CN111735956A - 一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法，本发明基于竞争免疫层析方法,将包被抗原、抗体和待测物共同组成的三元体系，通过梯度减少抗体浓度，可改变方法的灵敏度，即通过设置4条包被有抗原的检测线，梯度降低抗体的反应浓度，在单一试纸条构建多级灵敏度的免疫反应，结合荧光微球的高灵敏特性，构建了基于普通荧光手电照射肉眼可直接读取的西布曲明竞争免疫层析半定量检测方法。该方法是荧光微球免疫层析技术在西布曲明检测中的首次应用，操作步骤简便、经济成本低、灵敏度高、结果可靠，可用于保健食品中西布曲明非法添加物的定性和半定量筛查分析，满足西布曲明现场快速筛查的需要。
Description
【技术领域】
本发明涉及西布曲明检测方法，尤其是一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法。
【背景技术】
西布曲明(sibutramine)作为一种合成类减肥药，化学式为C17H26ClN，在临床医学上主要用于肥胖症的治疗，通过控制神经中枢来抑制食欲。主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取，増加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，进而使下丘脑饱食中枢兴奋，抑制食欲，降低碳水化合物的吸收，减轻体重。长期服用西布曲明可导致眩晕、抑郁、焦虑和协调功能下降等严重精神症状，甚至具有非致死性心脏病发作、非致死性中风等严重心血管疾病风险。《中华人民共和国食品安全法》第三十八条明确规定，生产经营的食品中不得添加药品，即不得在保健食品中添加药物成分。然而由于西布曲明具有良好的减肥效果，导致减肥类保健食品，特别是网络出售的减肥类食品中非法添加西布曲明的案例屡见不鲜。
目前国内外检测西布曲明及其类似物的方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、离子迁移谱法、离子迁移谱-质谱联用法、流动注射电化学发光法、毛细管电泳法、红外光谱法等。尽管这些方法能够检测西布曲明及其类似物，但所用仪器大多昂贵，且样品需前处理的耗时长，以及对环境有污染。
近年来随着标记材料的发展，免疫层析法迈入定量检测阶段。然而这些量化数据仍然需要专门的扫描仪进行读取，仪器不便携带且增加了检测成本。不借助仪器对目标物进行量化分析正成为当前一个新的研究热点。近期有研究通过设置多条包被有捕捉抗体的T线，实现了与待测物正相关的梯度显色，从而分别建立了降钙素原和马铃薯病毒X的免疫层析半定量检测方法。然而该方法必须使用两个抗体识别一个待测物，不适合于西布曲明等小分子检测。也有人认为通过不断稀释，试验出达到方法检出限所需的稀释倍数，也可估算出待测物浓度，然而该方法的缺点是过于耗时。
本发明即针对现有技术的不足而研究提出。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法。免疫层析法在过去很长一段时间都被作为定性检测方法，随着可见光或荧光层析试纸扫描仪的推出，定量免疫层析成为研究的热点。然而在实际应用上，因为样品基质的复杂性，免疫层析定量仍具有较大的误差，只能对含量进行大致判断。因此，研制不需要配套扫描仪的免疫层析半定量检测方法将有助于降低检测成本，方便现场检测。本发明基于竞争免疫层析方法，将包被抗原、抗体和待测物共同组成的三元体系，通过梯度减少抗体浓度，可改变方法的灵敏度，即通过设置4条包被有抗原的检测线，梯度降低抗体的反应浓度，在单一试纸条构建多级灵敏度的免疫反应，结合免疫荧光微球的高灵敏特性，构建了基于普通荧光手电照射肉眼可直接读取的西布曲明竞争免疫层析半定量检测方法。该方法是荧光微球免疫层析技术在西布曲明检测中的首次应用，操作步骤简便、经济成本低、灵敏度高、结果可靠，可用于保健食品中西布曲明非法添加物的定性和半定量筛查分析，满足西布曲明现场快速筛查的需要。
为解决上述技术问题，本发明一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法，包括如下步骤：
