CN113588962B - 一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素b1的方法 - Google Patents

一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素b1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法，属于免疫分析快速检测技术领域。本发明所述的方法包括如下步骤：(1)样品前处理：在待测物中加入提取液进行提取，得到提取液；(2)将Eu3+‑荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu‑FB1‑mAb和提取液混合均匀，孵育，得到待测溶液；(3)将待测溶液加入荧光免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，然后测试荧光免疫定量试纸条上T线的荧光强度值；(4)将T线的荧光强度值代入标准曲线，得到待测物中伏马毒素B1的浓度。本发明的方法中采用的荧光免疫定量试纸条具有灵敏度高、成本低廉、操作简便、快速定量检测、稳定性好，市场前景广阔，易推广使用。

Description

一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法
技术领域
本发明涉及一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法，属于免疫分析快速检测技术领域。
背景技术
伏马毒素B1(fumonisin)主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、轮状镰刀菌(Fusarium verticlllioides)和多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等真菌产生，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯型水溶性代谢产物。
目前发现的伏马毒素B1有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP共11种，其中FB1为其主要组分，含量占伏马毒素B1的70％-80％，且毒性最强。伏马毒素B1会对人和动物的健康产生严重危害，导致人神经管型缺陷症、食道癌及心血管疾病，在动物中引发马脑白质软化综合症、猪肺水肿、啮齿动物肝脏和肾脏损伤等。研究表明，伏马毒素B1特别是FB1广泛存在于玉米及其制品中；在大米、小麦、大麦、调味品、高粱、啤酒、牛奶等食品、中药和饲料中也有一定浓度的伏马毒素B1存在，对人的健康和畜牧业发展构成潜在威胁。
尽管伏马毒素B1的潜在危害很大，但是目前国际上对伏马毒素B1在食品中的限量尚无统一标准，并且也少有国际组织针对伏马毒素B1制定细致完善的限量标准。欧盟规定供人类直接食用的玉米制品中FB1和FB2的总量应低于400μg/kg-1，玉米粉(粒度≤500μm)中FB1和FB2的总量应低于1mg/kg；玉米(未加工)中FB1和FB2的总量应低于2mg/kg；美国FDA指出玉米面及其制品(脂肪含量≥2.25％)中FB1、FB2、FB3的总量应低于2mg/kg；且规定动物饲料中FB1、FB2、FB3的总量不超过100mg/kg；我国仅在动物饲料的卫生标准中规定，饲料原料中玉米及其加工制品、玉米酒精类产品、玉米青贮饲料和玉米秸秆中FB1和FB2总量应低于60mg/kg；
在GB5009.240-2016中规定了三种针对玉米及其制品中伏马毒素B1的检测方法：免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱联、免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法；其他方法还有酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金法及近红外光谱法等。其中高效液相色谱法(HPLC)因其测量准确、灵敏度高、重现性好而应用广泛，是对伏马毒素B1进行定量分析的主要手段，检测限可以达到0.05-0.1mg/kg。但是HPLC法需要高纯度的标准品、待测样品需要进行前处理、相关仪器价格昂贵且操作复杂，这些问题限制了HPLC法的应用。
相对于使用精密仪器的传统检测方法，免疫分析法利用毒素诱发免疫反应产生抗体，抗体和抗原进行特异性结合来进行毒素检测，其操作简单、方便携带、成本较低，适用于进行现场快速筛选，是比较理想的检测方法。目前市场上已有检测伏马毒素B1的胶体金免疫层析试纸条，如中国专利CN211505566U、CN101661043A，但是采用胶体金作为识别探针，胶体金颗粒粒径均一性较差，免疫标记物不稳定，只能进行定性检测，在现场快速检测中无法满足快速定量检测的需求。
目前，我国农产品受到伏马毒素B1污染的情况依然不容乐观，人们也愈发重视食品的质量，传统检测方法已无法满足需求，因此急需建立一种灵敏度更高，并且可以用于现场快速、高通量检测食品中伏马毒素B1的方法。
发明内容
[技术问题]
