交叠连接，在抗体金标垫上压有作为样品吸收区的玻璃纤维膜，这4部分均贴附于白色双面胶塑料底板上。用切条机将已粘贴好的免疫层析试纸沿纵向切成5mm×60mm的试纸条。

(9)样品测试和结果判读

将试纸条样品吸收垫插入待测样品中，停留5秒后取出平放，10分钟后观察结果。结果判断方法是通过显示于免疫层析膜上的条纹数量，来判定待检样品中2，4-D的含量。当样品中不含2，4-D时，玻璃纤维膜上的胶体金-抗2，4-D抗体量刚可使硝酸纤维素膜上4条检测线显色，质控线也显色；当样品中2，4-D为低含量时(21-100ng/ml)，检测线1、2、3和质控线显色、检测线4不显色；样品中2，4-D为中低含量时(200-600ng/ml)，检测线1、2和质控线显色，第3、4条检测线不显色；样品中2，4-D为中度含量时(1-6mg/ml)，检测线1和质控线显色，检测线2、3、4不显色；样品中2，4-D为高度含量时(＞10mg/l)，检测线1、2、3、4均不显色，只质控线显色。

本发明具有实质性特点和显著进步，主要表现为反应操作简便，灵敏度高而稳定、产品易于保存，不需繁烦的洗涤环节，检测速度快，整个反应在10分钟内完成，真正达到一步法快速检测样品中待测农药是否超标目的。

具体实施方式：

实施例1

采用改良EDC法合成2，4-D免疫用人工抗原，以2，4-DB为半抗原，牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，称取2，4-DB 60mg，加入0.05M PB(PH 11以上)，搅拌使其缓慢溶解，之后调节PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS，充分混合，静置5min，再加入90mg EDC，搅匀，静置5min，该反应液1小时内缓慢滴加到60mg 9ml的BSA溶液中，并4℃下搅拌反应过夜，接着用0.15M NaCl液透析5-6次，8小时/次，之后采用光谱测定法偶联物的结合比，得到结合比为1∶24的2，4-DB-BSA偶联物，分装冻存于-20℃冰箱中。制备人工抗原过程中，同时进行包被抗原的合成，方法为以2，4-D 60mg代替2，4-DB，按同样方法与60mg9ml的OVA溶液反应，合成包被抗原2，4-D-OVA。

获得的人工抗原2，4-DB-BSA免疫10周龄的BALB/c小鼠，初次免疫用等量的佛氏完全佐剂乳化人工抗原，进行腹部皮下注射，抗原剂量为300ug，然后以佛氏不完全佐剂乳化人工抗原，剂量约为首次剂量的1/4，进行6次加强免疫，每次间隔2-3周，采用ELISA法检测抗血清效价，待抗血清效价达到一定的值后，再加强一次，3天后外科手术取免疫鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞系P3/X63-Ag8融合，HAT筛选并进行克隆化，筛选出能稳定分泌抗2，4-D单克隆抗体的细胞株，该细胞株注入小鼠腹腔，取腹水制备单抗，分离纯化，然后用ELISA法做抗体效价和抗体亲合性、特异性的测定。

取700ug纯化单克隆抗体，边搅拌边注入预先制备的30nm大小的胶体金溶液100ml(PH 8.2)中，室温搅拌30min，加10％BSA搅5min，加10％PEG20002ml，搅拌5min，12000rpm离心50min，吸去上清，沉淀即为纯化的金标记抗体。由保存液稀释金标抗体至工作浓度，按50ul/cm²的量均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，并由此确定单位面积上附着金标抗体的量，使其与处理过硝酸纤维素膜上4条检测条线包被原的量刚好完全中和。-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。将2，4-DB-OVA偶联物喷涂于硝酸纤维素膜检测区内的4条检测线上，每线宽0.5cm，点样量25ul，各条带间隔2mm，自左至右依次为第1、2、3、4线，2，4-D包被原溶液浓度按4、3、2、1的次序递增，点样液浓度依次为60ng/ml、600ng/ml、6ug/ml、60ug/ml，且4条检测线上包被原的总量刚好可与金标垫上的金标记抗体完全中和。羊抗鼠IgG 1.0mg/ml喷涂于质控线上。然后将玻璃纤维素膜、已固定金标记抗2，4-D抗体的玻璃纤维素膜、已平行包被2，4-D-OVA偶联物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴到50mm×240mm单面胶PVC板上。用切条机将其沿纵向切成5mm×60mm的试纸条。

