CN110607270A

CN110607270A - 一种基于核酸适体免疫pcr共同表征外泌体膜标志物和rna的方法

Info

Publication number: CN110607270A
Application number: CN201911011894.3A
Authority: CN
Inventors: 方晓红; 董再再; 赵立波; 张振; 周卫; 徐丽
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN110607270B

Abstract

本发明涉及一种基于核酸适体免疫PCR共同表征外泌体膜上标志物和RNA的方法。此方法主要涉及通过核酸适体对外泌体膜上标志物进行特异性识别和结合，再通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)同时扩增结合在外泌体上的核酸适体及外泌体RNA，实现外泌体膜上标志物和RNA的同时表征。利用本发明提出的方法，可实现外泌体膜上标志物和RNA的同时高灵敏检测，节约样本，操作简单，具有很高的临床应用价值。

Description

一种基于核酸适体免疫PCR共同表征外泌体膜标志物和RNA的方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种外泌体分子检测方法，特别是一种基于核酸适体免疫PCR同时检测外泌体膜标志物和RNA的检测方法。

背景技术

外泌体是细胞分泌的直径在30-150nm的脂质外囊泡，携带了源细胞多种蛋白质，RNA和DNA等信息。其中，癌细胞分泌的外泌体在肿瘤生长，转移，免疫逃逸和血管生成过程中起重要作用。肿瘤细胞外泌体具有与癌症相关的特异性蛋白质和RNA，通过检测这些标志物可以更加准确地进行疾病诊断和治疗指导。同时，越来越多的证据表明，外泌体上蛋白的诊断价值与血浆中存在的蛋白有着显著差异。因此，外泌体被认为是液体活检中的新兴标志物。为了充分利用外泌体，有必要对外泌体标志物进行综合分析，获得转录组学和蛋白质组学在内的多种信息，从而为临床决策提供充足的依据。

为了能实现外泌体的分析检测，研究者们基于流式细胞术，荧光，比色和电化学等技术发展了多种多样的方法。然而，这些方法主要集中在外泌体RNA 或者蛋白质中的一类，并没有充分利用外泌体携带的信息，导致样本消耗量和操作步骤的增加。尤其是外泌体中一些特定的靶标，浓度仅为1/10⁶个/毫升。如果使用两种方法分别进行检测，将进一步减少每种方法的样本量，增加了检测难度。因此，亟需发展在有限的样品中高效地对外泌体进行综合分析的方法。免疫PCR方法通过连接有DNA序列的抗体将蛋白转换为DNA，为同时检测蛋白质和RNA提供了可能。但是，由于传统的免疫PCR需要先将DNA序列与抗体进行连接，这不仅不能保证修饰后抗体的识别效率，而且还增加了操作难度和检测成本。核酸适体作为“化学抗体”，具有合成简单，稳定性好，特异性高和亲和力强的优点。更重要的是，核酸适体的本身为DNA或RNA序列，能够通过PCR直接进行扩增，可有效的提高靶标的检测灵敏度。到目前为止，还没有可同时检测外泌体蛋白和RNA的方法报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出基于核酸适体免疫PCR方法实现外泌体膜上标志物和RNA的同时检测。利用核酸适体对外泌体膜上标志物进行特异性识别，然后，通过聚合酶链反应同时扩增外泌体上连接的核酸适体以及外泌体RNA，实现外泌体膜上标志物和RNA高灵敏同时检测。

一方面，本发明所述一种外泌体检测方法，其特征在于：先利用核酸适体识别外泌体膜标志物，然后通过核酸扩增的方式实现对外泌体膜标志物和RNA 的同步检测。

尽管本发明所述外分泌体检测方法具有潜在的临床诊断应用前景，但就本发明要求保护的外泌体检测方法而言，其直接目的仅是同时提供外分泌体膜标志物和外泌体RNA的信息，而并非直接进行疾病诊断。