A、取样。取样品，加入0.01M pH 7.4PBS中，沉淀或离心，得到上清液，作为待测液；
B、制备西布曲明抗体-荧光微球偶联物。将免疫荧光微球，EDC，NHS按1:1:1的比例投料，并加入500-1500倍质量的去离子水，活化，接着离心去除上清液,接着加入pH 7.4的0.01M PBS重悬，通过保护标记法将免疫荧光微球偶联至西布曲明抗体，标记完成后，西布曲明抗体-荧光微球偶联物离心去除上清液，加入复溶液重悬抗体-荧光微球偶联物，所述复溶液为含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG20000、0.5％Tween-20、0.1％proclin300的0.01MpH 7.4PBS溶液，之后，在聚苯乙烯微孔中加入西布曲明抗体-荧光微球偶联物，冻干后作为反应杯；
C、制备荧光试纸条，将0.2mg/mL的西布曲明包被抗原划4条平行线于NC膜上，从上到下分别记为检测1线，检测2线，检测3线和检测4线，于30-40℃真空干燥6-20h，室温真空干燥8-16h，最后将吸水纸和NC膜贴在PVC底板上，并切成3-6mm宽的试纸条，并放在室温条件下真空干燥以备用；
D、确定试纸条最低检测出限，用不同浓度的西布曲明标准溶液滴加到检测卡上，记录检测1线，检测2线，检测3线，检测4线消失的浓度为标志参考浓度，其中仅检测1线刚好消失的浓度为试纸条的最低检测出限；
E、检测比对，取步骤A的待测液，加入到反应杯中，搅拌均匀，在不小于15℃的室温环境中反应3-10min，反应后上样，进行免疫层析分析；将聚苯乙烯微孔中的液体转移至检测卡的加样孔中，层析5-15min,用荧光手电筒照射后观察结果；当检测1线、检测2线、检测3线和检测4线同时显色，结果为阴性；当检测1线消失，结果为阳性。
如上所述一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法，所述步骤B中，在聚苯乙烯微孔中加入2μg西布曲明抗体-荧光微球偶联物，并以荧光微球质量计。
与现有技术相比较，传统的免疫层析定量方法需要使用扫描仪等专用检测仪器对光密度进行计算，不易随身携带。本发明通过设置4条检测线，逐级捕捉未与目标药物结合的抗体，显示的条带越多说明体系中的目标药物浓度越低，从而实现基于肉眼观察的西布曲明免疫层析半定量检测。该方法对实际样品的检出限为0.5μg/kg，定性上未发现假阳性或假阴性，定量结果也具有一定的参考意义。采用本发明方法，具有步骤简单、操作方便、经济成本低的特点，能满足西布曲明现场快速筛查的需要。
另外，本发明方法中标记抗体需要和多条检测线进行反应，工作浓度比单检测线的免疫层析法要高，因此需要更高浓度的西布曲明才能产生抑制，导致灵敏度略差。故本发明以荧光材料作为抗体标记物能大幅度提高免疫层析灵敏度，从而使得目视读取免疫层析检测法灵敏度符合应用要求。
【附图说明】
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，其中：
图1西布曲明目视读取-免疫层析检测法及试纸条结构示意图；
图2不同吐温-20浓度对试纸条显色效果的影响；
图3不同NC膜对试纸条显色效果的影响；
图4西布曲明荧光免疫层析动态荧光曲线；
图5西布曲明最低检出限和最大可检出浓度；
【具体实施方式】
下面结合附图1-5对本发明的实施方式作详细说明。
1材料与方法
1.1材料与试剂
硝酸纤维膜(NC膜)、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸及PVC底板；氨基修饰的免疫荧光微球(材质为聚苯乙烯)；西布曲明类标准品(西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、苄基西布曲明、豪莫西布曲明)，以及其他试剂，其他试剂均为国产分析纯。西布曲明单克隆抗体和西布曲明抗原由深圳市三方圆生物科技有限公司提供。