测定样品时，将试纸条样品吸收垫插入待测样品中，停留5秒后取出平放，5分钟后观察结果。结果判断方法是通过显示于免疫层析膜上的条纹数量，来判定待检样品中2，4-D的含量。当样品中不含2，4-D时，玻璃纤维膜上的胶体金-抗2，4-D抗体量刚可使硝酸纤维素膜上4条检测线显色，质控线也显色；当样品中2，4-D为低含量时(21-100ng/ml)，检测线1、2、3和质控线显色、检测线4不显色；样品中2，4-D为中低含量时(200-600ng/ml)，检测线1、2和质控线显色，第3、4条检测线不显色；样品中2，4-D为中度含量时(1-6mg/ml)，检测线1和质控线显色，检测线2、3、4不显色；样品中2，4-D为高度含量时(＞10mg/l)，检测线1、2、3、4均不显色，只质控线显色。

实施例2

采用改良EDC法合成2，4-D免疫用人工抗原，以2，4-DB为半抗原，牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，称取2，4-DB 60mg，加入0.05M PB(PH 11以上)，搅拌使其缓慢溶解，之后调节PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS，充分混合。静置5min，再加入90mg EDC，搅匀，静置5min，该反应液1小时内缓慢滴加到60mg 9ml的BSA溶液中，并4℃下搅拌反应过夜，接着用0.15M NaCl液透析5-6次，8小时/次，之后采用紫外光谱吸收法定量测定偶联物的结合比，得到结合比为1∶24的2，4-DB-BSA偶联物，分装冻存于-20℃冰箱中。制备人工抗原过程中，同时进行包被抗原的合成，方法为以2，4-D 60mg代替2，4-DB，按同样方法与60mg 9ml的OVA溶液反应，合成包被抗原2，4-D-OVA。

获得的人工抗原2，4-DB-BSA免疫新西兰白雄兔，选择体重1.0-2.0kg兔采用背部皮下多点注射法进行免疫。按0.9mg/兔计的2，4-DB-BSA人工抗原与等量佛氏完全佐剂充分乳化，加强免疫时用等量佛氏不完全佐剂代替，每次免疫时间间隔为2周，共免疫6次，最后一次免疫后10天采血收集血清，以ELISA法测定抗血清效价，待抗血清效价达到要求后，用心脏采血法获取血液，析出抗血清加入0.01％硫柳汞，分装后于-20C冻存。然后用ELISA法做抗体效价和抗体亲合性、特异性的测定。

取700ug纯化的抗体，边搅拌边加入预先制备的30nm大小的胶体金溶液100ml(PH 8.2)中，室温搅拌30min，加10％BSA搅5min，加10％PEG20002ml，搅拌5min，12000rpm离心50min，吸去上清，沉淀即为纯化的金标记抗体。由保存液稀释金标抗体至工作浓度，按50ul/cm²的量均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，并由此确定单位面积上附着金标抗体的量，使其与处理过硝酸纤维素膜上4条检测条线包被原的量刚好完全中和。-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。将2，4-DB-OVA偶联物喷涂于硝酸纤维素膜检测区内的4条检测线上，每线宽0.5cm，点样量25ul，各条带间隔2mm，自左至右依次为第1、2、3、4线，2，4-D包被原溶液浓度按4、3、2、1的次序递增，点样液浓度依次为60ng/ml、600ng/ml、6ug/ml、60ug/ml。羊抗兔IgG1.0mg/ml喷涂于质控线上。然后将玻璃纤维素膜、已固定金标记抗2，4-D抗体的玻璃纤维素膜、已平行包被2，4-D-OVA偶联物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴到双面胶PVC板上。用切条机将其沿纵向切成5mm×60mm的试纸条。

测定样品时，将试纸条样品吸收垫插入待测样品中，停留5秒后取出平放，5分钟后观察结果。结果判断方法是通过显示于免疫层析膜上的条纹数量，来判定待检样品中2，4-D的含量。当样品中不含2，4-D时，玻璃纤维膜上的胶体金-抗2，4-D抗体量刚可使硝酸纤维素膜上4条检测线显色，质控线也显色；当样品中2，4-D为低含量时(21-100ng/ml)，检测线1、2、3和质控线显色、检测线4不显色；样品中2，4-D为中低含量时(200-600ng/ml)，检测线1、2和质控线显色，第3、4条检测线不显色；样品中2，4-D为中度含量时(1-6mg/ml)，检测线1和质控线显色，检测线2、3、4不显色；样品中2，4-D为高度含量时(＞10mg/l)，检测线1、2、3、4均不显色，只质控线显色。