进一步，所述核酸适体特异性识别外泌体上的膜蛋白、多糖等靶标分子。特别是有生理、病理意义的靶标分子。

进一步，所述核酸适体可特异性识别外泌体的CD63蛋白、PD-L1蛋白等外泌体膜标志物；所述外泌体RNA包括SLC25A6 RNA、IDO1 RNA等。

进一步，所述对外泌体膜标志物和RNA的同步检测既可以在同一反应体系中进行，也可以在不同的反应体系中进行；优选除了引物和/或探针以外，对外泌体膜标志物的检测和对外泌体RNA的检测，反应体系相同、反应条件相同。

进一步，所述核酸扩增包括PCR、LAMP、滚环复制等，优选所述核酸扩增包括荧光定量实时PCR。

进一步，所述核酸适体的3’端和5’端分别连接有引物模板序列，所述引物模板序列不影响核酸适体对外泌体膜标志物的识别和结合。

第二方面，本发明还提供一种外泌体检测方法，包括：

(1)外泌体的提取；

(2)加入核酸适体形成外泌体-核酸适体复合物；

(3)外泌体-核酸适体复合物的分离；

(4)外泌体-核酸适体复合物的核酸扩增；

其中：所述核酸适体能够识别外泌体膜标志物；所述步骤(4)中外泌体- 核酸适体复合物的核酸扩增包括对一种或多种外泌体RNA的扩增、和对一种或多种核酸适体的扩增。

进一步，所述核酸适体可特异性识别外泌体的CD63蛋白、PD-L1蛋白等外泌体膜标志物；优选所述识别CD63蛋白的核酸适体包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，所述识别PD-L1的核酸适体包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

进一步，所述核酸适体可采用以下衍生物替代：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

更进一步，所述外泌体RNA包括SLC25A6 RNA、IDO1 RNA等。外泌体 RNA IDO1的扩增引物包括SEQ ID NO:11-12、探针包括SEQ ID NO:13外泌体RNA SLC25A6的扩增引物包括SEQ ID NO:14-15、探针包括SEQ ID NO:16。

进一步，所述核酸适体的3’端和5’端分别连接有引物模板序列，所述引物模板序列不影响核酸适体对外泌体膜标志物的识别和结合。所述引物模板序列不参与核酸适体的构象形成。

进一步，所述核酸适体的扩增引物包括SEQ ID NO:5-6、探针包括SEQ ID NO:7，或所述核酸适体的扩增引物包括SEQ ID NO:8-9、探针包括SEQ ID NO:10。

进一步，步骤(1)所述外泌体的提取，包括利用固相载体对样本中的外泌体进行捕获、分离；并且

进一步，步骤(3)所述外泌体-核酸适体复合物的分离，包括将外泌体-核酸适体复合物从固相载体上释放出来。

更进一步，所述的固相载体为磁珠，优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺修饰的磁珠。

第三方面，本发明提供用于实施所述外泌体检测方法的试剂盒或试剂组，包括捕获外泌体的固相载体、识别外泌体膜标志物的核酸适体、还原剂如二硫苏糖醇或2-巯基乙醇、核酸适体扩增剂、RNA逆转录和扩增剂。

进一步，所述核酸适体扩增剂、RNA逆转录和扩增剂位于同一容器或不同容器。

进一步，所述核酸适体扩增剂包括核酸适体扩增引物和/或探针；所述RNA 逆转录和扩增剂包括RNA逆转录酶、RNA扩增引物和/或探针。

进一步，所述识别外泌体膜标志物的核酸适体可特异性识别外泌体的CD63 蛋白、PD-L1蛋白等外泌体膜标志物；优选所述识别CD63蛋白的核酸适体包括SEQ ID NO:1或SEQID NO:3，所述识别PD-L1蛋白的核酸适体包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

更进一步，所述外泌体RNA包括SLC25A6 RNA、IDO1 RNA等。外泌体 RNA IDO1的扩增引物包括SEQ ID NO:11-12、探针包括SEQ ID NO:13，外泌体RNA SLC25A6的扩增引物包括SEQ ID NO:14-15、探针包括SEQ ID NO:16。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)核酸适体具有特异性好，亲和力高的优势，连接引物的修饰可通过化学方法直接合成，无需额外的修饰步骤，且化学性质稳定。通过改变核酸适体序列，可实现对各种靶分子的检测或多种靶标的同时检测，适用性广。

