CN111235243A - 一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法 - Google Patents
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Abstract
一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，属于生物技术及医学定量技术领域。本发明方法包括以下步骤：（1）构建抗体‑DNA复合物；（2）从样品中分离纯化得到总外泌体/胞外囊泡，采用步骤（1）所述抗体‑DNA复合物标记肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡；（3）对经步骤（2）标记的肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡进行QPCR定量检测。本发明方法实现了肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量检测，适用范围广，成本较低，可以用于多种肿瘤靶标的定量检测和定性检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及医学定量技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法。
背景技术
外泌体/胞外囊泡是一类微小胞外的囊泡，含有丰富的功能生物大分子，如蛋白质，核酸，脂类。外泌体/胞外囊泡可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，参与细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭机体、免疫应答、抗原提呈等方面，可作为细胞组织间的转移信号分子。另外肿瘤细胞分泌的特定外泌体/胞外囊泡具有作为疾病检测的生物标志物的潜能。因此外泌体/胞外囊泡在肿瘤诊断中扮演着举足轻重的地位，开发一种行之有效的外泌体/胞外囊泡精确定量方法对于恶性肿瘤的诊疗具有重大意义。现有定量外泌体/胞外囊泡的技术有比色法、荧光法、电化学方法、表面离子共振法及表面增强拉曼法等。比色分析法是一种通过测量特定波长的光吸收程度来测定有色物质浓度的方法。金纳米粒子 (Au NPs) 由于具有超高的消光系数而被广泛应用于比色分析中；还有科学家通过单壁碳纳米管 (s-SWCNTs) 和适配体的相互作用建立了一种肉眼可见的比色方法检测外泌体。
链霉亲和素-生物素系统是近年来发展出的生物放大系统。链霉亲和素是链霉菌培养物重点的一种蛋白，肽链中色氨酸残基可以与生物素结合，它们之间的结合力是抗原与抗体之间结合力的1万倍，且极其稳定。此外，每个链霉亲和素分子具有4个亚基，可以与4个生物素分子结合。链霉亲和素和生物素可偶联抗体等生物大分子，也可被酶、胶体金、放射性同位素和荧光素标记，作级联放大反应。因此应用的链霉亲和素-生物素系统建立了许多生物大分子的分析方法。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法。本发明通过构建一种利用抗体-DNA复合物标记和定量肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡，能够间接反映肿瘤细胞与正常细胞的差异。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）构建抗体-DNA复合体；
（2）从样品中分离纯化得到总外泌体/胞外囊泡，采用步骤（1）所述抗体-DNA复合物标记肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡；
（3）对经步骤（2）标记的肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡进行QPCR定量检测。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（1）中构建的方法为：抗体和DNA分别生物素化处理后，将生物素化抗体和生物素化DNA混合，再加入链霉亲和素分子混合反应，或者将生物素化抗体和链霉亲和素分子混合，再加入生物素化DNA混合反应，得到抗体-DNA复合体。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体为根据检测肿瘤抗原的不同所选用的偶联生物素的抗体；所述生物素化DNA为一端带有生物素的DNA模板，其长度为10-1000 核苷酸，优选长度为20-100 核苷酸。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体与链霉亲和素的分子数量比例为：1:4-1:1000，优选1:10-1:50，所述链霉亲和素与生物素化DNA的分子数量比例小于1:4。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体和生物素化DNA混合时间为2-10min，所述再加入链霉亲和素分子混合反应时间为5min-10h，优选为10min-90min，所述生物素化抗体和链霉亲和素分子混合时间为10-60min，所述再加入生物素化DNA混合反应时间为10-60min。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于每分子所述抗体-DNA复合体中含有一个生物素化抗体和三个生物素化DNA。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（2）中样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液和唾液。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（2）中标记方法为：将抗体-DNA复合体与外泌体/胞外囊泡混合孵育。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述孵育条件为温度4℃-30℃，反应时间10min-12h，优选条件为温度25℃，反应时间2 h。