目前市场上已有检测伏马毒素B1的胶体金免疫层析试纸条通常是采用胶体金作为识别探针，胶体金颗粒粒径均一性较差，免疫标记物不稳定，只能进行定性检测，在现场快速检测中无法满足快速定量检测的需求。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明采用荧光微球替代传统的胶体金，用荧光微球标记伏马毒素B1抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，可以在常温下对样品中的伏马毒素B1进行快速定量分析。
本发明第一个目的是提供一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法，包括如下步骤：
(1)样品前处理：在待测物中加入提取液进行提取，得到提取液；
(2)将Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb和提取液混合均匀，孵育，得到待测溶液；
(3)将待测溶液加入荧光免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，然后测试荧光免疫定量试纸条上T线的荧光强度值；
(4)将T线的荧光强度值代入标准曲线，得到待测物中伏马毒素B1的浓度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的提取液为乙腈水溶液，其中乙腈的体积浓度为50％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述提取的条件为：在20-30℃(常温)下提取20-40min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述待测物和提取液的用量比以g/mL计为1:5-20，进一步优选为1:10。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述提取之后离心，取上清液，收集，得到提取液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb(探针溶液)和提取液的体积比为1:5-7，进一步优选为1:6。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的孵育是30-40℃、500rpm震荡孵育5-15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb是通过EDC和NHS介导活化作用与抗体分子的氨基结合，形成酰胺键而制备得到的；Eu3+-荧光微球的粒径250-350nm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的荧光免疫定量试纸条的制备方法包括如下步骤：
将0.03-0.3mg/mL伏马毒素B1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T，将0.5-2.0mg/mL羊抗鼠IgG溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为质控线C，37℃干燥2-4h；其中检测线T和质控线C的距离为4.0-6.0mm，检测线T和质控线C的宽度为3.0-5.0mm；
之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条；样品垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠2.0-4.0mm；吸水纸叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠2.0-4.0mm；检测线T距离样品垫的距离为4.0-6.0mm，质控线C距离吸水纸的距离为4.0-6.0mm；
最后，用切条机将粘贴好的板切成约3.0-5.0mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到荧光免疫定量试纸条，4℃密封保存备用。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述荧光免疫定量试纸条的制备方法中伏马毒素B1完全抗原溶液和羊抗鼠IgG溶液都是采用0.01M pH 7.0-7.5的磷酸缓冲液(PBS)稀释的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述待测溶液在荧光免疫定量试纸条的样品垫上用量为60-80μL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述层析是37℃下层析10-20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述荧光强度值是利用HG-98免疫层析定量分析仪测定。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述标准曲线为：
