CN114878808A - 一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸及半定量检测体系 - Google Patents

一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸及半定量检测体系 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸条及半定量分段检测体系，涉及胶体金检测技术领域。本发明通过控制不同检测条带上半抗原的数量使得胶体金聚集体被分段结合显示，通过条带的显色数量得出肉眼可读的被检测物的浓度范围区间。制得一种新式能够分段显示被检测物的浓度范围的胶体金试纸检测工具，适用于疾病早筛和动态评估，同时也可以在其他非医学场景中应用，例如农药检测、食品安全检测和水物质检测。以医学为例，制备好的试纸在滴加患者的一滴血液后其分段式的颜色反应结果可用于快速检测血清学指标，便于疾病的早期筛查和动态评估临床某些高危特殊疾病的患病风险、严重程度，划定危险人群。

Description

一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸及半定量 检测体系
技术领域
本发明属于胶体金检测技术领域，具体涉及一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸及半定量检测体系。
背景技术
胶体金免疫层析技术(GICA)是以胶体金标记技术、免疫技术和层析技术为基础发展出来的一项快速检测技术，其基本原理是通过将硝酸纤维素膜作为载体，利用微孔膜的毛细血管作用，滴加的液体样品从膜条一端的缓慢渗移至另一端过程中，通过胶体金聚集呈现的颜色将试纸中抗原抗体结合反应显示出来。传统的胶体金方法当检测线和质控线同时呈红紫色的两条免疫复合物线条时，表明结果呈阳性；如果只有质控线出现一条免疫复合物线条，表明结果呈阴性。传统方法只能对抗原抗体的存在做定性判断，不能对检测物质进行定量判断。
竞争抑制法作为免疫胶体金技术的主要方法之一，主要用于检测具有单一结合位点的小分子物质，如D-二聚体、三聚氰胺、氰戊菊酯、呋喃西林等。本实验以D-二聚体为例发明一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸条。D-二聚体是交联纤维蛋白(Fb)经纤溶确作用后的特异降解产物，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物，是唯一反映凝血和纤溶的理想指标，D-二聚体正常参考值范围为0～243ng/mL，临床上一般以0.5μg/mL作为判断D-二聚体是否增高的临界值。随着现代生活节奏的加快及人们饮食结构的改变，近年来血栓及肺栓塞性疾病，DIC、心脑血管疾病及恶性肿瘤等疾病发病率有逐年增高的趋势，研究表明，在这些疾病中，均会有凝血及纤溶系统的异常，进而导致体内D-二聚体水平的升高，其升高程度与病情进展程度密切相关。因此，检测样本血浆中D-二聚体的含量可以辅助诊断以上疾病的发生发展，尤其在肺栓寒和深静脉血栓的排除诊断中，D-二聚体具有极其重要的临床排除诊断价值。此外，也有研究表明，D-二聚体的升高与急性胰腺炎，糖尿病血管性病变及急慢性荨麻疹等疾病的发生发展和预后有极其密切的联系。因此，检测样本血浆中D-二聚体的含量具有极其重要的临床应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸条及半定量检测体系，可对抗原进行半定量检测，具有操作简便、成本低、特异性强、稳定性好等优点，有望在现场筛查和快速检测中广泛应用，同时辅助临床医生及时制定治疗方案，改善患者预后。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于双抗体夹心的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸条，胶体金分段半定量检测试纸条包括依次粘贴在PVC板上的样品垫、抗体胶体金垫、半抗原包被的硝酸纤维素膜、二抗包被后的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述包被后的硝酸纤维素膜包含多条检测线和一条质控线；
所述质控线上包被兔抗鼠抗小分子抗体；
每条检测线上包被相同或不同浓度的半抗原。
优选的，在所述PVC底板中央粘贴包被后的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜下缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜上缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫上缘粘贴样品垫。
优选的，所述每条检测线上包被的半抗原的量分段检测浓度；
所述半抗原包括D-二聚体、三聚氰胺、氰戊菊酯、呋喃西林等，下述实验过程以D-二聚体为例。
优选的，在所述胶体金分段半定量检测试纸条上的硝酸纤维素膜上设置3条检测线；
