CN113552361A - 一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用，涉及食品安全检测领域。该试纸条能简单快捷地半定量检测金刚烷胺，而无需专业的仪器设备和专业的实验室辅助检测，使用方式简单无需进行技术培训，手动操作使用同时结果肉眼可直接识别，大大提高了实地现场对金刚烷胺的检测效率，方便了市场监管时就地取样调查得出结果，通过试纸条可以快速就地实现待测物的检测和结果判读。同时通过四条不同浓度梯度的检测线能够快速半定量判断金刚烷胺的残留含量，在金刚烷胺药物的快速免疫检测方面应用前景广阔，适用于大规模推广使用。

Description

一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，具体而言，涉及一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
金刚烷胺又称金刚胺、三环癸胺，可促进纹状体内的多巴胺能神经末梢运作，有利于中枢神经系统内的多巴胺和儿茶酚胺的相互作用，从而增加神经元内的多巴胺含量；此外，金刚烷胺又可作为抗病毒药物能够封闭宿主细胞膜上的通道，阻断RNA病毒进入宿主细胞，干扰病毒的复制进程。由于上世纪六七十年代许多国家出现A2型流感大流行，由美国FDA宣布金刚烷胺作为防治流感的抗病毒药物并被广泛使用，此外，金刚烷胺在治疗帕金森病及防治由甲型H1N1病毒引发的禽流感等方面有突出表现。
金刚烷胺的化学名为三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-胺，CAS登记号为768-94-5，分子式为C10H17N，相对分子量为151.249，化学结构式见式(Ⅰ)：
Figure BDA0003095731590000011
长期滥用金刚烷胺会造成病毒株的耐药性，同时人类过量摄入可导致中枢神经系统中毒，严重者可至脑动脉硬化。根据2005年我国农业部发布第560号公告，废止金刚烷胺在畜禽养殖业中相关使用标准。然而，近年来金刚烷胺在鸡肉鸡蛋中检出的情况时有发生。在畜禽产品中残留的金刚烷胺可以通过食物链进入人体进而危害人的身体健康，同时病毒株的耐药率上升也严重影响了国家动物疫病防控政策的实施，因此需要对金刚烷胺进行严格检测管控。
目前，传统的金刚烷胺检测方法包括色谱法、酶联免疫吸附法、光谱法和电化学传感器检测法等，这些方法存在仪器设备昂贵、操作流程复杂需求专业技术人员指导等问题，难以满足大通量的市场监控。因此，研究并开发成本低廉，操作简便，能够快速应用于实地现场金刚烷胺的检测手段具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半定量检测金刚烷胺的试纸条及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条，试纸条包括底板，在底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，硝酸纤维素膜上包被有四条检测线和质控线，四条检测线是指包被有四个浓度梯度的金刚烷胺抗原的检测线，质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线；X为羊或兔；胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
四条检测线沿层析方向金刚烷胺抗原的浓度依次递增，金刚烷胺抗原指金刚烷胺－牛血清白蛋白的偶联物。
在本发明应用较佳的实施方式中，沿层析方向，硝酸纤维膜上金刚烷胺抗原的浓度依次为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL。
本发明提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
在底板上，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接，酸纤维素膜上包被有四条检测线和质控线。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括在硝酸纤维素膜上间隔包被0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL浓度的金刚烷胺抗原作为四条检测线，并在硝酸纤维素膜上包被X抗鼠IgG作为质控线，且质控线与四条检测线间隔设置；
优选地，X抗鼠IgG的浓度为0.3－0.8mg/mL。
在本发明应用较佳的实施方式中，在硝酸纤维膜上，每0.5-2cm长度上喷1-2μL的金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm；
制备方法还包括在硝酸纤维膜上喷设金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG后进行干燥。
在本发明应用较佳的实施方式中，在将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物，并将金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金结合垫；
金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
每1mL胶体金溶液中添加2－4μL的金刚烷胺抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液40－50μL，添加40－45μL的1wt％BSA溶液；
