KR20180059107A

KR20180059107A - 압타머를 이용한 이뮤노-피씨알 방법

Info

Publication number: KR20180059107A
Application number: KR1020160158283A
Authority: KR
Inventors: 박영석
Original assignee: 주식회사 팍스젠바이오
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2018-06-04

Abstract

본 발명은 압타머를 사용하여 면역-중합효소연쇄반응 (Immuno-Polymerase Chain Reaction)을 하는 압타머 이뮤노-피씨알 (Aptamer Immuno-PCR) 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 이뮤노-피씨알에서 사용하는 측정항체-올리고머 (Detection antibody-oligomer)를 대신하여 압타머를 사용함으로써, 이 압타머 자체를 주형으로 하여 피씨알을 수행할 수 있게 한 것이다.

Description

압타머를 이용한 이뮤노-피씨알 방법 {Method of Immuno-PCR using Aptamer}

본 발명은 압타머 (Aptamer)를 사용하여 면역-중합효소연쇄반응 (Immuno-Polymerase Chain Reaction)을 하는 압타머 이뮤노-피씨알 (Aptamer Immuno-PCR) 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 이뮤노-피씨알에서 사용하는 측정항체-올리고머 (Detection antibody-oligomer)를 대신하여 압타머를 사용함으로써, 이 압타머 자체를 주형으로 하여 피씨알을 수행할 수 있게 한 것이다.

면역진단은 시료의 분석에 있어서 항원에 대한 특이적인 항체 반응을 이용하는 기술로 대표적인 것이 효소면역측정법 (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)이다. 이는 현재의 질병상태를 간단하고 확실하게 진단할 수 있으나 항원 검사를 하기에는 다소 민감도가 낮아 항체 검사에 주로 사용하고 있다. 이 분석법은 체외진단 시장에서 가장 큰 부분을 차지하고 있다.

분자진단은 유전정보 물질인 DNA 또는 RNA를 검출 및 분석하여 질병을 진단하는 방법으로 가장 대표적으로 사용되고 있는 것이 중합효소연쇄반응 (PCR: Polymerase Chain Reaction)이다. 이 방법은 미량의 특정 DNA를 짧은 시간 내에 많은 양으로 증폭시키는 기술로서, 항원-항체 자체만을 보는 면역진단에 비해 민감도를 획기적으로 높일 수 있는 방법이다. 최근에는 형광 프로브를 사용하는 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 방법이 보편화되어 암 진단 등에서 근본적인 원인의 진단 및 정량에 사용되고 있다. (Park HS등, Yonsei Med J. 2017 Jan;58(1):19-26)

이와 같은 면역진단과 분자진단은 진단 시장에서 가장 핵심적인 두축을 이루고 있는데 서로가 각각의 장단점을 지니고 있다.

구분	면역진단	분자진단
장점	- 특이도가 높음 - 질병의 현 상태를 판단	- 민감도가 높음 - 다중 검사가 가능함
단점	- 민감도가 낮아 미량의 항원 검사에는 부적합함 - 항체 미검출 기간이 긴 편임	- 샘플에 따라서 핵산추출, PCR 등 과정이 복잡함 - 숙련된 인력이 필요하여 가격이 고가임

최근에 면역진단의 가장 큰 단점인 민감도를 높이기 위하여 여러 기술들이 접목되고 있는데, 이중에 이뮤노-피씨알 (Immuno-PCR)은 PCR의 가장 큰 장점인 핵산을 증폭시키는 방법을 이용한 것이다. 이 이뮤노-피씨알 기술은 1992년에 Sano 등 이 Science지 (1992 Oct 2;258, 5079:120-2)에 처음 발표한 것으로 측정항체에 DNA를 결합시킨 후에 이를 주형으로 하여 피씨알을 수행함으로써 소량의 표적 단백질로 많은 양의 DNA로 증폭하도록 고안한 방법으로 일반적인 ELISA 방법에 비해 100-10,000배의 민감도 향상을 보이고 있다.

이 기술을 수행하기 위해 가장 어려운 점의 하나는 측정항체에 DNA를 결합시키는 것으로 여러 단계를 거침으로써 합성 수율 저하와 품질관리 등의 어려움이 있다.

