CN111141900B

CN111141900B - 一种免疫胶体金混合标记法

Info

Publication number: CN111141900B
Application number: CN202010091698.8A
Authority: CN
Inventors: 杨春江; 袁志波; 马孝斌
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111141900A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫胶体金混合标记法，具体包括下述步骤：步骤一、调整pH值；步骤二、添加结合物，将预定量的C线抗体添加在结合物中；步骤三、封闭；步骤四、添加稳定剂。本发明的免疫胶体金混合标记法，构建了仅与真C线结合的C线抗体，提高了免疫胶体金标记后无真C线结合能力的材料(受体或抗体)灵敏度，同时降低了假阳性。

Description

一种免疫胶体金混合标记法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫胶体金混合标记法。

背景技术

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，还原聚合成为特定大小的纳米金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金颗粒带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

侧向层析技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、简便、单人份检测、经济的优点,现已广泛应用于医学检测、食品质量监测、环境监测、农业和畜牧业、出入境检验检疫、法医定案等领域。

如图1所示，侧向层析技术以硝酸纤维素膜(NC膜)为载体，将特异性的抗原或抗体固定在NC膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用侧向移动，与结合垫上的胶体金或微球标记的试剂发生特异的免疫反应，再移动到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗体检测线(T线)捕获，聚集在检测带上，通过目测硝酸纤维素表面标记物(胶体金或乳胶颗粒)的光反射信号得到直观的显色结果。其它未结合的标记物则越过检测带，被指控线C线的抗体(通常是羊抗鼠)捕获。通过T线和C线的有无和颜色深浅实现待测物的定性或半定量检测。

抗体是免疫胶体金标记的主要标记物，如图2所示，抗体的空间结构呈Y字型，由两条轻链和两条重链组成。重链的氨基端与轻链组成与抗原结合的Fab段，两条重链的羧基端由二硫键连接组成保守的Fc段。

在免疫胶体金标记过程，抗体与胶体金颗粒的结合构型，在空间上具有方向性。为了描述这种空间结合构型的方向性，笔者将抗体的Fab段定义为头部(Head)，Fc段定义为脚部(Foot)。这样抗体分子与胶体金颗粒的空间结合构型有三种状态，分别如图3中的A、B、C所示：1，Fab段与胶体金颗粒结合态，头朝下结合态，Head-on；2，Fc段与胶体金颗粒结合态，脚朝下结合态，Foot-on；3，侧卧态，Side-on。在生产标记中发现，有一些抗体标记后，仅存在Foot-on结合态，或者Foot-on与Side-on结合混合态，而无Head-on结合态。在侧向层析试纸条的测试结果判读直观表现就是，T线显色强度良好，抑制率良好，但抗体C线显色非常弱，或不显色。

很多抗生素、农药、毒品的单克隆抗体很难筛选，使用受体蛋白检测，受体蛋白没有Fc段，不能够与抗体结合。

目前的解决方法是应用BSA封闭胶体金颗粒混合化学染料在NC膜上划假C线。假C线的显色强度是恒定的，无T线与C线强弱的消长变换，这就丧失了一部分的灵敏度。另外假C线与胶体金标记物的活性无关，与免疫金的活性状态不同步，不能指示免疫金的活性状态，在质量控制上容易造成假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫胶体金混合标记法，以解决上述问题。