优选地，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶；
优选地，每1－2cm的结合垫上喷2－5μL的金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物。
本发明还提供了一种检测金刚烷胺的试剂盒，其包括半定量检测金刚烷胺的试纸条以及壳体。
本发明还提供了一种使用半定量检测金刚烷胺的试纸条或检测金刚烷胺的试剂盒进行半定量检测金刚烷胺的方法，包括如下步骤：
将试纸条插入待检物质中或将待检物质滴在试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有4条均显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在0-50ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有3条均显色，而最小包被浓度的检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在50-100ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有2条均显色，而2条检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在100-200ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线仅有1条最高包被浓度的检测线显色，其余3条检测线均不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在大于200ng/mL；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
半定量检测金刚烷胺的试纸条或检测金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中残留金刚烷胺检测或中药材和中药饮片中残留金刚烷胺检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条，该试纸条能简单快捷地半定量检测金刚烷胺，而无需专业的仪器设备和专业的实验室辅助检测，使用方式简单无需进行技术培训，手动操作使用同时结果肉眼可直接识别，大大提高了实地现场对金刚烷胺的检测效率，方便了市场监管时就地取样调查得出结果，通过试纸条可以快速就地实现待测物的检测和结果判读。同时通过四条不同浓度梯度的检测线能够快速半定量判断金刚烷胺的残留含量，在金刚烷胺药物的快速免疫检测方面应用前景广阔，适用于大规模推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的试纸条结构示意图；
图2为试纸条组装流程示意图；
图3为半定量梯度检测金刚烷胺试纸条特异性的验证结果图；图中从左至右添加标样分别为：金刚烷胺、恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星；
图4为半定量梯度检测试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图；图中从左至右添加的金刚烷胺浓度分别为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL；
图5为当硝酸纤维素膜上划线浓度很低时，对比例1提供的试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图；图中从左至右添加的金刚烷胺浓度分别为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL；
图6为当硝酸纤维素膜上划线浓度很高时，对比例2提供的试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图；图中从左至右添加的金刚烷胺浓度分别为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条，试纸条包括底板，在底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，硝酸纤维素膜上包被有四条检测线和质控线，四条检测线是指包被有四个浓度梯度的金刚烷胺抗原的检测线，质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线；X为羊或兔；胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
四条检测线沿层析方向金刚烷胺抗原的浓度依次递增，金刚烷胺抗原指金刚烷胺－牛血清白蛋白的偶联物。
借助四条金刚烷胺抗原浓度递增的检测线可以实现待测产品中金刚烷胺含量的粗定量(也即为半定量)，从而为食品安全监管提供便利，例如可以根据试纸条显色的条带数判断该待测产品是否存在金刚烷胺含量超标。
需要说明的是，上述质控线使用的抗体要求能够与金标抗体偶联物相结合，符合此条件的抗体均可作为质控线划线使用。
在本发明应用较佳的实施方式中，沿层析方向，硝酸纤维膜上金刚烷胺抗原的浓度依次为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL。