上述中硝酸纤维膜(NC膜)、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸及PVC底板购于美国Millipore公司，氨基修饰的荧光微球采用辉质生物产品，其相关参数为：直径0.2μm、激发波长488nm,发射波长525nm。西布曲明类标准品购于加拿大TRC公司。
1.2仪器与设备
图片拍摄设备为产自华为的荣耀8，该荣耀8摄像头能覆盖美国BIOTEK 540nm±25nm滤光片；产自浙江隆业电器的470nm±30nm、100mW LED手电筒；产自美国Bio-Dot公司的XYZ3100点膜仪；产自美国Millipore公司的Milli-Q水处理系统。
1.3方法
1.3.1西布曲明抗体-荧光微球偶联物制备
将免疫荧光微球，EDC，NHS按1:1:1的比例投料，并加入1000倍质量的去离子水。活化过夜后，离心去除上清液，再加入pH 7.4的0.01M PBS重悬。通过保护标记法将免疫荧光微球偶联至西布曲明抗体，标记完成后，西布曲明抗体-荧光微球偶联物离心去除上清液，加入复溶液重悬抗体-荧光微球偶联物，复溶液为含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG20000、0.5％Tween-20、0.1％proclin300的pH7.4 0.01M PBS的溶液。之后，在聚苯乙烯微孔中加入2μg西布曲明抗体-荧光微球偶联物，以荧光微球质量计，冻干后作为反应杯。
1.3.2荧光试纸条的制备
荧光试纸条结果如图1所示。将0.2mg/mL西布曲明包被抗原按图1所示划4条平行线于NC膜上，从上到下分别记为检测1线，检测2线，检测3线和检测4线。于37℃真空干燥12h，室温真空干燥12h。最后将吸水纸和NC膜贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，室温条件下真空干燥，备用。
1.3.3试纸使用方法及方法检出限
在反应杯中加入100μL样品液体，搅拌均匀，在不小于15℃的室温环境中反应5min。将微孔中的液体转移至检测卡的加样孔中。层析10min观察结果，用荧光手电照射后观察结果，四条检测线同时显色结果为阴性，检测1线消失时结果为阳性。用不同浓度的西布曲明标准溶液滴加到检测卡上，分别记录检测1线，检测2线，检测3线，检测4线消失的浓度为标志参考浓度，其中仅检测1线刚好消失的浓度为该试纸检测方法的最低检出限。
1.3.4前处理及上样方法
取样品1.00g，加入9mL 0.01M pH 7.4的PBS中，沉淀5min或者取样品2000g，离心1min；之后取上清液100μL作为待测液，加入到反应杯中，反应后上样，进行免疫层析分析。
1.3.5真实样品的方法比对
采购声称有减肥功效的食品或保健食品50份，使用本发明建立的方法和国家食品补充检验方法《食品中西布曲明等化合物的测定》(BJS201701)所规定的液质法法进行对照检测。
2结果与分析
2.1表面活性剂浓度对显色效果的影响
本发明目视读取荧光半定量免疫层析检测法是以标记抗体依次结合4条检测线为原理，判断药物对标记抗体的抑制程度，从而估算样品中的药物含量。由于需要尽可能的让标记抗体和依次经过的检测线充分反应，所以层析速度要比单检测线层析慢。表面活性剂可以增加标记抗体在层析体系中的分散性，从而增加层析速度。本发明首先选用了单检测线免疫层析中常用的含0.5％吐温-20的复溶液，上样后8min即可达到显色稳定。然而,如图2所示，0.5％吐温-20的反应体系使得层析速度过快，标记抗体不能和检测线上的包被抗原充分反应，导致多条检测线弱显色。而0.02％吐温-20则含量过低，标记抗体分散性交叉，无法顺利层析。本发明在0.1％吐温-20的反应体系下，可获得最佳的显色效果，即该处理下条带显示清晰且条带数较少。
2.2NC膜对显色效果的影响