本发明采用了如下技术方案：

一种免疫胶体金混合标记法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、调整pH值；

步骤二、添加结合物，将预定量的C线抗体添加在结合物中；

步骤三、封闭；

步骤四、添加稳定剂。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：

C线抗体的筛选过程如下：

步骤2-1，采用预定量的封闭蛋白包被酶标板；

步骤2-2，制备封闭蛋白单克隆抗体，培养上清1000倍稀释，OD_450nm值大于2.0；

步骤2-3，采用预定量的免疫胶体金直接标记，pH7.8～9.0；

步骤2-4，NC膜制备，T线加入预定量的封闭蛋白，C线加入预定量的羊抗鼠抗体，加入预定量的划膜液，然后进行烘膜；

步骤2-5，筛选条件：ELISA与封闭蛋白亲和力强，血清效价10万以上；与其他封闭蛋白无交叉反应；5ug/ml直接标记，10ul湿金，免疫胶体金T线不显色，C线显色强度大于1200，筛选得到C线抗体。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤一中：添加K₂CO₃调整pH值。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤二中，C线抗体的浓度是0.5～4.0ug/ml。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤三中，添加BSA进行封闭。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤2-3中，免疫胶体金直接标记的用量为5ug/ml。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤2-3中，采用0.2M K₂CO₃添加量0.25～10ul进行pH值调节。

进一步，本发明的免疫胶体金混合标记法，还具有这样的特征：步骤2-4中，T线加入0.5mg/ml封闭蛋白，C线加入0.5mg/ml羊抗鼠，划膜液为0.05M PBS，烘膜条件是40℃24h。

本发明的有益效果为：本发明的免疫胶体金混合标记法，构建了仅与真C线结合的C线抗体，提高了免疫胶体金标记后无真C线结合能力的材料(受体或抗体)灵敏度，同时降低了假阳性。

附图说明

图1是本发明背景技术中免疫胶体金试纸条的结构原理图；

图2是本发明背景技术中抗体的空间结构示意图；

图3是本发明背景技术中抗体分子与胶体金颗粒的空间结合构型的三种状态示意图(分别对应图3中A、B、C)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式来进一步阐述本发明的技术方案。

本发明的技术路线是，1，免疫封闭蛋白；2，筛选C线抗体；3，混合标记。

一、免疫封闭蛋白

本发明选择常用的封闭蛋白BSA、OVA、酪蛋白作为免疫原。封闭蛋白在自然样本中的含量丰度大，具有容易获得、特异性好、与其他检测物基本无交叉反应、成本低廉的优点，故本发明采用常用的封闭蛋白作为免疫原。

免疫程序共四次免疫：一免、二免、三免、加强免。具体免疫程序如下：

一免：D0天，弗氏完全佐剂，腹腔，50mg。

二免：D21天，弗氏不完全佐剂，皮下，30mg。

三免：D35天，弗氏完全佐剂，皮下，30mg。

加强免：D42天，弗氏不完全佐剂，腹腔，50mg。

二、筛选C线抗体

初次免疫后D45天，间接ELISA检测血清效价大于10万。无菌取免疫小鼠脾脏，SP20融合。

C线抗体筛选方案：

1，调节封闭蛋白浓度为5ug/ml，以100ul/well的量包被酶标板。

2，制备封闭蛋白单克隆抗体，培养上清经1000倍稀释后，OD_450nm值大于2.0，每种封闭蛋白30株。

3，纯化封闭蛋白单克隆抗体，调节浓度为5ug/ml，免疫胶体金直接标记，标记pH7.8～9.0(0.2M K₂CO₃添加量0.25～10ul)。

4，使用NC膜，T线为0.5mg/ml封闭蛋白，C线为0.5mg/ml羊抗鼠抗体，划膜液为0.05M PBS，40℃条件下干燥24h。

5，筛选条件：ELISA与封闭蛋白亲和力强，血清效价10万以上；与其他封闭蛋白无交叉反应；5ug/ml直接标记，10ul湿金，免疫胶体金T线不显色，C线显色强度大于1200。

三、混合标记

常规的免疫胶体金标记步骤是：1，调整pH值；2，添加结合物；3，封闭；4，添加稳定剂。因是直接添加结合物，故本发明命名为直接标记法。混合标记法与直接标记法的创新在于在才添加结合物步骤混合添加C线抗体，以实现与真C线羊抗鼠的结合，增加T线与C线强弱的消长变换，提高灵敏度。在生产实践中，对于受体和无真C线结合能力的单克隆抗体作为结合物的胶体金标记，本发明可以提高灵敏度30～100%。