所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（3）中QPCR定量检测方法为：QPCR定量检测肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡表面的抗体-DNA复合物中DNA的分子数量，进而计算得到肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的含量。
本发明具有以下有益效果：该定量方法实现了肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量检测，适用范围广，成本较低，可以用于多种肿瘤靶标的定量检测和定性检测。
附图说明
图1为抗体-DNA复合物的构建方法及链接外泌体/胞外囊泡方法示意图；
图2为链霉亲和素与生物素化DNA混合后产生的显示链接方式的凝胶电泳图；
图3为QPCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。除非另外指出，本发明及以下实施例中所涉及的术语、英文缩写均为本领域技术人员可理解。
实施例1：构建抗体-DNA复合物
按照如下模板合成DNA：
生物素化抗体为生物素化人EpCAM抗体。
抗体和DNA分别生物素化处理后，将生物素化抗体和生物素化DNA混合5min，再加入链霉亲和素分子混合反应30min，得到抗体-DNA复合体。
利用生物素-链霉亲和素系统使抗体和DNA交联，原理图如图1。根据泊松分布原理，将链霉亲和素（100μg/mL）和生物素化抗体（10μg/mL）按照10：1的比例混合使绝大部分的生物素化抗体单独结合到一个链霉亲和素分子上，两个以上抗体结合到同一个链霉亲和素分子的概率非常低。
为了确定链霉亲和素和生物素化DNA的用量比例，将链霉亲和素（100μg/mL）和生物素化DNA(10μM)按0:2、3:1、1:1、3:4、3:5的比例混合反应后，生物素化的DNA结合到链霉亲和素分子上。然后，进行聚丙烯凝胶电泳,得到链霉亲和素分子连接生物素化DNA的四种亮带如图2所示。每个链霉亲和素分子可以结合4个生物素分子，其中包括一个生物素化抗体和三个生物素化DNA。
实施例2：构建抗体-DNA复合物
按照如下模板合成DNA：
生物素化抗体为生物素化人EpCAM抗体。
抗体和DNA分别生物素化处理后，将生物素化抗体和生物素化DNA混合5min，再加入链霉亲和素分子混合反应30min，得到抗体-DNA复合体。
利用生物素-链霉亲和素系统使抗体和DNA交联构建抗体-DNA复合体，原理图如图1。根据泊松分布原理，将链霉亲和素（100μg/mL）和生物素化抗体（10μg/mL）按照10：1的比例混合使绝大部分的生物素化抗体单独结合到一个链霉亲和素分子上，两个以上抗体结合到同一个链霉亲和素分子的概率计算如下：
根据泊松分布计算，
其中n是每个链霉亲和素上的抗体数，λ是每个链霉素分子上的平均抗体数；因此当抗体：链霉亲和素=0.1时，λ=0.1。一个链霉素分子上带有2个或以上抗体的概率为：
由以上计算可知：链霉亲和素（100μg/mL）和生物素化抗体（10μg/mL）按照10：1的比例混合时，2个或以上抗体同时结合在一个链霉亲和素的概率为0.45%，因此绝大部分的抗体分子单个地结合在链霉亲和素上，形成抗体-DNA复合体中含有一个生物素化抗体和三个生物素化DNA。
当链霉亲和素（100μg/mL）和生物素化抗体（10μg/mL）按照大于10：1的比例混合时，2个或以上抗体同时结合在一个链霉亲和素的概率将更低。
实施例3：生物素化EpCAM抗体-DNA复合物标记特异性外泌体/胞外囊泡
使用MagCaptureTM Exosome isolation Kit PS (Wako)试剂盒捕获分离纯化5 mL细胞上清中的总外泌体。
具体实施的详细步骤描述如下：
使用经10000×g离心处理的细胞上清作为样品。将5 mL样品移至15 mL离心管，加入样品体积1/500的外泌体结合增强液添加至样品，使用漩涡混合器进行混合后加入60μL捕获磁珠并混匀。在4℃下，使用旋转混合仪进行混合捕获磁珠与样品3h以上，使外泌体/胞外囊泡固定到捕获磁珠表面。最后将15mL反应管放在台式离心机上稍离后，固定在磁力架上，静置10min，待磁珠完全吸附于管壁后，使用微量移液器去除上清，得到结合到磁珠表面的外泌体。
向15 mL反应管加入1mL洗涤缓冲液(含外泌体结合增强液)，使用旋涡混合器进行混合后固定在磁力架上，静置10 min，待磁珠完全吸附于管壁后，使用移液器除去上清;重复上述清洗步骤3次。得到已清洗细胞外囊泡结合磁珠，用100μL ddH2O重悬。
将链霉亲和素（100 μg/mL）4 μL和生物素化EpCAM抗体（10μg/mL）10μL混合反应30min后，加入exosmePCR（10μM）3μL混合后再反应30 min构建抗体-DNA复合体；然后在25℃下将构建的抗体-DNA复合体与上述结合在磁珠上的外泌体混合孵育2 h；EpCAM抗体识别总外泌体中的肿瘤特异性EpCAM阳性外泌体，并将DNA标记到肿瘤特异性外泌体上。
实施例4：生物素化GPC-1抗体-DNA复合物标记胰腺癌特异性外泌体/胞外囊泡
使用MagCapture Exosome isolation Kit PS (Wako)试剂盒捕获分离纯化2 mL血浆中的总外泌体。
具体实施的详细步骤描述如下：
首先血液样品经过1200转/分钟离心处理10分钟，取血浆。血浆经10000×g离心处理2次后转移到离心管中，加入样品体积1/500的外泌体结合增强液添加至样品，使用漩涡混合器进行混合后加入60μL捕获磁珠并混匀。在4℃下，使用旋转混合仪进行混合捕获磁珠与样品3h以上，使血浆中的外泌体/胞外囊泡固定到捕获磁珠表面。最后将15mL反应管放在台式离心机上稍离后，固定在磁力架上，静置10min，待磁珠完全吸附于管壁后，使用微量移液器去除上清，得到结合到磁珠表面的外泌体。