当伏马毒素B1的浓度范围为0.75-10.0ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，Y＝-65.47LgX+86.36，其中Y为T/T0，X为伏马毒素B1的浓度；R2＝0.9914，检测限可达到1.211ng/mL。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法在食品检测领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是市售玉米制品中伏马毒素B1的检测。
[有益效果]
(1)本发明所述的方法能够实现快速定量检测玉米制品中伏马毒素B1的含量，特异性强、灵敏度高，其中当伏马毒素B1的浓度范围为0.75-10.0ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝-65.47LgX+86.36，R2＝0.9914，检测限可达到1.211ng/mL。
(2)本发明所述的方法检测范围广，其定量的线性范围能够达到0.75ng/mL-10.0ng/mL，该检测方法稳定可靠，样品添加回收率为97.25％-111.55％，变异系数均小于4.28％。
(3)本发明所述的方法以伏马毒素B1单克隆抗体作为识别靶点，以荧光微球为信号源，荧光微球的体积远大于传统荧光染料分子的体积，不但可以有效消除非特异性荧光干扰，粒径均一，表面功能基团稳定可控，实验重复性较好，检测特异性强，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为即时检测提供了极大的便捷。
(4)本发明的方法中采用的荧光免疫定量试纸条具有灵敏度高、成本低廉、操作简便、快速定量检测、稳定性好、适合工商部门、第三方检测机构、各级政府监管部门、各类农产品企业等使用，市场前景广阔，易推广使用。
附图说明
图1为荧光免疫定量试纸条的结构图。
图2为基于荧光微球标记的免疫层析定量试纸条检测伏马毒素B1的标准曲线以及定量曲线。
图3为制备Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb中标记缓冲液pH的优化的测试结果。
图4为制备Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb中活化剂和荧光微球质量比例的优化的测试结果。
图5为荧光免疫定量试纸条中伏马毒素B1完全抗原溶液的浓度优化的测试结果。
图6为伏马毒素B1免疫层析定量试纸条的检测线(T线)免疫动力学曲线；其中(A)为以荧光强度值为纵坐标，免疫反应时间为横坐标绘制的免疫反应动力学曲线；(B)为以T/T0位纵坐标，免疫反应时间为横坐标绘制的免疫反应动力学曲线。
图7为提取过程的优化的测试结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1 Eu3+-荧光微球标记伏马毒素B1单克隆抗体(荧光探针)的制备
相关溶液的制备：
活化缓冲液：pH 6.0 0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES,C6H13NO4S·H2O)；
偶联缓冲液：pH 7.0 0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)(避免使用存在游离胺的溶剂)；
活化剂：2mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，C8H17N3·HCl)溶液以及2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，C4H5NO3)溶液；
封闭缓冲液：含1.0％BSA(质量浓度)、0.05％Tween-20(质量浓度)pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)；
标记缓冲液：含0.3％Tween-20的pH为7.0的浓度为0.05M的Tris-HCl溶液；
微球复溶液：含有1.0％牛血清白蛋白和0.5％Tween-20的pH为7.0的浓度为0.05mol/L的Tris-HCl溶液
Eu3+-荧光微球标记伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb的制备方法包括如下步骤：
(1)取10μL表面修饰有羧基官能团的铕(Eu3+)荧光微球(购于泰州百纳泰科新材料技术有限公司，粒径300nm，1％固形物含量)，超声分散3min，加入900μL活化缓冲液，用移液器反复吹打之后于4℃，以15000rpm的转速离心15min；
(2)弃上清，加入900μL活化缓冲液，超声重悬，重复离心清洗3次；
(3)弃上清，加入900μL活化缓冲液超声重悬，加入5μL浓度为2.0mg/mL的EDC溶液、5μL浓度为2.0mg/mL的NHS溶液作为活化剂，25℃下500rpm避光震荡活化40min；
(4)活化完成之后于4℃，以15000rpm的转速下离心20min，弃上清，加入900μL偶联缓冲液，用移液器吹打清洗微球，之后于4℃，15000rpm的条件下离心20min；重复3次；
(5)弃上清，加入900μL偶联缓冲液，超声重悬，并用移液器反复吹打均匀；再加入2.0μg伏马毒素B1单克隆抗体(制备方法参考文献：宫慧芝,计融,杨军,江涛,李凤琴.伏马菌素B1免疫学检测方法的建立[J].中国公共卫生,2006(07):840-842.)，使用移液器反复吹打均匀，于25℃，以500rpm避光震荡偶联3h；