当所述抗原为D-二聚体时，3条检测线上，检测线T1上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T2上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T3上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原6.0μL。
优选的，所述抗体胶体金垫的包被方法，包括：将利用PB溶液稀释后的抗原的对应一抗，与调节pH值的胶体金溶液混合均匀，静置20min后，加入封闭液，静置后离心弃上清，利用金胶缓冲液对离心后的沉淀进行重悬，得一抗-胶体金标记物，将所述一抗-胶体金标记物喷涂在金标垫上，得所述抗体胶体金垫。
优选的，利用所述胶体金分段半定量检测试纸条对血液样本进行检测。
优选的，以血液为检测样本时，只有质控线C显示红紫色时，结果其对应一阶梯浓度；当质控线C与T1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线C与T1、T2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线C与三条T线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度。当质控线C不显色时则试纸失效。
优选的，当只有质控线C显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(4mg/L，+∞)；当质控线C与T1线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(2mg/L，4mg/L]；当质控线C与T1、T2线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(1mg/L，2mg/L]；当质控线C与T1、T2、T3线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(0，1mg/L]；当质控线C不显色时实验结果失效。
有益效果：本发明提供了一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸条，包含多条检测线，在医学场景中可在短时间内对患者病情进行评估，预后预测准确性高、方法简单，为临床工作提供借鉴；同时也可以在其他非医学场景中应用，例如农药检测、食品安全检测和水物质检测。本发明实施例中通过设置检测线T1，T2，T3……Tn进行分段检测，在样本血液量固定的情况下，通过n条检测线的显色状况有助于易感人群的危险分级早筛判断：样本滴落在胶体金分段半定量检测试纸条上时依次经过金标垫、检测线T1、检测线T2、检测线T3……检测线Tn和质控线C。检测线T1-Tn分别对应相应的分段检测浓度。检测线T1-Tn和质控线C在检测前均无显色。聚集呈红紫色的免疫胶体金与鼠源抗体结合物(胶体金-抗体复合物)均匀分布于胶体金结合垫上。检测线T中含有事先已经吸附的半抗原，其可以与胶体金-抗体复合物结合。控制线C中含有可以与胶体金-抗体复合物结合的兔抗鼠抗体。样本血液中不含半抗原时，检测线和质控线同时显色。样本血液中含有半抗原时，当样本中的半抗原经过免疫胶体金时，抗体会与半抗原结合。当胶体金-抗体复合物随着血液样本移动至检测线时，未结合样本中半抗原的免疫胶体金会被吸附至检测T线，进一步聚集后使检测线T呈红紫色。检测线T1-Tn根据其对应的分段检测浓度被设置有固定的免疫胶体金结合上限，在样本血液量固定的情况下，通过n条检测线显示的颜色组合情况可得出样本中半抗原的含量范围，在医学场景中可以应用于早筛和动态评估临床某些高危特殊疾病的患病风险、严重程度，划定危险人群；同时也可以在其他非医学场景中应用，例如农药检测、食品安全检测和水物质检测。质控线C位置吸附的是兔抗鼠抗体，在没有捕获吸附鼠源抗体的胶体金时，由于兔抗鼠抗体是无色蛋白，故C线不显色，但捕获到吸附鼠源抗体的胶体金时，就会显示为红紫色条带。
附图说明
图1为本发明所述胶体金分段半定量检测试纸条的结构图；
图2为本发明所述胶体金分段半定量检测试纸条的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于双抗体夹心的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸条，胶体金分段半定量检测试纸条包括依次粘贴在PVC板上的样品垫、抗体胶体金垫、半抗原包被的硝酸纤维素膜、二抗包被后的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述包被后的硝酸纤维素膜包含多条检测线和一条质控线；
所述质控线上包被兔抗鼠抗体；
每条检测线上包被相同或不同浓度的半抗原。
本发明所述胶体金分段半定量检测试纸条的结构优选如图1所示，在所述PVC底板中央粘贴包被后的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜下缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜上缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫上缘粘贴样品垫。