发明人发现，选择硝酸纤维膜上金刚烷胺抗原的浓度依次在上述浓度条件下能够实现金刚烷胺的半定量，而当硝酸纤维膜上金刚烷胺抗原的浓度不在上述浓度梯度范围下时，无法实现金刚烷胺的半定量。例如当金刚烷胺抗原四条划线浓度均小于0.05mg/mL，即为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL和0.5mg/mL时，由于可用的金标抗体结合位点过少会导致阴性样本也无法产生条带，相反当金刚烷胺四条划线浓度均高于1.5mg/mL，即为1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL和3mg/mL时，可用的金标抗体结合位点过多会导致即使在阳性样品浓度很高的情况下，四条检测线均显色，从而失去检测意义。
本发明提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
在底板上，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接，酸纤维素膜上包被有四条检测线和质控线。
需要说明的是，上述粘接可以选择试纸条专用固定带固定粘接，也可以根据需要选择胶条等其他方式实现粘接。
可选的，平稳放置硝酸纤维素膜，佩戴防护手套将胶体金结合垫上部压到硝酸纤维素膜下部并固定，将样品垫上部压在胶体金结合垫下部并固定；互相之间重叠处设置为0.2cm；使用试纸条专用固定带贴纸固定硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫。紧贴硝酸纤维素膜上部粘贴吸水垫，重叠部分设置为0.2cm。试纸条组装好后剪裁成3mm的规格。
此外，在其他实施方式中，可以根据需要设置重叠的大小以及裁剪的规格。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述制备方法还包括在硝酸纤维素膜上间隔包被0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL浓度的金刚烷胺抗原作为四条检测线，并在硝酸纤维素膜上包被X抗鼠IgG作为质控线，且质控线与四条检测线间隔设置；
优选地，X抗鼠IgG的浓度为0.3－0.8mg/mL。
需要说明的是，上述羊抗鼠IgG的浓度为发明人经过大量的实验筛选而出的特定浓度，在上述浓度下，可以满足较广范围的待测产品的检测，并且在上述浓度下，质控线显色较为明显，便于肉眼观察。
在本发明应用较佳的实施方式中，在硝酸纤维膜上，每0.5-2cm长度上喷1-2μL的金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm；
例如：在硝酸纤维膜上，每1cm长度上喷1μL的金刚烷胺抗原或羊抗鼠IgG，相邻两条线之间的间距为0.3cm。
制备方法还包括在硝酸纤维膜上喷设金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG后进行干燥。可选的，在烘箱内干燥过夜，设置烘箱的温度为35－45℃。
在本发明应用较佳的实施方式中，在将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物，并将金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得胶体金结合垫。
需要说明的是，制备胶体金结合垫时，使用喷金机将金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上。
金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物。
例如10000rpm离心15min，离心弃上清。沉淀应呈现均匀紫红色，若离心管壁黏着有红色物质或底部是黑色泥状物表示标记失败。
每1mL胶体金溶液中添加2－4μL的金刚烷胺抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液40－50μL，添加40－45μL的1wt％BSA溶液；
优选地，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶。上述由于蔗糖具有亲水性，添加蔗糖更有利于金标抗体在结合垫上的释放，使用更少金标抗体的同时，最大程度提高试纸条显色，节省原材料例如选择添加200μL PB复溶，同时添加5wt％的蔗糖。
优选地，每1－2cm的结合垫上喷2－5μL的金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物。
本发明还提供了一种检测金刚烷胺的试剂盒，其包括半定量检测金刚烷胺的试纸条以及壳体。
需要说明的是，在其他实施方式中，可以设置壳体上具有加样孔以方便将待测样本液滴加在试纸条的样本垫上。
本发明还提供了一种使用半定量检测金刚烷胺的试纸条或检测金刚烷胺的试剂盒进行半定量检测金刚烷胺的方法，包括如下步骤：
将试纸条插入待检物质中或将待检物质滴在试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有4条均显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在0-50ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有3条均显色，而最小包被浓度的检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在50-100ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有2条均显色，而2条检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在100-200ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线仅有1条最高包被浓度的检测线显色，其余3条检测线均不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在大于200ng/mL；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