(6)偶联结束后加入200μL封闭缓冲液，用移液器反复吹打均匀，于25℃，以500rpm避光震荡封闭35min；
(7)封闭结束后于4℃，以15000rpm的转速离心15min，弃上清，加入900μL标记缓冲液，用移液器反复吹打混匀，清洗微球，重复3次；
(8)最后一次清洗结束后于4℃，以15000rpm的转速离心15min，弃上清，加入400μL微球复溶液，得到铕(Eu3+)荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体，即Eu-FB1-mAb，于4℃保存备用。
实施例2
荧光免疫定量试纸条的制备方法包括如下步骤：
将0.1mg/mL伏马毒素B1完全抗原溶液喷涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T，将1.0mg/mL羊抗鼠IgG溶液喷涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为质控线C，喷涂量均为1μL/cm(仪器参数，指喷头每移动1cm，即在NC膜上喷涂1μL的对应溶液)，37℃干燥3h；其中检测线T和质控线C的距离为5.0mm，检测线T和质控线C的宽度为4.0mm；喷涂采用美国BioDot公司XYZ3050型三维喷点平台；
之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条；样品垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠3.0mm；吸水纸叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠3.0mm；检测线T距离样品垫的距离为5.0mm，质控线C距离吸水纸的距离为5.0mm；
最后，用切条机将粘贴好的板切成约4.0mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到荧光免疫定量试纸条，4℃密封保存备用。结构如图1。
实施例3标准曲线的构建
基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的标准曲线的构建，包括如下步骤：
取伏马毒素B1标准品用PBS缓冲液(浓度0.01mol/L、pH7.4)配置成浓度为0、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0ng/mL的标准溶液用于免疫荧光试纸条的检测。
将实施例1所述Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体(Eu-FB1-mAb)作为荧光探针，将60μL的标准溶液与10μL荧光探针于1.5mL离心管中混匀，于37℃、500rpm震荡孵育10min，得到待测溶液；
之后用移液器将70μL待测溶液缓慢滴入实施例2所述荧光免疫定量试纸条的样品垫，在37℃下免疫层析15min后用HG-98免疫定量分析仪记录试纸条的T线荧光值，每个浓度测定六个平行，设定浓度为0.0ng/mL标准液的T线荧光值为T0，其他加标浓度的T线荧光值为T，以各个伏马毒素B1标准品浓度的对数值为横坐标，T/T0×100(％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为(1-T/T0)×100％。
得到的标准曲线如图2，从图2可以看出：随着伏马毒素B1浓度的增大，试纸条T线条带的荧光强度值会逐渐下降，T/T0则会随之下降；当伏马毒素B1的浓度为0.75-10.0ng/mL时，伏马毒素B1浓度的对数值与T/T0成线性关系，线性方程为Y＝-65.47LgX+86.36，其中Y为T/T0，X为伏马毒素B1的浓度；R2＝0.9914，IC50＝3.592ng/mL，检测限LOD可达到1.211ng/mL。
实施例4
一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法，包括如下步骤：
(1)样品前处理：
取2g市售玉米面置于50mL离心管中，加入20mL体积分数为50％的乙腈-水溶液，振荡混合，使玉米粉在提取液中充分分散，于25℃震荡提取30min；提取后以8000rpm的转速离心5min，得到上清液；之后将上清液过0.22μm微孔滤膜后，收集，得到提取液；
(2)将10μL实施例1制备的Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb和60μL提取液混合均匀，在金属浴摇床中以37℃、500rpm避光预孵育10min，得到待测溶液；
(3)将得到的70μL待测溶液加入实施例2的荧光免疫定量试纸条的样品垫上，在37℃下层析15min；之后用HG-98免疫定量分析仪检测T线的荧光强度值；
(4)将T线的荧光强度值代入实施例3的标准曲线，得到待测物中伏马毒素B1的浓度。
实施例5检测条件的优化
(1)制备Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAbzhon中标记缓冲液pH的优化
时间分辨荧光微球具有一定的疏水性，易发生聚集，为了保持微球的分散性，需要优化微球标记抗体过程中的标记缓冲液pH。