本发明在组装所述胶体金分段半定量检测试纸条时，优选在干燥间内准备好吸水滤纸样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜上缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫上缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条；再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。
在本发明中，所述抗体胶体金垫的包被方法，优选包括：将利用PB溶液稀释后的抗原的对应一抗，与调节pH值的胶体金溶液混合均匀，静置20min后，加入封闭液，静置后离心弃上清，利用金胶缓冲液对离心后的沉淀进行重悬，得一抗-胶体金标记物，将所述一抗-胶体金标记物喷涂在金标垫上，得所述抗体胶体金垫。本发明优选利用0.02mol/LK2CO3溶液调节至最佳pH值，充分搅拌后逐滴加入稀释后的单克隆抗体溶液，混匀后静止20min。本发明所述封闭液优选为10％BSA溶液，搅拌混匀后，静止20min。
本发明所述胶体金优选粒径为30nm的胶体金，其制备方法优选包括柠檬酸三钠还原法，实施例中优选包括：取100mL双蒸水，加热至沸腾，加入1mL 1％的氯金酸，搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1％的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，30min后停止加热，冷却至室温后4℃避光保存。
本发明所述每条检测线上包被的抗原的量优选与分段检测浓度的抗原范围相对应；以血液为检测样本时，只有质控线C显示红紫色时，结果其对应一阶梯浓度；当质控线C与T1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线C与T1、T2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线C与三条T线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度。当质控线C不显色时则试纸失效。
在本发明中，由于部分小分子本身只有抗原性而无免疫原性，如多糖、多肽、类脂等小分子物质，需要将其与载体结合后形成大分子，从而获得免疫原性，即可诱导动物产生针对半抗原的抗体。本发明所述抗原优选包括小分子半抗原，实施例中以D-二聚体(也称D-二聚体半抗原)为例进行说明，并以所述抗原进行检测线的划线，所述检测线优选包括T1线、T2线和Tn线，n为≥3的正整数，并且在划线时，将小分子半抗原用PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L，1％甲醇)稀释20倍，喷于硝酸纤维素膜上。在本发明实施例中，当采用3条检测线时，在检测线T3上5mm处以喷量1.0μL/cm喷涂兔抗鼠抗小分子抗体(二抗)(0.07mg/mL)，作为质控线(C线)，将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥2h，备用。
本发明优选利用所述胶体金分段半定量检测试纸条对血液样本进行检测，样本滴落在胶体金分段半定量检测试纸条上时依次经过胶体金结合垫、检测线T1、检测线T2、检测线Tn和质控线C，检测线T1-Tn各自表示不同浓度梯度的生物标志物，并对应各自的分段检测浓度，所述生物标志物以及分段检测浓度与上述相同，在此不再赘述。
本发明所述检测体系中，以鼠源：抗体为一抗，以兔源：兔抗鼠抗体抗体为二抗，且所述胶体金分段半定量检测试纸条的制备方法优选与上述相同。当样本滴落在胶体金分段半定量检测试纸条上时依次经过金标垫、检测线T1、检测线T2、检测线T3……Tn和质控线C。检测线T1-Tn分别对应相应的检测浓度区间。检测线T1-Tn和质控线C在检测前均无显色。聚集呈紫色的免疫胶体金与鼠源抗D-二聚体抗体结合物(胶体金-抗体复合物)均匀分布于胶体金结合垫上。检测线T中含有事先已经吸附的半抗原，其可以与胶体金-抗体复合物结合。控制线C中含有可以与胶体金-抗体复合物结合的兔抗鼠抗体。样本血液中不含半抗原时，检测线和质控线同时显色。样本血液中含有半抗原时，当样本中的半抗原经过免疫胶体金时，抗体会与半抗原结合。当胶体金-抗体复合物随着血液样本移动至检测线时，未结合样本中半抗原的免疫胶体金会被吸附至检测T线，进一步聚集后使检测线T呈红紫色。n条检测线T1-Tn根据其对应的检测浓度区间被设置有固定的免疫胶体金结合上限，在样本血液量固定的情况下，通过n条检测线显示的颜色组合情况可得出样本中半抗原的含量范围从而早筛和动态评估临床某些高危特殊疾病的患病风险、严重程度，划定危险人群。质控线C位置吸附的是兔抗鼠抗体，在没有捕获吸附鼠源抗体的胶体金时，由于兔抗鼠抗体是无色蛋白，故C线不显色，但捕获到吸附鼠源抗体的胶体金时，就会显示为红紫色条带。