Beta内酰胺受体WG001的直接标记和混合标记实例：

混合标记法与直接标记法的灵敏度对比实验方案：选择直接标记法生产的商品化用试纸条生产标记条件，这是直接标记法多轮优化后的最优生产条件，WG001的最佳标记浓度5ug/ml，pH值8.2(用0.2M K₂CO₃调pH值，2ul/ml Au)。混合标记中，C线抗体的筛选条件是，0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml。

抗体混合液的配制：

WG001，浓度5mg/ml，C线抗体，浓度5mg/ml，配制100ul抗体混合液如表1所示：

表1、100ul抗体混合液各组分ul数

标记步骤：

1)标记离心管：Mark笔标记5支5ml离心管，在管盖上分别标记0.5，1.0，2.0，4.0；

2)添加裸金：混匀胶体金裸金，每管加入3ml胶体金溶液；

3)添加K₂CO₃：在离心管管盖上添加6.0ul 0.2M K₂CO₃，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮；

4)添加抗体：在离心管管盖上添加30ul的混合抗体，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置10min；

5)添加BSA：在离心管管盖上添加30ul 10%BSA，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮，静置5min；

6)添加PEG：在离心管管盖上添加30ul 10%PEG，盖好离心管盖，涡旋混匀2轮；

7)离心：使用台式高速离心机，将离心管两两置于转子的对角处，12000rpm，离心4min；

8)弃上清：先用1ml移液器弃掉绝大部分上清，再用200ul弃掉沉淀表面残液(剩余约50ul，以不吸起金沉淀为准)；

9)重悬复溶：每管加入300ul复溶液，摇晃重悬，试管底部沉淀金全部悬起，涡旋混匀2轮，备用。

本发明Beta内酰胺类侧向层析试纸条的质控标准为：阴性T值1300～1500，C值大于200，T/C值大于3.0；阳性青霉素G1ppb，T/C值0.7～0.9。直接标记与混合标记的结果如表2所示(每个条件平行测试3条取平均值)：

表2、直接标记与混合标记测试结果

直接标记法，最优灵敏度为青霉素G1.0ppb，混合标记法最优灵敏度为0.5ppb，WG001的标记灵敏度混合标记法与直接标记法比较由1.0ppb提高到0.5ppb。可见本发明所提供的标记法，灵敏度有了较大的提升。

Claims

1.一种免疫胶体金混合标记法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、添加裸金后，添加K₂CO₃调整pH值；

步骤二、添加结合物，将预定量的C线抗体添加在结合物中；

步骤三、添加BSA封闭；

步骤四、添加稳定剂；

其中：步骤二中所述结合物为无Fc段的受体蛋白；

步骤二中所述C线抗体的筛选过程为：

步骤2-1，采用预定量的封闭蛋白包被酶标板，所述封闭蛋白为BSA或OVA或酪蛋白；

步骤2-2，制备封闭蛋白单克隆抗体，培养上清1000倍稀释，OD值大于2.0；

步骤2-3，采用预定量的免疫胶体金直接标记，pH7.8～9.0；

步骤2-5，筛选条件：ELISA与封闭蛋白亲和力强，血清效价10万以上；与其他封闭蛋白无交叉反应；5ug/ml直接标记，10ul湿金，免疫胶体金T线不显色，C线显色强度大于1200，筛选得到C线抗体；

所述C线抗体的浓度是0.5～4.0ug/ml。

2.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤2-3中，免疫胶体金的用量为5ug/ml。

3.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤2-3中，采用0.2M K₂CO₃添加量0.25～10ul进行pH值调节。

4.根据权利要求1所述的免疫胶体金混合标记法，其特征在于：

步骤2-4中，T线加入0.5mg/ml封闭蛋白，C线加入0.5mg/ml羊抗鼠抗体，划膜液0.05MPBS，烘膜条件是40℃24h。