向15 mL反应管加入1mL洗涤缓冲液(含外泌体结合增强液)，使用旋涡混合器进行混合后固定在磁力架上，静置10 min，待磁珠完全吸附于管壁后，使用移液器除去上清;重复上述清洗步骤3次。得到已清洗细胞外囊泡结合磁珠，用100μL ddH2O重悬。
将链霉亲和素（100 μg/mL）4 μL和生物素化GPC-1抗体（10μg/mL）10μL混合反应30min后，加入exosmePCR（10μM）3μL混合后再反应30 min构建抗体-DNA复合体；然后在25℃下将构建的抗体-DNA复合体与上述结合在磁珠上的外泌体混合孵育2 h；GPC-1抗体识别总外泌体中的肿瘤特异性EpCAM阳性外泌体，并将DNA标记到肿瘤特异性外泌体上。
实施例5：QPCR法定量肿瘤特异性外泌体
模板DNAexosmePCR通过特异性抗体结合到肿瘤特异性外泌体上之后通过QPCR进行定量检测。QPCR定量检测肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡表面的抗体-DNA复合物中DNA的分子数量，进而计算得到肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的含量。
QPCR引物序列为：
Forward primer： GCCGTGTTGGCTCGGATAC；
Reverse primer：CCAGGGAGTGATGGTTGGAATG。
磁珠捕获的外泌体与抗体-DNA复合物混合后室温下孵育2h后，洗涤8-10次后，对复合物进行QPCR测定。选用TaKaRa RR420A 试剂盒进行 PCR 扩增。其中，20μLPCR 体系主要包含：TB Green Premix Ex Taq（TLi RNaseH PLμs）（2X Conc.）10μL（1×），Forwardprimer（10 μM）（0.5μL），Reverse primer（10 μM）（0.5μL），样品2 μL,加水补足20 μL。PCR扩增条件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环，95℃ 10min，65℃ 5s。同时，以模板DNAexosmePCR作为标准品，制作标准曲线，最后计算获得的外泌体浓度为0.060 μM（图3）。
Claims (10)
1.一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）构建抗体-DNA复合体；
（2）从样品中分离纯化得到总外泌体/胞外囊泡，采用步骤（1）所述抗体-DNA复合物标记肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡；
（3）对经步骤（2）标记的肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡进行QPCR定量检测。
2.如权利要求1所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（1）中构建的方法为：抗体和DNA分别生物素化处理后，将生物素化抗体和生物素化DNA混合，再加入链霉亲和素分子混合反应，或者将生物素化抗体和链霉亲和素分子混合，再加入生物素化DNA混合反应，得到抗体-DNA复合体。
3.如权利要求2所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体为根据检测肿瘤抗原的不同所选用的偶联生物素的抗体；所述生物素化DNA为一端带有生物素的DNA模板，其长度为10-1000 核苷酸，优选长度为20-100 核苷酸。
4.如权利要求2所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体与链霉亲和素的分子数量比例为：1:4-1:1000，优选1:10-1:50，所述链霉亲和素与生物素化DNA的分子数量比例小于1:4。
5.如权利要求2所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述生物素化抗体和生物素化DNA混合时间为2-10min，所述再加入链霉亲和素分子混合反应时间为5min-10h，优选为10min-90min，所述生物素化抗体和链霉亲和素分子混合时间为10-60min，所述再加入生物素化DNA混合反应时间为10-60min。
6.如权利要求1或2所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于每分子所述抗体-DNA复合体中含有一个生物素化抗体和三个生物素化DNA。
7.如权利要求1或2所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（2）中样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液和唾液。
8.如权利要求1所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（2）中标记方法为：将抗体-DNA复合体与外泌体/胞外囊泡混合孵育。
9.如权利要求8所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述孵育条件为温度4℃-30℃，反应时间10min-12h，优选条件为温度25℃，反应时间2 h。
10.如权利要求1所述的一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法，其特征在于所述步骤（3）中QPCR定量检测方法为：QPCR定量检测肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡表面的抗体-DNA复合物中DNA的分子数量，进而计算得到肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的含量。
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