在本发明实施实例中，所述胶体金分段半定量检测试纸条上的硝酸纤维素膜上包被，且设置3条检测线，检测线T1上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T2上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T3上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原6.0μL。
利用本发明所述胶体金分段半定量检测试纸条进行检测时，优选以血液样本进行评测时，只有质控线C显示红紫色时，结果其对应一阶梯浓度；当质控线C与T1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线C与T1、T2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线C与三条T线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度。当质控线C不显色时则试纸失效；更优选的，当只有质控线C显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(4mg/L，+∞)；当质控线C与T1线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(2mg/L，4mg/L]；当质控线C与T1、T2线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(1mg/L，2mg/L]；当质控线C与T1、T2、T3线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(0，1mg/L]；当质控线C不显色时实验结果失效。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以D-二聚体抗原为例的竞争抑制法免疫胶体金检测试纸条的具体制备方法
1、样品垫及金标垫前处理：
样品垫前处理：将样品垫置于含1％BSA、2％葡萄糖、pH7.2、0.1mol/L的PBS缓冲液中浸泡2h，37℃干燥2h备用；
金标垫前处理：将金标垫置于含0.5％BSA、pH7.2、0.5mol/L的PBS缓冲液中均匀浸湿1h，37℃干燥3h备用。
2、胶体金的制备：
将1.0g氯金酸(HAuCl4)配成1.0％的水溶液，于4℃避光存放。在磁力搅拌下，把200mL的蒸馏水加热至沸腾，取1％氯金酸2mL迅速加入到沸腾的蒸馏水中，并保持3min，再向溶液中迅速加入2.7mL柠檬酸三钠，继续加热10min使溶液变为酒红色。将溶液放置室温使其自然冷却，用透射电镜观察胶体金粒，并计算金颗粒直径为30nm。
胶体金最适pH值的选择：取5支EP管并各加入1.0mL胶体金溶液，分别用0.02mol/LK2CO3调整pH值至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。分别取3.0μL 20μg/mL D-二聚体抗体溶液，加入0.01mol/L PBS溶液(pH7.4)100μL进行稀释，把稀释后的抗体溶液加入到各支EP管中。震荡使其混匀，然后室温静置10min。然后向各管中加入100μL 10.0％NaCl溶液，震荡后室温静置4h。用紫外分光光度计测定各管的OD525值，选取OD525值最高点对应的pH为最佳pH值8.5。
抗体最佳使用量的选择：取5支EP管并各加入1.0mL胶体金溶液，用0.02mol/LK2CO3调整pH值至上述中最佳pH值。另取5支EP管各加入100μL 0.01mol/L PB溶液(pH7.4)，分别加入浓度为20μg/mL的抗体1.0、2.0、3.0、5.0、7.0μL，然后把不同用量的抗体稀释液加入到胶体金溶液中。震荡使其混匀，然后室温静置10min。然后向各管中加入100μL 10％NaCl溶液，震荡后室温静置4h。用紫外分光光度计测定各管的OD525值，选取OD525值最高点对应的使用量为最佳使用量。
3、金标抗体的制备：
取所述的最佳使用量的D-二聚体单克隆抗体，加入100μL 0.01mol/L PB溶液(pH7.4)进行稀释；取胶体金溶液1.0mL，用0.02mol/L K2CO3溶液调节至最佳pH值，充分搅拌后逐滴加入稀释后的单克隆抗体溶液，混匀后静止20min。然后加入30μL 10％BSA(封闭液)溶液，搅拌混匀后，静止20min。将制备好的免疫胶体金溶液以10000r/min的转速离心8min，将沉淀用金胶缓冲液重悬，4℃保存备用。
以三种D-二聚体半抗原含量梯度作为硝酸纤维素膜上的检测线(T1、T2、T3线)，兔抗鼠抗D-二聚体抗体(二抗)作为质控线(C线)。将D-二聚体半抗原用PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L，1％甲醇)稀释20倍(浓度为1.0mg/mL)，用喷膜仪以喷量1.0μL/cm喷于硝酸纤维素膜上，其中T1＝3.0μL、T2＝3.0μL、T3＝6.0μL；在检测线上5mm处以喷量1.0μL/cm喷涂羊抗兔二抗(0.07mg/mL)，将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥2h，备用。用喷膜仪将鼠源：抗D-二聚体抗体-胶体金标记物按5.5μL/cm的量均匀喷涂在金标垫上，37℃干燥1h，备用。