(2)通过将外泌体膜上标志物经核酸适体转化为DNA，利用PCR即可对外泌体膜上标志物与RNA的同时表征。一次操作，即可完成两类标志物的同步检测，显著简化操作步骤，并节约检测样本。

(3)PCR通过指数扩增的方式进行信号放大，对靶标的检测灵敏度较线性方式更高，且PCR技术成熟，所需仪器比较普遍，适合推广应用。通过TaqMan 荧光定量PCR，利用不同荧光标记的探针，可实现同一样本中多种靶标的同时检测，以及同体系检测。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1基于核酸适体免疫PCR方法对外泌体膜蛋白和RNA同时检测示意图。

图2外泌体在固相载体上的捕获和释放。

a)通过流式细胞仪分别检测二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DistearoylPhosphoethanolamine，DSPE)修饰的磁珠(DSPE-S-S-MBs)(Control)， DSPE-S-S-MBs与荧光素标记的外泌体结合后(Exo)，以及加二硫苏糖醇 (Dithiothreitol，DTT)释放后(Exo+DTT)的荧光强度结果；

b)经DSPE-S-S-MBs捕获并被CD63核酸适体识别后，A375细胞外泌体 (5×10⁵个/μL)(DTT-)和从磁珠上释放后(DTT+)的PCR结果。

图3以外泌体CD63蛋白为例，采用核酸适体免疫PCR方法检测不同浓度 (50-5×10⁵个/μL)的外泌体。

a)核酸适体荧光定量PCR检测的循环数与外泌体的浓度负相关；

b)核酸适体荧光定量PCR检测的Ct值与外泌体的浓度负相关。

图4针对结合PD-L1的核酸适体进行荧光定量PCR，对来自3个健康人 (H1-H3)和5个肺癌患者血浆样品中的外泌体PD-L1蛋白的表征结果。

图5采用荧光定量PCR对来自3个健康人(H1-H3)和5个肺癌患者血浆样品中的外泌体IDO1 RNA和SLC25A6 RNA的表征结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1：基于适体的免疫PCR检测方法的建立

步骤1：DSPE-S-S-MBs的合成；

步骤1.1：将1mL羧基修饰的磁珠用PBS洗3次，最终重悬在1mL PBS 中；

步骤1.2：向步骤1.1中加入15mg胱胺盐酸盐混合均匀后，再加入10mg EDC ((1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride)和10mg羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)，室温搅拌反应5h；

步骤1.3：将步骤1.2中的混合溶液在外加磁场下进行分离，重复清洗3次，最后重悬在1mL PBS中；

步骤1.4：向步骤1.3中加入10mg NHS与DSPE共同修饰的聚乙二醇 (NHS-PEG-DSPE)，混合均匀，室温反应16h；

步骤1.5：将步骤1.4中的混合溶液在外加磁场下进行分离，重复清洗5次，最后重悬在1mL PBS中。

经过以上5个步骤即得到通过二硫键连接DSPE的磁珠DSPE-S-S-MBs。

步骤2：外泌体的捕获

步骤2.1：将步骤1中合成的DSPE-S-S-MBs与含有外泌体的样本在200μ L PBS中混合均匀，37℃反应1h；

步骤2.2：将步骤2.1中的混合溶液在外加磁场下进行分离，PBS清洗3次，最后重悬在200μL孵育缓冲液(含有1mM MgCl₂的PBS)中。

经过以上2个步骤即实现DSPE-S-S-MBs对外泌体的捕获。

步骤3：外泌体的识别

步骤3.1：将步骤2.2得到的溶液中加入经引物连接的核酸适体，37℃，反应1h；

步骤3.2：将步骤3.1中的混合溶液在外加磁场下进行分离，PBS(含有1mM MgCl₂)重复清洗5次，最后重悬在20μL PBS中。

经过以上2个步骤即实现连接引物的核酸适体对外泌体的识别。

步骤4：外泌体的释放

步骤4.1：将步骤3.2中加入50mM DTT，37℃，反应30min；

步骤4.2：将步骤4.1中的溶液在磁场下分离出磁珠，得到结合有核酸适体的外泌体上清液。

经过以上2个步骤即实现外泌体从磁珠上的释放。

利用DSPE-S-S-MBs执行对荧光素标记的外泌体捕获及释放步骤。由于本实施例中磁珠的直径为4-5μm，因此，可以通过常规的流式细胞仪进行表征。流式细胞仪测定的荧光强度结果如图2a所示，DSPE-S-S-MBs与荧光素标记的外泌体结合后的荧光强度显著增加，表明外泌体可以被DSPE-S-S-MBs有效地捕获。当采用DTT打断DSPE与MBs之间连接的二硫键，再次使用流式细胞仪进行检测。释放后DSPE-S-S-MBs上的荧光强度显著降低，表明大量外泌体已从DSPE-S-S-MBs上释放，释放效率约为82％。以上结果表明外泌体可以通过DSPE-S-S-MBs进行捕获并由DTT进行释放。

步骤5：PCR扩增

PCR反应中采用TaqMan荧光定量方法进行扩增。

20μL体系

2×缓冲液(RR064，Takara)：10μL

正向引物：0.4μL(10^-5mol/L)

反向引物：0.4μL(10^-5mol/L)

TaqMan探针：0.4μL(10^-5mol/L)

Taq酶(RR064，Takara)：0.4μL

逆转录酶(RR064，Takara)：0.4μL

步骤4.2中结合有核酸适体的外泌体上清液：3μL

超纯水补足至20μL

由于DNA无需逆转录，核酸适体扩增体系中使用超纯水代替逆转录酶，其余与RNA扩增体系完全一致。在同一体系中检测多种靶标时，将与靶标对应的引物和探针同时加入此体系中。

步骤设定：

逆转录过程：42℃，10min

预变性：95℃，10s

循环(40轮)：95℃，5s，60℃，30s。

实施例2：针对核酸适体的荧光定量PCR表征外泌体膜标志物CD63蛋白

以外泌体CD63蛋白为例，采用SEQ ID NO:1所示核酸适体进行免疫PCR 方法检测不同浓度(50-5×10⁵个/μL)的外泌体，利用CD63蛋白的核酸适体SEQ ID NO:1进行荧光定量PCR检测，扩增引物包括SEQ ID NO:5-6、探针包括SEQ ID NO:7(5’端标记FAM，3’端标记MGB)。结果如图3所示。可以看出，结合 CD63蛋白的核酸适体荧光定量PCR检测的循环数和Ct值与外泌体的浓度负相关。因此，通过荧光定量PCR检测核酸适体能够对外泌体膜标志物进行定量检测。

实施例3：外泌体PD-L1蛋白、外泌体RNA SLC25A6和IDO1在同一反应体系中进行表征

对3名健康人(H1-H3)和5名肺癌患者(P1-P5)的血浆样本外泌体PD-L1 蛋白、外泌体RNA SLC25A6和IDO1在同一反应体系中进行同时表征。

反应体系中，针对PD-L1蛋白的核酸适体SEQ ID NO:2进行荧光定量PCR 检测，扩增引物包括SEQ ID NO:8-9、探针包括SEQ ID NO:7(5’端标记FAM， 3’端标记MGB)。针对外泌体RNA SLC25A6和IDO1进行荧光定量PCR检测，外泌体RNA IDO1的引物包括SEQ ID NO:11-12、探针包括SEQ ID NO:13(5’端标记VIC，3’端标记BHQ1)；外泌体RNA SLC25A6的引物包括SEQ ID NO:14-15、探针包括SEQ ID NO:16(5’端标记Cy5，3’端标记BHQ3)。

针对PD-L1蛋白的核酸适体的实时荧光检测结果如图4所示，可以看到从 5名肺癌患者血浆中捕获的外泌体均检测到PD-L1，这与组织学检测结果一致。而从3名健康人血浆中捕获的外泌体中未检测到PD-L1，说明PD-L1核酸适体具有良好的特异性。