半定量检测金刚烷胺的试纸条或检测金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中残留金刚烷胺检测或中药材和中药饮片中残留金刚烷胺检测中的应用。
该试纸条的检测原理在于：将试纸条插在待检样本溶液中或者将待检样本溶液滴加于样品垫上，混匀后，待检样品液与胶体金结合垫上的金标抗体结合后一起在硝酸纤维素膜上扩散，方向为由样品垫至吸水垫；若待检样品液中金刚烷胺的含量高，则扩散过程中待检样品液中的金刚烷胺可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上与金刚烷胺抗原结合点，阻止金标抗体与硝酸纤维素膜上金刚烷胺抗原复合结合(待检液中的金刚烷胺竞争性结合胶体金结合垫上的金标抗体)，检测线不显色，而羊抗鼠IgG(或兔抗鼠IgG)则可与金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中金刚烷胺类药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与硝酸纤维素膜上金刚烷胺抗原结合，检测线显色，同时羊抗鼠IgG也可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。
而不同浓度的检测线上包被的金刚烷胺抗原的浓度可结合的金标抗体的能力不同，由此将待检样品液的浓度进行半定量。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
如下为本实施例以及实验例所使用的材料：牛血清白蛋白(BSA，分子量68kDa)、羊抗小鼠二抗IgG购自索莱宝公司。吸收垫、样品垫、吸水纸、塑料壳、硝酸纤维素膜(NC膜)和喷金机(BioDot XY-3000)等试纸条制作材料及设备均购自上海杰一生物有限公司；KOH等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。
金刚烷胺：购自天津阿尔塔科技有限公司。
金刚烷胺抗原、抗体：购自广州优抗多生物技术有限公司。
胶体金溶剂购自上海杰一生物有限公司。
pH7.5、0.1M的PBS缓冲液的制备方法：称量4.0g NaCl、0.1g KH2PO4、1.48gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至500mL。
0.01M，pH 7.4的磷酸缓冲液PB:称取KH2PO4 0.02g；Na2HPO4·12H2O 0.296g，用超纯水定容到1000mL，常温保存待用。
0.1M硼酸钾溶液，pH 8.3:分别称取KOH 0.397g，H3BO3 3.092g，溶解后使用超纯水定容到500mL，常温保存待用。
0.1％NaN3:称取0.1g NaN3，将其溶于100mL超纯水中，0.45μm过滤，常温保存待用。
1％BSA溶液:称取1g BSA溶于100mL超纯水中，过滤后添加0.1％的NaN3，使总体积稀释20倍防止蛋白质溶液变质。常温保存待用。
预处理液：在0.01M的PBS中加入0.1wt％BSA溶液，同时添加1％Tween-20溶液充分摇匀。
实施例1
本实施例提供了一种半定量检测金刚烷胺的试纸条，其结构图参照图1所示，T线为检测线，C线为质控线。
制备方法如下：
(1)金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物(即为金标抗体偶联物)的制备：
抗体的准备：待使用的金刚烷胺抗体使用PB溶液透析一次后，用蒸馏水透析2次，每4h换一次透析液。冷冻干燥后使用超纯水溶解为2mg/mL。
筛选最佳标记条件：准备5个1.5mL离心管，每管均加入胶体金1mL，0.1M硼酸钾溶液50μL(使用硼酸钾溶液调节胶体金溶液的pH)。轻柔颠倒，充分使溶液混匀，防止剧烈震荡破坏胶体金溶液稳定性。5个离心管中分别加入2μL、3μL、4μL、5μL、8μL前述的抗体溶液(2mg/mL)，在其他实施方式中可以根据需要改变抗体的添加量。轻柔颠倒混匀后每管加入10％NaCl溶液50μL。混匀后观察混合液颜色。选择颜色不变的作为添加抗体的合适浓度。本实施例确定的最佳标记条件添加3μL抗体溶液。
金刚烷胺抗体与胶体金偶联物的制备：根据试纸条制作量准备若干1.5mL离心管，每管加入1mL胶体金溶液，0.1M硼酸钾溶液50μL，轻柔颠倒混匀。添加3μL抗体溶液。混匀后每管加入40μL10％BSA溶液，混匀。10000rpm离心15min，离心弃上清。沉淀应呈现均匀紫红色，若离心管壁黏着有红色物质或底部是黑色泥状物表示标记失败。为了防止胶体金-抗体偶联物结构被破坏，需手动颠倒混匀。
需要说明的是，发明人发现必须按照硼酸钾、抗体的添加顺序进行配制，首先加入硼酸钾溶液平衡胶体金pH，之后加入抗体，轻柔颠倒混匀后形成胶体金-抗体偶联物。
工作液的制备：将上述步骤获得的沉淀使用200μL PB复溶，同时添加5wt％的蔗糖，添加蔗糖更有利于金标抗体在结合垫上的释放，使用更少金标抗体的同时，最大程度提高试纸条显色。