组装：把硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫贴在PVC底板上，使样品垫与金标垫重合0.2cm(长度方向上)，金标垫与硝酸纤维素膜重合0.2cm(长度方向上)，硝酸纤维素膜与吸水垫重合0.3cm(长度方向上)，组装并切割成条。
4、结果判定：
将待测的血液用滤血膜过滤红细胞后，垂直滴于样品垫上，液体流动时开始计时，静置反应5min，观察结果。当只有质控线C显示为红紫色时，D-二聚体浓度为(4mg/L，+∞)；当质控线C与T1线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度为(2mg/L，4mg/L]；当质控线C与T1、T2线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度为(1mg/L，2mg/L]；当质控线C与T1、T2、T3线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度为(0，1mg/L]；当质控线C不显色时实验结果失效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于竞争抑制法的胶体金分段半定量检测试纸条，其特征在于，胶体金分段半定量检测试纸条包括依次粘贴在PVC板上的样品垫、抗体胶体金垫、半抗原包被的硝酸纤维素膜、二抗包被后的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述包被后的硝酸纤维素膜包含多条检测线和一条质控线；
所述质控线上包被兔抗鼠抗小分子二抗；
每条检测线上包被相同或不同浓度的半抗原。
2.根据权利要求1所述胶体金分段半定量检测试纸条，其特征在于，在所述PVC底板中央粘贴包被后的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫。
3.根据权利要求1所述胶体金分段半定量检测试纸条，其特征在于，所述每条检测线上包被的半抗原的量与待测物质的分段浓度相对应；所述半抗原包括多糖、类脂、核酸和某些小分子化合物。
4.根据权利要求3所述胶体金分段半定量检测试纸条，其特征在于，在所述胶体金分段半定量检测试纸条上的硝酸纤维素膜上设置3条检测线；
当所述抗原为D-二聚体时，3条检测线上，检测线T1上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T2上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原3.0μL，检测线T3上喷涂1.0mg/mL的D-二聚体半抗原6.0μL。
5.根据权利要求4所述胶体金分段半定量检测试纸条，其特征在于，所述抗体胶体金垫的包被方法，包括：将利用PB溶液稀释后的抗原的对应一抗，与调节pH值的胶体金溶液混合均匀，静置20min后，加入封闭液，静置后离心弃上清，利用金胶缓冲液对离心后的沉淀进行重悬，得一抗-胶体金标记物，将所述一抗-胶体金标记物喷涂在金标垫上，得所述抗体胶体金垫。
6.一种胶体金试纸的分段半定量检测体系，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述胶体金分段半定量检测试纸条。
7.根据权利要求6所述分段半定量检测体系，其特征在于，利用所述胶体金分段半定量检测试纸条对血液样本进行检测。
8.根据权利要求7所述分段半定量检测体系，其特征在于，以血液为检测样本时，只有质控线C显示红紫色时，结果其对应一阶梯浓度；当质控线C与T1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线C与T1、T2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线C与三条T线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度。当质控线C不显色时则试纸失效。
9.根据权利要求7或8所述分段半定量检测体系，其特征在于，只有当质控线C显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(4mg/L，+∞)；当质控线C与T1线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(2mg/L，4mg/L]；当质控线C与T1、T2线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(1mg/L，2mg/L]；当质控线C与T1、T2、T3线同时显示为红紫色时，D-二聚体浓度区间为(0，1mg/L]。
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