NC膜是影响免疫层析速度的另外一个因素，其孔径越大层析速度越快。本发明选用了三种常用于免疫层析的膜，按孔径由大到小分别为Sartorius CN95，SartoriusCN140，Pallvivid170。经测试，由于孔径过小，本发明所用的荧光纳米颗粒在Pallvivid170膜上层析阻滞。如图3所示，Sartorius CN95由于流速过快，待测物显色效果不及Sartorius CN140。本发明也曾通过调节表面活性剂吐温-20浓度以降低Sartorius CN95的流速，但是表面活性剂浓度调节至0.02％时，在Sartorius CN95上同样出现了层析阻滞。因此本发明具体实施例采用Sartorius CN140作为试纸条NC膜。
2.3抗原抗体浓度对灵敏度的影响
经发现，上样的抗体，即西布曲明抗体-荧光微球偶联物浓度以及试纸条包埋的抗原浓度对检测灵敏度具有重要影响，优化免疫层析体系中抗体、抗原浓度是目视读取荧光半定量免疫层析检测法成功与否的关键。结果表明，检测线抗原浓度或荧光标记抗体量过低，将会导致无法获得清晰的检测线，而且还会导致定量试纸条稳定性差且保质期较短；相反它们浓度过高，虽然能获得清晰的检测线，即强显色，但因为抗原或抗体的过量，也会影响竞争免疫检测方法的灵敏度。如表1所示，当荧光标记抗体量为2μg和检测线抗原浓度为0.2μg/mL时，能获得清晰的检测线，此时灵敏度最高，检出限低至0.05μg/mL；而荧光标记抗体量和检测线抗原浓度均翻倍，此时抗体为4μg、抗原为0.4μg/mL，尽管检测线上具有较强的显色，但是试纸条能达到的最低检测浓度却差了40倍，故只能达到2.0μg/mL。本发明最终选取荧光标记抗体量为2μg，检测线抗原浓度为0.2μg/mL。
表1抗体量和抗原量的正交分析
2.4层析时间的确定
免疫层析是一个动态反应的过程，因此确定合适的层析时间及关系到结果的准确也影响到检测时效。本发明使用纯水和0.05μg/mL西布曲明溶液作为另一待测液，使用荧光扫描仪分别扫描检测1线和检测2线。结果如图4所示，免疫层析在在10min时达到平衡，因此10min作为本方法的最佳层析时间。
2.5检测方法评估
本发明方法的优点在于不需要使用复杂的分析仪器，在评估时采用价格便宜且便携的LED荧光手电作为激发光源，在滤光片的辅助下目视读取荧光信号。滤光片的作用是滤除杂光，以得到清晰的条带。图5显示的是在暗室下采用手机对荧光微球免疫层析试纸条进行拍照的结果，该手机摄像头可覆盖540±25nm滤光片。由图可以看出，0.05μg/mL西布曲明可将检测线1完全抑制消带，即为试纸条西布曲明的最低检测限；在9.00μg/mL时4条检测线均不可见，即为该方法检测西布曲明的最大浓度值。如果样品中西布曲明浓度过高，即大于9.00μg/mL，将会导致4条检测线均不可见，需要再次稀释100倍，使得待测液中西布曲明的浓度在试纸条的检测范围0μg/mL～9.00μg/mL内。基于上述条件，以线性范围的最低点0.05μg/mL乘以其样本前处理稀释倍数10，得到实际样品的最低检出限为0.5mg/kg，这与目前报道的西布曲明胶体金免疫层析方法的检出限相当。
西布曲明属于一类结构相似功能相近的药物家族，常见的还包括N-单去甲基西布曲明，N,N-双去甲基西布曲明，苄基西布曲明和豪莫西布曲明。本发明依据国家食品补充检验方法《食品中西布曲明等化合物的测定》(BJS 201701)，测试了其中列出的违法添加减肥降脂类化合物的交叉反应。该方法对西布曲明家族药物均有交叉反应，和其他常见违法添加在保健食品中的减肥降脂类化合物无交叉反应，如表2所示，说明该方法对西布曲明类药物具有良好的广谱特异性。
表2与各减肥类药物的交叉反应率
2.5实际样品检测
分别采用本发明新建立的目视读取荧光免疫层析法和国标规定的LC-MS/MS法对从网络购买的50份声称有减肥功效的食品、保健食品样品进行检测。结果显示，目视读取荧光半定量免疫层析法检测到西布曲明类药物的样品有10份，检出率为20％，未检出的有40份，而且其中有一个样品，为样品6。非法添加的单去甲基西布曲明也能被检出，未观察到假阳性，该目视读取荧光免疫层析法与国标方法的检测结果完全一致。表3显示，在被检出10个阳性样品中，所有的LC-MS/MS确证结果均能落在目视读取免疫层析法的半定量区间内，表明这两种方法具有良好的正相关性。由此可见，目视读取免疫层析法能够满足西布曲明快速定性、半定量检测的需求，可为后续LC-MS/MS的确证工作提供参考依据。
表3两种方法检测食品中西布曲明含量(n＝6)