附图说明

图1半定量快速检测2，4-D胶体金试纸条结构图

图2半定量快速检测2，4-D胶体金试纸条的主视结构图

图3检测显示2，4-D阴性结果

图4检测显示2，4-D低量时(＞21，＜200ng/m)

图5检测显示2，4-D中低含量时(＞200，＜1000ng/ml)

图6检测显示2，4-D中度含量时(＞1000，＜5mg/ml)

图7检测显示2，4-D高度含量时(＞5mg/ml)

图中1样品吸收区，2、玻璃纤维素膜，3、金标记抗体区块，4、PVC板，5、T测试区(4条线)，6、C质控线，7、硝酸纤维素膜，8、吸水滤纸。

Claims (9)

1.一种2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其具体步骤为，①半抗原的选择：通过比较，选择2，4-DB为合成人工免疫抗原的半抗原，2，4-D为合成人工包被抗原的半抗原；②人工抗原的合成：以改良EDC法将2，4-D免疫半抗原2，4-DB与BSA偶联，合成人工免疫抗原2，4-DB-BSA；③抗2，4-D特异性抗体的制备：利用上述合成的偶联物2，4-DB-BSA免疫动物制备效价高特异性强的抗2，4-D抗体；④纳米胶体金颗粒的制备：使用氯金酸和柠檬酸三钠为反应试剂用煮沸法制备胶体金纳米颗粒；⑤胶体金标记抗2，4-D特异性抗体：抗2，4-D抗体经分离纯化后，将制备的胶体金颗粒标记于抗2，4-D的特异性抗体上；⑥金标垫的制备和硝酸纤维素膜的处理：将胶体金标记的抗2，4-D抗体固定在玻璃纤维素膜上；2，4-D-OVA包被原固相化喷涂4条检测线组成检测区，羊抗兔IgG(或羊抗鼠IgG)1.0mg/ml喷涂于质控线，硝酸纤维素膜上1、2、3、4检测线上喷涂2，4-D-OVA量刚好与金标垫上标记抗体中和；⑦免疫层析试纸条的制备：单面胶PVC板上，依次粘贴上玻璃纤维素膜、已固定金标记抗2，4-D抗体的玻璃纤维素膜、已平行包被2，4-D-OVA包被原检测线和羊抗鼠(或羊抗兔)IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫。用切条机将已粘贴好的PVC板沿纵向切成5mm×60mm的试纸条；⑧样品测试和结果判读方法：根据竞争抑制免疫层析原理，进行农药残留的分析测定；建立的检测体系对2，4-D农药的最小检测量为21ug/ml，且可实现半定量显示，在5分钟内完成快速检测。

2.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及步骤①的具体为：制备2，4-D抗体可方便选择2，4-D或2，4-DB为半抗原，但通过比较，2，4-DB为半抗原较2，4-D做半抗原更具科学性，2，4-DB与2，4-D分子结构类似，只是2，4-DB较2，4-D天然具有较长的碳链间隔臂(增加2个碳的碳链长)，更易使半抗原的分子独特部位暴露(即突出抗原决定簇)，而增强免疫性。因此本项选择2，4-DB为合成人工免疫抗原的半抗原，而为了提高检测灵敏度，人工包被抗原合成选择的半抗原为2，4-D。

3.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤②的具体为：选择2，4-DB为2，4-D抗体制备的半抗原，牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，然后通过改良EDC法合成人工抗原2，4-DB-BSA。称取2，4-DB 60mg，加入0.05M PB(PH 11以上)，搅拌使其缓慢溶解，之后调节PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS，充分混合，再加入EDC，再加入90mgEDC，搅匀，静置片刻，并将此反应液1小时内缓慢滴加到事先配好的60mg 9ml BSA溶液中，4℃下搅拌反应过夜，0.15MNaCl液透析3天，5-6次左右，紫外分光光度计测紫外法测定和计算偶联物的结合比，得到适当结合比的2，4-DB-BSA偶联物，-20℃下冻存。制备人工免疫抗原过程中，同时进行人工包被抗原的合成，以2，4-D为半抗原，卵清蛋白OVA为载体蛋白，改良EDC法合成包被抗原2，4-D-OVA。