(2)组装试纸条(参照图2所示)。图2所示的图标：1.PB复溶后的金标抗体通过喷金机固定在金标垫上；2.试纸条底板；3.硝酸纤维素膜；4.划线为羊抗鼠二抗作为质控线；5.四条不同浓度梯度的金刚烷胺抗原作为检测线；6.吸水垫黏贴至底板上部；7.样品垫黏贴至底板下部。
先分别将金刚烷胺抗原和羊抗鼠二抗IgG用PB溶解，配置成系列浓度后，用来筛选合适的条件和灵敏度。
将金刚烷胺抗原按浓度梯度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL与羊抗鼠二抗IgG分别喷在硝酸纤维素膜上作为四条检测线(T线)和对照线(C线)，每两条线之间间距为0.3cm，硝酸纤维素膜每1cm喷样1μL。40℃烘箱干燥过夜。稀释液为PB。
将步骤(1)中的偶联物离心获得沉淀，分别使用200、400、800、1000和1200mL的PB复溶，从而筛选试纸条的最优工作条件，经筛选，200mL的PB为最优工作条件。
然后准备胶体金结合垫，使用喷金机将金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物均匀喷到结合垫上，每1cm结合垫喷3μL步骤(1)制备的金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物。40℃烘箱干燥过夜。
平稳放置NC膜，佩戴指套将胶体金结合垫上部压到NC膜下部并固定，将样品垫上部压在胶体金结合垫下部并固定；三者重叠处设置为0.2cm。使用试纸条专用胶带及贴纸固定NC膜、胶体金结合垫和样品垫。紧贴NC膜上部安装吸水垫。试纸条组装好后剪裁成3mm的规格。
对比例1
本对比例提供了一种试纸条，与实施例1的制备方法区别仅在于硝酸纤维素膜上的金刚烷胺抗原划线浓度：金刚烷胺抗原四条划线浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL和0.5mg/mL，其余的制备方法与实施例1相同。对比例1提供的试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图参照图5所示；图中从左至右添加的金刚烷胺浓度分别为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。
结果显示由于可用的金标抗体结合位点过少会导致阴性样本也无法产生条带。
对比例2
本对比例提供了一种试纸条，与实施例1的制备方法区别仅在于硝酸纤维素膜上的金刚烷胺抗原划线浓度：金刚烷胺四条划线浓度为1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL和3mg/mL，其余的制备方法与实施例1相同。对比例2提供的试纸条检测不同浓度金刚烷胺的结果图参照图6所示；图中从左至右添加的金刚烷胺浓度分别为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。
结果显示，可用的金标抗体结合位点过多会导致即使在阳性样品浓度很高的情况下，四条检测线均显色，从而失去检测意义。
实验例1
本实验例对实施例1制备的半定量梯度金刚烷胺快速免疫检测试纸条进行特异性评价和不同浓度金刚烷胺的检测评价。
本实验利用其他三种常见兽药：恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星检验了半定量梯度金刚烷胺检测试纸条的交叉反应。
分别用PB将恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星标准样品分别稀释成100ng/mL。滴加50μL标准样品溶液到实施例1制备的试纸条的样品垫中，15分钟内观测试纸条颜色，根据T线均不显色判断试纸条对其他三种兽药无交叉反应(参照图3所示)。
试纸条半定量检测范围的确定：
半定量检测范围指本试纸条提供的通过肉眼可见的试纸条显色线来判断待目标物质金刚烷胺的浓度范围。
将金刚烷胺标准液稀释为500、200、100、50ng/mL四个浓度，使用预处理液作为阴性对照，滴加50μL标准样品溶液到试纸条的样品垫中，15分钟内观测试纸条颜色，根据T线颜色深浅来判断试纸条最小消线浓度。
如图4所示，阴性样品中试纸条的4条T线及1条C线总计5条线显色，当金刚烷胺标准样品浓度上升至50ng/mL时，距离样品垫最近的一条T线即划线浓度最低为0.1mg/mL的T线受到抑制不显色，上方剩余4条线仍显色，即当使用本试纸条测试未知浓度金刚烷胺样品时，如果显色线为4条，可判定金刚烷胺浓度在0-50ng/mL之间；当金刚烷胺标准样品浓度上升至100ng/mL时，距离样品垫最近的两条T线即划线浓度为0.1mg/mL和0.2mg/mL的T线受到抑制不显色，上方剩余3条线仍显色，即当使用本试纸条测试未知浓度金刚烷胺样品时，如果显色线为3条，可判定金刚烷胺浓度在50-100ng/mL之间；同理当显色线条为2条时，金刚烷胺浓度在100-200ng/mL之间、当显色线条为1条时，即待测溶液中的金刚烷胺完全抑制T线显色，只有剩余C线显色，金刚烷胺浓度应在大于200ng/mL(结果参照图4所示)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种半定量检测金刚烷胺的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，在所述底板的表面沿层析方向依次铺设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，且所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定连接，所述硝酸纤维素膜上包被有四条检测线和质控线，四条所述检测线是指包被有四个浓度梯度的金刚烷胺抗原的检测线，所述质控线是指包被有X抗鼠IgG的质控线，所述X为羊或兔；所述胶体金结合垫上设有金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