调整实施例1中标记缓冲液的pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的浓度为0.05mol/LTris-HCl缓冲液，其他和实施例1保持一致，得到Eu3+-荧光微球标记伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb；
并选取阴性样本和阳性样本(伏马毒素B1的浓度为5.0ng/mL)；用同一批次的试纸条检测分析比较不同pH缓冲环境下荧光微球与FB1-mAb的偶联效果，通过对应检测线的荧光强度以及阴阳性组之间的竞争抑制率来判断偶联效果，确定最优的标记缓冲液pH。
将等量的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAbzhon滴加到实施例2制备的荧光免疫定量试纸条的样品垫上，检测不同偶联pH下试纸条的检测线上荧光强度的变化，每组平行三次，15min后用荧光定量仪读取T线的荧光信号值，根据阴性组T线荧光强度和阳性组最大竞争抑制率(1-T/T0)确定最佳pH。
结果如图3，从图3可以看出：不同pH环境下偶联的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAbzhon的荧光强度有所不同，在pH为7.0时，检测线处的荧光强度较高，阴性样本T线处的信号强度和阳性样本(FB1浓度为5.0ng/mL)的竞争抑制率较高，偏酸或偏碱的环境都会影响免疫竞争效果，故选择pH7.0为最佳标记缓冲液pH值。
(2)制备Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAbzhon中活化剂和荧光微球比例的优化
活化剂的用量直接影响荧光微球活化的程度，活化剂过少会造成荧光微球上的羧基基团没有被完全活化，影响探针的偶联效果，过量会造成荧光微球的羧基基团团聚聚集，荧光信号值降低，进而影响活化效果。
将5μL、10μL、16.7μL、25μL、50μL现配的EDC溶液(浓度为2mg/mL)和5μL、10μL、16.7μL、25μL、50μL现配的NHS溶液(浓度为2mg/mL)分散于溶有50μL时间分辨荧光微球(浓度为10mg/mL)的MES缓冲液(MES缓冲液体积为800μL，体系中共溶解有500μg的时间分辨荧光微球)，使两种活化剂与时间分辨荧光微球的质量比均为1：50、1：25、1：15、1：10、1：5，并选取阴性样本和阳性样本(FB1浓度为5.0ng/mL)用实施例2的试纸条检测分析，比较不同质量比例下荧光微球的活化效果，通过对应检测线的荧光强度以及阴、阳性组之间的竞争抑制率来判断活化效果，确定最优的活化剂与时间分辨荧光微球的质量比。
结果如图4，从图4可以看出：当活化剂与为时间分辨荧光微球的质量比为1：15时，时间分辨荧光微球的活化效果最佳。
(3)荧光免疫定量试纸条中伏马毒素B1完全抗原溶液的浓度优化
为了提高试纸条检测的灵敏度，研究不同完全抗原浓度对阴性对照组与伏马毒素B1含量为5.0ng/mL的阳性样本之间的竞争抑制率的影响。
具体过程如下：
调整实施例2中伏马毒素B1完全抗原(FB1-OVA)溶液的浓度为0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.3mg/mL，得到荧光免疫定量试纸条。
选取阴性对照组(PBS溶液，同偶联缓冲液)和阳性试验组(伏马毒素B1浓度为5.0ng/mL)进行测试，来评价不同浓度的伏马毒素B1完全抗原对检测方法的影响。
结果如图5所示，从图5可以看出：随着T线处FB1-OVA浓度的增加，阴性对照组(PBS溶液，同偶联缓冲液)与阳性试验组(5.0ng/mL)之间的荧光强度逐渐增加，而竞争抑制率先上升后下降，当FB1-OVA的浓度为0.1mg/mL时，阴阳试验组之间的竞争抑制率(1-T/T0)达到最大值62.22％。此时检测线处也有相对较强的荧光信号值，阴性组T线荧光强度均值为1998857a.u.，阳性组T线荧光强度均值为754400a.u.。因此T线处FB1-OVA浓度优选为0.1mg/mL。
(4)层析时间的优化
为了在对样品测试时获得稳定的T线荧光值从而得到稳定的竞争抑制率，同时尽可能缩短检测的时间。
选取伏马毒素B1浓度不同的三组阳性样本(1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL)以及阴性样本，研究了不同免疫反应时间下对应样本在试纸条T线处的荧光强度及阴性阳性样本之间竞争抑制率的变化。
具体如下：将60μL待测样品(伏马毒素B1浓度分别为0.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL)与10μL实施例1所述Eu3+-荧光微球标记伏马毒素B1单克隆抗体于1.5mL离心管中混匀，在金属浴摇床中以37℃、500rpm避光预孵育10min，取全部70μL混合物加入实施例2所述试纸条的样品垫上，在37℃下进行层析，用HG-98免疫定量分析仪记录每分钟的T线荧光强度变化(记录1-20min内的变化)。以T线荧光强度为纵坐标，免疫反应时间为横坐标绘制免疫反应动力学曲线，观察T线荧光强度随时间变化的趋势，以T线荧光值达到稳定的时间作为较佳检测时间。
测试结果如图6，从图6中A中可以看出：伏马毒素B1浓度不同的样品的T线荧光值在1-15min内随着时间的延长而不断增强，但在15min之后，T线荧光值不再发生较大变化，逐渐趋于稳定。从图6中B可以看出：伏马毒素B1浓度为5.0ng/mL的阳性试验组与阴性试验组之间的竞争抑制率在15min左右趋于稳定，综上两点，免疫层析时间应设置为15min。
(5)提取过程的优化
为了使样品中的伏马毒素B1得到完全提取，从而提升试纸条的准确度，同时尽可能缩短样品的前处理时间，将提取液和提取时间作为影响样品前处理效果的两个关键因素，
选取了4种不同的提取液：超纯水、30％甲醇-水溶液、70％甲醇-水溶液、50％乙腈-水溶液(所述百分比为有机溶剂的体积百分比)；以及3个不同的提取时间：15min、30min和60min；进行试验。
采用免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法对所有待测样品中伏马毒素B1的浓度进行了测试(测试方法参考GB5009.240-2016中的第三法)，将测试的得到的结果作为对应样品中伏马毒素B1浓度的准确浓度，后续使用试纸条对采取不同提取液、不同提取时间处理的样品进行检测，得到的结果与之前通过精密仪器方法测得的准确浓度进行比较，以回收率作为评价前处理方法的指标。回收率的计算公式如下式(1)：
结果如图7所示：当提取时间为15min时，4种提取液的回收率都低于70％；提取时间为30min时，采用50％乙腈-水的实验组的回收率接近100％，采用70％甲醇-水的实验组的回收率接近90％；提取时间为60min时，采用50％乙腈-水和70％甲醇-水的实验组的回收率均超过了100％，而另外2个实验组的回收率仍然低于70％；为了有效且充分地提取样品中的伏马毒素B1，同时在相对较短的时间内完成对样品的前处理，综合以上结果，选择50％乙腈-水溶液作为提取液，提取时间设置为30min。
实施例6实施例2所述的荧光免疫定量试纸条的测试
1、精密度测试
从同一批次内取出8个荧光免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(FB1 2.0ng/mL)T线处的荧光强度值(T)分析批内差异(表1)。
通过4个不同批次的荧光免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(FB1 2.0ng/mL)T线处的荧光强度值(T)分析批间差异(表2)。变异系数的计算公式如下式(2)：
由表1可知：通过变异系数计算公式分析得到T0、T和T/T0(％)的同一批次内变异系数分别为1.56％、2.20％和1.13％；由表2可知，T0、T和T/T0(％)的不同批次间变异系数分别为1.21％、2.21％和1.02％；同一批次内和不同批次间的数据表明该试纸条的批内和批间变异系数小，精密度高，准确性好，基本符合定量检测试纸条的要求。
表1同一批次内精密度检测结果
批内 T0 T T/T0(％)
1 2033654 1400156 68.85
2 1976412 1359987 68.81
3 1991514 1360036 68.29
4 2046654 1430158 69.88
5 1969411 1350642 68.58
6 2024464 1361135 67.23
7 2041135 1391103 68.15
8 2056648 1431009 69.58
Mean 2017487 1385528 68.67
SD 31477 30454 0.78
CV(％) 1.56 2.20 1.13
表2不同批次间精密度检测结果
批间 T0 T T/T0(％)
1 2030023 1426610 70.28
2 1986617 1380014 69.47
3 1970011 1351135 68.59
4 2018861 1420025 70.34
Mean 2001378 1394446 69.67
SD 24125 30712 0.71
CV(％) 1.21 2.21 1.02
2、准确度测试
伏马毒素B1广泛出现于玉米及其制品中，其中作为大众日常消费品的玉米粉(面)极易受到伏马毒素B1的污染，而且玉米粉(面)通常作为原料直接用于家庭烹饪，与民众的生活息息相关，因此检测其中的伏马毒素B1含量具有很强的现实意义。故荧光免疫定量试纸条的性能测试均选择玉米粉(面)作为目标样品。
为了验证荧光免疫定量试纸条的准确度，随机从市场上购买了玉米粉，将其作为样品进行加标回收试验，设置高(5.0ppm)、中(2.0ppm)、低(1.0ppm)三组不同的加标浓度，每组浓度梯度均设置三组平行试验，加标之后的具体样品检测过程参照实施例4。以加标回收率作为准确度的评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果变异系数(CV)作为精密度评价指标。加标回收率的计算公式如下式(3)：
结果如表3所示，加标回收率在97.25％到111.55％之间，测定结果的变异系数均小于4.28％，结果表明荧光免疫定量试纸条符合免疫检测的准确度要求，能够用于现场快速筛查与检测。
表3准确度检测结果
3、稳定性测试
将荧光免疫定量试纸条分别放置在4℃和37℃密封保存1个月后，测定其T线处的荧光值。
结果表明：荧光免疫定量试纸条在4℃放置一个月后，荧光信号变化较小，而在37℃下放置一个月后，荧光强度变化较大，一方面可能是由于抗体为生物活性分子，会存在失活问题，另一方面，可能是荧光探针自身荧光信号减弱造成的，因此有待寻找更合适的稳定剂来保护荧光探针，从而增加试纸条的稳定性、使保藏期更长。