4.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤③的具体为：获得的人工抗原(偶联物)免疫BALB/c小鼠或新两兰白雄兔。免疫BALB/c小鼠采用腹部皮下注射，初次免疫剂量300ug/鼠，与佛氏完全佐剂等量混合充分乳化，加强免疫时剂量为首免的1/4，与等量不完全佐剂混合充分乳化后注射，上下2次免疫间隔2-3周。采用ELISA法检测抗血清效价，待抗血清效价达一定值后，再加强一次。通过外科手术取免疫鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞系P3/X63-Ag8融合，HAT筛选并克隆化，筛选出能稳定分泌抗2，4-D单克隆抗体的细胞株，该细胞株注入小鼠腹腔，取腹水制备单抗。分离纯化抗体，然后用ELISA法做抗体效价和亲合性、特异性的测定。

5.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤④的具体为：纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01％。煮沸后每100ml加入1％柠檬酸三钠水溶液3ml，继续煮沸3min。待冷却后用0.2M的K₂CO₃调至PH 8.2。冷却后4℃保存备用，取样进行透射电镜观察粒子大小。

6.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤⑤的具体为：在磁力搅拌下，将1.4mg纯化的抗2，4-D特异性抗体IgG，快速搅拌下加入上述100ml胶体金溶液中，室温搅拌30min后，加10％牛血清白蛋白4ml，再搅拌5min，加10％聚乙二醇(PEG2000)2ml(终浓度为0.2％)，室温下搅拌5min，12000rpm离心50min，吸去上清后所得沉淀即为纯化的金标记抗体，将其贮存于保存液中，4℃冰箱中保存。

7.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤⑥的具体为：稀释金标抗体至工作浓度，按50ul/cm²的量均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。硝酸纤维膜上将2，4-D-OVA包被原固相化喷涂4条检测线组成检测区，每条检测线宽度1-1.5mm，每条线在0.5cm宽的试纸条上点样量25ul，条带间隔2mm，如图自左至右依次为第1、2、3、4线，2，4-DB-OVA包被原浓度按照4、3、2、1的次序依次递增，点样液浓度依次为60ng/ml、600ng/ml、6ug/ml、60ug/ml。且4条检测线上包被原的总量刚好可与金标垫上的金标抗体完全中和。羊抗兔IgG(或羊抗鼠IgG)1.0mg/ml喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，用含1％BSA、0.5％Tween-20的PBS封闭30min，洗涤3次，自然风干。

8.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤⑦的具体为：试纸结构底板中部为作为实验反应区的硝酸纤维素膜，其上有含4条涂有2，4-D-OVA偶联物线的检测区和一条指示试纸条质量的质控带C，最左侧为样品区，底板另一端头为吸水滤纸，硝酸纤维素膜二端分别与抗体金标垫和吸水滤纸相互交叠连接，在抗体金标垫上压有作为样品吸收区的玻璃纤维膜，这4部分均贴附于白色双面胶塑料底板上。组装好后，用切条机将已粘贴好的免疫层析试纸沿纵向切成5mm×60mm的试纸条。

9.根据权利要求1所述的2，4-D农药残留的半定量纳米胶体金层析测定方法，其特征是，所涉及的步骤⑧的具体为：将试纸条样品吸收垫插入待测样品中，停留5秒后取出平放，10分钟后观察结果。结果判断方法是通过显示于免疫层析膜上的条纹数量，来判定待检样品中2，4-D的含量。当样品中不含2，4-D时，玻璃纤维膜上的胶体金抗2，4-D抗体量刚可使硝酸纤维素膜上4条检测线显色，质控线也显色；当样品中2，4-D为低含量时(21-100ng/m1)，检测线1、2、3和质控线显色、检测线4不显色；样品中2，4-D为中低含量时(200-600ng/ml)，检测线1、2和质控线显色，第3、4条检测线不显色；样品中2，4-D为中度含量时(1-6mg/ml)，检测线1和质控线显色，检测线2、3、4不显色；样品中2，4-D为高含量时(＞10mg/l)，检测线1、2、3、4均不显色，只质控线显色。

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