针对外泌体RNA SLC25A6和IDO1分别进行荧光定量PCR检测的结果如图5所示，其中，所有样品外泌体的SLC25A6 RNA均可被检测到，表明PCR 的结果是正确的。在IDO1 RNA的结果中，P2和P5含有IDO1 RNA，其余样本未检测出IDO1 RNA。这些结果表明，本发明提出的基于核酸适体免疫PCR 的方法可以同时检测临床样品中外泌体的膜蛋白和RNA。

表1：引物、探针、核酸适体的序列

注：F为正向引物，R为反向引物，TaqMan为TaqMan探针。SEQ ID NO:1-2 中加下划线部分为核酸适体序列。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 中国科学院化学研究所

<120> 一种基于核酸适体免疫PCR共同表征外泌体膜标志物和RNA的方法

<130> 无

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acttcagtcc atctctcgct caccccacct cgctcccgtg acactaatgc taagttccta 60

tcagatcaac ct 72

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attatagagg acacctagtc acgggccaca tcaactcatt gatagacaat gcgtccactg 60

cccgtgttat tacgacattt tggaa 85

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccccacct cgctcccgtg acactaatgc ta 32

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgggccaca tcaactcatt gatagacaat gcgtccactg cccgt 45

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acttcagtcc atctctcgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggttgatct gataggaact 20

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accccacctc gctcc 15

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

attatagagg acacctagt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttccaaaatg tcgtaataac 20

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggccacat caact 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggagaaagc ccttcaagtg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccagaaccct tcatacacca g 21

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accaaatcca cgatcatgtg aaccca 26

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggcctacttc ggcgtgtac 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaaggggtag gacaccacg 19

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcacggtctg cgcgatcatc ca 22

Claims

1.一种外泌体检测方法，其特征在于：先利用核酸适体识别外泌体膜标志物，然后通过核酸扩增的方式实现对外泌体膜标志物和RNA的同步检测。

2.如权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于：所述核酸适体特异性识别外泌体上的膜蛋白、多糖等靶标分子。

3.一种外泌体检测方法，包括：

(1)外泌体的提取；

(2)加入核酸适体形成外泌体-核酸适体复合物；

(3)外泌体-核酸适体复合物的分离；

(4)外泌体-核酸适体复合物的核酸扩增；

其特征在于：所述核酸适体能够识别外泌体膜标志物；所述步骤(4)中外泌体-核酸适体复合物的核酸扩增包括对一种或多种外泌体RNA的扩增、和对一种或多种核酸适体的扩增。

4.如权利要求1-3任一所述外泌体检测方法，其特征在于：所述核酸适体可特异性识别外泌体的CD63蛋白、PD-L1蛋白等外泌体膜标志物；所述外泌体RNA包括SLC25A6RNA、IDO1RNA等。

5.如权利要求1-3任一所述的外泌体检测方法，其特征在于：所述对外泌体膜标志物和RNA的同步检测既可以在同一反应体系中进行，也可以在不同的反应体系中进行；优选除了引物和/或探针以外，对外泌体膜标志物的检测和对外泌体RNA的检测，反应体系相同、反应条件相同。

6.如权利要求1-3任一所述的外泌体检测方法，其中所述核酸扩增包括PCR、LAMP、滚环复制等。

7.如权利要求1-3任一所述的外泌体检测方法，其特征在于所述核酸适体的3’端和5’端分别连接有引物模板序列，所述引物模板序列不影响核酸适体对外泌体膜标志物的识别和结合。

8.如权利要求3所述外泌体检测方法，其特征在于：步骤(1)所述外泌体的提取，包括利用固相载体对样本中的外泌体进行捕获、分离；步骤(3)所述外泌体-核酸适体复合物的分离，包括将外泌体-核酸适体复合物从固相载体上释放出来。

9.如权利要求8所述的外泌体检测方法，其特征在于：所述的固相载体为磁珠，优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺修饰的磁珠。

10.用于实施权利要求1-9任一所述方法的试剂盒或试剂组，包括捕获外泌体的固相载体、识别外泌体膜标志物的核酸适体、还原剂如二硫苏糖醇或2-巯基乙醇、核酸适体扩增剂、RNA逆转录和扩增剂。