3结论
本发明建立了可基于肉眼直接读取结果的西布曲明半定量荧光微球竞争免疫层析检测方法。通过梯度降低竞争免疫层析反应体系中抗体的浓度，在单一试纸条中完成多个灵敏度不同的免疫反应，检测条带的显示数目随着目标待测物浓度的增加而逐渐减少，实现了依靠普通荧光手电照射、肉眼直接读取结果的定性、半定量西布曲明检测方法。该方法通过试纸条上显色条带的数量即可对西布曲明进行半定量分析，方法简单、方便、成本低，灵敏度高，方法灵敏度与现有的西布曲明胶体金免疫层析方法相当，定性上未发现假阳性或假阴性，同时在定量结果具有一定的参考意义，能满足西布曲明快速筛查的需要。本发明提出的免疫层析半定量检测模式具有通用性，不仅适用于西布曲明检测，也能为其他药物的半定量检测提供新的研究思路。
本发明通过在免疫层析的NC膜上设置多条检测线，使标记抗体在不同的西布曲明浓度作用下，与检测线展现出不同的效果。标记抗体依次通过检测4线至检测1线。当西布曲明浓度较大时，大部分抗体因结合了西布曲明，从而不再和更多的检测线进行结合；而当西布曲明浓度较低时，检测4线并不能结合全部的标记抗体，使得标记抗体还能继续和其他的检测线依次结合，直到结合完毕，因此通过肉眼观察条带显示情况，即可对样品中西布曲明的浓度进行半定量判断。
对于本发明目视读取荧光半定量免疫层析检测法，在商品化使用时，首先是试纸的保质期要能达到商品化条件。该方法需要标记抗体和多条质控线进行充分反应，层析速度较单检测线层析法慢。为控制层析速度，表面活性剂加入量更少，NC膜的孔径也比较小，在长时期保持后标记抗体能否保持分散性和通过性需要进一步测试。此外，作为商品化的层析试纸，还需设置质控线。
Claims (2)
1.一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法，其特征在于包括如下步骤：
A、取样，取样品，加入0.01M pH 7.4PBS中，沉淀或离心，得到上清液，作为待测液；
B、制备西布曲明抗体-荧光微球偶联物，将免疫荧光微球，EDC，NHS按1:1:1的比例投料，并加入500-1500倍质量的去离子水，活化，接着离心去除上清液,接着加入pH 7.4的0.01M PBS重悬，通过保护标记法将免疫荧光微球偶联至西布曲明抗体，标记完成后，西布曲明抗体-荧光微球偶联物离心去除上清液，加入复溶液重悬抗体-荧光微球偶联物，所述复溶液为含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG20000、0.5％Tween-20、0.1％proclin300的0.01MpH 7.4PBS溶液，之后，在聚苯乙烯微孔中加入西布曲明抗体-荧光微球偶联物，冻干后作为反应杯；
C、制备荧光试纸条，将0.2mg/mL的西布曲明包被抗原划4条平行线于NC膜上，从上到下分别记为检测1线，检测2线，检测3线和检测4线，于30-40℃真空干燥6-20h，室温真空干燥8-16h，最后将吸水纸和NC膜贴在PVC底板上，并切成3-6mm宽的试纸条，并放在室温条件下真空干燥以备用；
D、确定试纸条最低检测出限，用不同浓度的西布曲明标准溶液滴加到检测卡上，记录检测1线，检测2线，检测3线，检测4线消失的浓度为标志参考浓度，其中仅检测1线刚好消失的浓度为试纸条的最低检测出限；
E、检测比对，取步骤A的待测液，加入到反应杯中，搅拌均匀，在不小于15℃的室温环境中反应3-10min，反应后上样，进行免疫层析分析；将聚苯乙烯微孔中的液体转移至检测卡的加样孔中，层析5-15min,用荧光手电筒照射后观察结果；当检测1线、检测2线、检测3线和检测4线同时显色，结果为阴性；当检测1线消失，结果为阳性。
2.根据权利要求1所述一种快速检测减肥类保健食品中西布曲明的方法，其特征在于所述步骤B中，在聚苯乙烯微孔中加入2μg西布曲明抗体-荧光微球偶联物，并以荧光微球质量计。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201002 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |