CN113533731A - 一种同时检测玉米中黄曲霉毒素b1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法 - Google Patents

一种同时检测玉米中黄曲霉毒素b1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法。所述方法包括以下步骤：(1)时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备；(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件筛选；(3)样品的检测，主要包括①样品前处理；②提取溶剂和提取时间的筛选；③检测分析：取100μL待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中混匀，37℃孵育2‑5min；将试纸条插入微孔，37℃反应5‑10min，随后对荧光层析试纸条进行定量/定性评测判定结果。本发明建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法，具有同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A、准确率高、检测时间短、操作简便等优势。

Description

一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分 辨荧光免疫层析方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，主要涉及一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法。
背景技术
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是所有真菌毒素中致癌性最高的，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)归类为一类致癌物，若人体不慎大量摄入会引发急性肝炎，长期摄入甚至会造成肝脏癌变。为了保障人民食品安全，国家质监局要求AFB1为谷物类食品的必检项目，国家标准GB 2761-2017《食品的真菌毒素限量》规定AFB1在谷物及其制品中最大残留限量为5.0～20μg/kg。
玉米赤霉烯酮(ZEN)，又常被称作F2毒素，是一种非甾体霉菌毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和粉红镰刀菌(Fusarium roseum)产生，是目前全世界之中污染范围最为广泛的一种镰刀菌毒素。首先，从赤霉病玉米中分离，玉米赤霉烯酮广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物。玉米赤霉烯酮病毒的结构与动物内源雌激素相似，所以可与始激素受体结合而显示出弱雌激素活性。根据实验表明，该病毒所具有的类雌激素作用有可能导致动物雌激素亢进症，进一步造成动物流产、死胎等生殖机能异常，并且对免疫系统有潜在的毒害作用，还可能会导致免疫抑制、生长下降、不育以及畸形等问题。粮食在受到玉米赤霉烯酮大范围污染后，不仅严重制约了农业经济，也在全球范围内带来严重的食品安全问题，也威胁到人类身体健康。现在全球已有很多国家制订了食品中关于ZEN的限量标准，以预防玉米赤霉烯酮对人和动物可能造成的危害。在我国规定，玉米赤霉烯酮在粮食中的含量，必须低于60μg/kg。
由于真菌毒素污染广泛，且往往共同存在于食品中造成混合污染，引起的联合毒性效应给人畜带来更大的威胁，AFB1与ZEN常同时污染谷物类食品，因此有必要开发一种操作简便，成本较低，可对这两种毒素同时进行快速筛查的免疫检测方法。目前，食品中真菌毒素的多组分检测方法已迅速发展，用于检测AFB1和ZEN的方法主要有高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法法、超高效液相色谱法-串联质谱法、薄层色谱法(TLC)、酶联免疫法(ELISA)以及和胶体金免疫层析法(Gold Immuno chromatography Assay，GICA)等。基于抗原抗体特异性结合反应的免疫快速检测方法也在不断开发，其中时间分辨荧光免疫层析方法(Time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，TRFICA)是以包埋了稀土元素离子螯合物的时间分辨荧光微球(Time-resolved Fluorescent Microspheres，TRFMs)为免疫探针，在层析体系中通过竞争反应体系进行检测的方法。利用其荧光衰变期长和发射光谱窄的特点，可使有效信号与非特异性的背景荧光信号区分，减少非特异性荧光的干扰，提高了灵敏度。通过荧光读数仪检测荧光强度比值，对食品中的真菌毒素进行定性或定量检测，具有简单、快速和可视的检测优势。
然而，时间分辨荧光微球作为免疫探针同时检测多种真菌毒素的免疫层析检测方法鲜有报道。本发明建立了基于稀土铕荧光微球作为检测信号，可同时检测AFB1和ZEN的时间分辨荧光免疫层析检测方法。
发明内容
本发明旨在针对现有背景技术中存在的不足，而提供的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法。
包括以下步骤：
(1)时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备：采用羧基化荧光微球制备荧光探针，在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件筛选：荧光微球的活化pH(5-7)、偶联荧光微球的抗体用量(AFB1-单克隆抗体2-5μg，ZEN-单克隆抗体1-6μg)、抗体-荧光探针用量(AFB1-荧光探针2-6μL，ZEN-荧光探针1-5μL)、检测线上包被抗原浓度(AFB1-OVA 0.2-1.5mg/ml，ZEN-OVA 0.2-2mg/ml)、质控线上羊抗鼠IgG浓度(0.1-0.3mg/ml)。
(3)样品的检测：①样品前处理：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；②提取溶剂和提取时间的筛选：准确称取1.0g玉米粉样品，分别加入5mL提取剂乙酸乙酯、乙腈、无水甲醇和甲醇水，充分振荡3-10min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；③检测分析：取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育2-5min；将试纸条插入微孔，37℃反应5-10min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
本发明的有益效果：目前，针对检测农产品和食品中AFB1和ZEN两种真菌毒素的研究已有大量报道，主要有高效液相色谱-质谱法联用，高效液相色谱气相色谱法等色谱法。虽然色谱及其联用技术能检测灵敏度高、重复性好，能够实现农产品和食品当中真菌毒素的准确分析，但是仪器分析需要专业技术人员的培训，复杂的样品前处理步骤以及昂贵的仪器设备，无法满足现场快速检测的需要。当前免疫分析法中应用最广泛的是ELISA和GICA。ELISA灵敏度高、特异性强、重复性好，但需要借助光学仪器判读结果、抗原抗体孵育时间较长、操作步骤繁琐，限制了其在现场快速检测的应用。GICA广泛应用在激素检测、病毒检测、真菌毒素残留物检测和兽药残留检测。但是，由于胶体金颗粒不具有自发光性能，所以需要大量颗粒聚集才能达到可视化水平，从而使GICA在定量检测中无法达到ELISA高灵敏度的检测水平。随着技术的进步，新型检测技术逐渐被开发出来，基于稀土金属时间分辨特征的荧光免疫层析分析技术，以其高灵敏、抗干扰、检测方便、逐渐成为市场备受青睐的产品。目前已建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法多集中于对单个真菌毒素进行分析，针对多种真菌毒素的时间分辨荧光免疫层析检测方法鲜有报道。因此本研究建立了基于稀土铕荧光微球作为检测信号，可同时检测AFB1和ZEN的时间分辨荧光免疫层析检测方法，能够准确有效地测出被测粮食中所含黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮毒素的含量，对于粮食污染的防治起到一定的促进作用，进一步保障了粮食的安全和健康。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
各实施案例中的步骤(4)时间分辨荧光免疫层析试纸条准确度评价方法均相同，其执行的国标高效液相色谱法的色谱条件如下：色谱柱为C18柱(4.6mm×150mm，填料粒径2.7μm)；流动相由5mmol/L乙酸溶液(流动相A)和甲醇溶液(流动相B)组成；流速为0.8μL/min；柱温为35℃；进样量为10μL；检测器为多反应检测(MRM)模式；梯度洗脱；5％～90％B(0～5min)，90％B(5～7min)，5％B(7～10min)。
实施例1
(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化10min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应20min；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件：荧光微球的活化pH为5；偶联荧光微球的AFB1-单克隆抗体为2μg，偶联荧光微球的ZEN-单克隆抗体为1μg；AFB1-荧光探针2μL，ZEN-荧光探针1μL；T1检测线上AFB1-OVA浓度为0.2mg/ml，T2检测线上ZEN-OVA浓度为0.22mg/ml；质控线C上羊抗鼠IgG浓度为0.1mg/ml。
(3)样品的检测：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；准确称取1.0g玉米粉样品，加入5mL提取剂乙酸乙酯，充分振荡3min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育2min；将试纸条插入微孔，37℃反应5min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。(4)准确度评价：对含有10μg/kgAFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
实施例2
(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化12min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应25mhn；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件：荧光微球的活化pH为5.5；偶联荧光微球的AFB1-单克隆抗体为2.5μg，偶联荧光微球的ZEN-单克隆抗体为2μg；AFB1-荧光探针3μL，ZEN-荧光探针2μL；T1检测线上AFB1-OVA浓度为0.25mg/ml，T2检测线上ZEN-OVA浓度为0.42mg/ml；质控线C上羊抗鼠IgG浓度为0.15mg/ml。
(3)样品的检测：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；准确称取1.0g玉米粉样品，加入5mL提取剂乙腈，充分振荡4min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育3min；将试纸条插入微孔，37℃反应6min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
实施例3
(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化15min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应30min；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件：荧光微球的活化pH为6；偶联荧光微球的AFB1-单克隆抗体为3.5μg，偶联荧光微球的ZEN-单克隆抗体为3μg；AFB1-荧光探针4μL，ZEN-荧光探针3μL；T1检测线上AFB1-OVA浓度为0.4mg/ml，T2检测线上ZEN-OVA浓度为0.86mg/ml；质控线C上羊抗鼠IgG浓度为0.2mg/ml。
(3)样品的检测：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；准确称取1.0g玉米粉样品，加入5mL提取剂甲醇，充分振荡5min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育5min；将试纸条插入微孔，37℃反应10min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
实施例4
(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化18min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应35min；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件：荧光微球的活化pH为6.5；偶联荧光微球的AFB1-单克隆抗体为4.5μg，偶联荧光微球的ZEN-单克隆抗体为4μg；AFB1-荧光探针5μL，ZEN-荧光探针4μL；T1检测线上AFB1-OVA浓度为0.85mg/ml，T2检测线上ZEN-OVA浓度为1.78mg/ml；质控线C上羊抗鼠IgG浓度为0.25mg/ml。
(3)样品的检测：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；准确称取1.0g玉米粉样品，加入5mL提取剂无水甲醇，充分振荡8min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育5min；将试纸条插入微孔，37℃反应8min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
实施例5
(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化20min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应40min；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件：荧光微球的活化pH为7；偶联荧光微球的AFB1-单克隆抗体为5μg，偶联荧光微球的ZEN-单克隆抗体为6μg；AFB1-荧光探针6μL，ZEN-荧光探针5μL；T1检测线上AFB1-OVA浓度为1.5mg/ml，T2检测线上ZEN-OVA浓度为2mg/ml；质控线C上羊抗鼠IgG浓度为0.3mg/ml。
(3)样品的检测：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；准确称取1.0g玉米粉样品，加入5mL提取剂甲醇，充分振荡10min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育5min；将试纸条插入微孔，37℃反应10min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
用制备的时间分辨荧光免疫层析试纸条和国标的高效液相色谱法两种检测方法对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品进行检测，通过回收率和相对标准偏差(RSD)评估其准确度及精确度，平行测定6次，以下是部分实验结果：
表1高效液相色谱组及各实施例的测定结果
Figure BSA0000245129490000091
根据表1可以得出，五组实施例的AFB1和ZEN的回收率均在94％以上，相对标准偏差(RSD)均在7％以下，表明该时间分辨荧光免疫层析定量分析法准确度、精准度和重现性良好，可满足实际检测需求。同时，与高效液相色谱法所测得的结果相比，五组实施例的AFB1和ZEN的回收率均和相对标准偏差(RSD)也与之接近，而该时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测时间最多只需20min，操作简单快速，且具有可视的检测优势。

Claims (11)

1.一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备：采用羧基化荧光微球制备荧光探针，在NC膜上喷涂(0.8μL/cm)包被抗原AFB1-OVA和包被抗原ZEN-OVA分别作为检测线(T1线和T2线)，羊抗鼠IgG作为质控线(C线)，包被后置于37℃的鼓风干燥箱中烘12h，将样品垫、吸水纸、NC膜与PVC底板进行组装，切成宽3mm的试纸条后避光干燥备用。
(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件筛选：荧光微球的活化pH(5-7)、偶联荧光微球的抗体用量(AFB1-单克隆抗体2-5μg，ZEN-单克隆抗体1-6μg)、抗体-荧光探针用量(AFB1-荧光探针2-6μL，ZEN-荧光探针1-5μL)、检测线上包被抗原浓度(AFB1-OVA 0.2-1.5mg/ml，ZEN-OVA 0.2-2mg/ml)、质控线上羊抗鼠IgG浓度(0.1-0.3mg/ml)。
(3)样品的检测：①样品前处理：玉米粉碎过20目筛，分装避光保存；②提取溶剂和提取时间的筛选：准确称取1.0g玉米粉样品，分别加入5mL提取剂乙酸乙酯、乙腈、无水甲醇和甲醇水，充分振荡3-10min，室温离心(4000r/min，5min)；取100μL上清液，用样品缓冲液稀释4倍，制得待测样品液；③检测分析：取100μL样品缓冲液或待测样品液，加入含有荧光探针的微孔中吹打混匀，37℃孵育2-5min；将试纸条插入微孔，37℃反应5-10min，随后对荧光层析试纸条进行检测分析。定性分析：在紫外灯下通过肉眼判断定性结果，当含有一定浓度待测物时，T线不显线，C线显红色荧光，则结果为阳性；相反，当无待测物时T线和C线均显红色荧光，结果为阴性。定量分析：反应结束后30s内，将荧光层析试纸条插入荧光读数仪读取结果，得到被测玉米中黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒A的含量。
(4)准确度评价：对含有10μg/kg AFB1和110μg/kg ZEN混合溶液的空白玉米样品，分别采用该时间分辨荧光免疫层析定量分析法和国标的高效液相色谱法两种检测方法进行检测，并对检测结果的一致性进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(1)采用羧基化荧光微球制备荧光探针的方法为：将10μL时间分辨荧光微球均匀分散在1mL活化液中，依次加入50μL EDC溶液(0.5mg/mL)和50μL NHS溶液(0.5mg/mL)，超声混匀，放置摇床振荡(200r/min)室温活化10-20min，离心(14000r/min，20min)弃上清；复溶于1mL偶联缓冲液中，超声振荡，使荧光微球重悬；加入抗体，放置摇床振荡室温反应20-40min；随后加入20μL封闭液，放置摇床振荡室温封闭反应1h，离心弃上清液；用200μL荧光微球复溶液复溶，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(1)荧光探针的制备方法中时间分辨荧光微球的活化时间为10-20min，加入抗体后的反应时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件中荧光微球的活化pH值为5-7。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件中AFB1单克隆抗体用量为2-5μg，ZEN单克隆抗体用量为1-6μg。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件中AFB1-荧光探针用量为2-6μL，ZEN-荧光探针用量为1-5μL。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件中荧AFB1-OVA为0.2-1.5mg/ml，ZEN-OVA为0.5-1mg/ml。
8.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(2)时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测条件中质控线上羊抗鼠IgG浓度为0.1-0.3mg/ml。
9.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(3)提取溶剂的选择：分别加入乙酸乙酯、乙腈、无水甲醇和甲醇水，充分振荡5min，按步骤制得待测样品液。比较4种提取剂的效果。
10.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(3)提取时间的选择：称取样品，加入提取剂后充分振荡3-10minn，按步骤制得待测样品液。
11.根据权利要求1所述的一种同时检测玉米中黄曲霉毒素B1和赤霉烯酮毒素的时间分辨荧光免疫层析方法，其特征在于：步骤(3)检测分析时，样品缓冲液或待测样品液与荧光探针混匀后，在37℃条件下孵育2-5min；将试纸条插入微孔后，需在37℃条件下反应5-10min。
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