CN1136319C - 一种基因快速诊断金标试条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因快速诊断金标试条及其制备方法，该试条是由吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板组成。吸水纤维上包被有金标鼠抗地高辛抗体-地高辛标记寡核苷酸探针1，硝酸纤维素膜上包被有链霉亲和素-生物素标记寡核苷酸探针2，以及羊抗鼠多克隆抗体和链霉亲和素-生物素标记寡核苷酸探针3。寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2能与所测靶基因序列的不同部位互补结合，而寡核苷酸探针3不与所测靶基因序列互补结合，寡核苷酸探针3也不与寡核苷酸探针1或2互补结合。本方法特异性强，敏感性高，缩短了操作时间，简化了操作步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因快速诊断金标试条及其制备方法。
背景技术
基因检测技术是分子生物学研究中的最基本的技术之一，也是当前疾病诊断和辅助诊断中最先进的技术之一(基因诊断定技术)，基因诊断技术在遗传性疾病、传染性疾病、肿瘤及法医界的诊断与研究中正起着越来越重要的作用。当前基因检测技术包括核酸分子杂交、聚合酶链反应(即PCR)-电泳技术、聚合酶链反应-酶联免疫测定技术、聚合酶链反应-核酸分子杂交技术等，其中比较快速、简便的技术有PCR杂交梳(Hybri-CombTM)，这些技术其敏感性或特异性都比较高，但操作却十分复杂，也十分费时(少则十来小时，多则十来天)，大大地制约了基因检测或基因诊断技术的推广或普及。PCR杂交梳虽然比以往的基因检测技术快速和简便得多，但由于PCR杂交梳只能测定PCR扩增的靶基因，且需要事先对PCR产物进行标记也需要对试条进行专门的染色，所以这种技术仍相当复杂和费时，也不能用于非PCR扩增法所来源的靶基因检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、敏感和特异的基因检测试条及其制备方法。
本发明是由吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和底板组成。吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次粘在底板上；吸水纤维上包被有金标鼠抗地高辛抗体—地高辛标记寡核苷酸探针1的结合物，硝酸纤维素膜上包被有链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物，以及羊抗鼠多克隆抗体和链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针3，寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2能与所测靶基因序列的不同部位互补结合，而寡核苷酸探针3不与所测靶基因序列互补结合，寡核苷酸探针3也不与寡核苷酸探针1或2互补结合。
其制备方法为：
1.制备寡核苷酸探针
直接用DNA合成仪合成寡核苷酸探针1、2、3，寡核苷酸探针1、2、3的大小均为17-40碱基对。寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2分别与靶基因的不同部分相结合，而这两种探针之间却不能互补结合。寡核苷酸探针3既不能与靶基因序列互补结合，也不能与寡核苷酸探针1或寡核苷酸探针2互补结合。检测的靶基因不同，所用的探针1、2、3也不同，目前已普遍使用探针来检测已知的基因。
2.提供地高辛寡核苷酸探针1-金标鼠抗地高辛抗体结合物
如可以按柠檬酸三钠还原法制备：使用市售的相应的标记试剂盒对地高辛或生物素标记寡核苷酸探针直接进行标记，地高辛(digixigenin-11-dUTP)或生物素连接于寡核苷酸的3`-末端或5`-末端。
按常规方法制备胶体金—鼠抗地高辛抗体结合物，胶体金大小为10-30nm；将地高辛—寡核苷酸探针1按终浓度0.05-0.5μM与胶体金—鼠抗地高辛抗体结合物混合，37℃孵育10-30分钟，包被于有金标鼠抗地高辛抗体处，37℃孵育0.5-1小时，然后将此溶液5-10μl点于吸水纤维上。
3.制备链霉亲和素—生物素标记
寡核苷酸探针2和链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针3结合物。
50μl浓度为10-30μg/ml的链霉亲和素和50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针2或50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针3混合，22℃-42℃反应30分钟。
4.提供羊抗鼠多克隆抗体(IgG)
5.制备基因检测金标试条
将吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次粘在底板上，吸水纤维部分点包被金标鼠抗地高辛抗体-地高辛标记寡核苷酸探针1结合物；用链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物作为检测线，羊抗鼠多克隆抗体作为阳性对照线和链霉亲和素—生物素—寡核苷酸探针3结合物作为阴性对照线在硝酸纤维素膜上包被成三条约0.3cm宽的线条；晾干后用含10％新生牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，干燥后依次粘在白色塑料片上，切成0.3cm×8cm的条，加干燥剂密封保存。
采用本方法也可以制成基因快速诊断金标试卡或基因快速诊断金标试板。
6.制备杂交缓冲液
50倍杂交缓冲液中含5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白，加双蒸水至500ml。
本发明的原理：样品中靶基因与试条上金标-鼠抗地高辛抗体—寡核苷酸基因探针1结合物结合后沿硝酸纤维素膜迁移，在包被有链霉亲和素—生物素(SA-Biotin)标记寡核苷酸基因探针2结合物处作为检测线，形成链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2-靶基因—金标抗地高辛寡核苷酸探针1“夹心物”而出现红色线(探针1和探针2分别与靶基因的不同部位结合，而探针1与2之间不会结合)。
本发明产品所使用的夹心反相膜核酸杂交技术，由于采用了与靶基因不同部位结合的两种探针(探针1和探针2)，与目前所采用的核酸杂交技术相比其特异性更高；本发明产品采用了链霉亲和素—生物素放大系统，所以其敏感性比普通的核酸杂交技术更高，与PCR杂交梳相当。由于本发明产品不需事先标记靶基因，采用的金标免疫层析技术又省掉了染色步骤；采用的反相杂交技术能使杂交过程直接在试条上进行，所以与普通的核酸杂交技术和PCR杂交梳相比，操作步骤更简单，操作时间更短；也由于本发明产品不需事先标记靶基因，所以它既适用于PCR产物的靶基因检测也适用于其它来源的靶基因检测，而PCR杂交梳只能用于PCR产物的靶基因检测；本发明产品不仅适用于DNA样本的基因检测，也适用于RNA样本的基因检测。
附图说明
图1为本发明的结构示意图
具体实施方式
下面详细介绍基因快速诊断金标试条及基制备方法。
如图1所示，本发明是由吸水纸1、吸水纤维2、硝酸纤维素膜3、吸水滤纸4和底板5组成。吸水纸1、吸水纤维2、硝酸纤维素膜3、吸水滤纸4依次粘在底板5上。
本发明的制备方法，以乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原基因的检测为例
工艺流程：
1.寡核苷酸探针的制备
直接用DNA合成仪合成寡核苷酸探针1、2、3，寡核苷酸探针1、2、3的大小均为17-40碱基对。寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2分别与靶基因的不同部分相结合，而寡核苷酸探针3既不与核心抗原基因序列互补结合，也不与探针1或探针2互补结合。以乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原基因的检测为例。HBV的核心抗原基因位于基因序列482-1033碱基之间，长552个碱基对。设计其寡核苷酸探针1的序列为CCTGTAACTGGGCATCTGGG；寡核苷酸探针2的序列为TAACAAGTGGAGTGGTATGT。寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2分别与核心抗原基因中的485到505位的碱基和621到40位的碱基互补结合，探针1和探针2不能互补结合。寡核苷酸探针3的序列为ATTCGCGGTTAGCCTATCTG，它既不与核心抗原基因序列也不与寡核苷酸探针1或寡核苷酸探针2互补结合。
2.制备地高辛寡核苷酸探针1-金标鼠抗地高辛抗体结合物
使用市售的相应的标记试剂盒对寡核苷酸探针直接进行地高辛或生物素标记，地高辛(digixigenin-11-dUTP)或生物素连接于寡核苷酸的3`-末端或5`-末端。按常规方法制备胶体金—鼠抗地高辛抗体结合物，胶体金大小为10-30nm，具体方法简述如下：用超三蒸水溶解氯金酸，使其最终浓度为0.005-0.02％。煮沸后每100ml加入0.5-1.5％柠檬酸三钠水溶液1.5ml，继续煮沸腾5分钟。待冷却后用0.1-0.3mol/L K2CO3调至PH8.2。快速搅拌下加入纯化的鼠抗地高辛抗体(IgG)1-3mg，并继续搅拌15分钟。加入牛血清白蛋白200-280mg，再搅拌5分钟，最后加入10％NaCl水溶液使含NaCl浓度为0.5-3％，混匀后以1000-3000r/min离心10分钟，弃沉淀，上清液以8000-15000r/min离心5-10分钟。小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的金标抗地高辛结合物，溶于贮存液中(0.02mol/L，PH7.4 Tris-HCl中，含有20-60mg/100ml分子量20000的PEG(聚二醇)，40-70％甘油，0.01-0.03％NaN3)，-20℃保存。
将地高辛标记的寡核苷酸探针1按终浓度0.05-0.5μM与金标鼠抗地高辛抗体混合，37℃孵育10-30分钟，包被于有金标鼠抗地高辛抗体处，37℃孵育0.5-1小时，然后将此溶液5-10μl点于吸水纤维上。