Claims (3)

1.一种基于荧光免疫定量试纸条检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品前处理：在待测物中加入提取液进行提取，提取后离心，取上清液，过滤膜，得到提取液；其中，待测物为玉米面，提取液为乙腈水溶液，其中乙腈的体积浓度为50％，25℃震荡提取30min；
(2)将Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb和提取液按照体积比1:5-7混合均匀，30-40℃、500rpm震荡孵育5-15min，得到待测溶液；
其中，Eu3+-荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体Eu-FB1-mAb的制备方法包括如下步骤：
取10μL表面修饰有羧基官能团的Eu3+荧光微球，超声分散，加入900μL活化缓冲液，用移液器反复吹打之后于4℃离心；其中表面修饰有羧基官能团的Eu3+荧光微球的粒径300nm，活化缓冲液：pH 6.0 0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸；
弃上清，加入900μL活化缓冲液，超声重悬，重复离心清洗；
弃上清，加入900μL活化缓冲液，超声重悬，加入5μL浓度为2.0mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、5μL浓度为2.0mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液作为活化剂，避光震荡活化40min；其中，两种活化剂与为时间分辨荧光微球的质量比均为1：15；
活化完成之后于4℃离心，弃上清，加入900μL偶联缓冲液，用移液器吹打清洗微球，之后于4℃离心；重复3次；其中偶联缓冲液：pH 7.0 0.01mol/L的磷酸缓冲液；
弃上清，加入900μL偶联缓冲液，超声重悬，并用移液器反复吹打均匀；再加入2.0μg伏马毒素B1单克隆抗体，使用移液器反复吹打均匀，避光震荡偶联3h；
偶联结束后加入200μL封闭缓冲液，用移液器反复吹打均匀，于25℃，以500rpm避光震荡封闭35min；其中封闭缓冲液：含1.0％BSA、0.05％Tween-20pH7.0的磷酸缓冲液；
封闭结束后于4℃离心，弃上清，加入900μL标记缓冲液，用移液器反复吹打混匀，清洗微球，重复3次；其中标记缓冲液：含0.3％Tween-20的pH为7.0的浓度为0.05M的Tris-HCl溶液；
最后一次清洗结束后于4℃离心，弃上清，加入400μL微球复溶液，得到铕(Eu3+)荧光微球标记的伏马毒素B1单克隆抗体，即Eu-FB1-mAb；其中微球复溶液：含有1.0％牛血清白蛋白和0.5％Tween-20的pH为7.0的浓度为0.05mol/L的Tris-HCl溶液；
(3)将待测溶液加入荧光免疫定量试纸条的样品垫上37℃进行层析15min，然后测试荧光免疫定量试纸条上T线的荧光强度值；
其中，待测溶液在荧光免疫定量试纸条的样品垫上用量为60-80μL；
荧光免疫定量试纸条的制备方法包括如下步骤：
将0.1mg/mL伏马毒素B1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜上作为检测线T，将0.5-2.0mg/mL羊抗鼠IgG溶液涂到硝酸纤维素膜上作为质控线C，37℃干燥2-4h；其中检测线T和质控线C的距离为4.0-6.0mm，检测线T和质控线C的宽度为3.0-5.0mm；
之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条；样品垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠2.0-4.0mm；吸水纸叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠2.0-4.0mm；检测线T距离样品垫的距离为4.0-6.0mm，质控线C距离吸水纸的距离为4.0-6.0mm；
最后，用切条机将粘贴好的板切成3.0-5.0mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到荧光免疫定量试纸条，4℃密封保存备用；
(4)将T线的荧光强度值代入标准曲线，得到待测物中伏马毒素B1的浓度；
其中，步骤(4)所述标准曲线为：当伏马毒素B1的浓度范围为0.75-10.0ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系，Y＝-65.47LgX+86.36，其中Y为T/T0，X为伏马毒素B1的浓度；R2＝0.9914，检测限可达到1.211ng/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测物和提取液的用量比以g/mL计为1:5-20。
3.权利要求1-2任一项所述的方法在食品检测领域的应用。
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