四条所述检测线沿所述层析方向金刚烷胺抗原的浓度依次递增，所述金刚烷胺抗原指金刚烷胺－牛血清白蛋白的偶联物。
2.根据权利要求1所述的半定量检测金刚烷胺的试纸条，其特征在于，沿所述层析方向，所述硝酸纤维膜上所述金刚烷胺抗原的浓度依次为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL。
3.一种如权利要求1或2所述的半定量检测金刚烷胺的试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
在所述底板上，将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接，所述酸纤维素膜上包被有四条所述检测线和所述质控线。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在所述硝酸纤维素膜上间隔包被0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL浓度的金刚烷胺抗原作为四条检测线，并在所述硝酸纤维素膜上包被X抗鼠IgG作为质控线，且所述质控线与四条所述检测线间隔设置；
优选地，所述X抗鼠IgG的浓度为0.3－0.8mg/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述硝酸纤维膜上，每0.5-2cm长度上喷1-2μL的金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG，相邻两条线之间的间距为0.2-0.5cm；
所述制备方法还包括在所述硝酸纤维膜上喷设金刚烷胺抗原或X抗鼠IgG后进行干燥。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在将所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫进行拼接之前还包括制备金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物，并将所述金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物喷于结合垫上制得所述胶体金结合垫；
所述金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物的制备包括：将胶体金溶液、硼酸钾溶液、金刚烷胺抗体溶液和牛血清白蛋白溶液混合制得混合液，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB复溶制得金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物；
每1mL胶体金溶液中添加2－4μL的金刚烷胺抗体溶液，添加0.1M的硼酸钾溶液40－50μL，添加40－45μL的1wt％BSA溶液；
优选地，离心后的沉淀用磷酸缓冲液PB和5－10wt％的蔗糖复溶；
优选地，每1－2cm的结合垫上喷2－5μL的所述金刚烷胺抗体和胶体金的偶联物。
7.一种检测金刚烷胺的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-2任一项所述的半定量检测金刚烷胺的试纸条以及壳体。
8.一种使用权利要求1-2任一项所述的半定量检测金刚烷胺的试纸条或权利要求7所述的检测金刚烷胺的试剂盒进行半定量检测金刚烷胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述试纸条插入所述待检物质中或将所述待检物质滴在所述试纸条的样品垫上，根据条带判断检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据条带判断检测结果的方法包括：
若质控线显色，且检测线有4条均显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在0-50ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有3条均显色，而最小包被浓度的检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在50-100ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线有2条均显色，而2条检测线不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在100-200ng/mL之间；
若质控线显色，且检测线仅有1条最高包被浓度的检测线显色，其余3条检测线均不显色，则判定待检物质中的金刚烷胺浓度在大于200ng/mL；
若质控线不显色，无论检测线是否显色，均判定试纸条失效。
10.如权利要求1-2任一项所述的半定量检测金刚烷胺的试纸条或权利要求7所述的检测金刚烷胺的试剂盒在畜禽产品中残留金刚烷胺检测或中药材和中药饮片中残留金刚烷胺检测中的应用。
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