3.制备链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物和链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针3结合物。
将50μl浓度为10-30μg/ml的链霉亲和素和50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针2或50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针3混合，22℃反应30分钟。
4.提供羊抗鼠多克隆抗体(IgG)结合物的制备
5.制备基因检测金标试条
测试条由吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸及其底板五部分组成。试条大小0.3cm×8cm。吸水纤维部分包被金标鼠抗地高辛抗体—地高辛标记寡核苷酸探针1结合物。用链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物作为检测线，羊抗鼠多克隆抗体作为阳性对照线和链霉亲和素—生物素—寡核苷酸探针3结合物作为阴性对照线在硝酸纤维膜上包被成三条0.3cm±0.1cm宽的线条，晾干后用10％新生牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭，干燥后依次粘在底板(如白色塑料片等)上，切成0.3cm×8cm的条，加干燥剂密封保存。
采用本方法也可以制成基因快速诊断金标试卡或基因快速诊断金标试板。
6.制备杂交缓冲液
50倍杂交缓冲液中含5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白，加双蒸水至500ml。
7.本发明的使用方法
a.靶基因样本的制备。DNA或RNA样本按常规方法制备，也可进一步对靶基因进行聚合酶链反应(PCR)。
b.按常规方法使靶基因变性。
c.杂交。20-40μl杂交缓冲液加5-20μl靶基因样本液组成杂交混合液，将金标试条金标端插入此混合液中，37℃孵育5-15分钟。
d.结果判断：测试线、阳性对照线同时出现红色为阳性(阴性对照线不显色)；测试线和阴性对照线均显红色为假阳性；阳性对照线不显色为试条失效。
Claims (2)
1、一种基因快速诊断金标试条，由吸水纸(1)、吸水纤维(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水滤纸(4)和底板(5)组成，吸水纸(1)、吸水纤维(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水滤纸(4)依次粘在底板(5)上，其特征在于，吸水纤维(2)上包被有金标鼠抗地高辛抗体—地高辛标记寡核苷酸探针1结合物，硝酸纤维素膜(3)上包被有链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物，以及羊抗鼠多克隆抗体和链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针3结合物，寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2能与所测靶基因序列的不同部位互补结合，而寡核苷酸探针3不与所测靶基因序列互补结合，寡核苷酸探针3也不与寡核苷酸探针1或2互补结合。
2、一种基因快速诊断金标试条的制备方法，其步骤如下：
2.1制备寡核苷酸探针
直接用DNA仪进行寡核苷酸探针1、2、3的合成，寡核苷酸探针1、2、3的大小均为17-40碱基对，寡核苷酸探针1和寡核苷酸探针2分别与靶基因的不同部分相结合，而这两种探针之间却不能互补结合，寡核苷酸探针3既不能与靶基因序列互补结合，也不能与寡核苷酸探针1或寡核苷酸探针2互补结合；
2.2提供地高辛寡核苷酸探针1-金标鼠抗地高辛抗体结合物；
2.3制备链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2和链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针3结合物；
50μl浓度为10-30g/ml的链霉亲和素和50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针2或50μl浓度为10-30μg/ml的生物素标记的寡核苷酸探针3混合，22℃--42℃反应30分钟；
2.4提供羊抗鼠多克隆抗体(IgG)
2.5制备基因检测金标试条
将吸水纸、吸水纤维、硝酸纤维素膜、吸水滤纸依次粘在底板上，吸水纤维部分包被金标鼠抗地高辛抗体—地高辛标记寡核苷酸探针1结合物；用链霉亲和素—生物素标记寡核苷酸探针2结合物作为检测线，羊抗鼠多克隆抗体作为阳性对照线和链霉亲和素—生物素—寡核苷酸探针3结合物作为阴性对照线，在硝酸纤维素膜上包被三条0.3cm±0.1cm宽的线条；晾干后用含10％新生牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，干燥后依次粘在底板上，切成0.3cm×8cm的条，加干燥剂密封保存。
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