최근에 항체를 대체시키는 압타머 (Aptamer) 기술이 개발되어 면역진단에 사용되고 있다. 이는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA 또는 RNA)으로 일반 단백질 항체에 비해 여러 장점을 지니고 있는데 첫째, DNA 합성을 하면 되므로 생산이 용이하고 이에 따라 항체 생산 보다 생산 가격이 저렴하며 둘째, 항체에 비해 DNA는 안정성이 매우 높아 실온 보관이 가능하다.

최근에 충북대학교 팀에서 압타머를 사용하여 간암을 진단하는데 진단 마커Lipocalin-2를 사용하여 암진단에서의 사용될수 있음을 보였다. (Scientific Reports, 2015 Jun 3;5:10897).

[선행특허 문헌]

대한민국 특허공개번호1020020044849

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 높은 민감도와 특이도로 항원 자체를 진단할 수 있는 방법을 제공한다

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 특정 항원에 대한 챕쳐 항체 (Capture antibody) 및 상기 특정 항원을 인지할 수 있는 압타머를 포함하고, 상기 압타머는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 있어서 주형으로 작용하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 특정항원은 전립선암을 진단하기 위하여 사용할 수 있는 마커로 PSA, PCA3, Collagen α-1(III) peptide, Collagen α-1(I) peptide (MMP Substrate), Psoriasis susceptibility 1 candidate gene 2 protein peptide, Sodium/potassium- transporting ATPase γ Peptide 등이고 신장암의 경우는 Cathepsin D, NMP22 등이며 방광암의 경우는 Bladder-tumor- associated antigen, NMP22, Calreticulin, Clusterin, α-1B-Glycoprotein 등 인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 진단은 전립선암, 신장암, 또는 방광암 등 암에 대한 진단인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 특정 항원에 대한 챕쳐 항체에 특정 항원을 반응시키고, 상기 특정 항원을 인지할 수 있는 압타머를 반응시키고, 상기 압타머를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 서 주형으로 사용하여 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 이뮤노-피씨알법에 대한 개량 기술로 이뮤노-피씨알법은 항원을 진단하는데 있어서 항체에 DNA의 염기 서열을 붙여 PCR 기술을 이용하여 방법으로 민감도를 획기적으로 증가 시킬 수 있는데, 이는 기존의 면역진단 방법으로는 불가능한 극미량의 항원을 진단할 수 있으나 항체에 DNA를 부착하는 등 여러 기술적인 어려움이 있어서,

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 기존의 항체 대신에 압타머를 사용하여 이를 PCR template로 사용하는 기술로써 높은 민감도와 특이도로 항원 자체를 진단할 수 있는 획기적인 기술이다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법은 기존의 면역진단 방법으로는 불가능한 극미량의 항원을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 압타머를 사용하므로 Ab-DNA probe를 만들 필요가 없이 바로 PCR 반응에 이용할 수 있는 편리성이 있는 기술이다.

도 1은 압타머 이뮤노-피씨알에 대한 도식이다.

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

Claims

특정 항원에 대한 캡쳐 항체 및 상기 특정 항원을 인지할 수 있는 압타머를 포함하고, 상기 압타머는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 있어서 주형으로 작용하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 특정항원은 전립선 특이항원(PSA), 전립선암 항원(PCA)3, 콜라겐 α-1(III) 펩타이드, 콜라겐 α-1(I) 펩타이드, 건선 감수성(Psoriasis susceptibility) 1 후보 유전자 2 단백질 펩타이드, 나트륨/칼륨-트랜스포팅 ATPase γ 펩타이드, 카텝신(Cathepsin) D, 핵 매트릭스 단백질(Nuclear Matrix Protein) 22, 방광암 관련 항원, 칼레티쿨린(Calreticulin), 크루스테린(Clusterin), 또는 α-1B-당단백질인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 진단은 전립선암, 신장암, 또는 방광암에 대한 진단인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
특정 항원에 대한 챕쳐 항체에 특정 항원을 반응시키고, 상기 특정 항원을 인지할 수 있는 압타머를 반응시키고, 상기 압타머를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 서 주형으로 사용하여 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 특정항원은 전립선 특이항원(PSA), 전립선암 항원(PCA)3, 콜라겐 α-1(III) 펩타이드, 콜라겐 α-1(I) 펩타이드, 건선 감수성(Psoriasis susceptibility) 1 후보 유전자 2 단백질 펩타이드, 나트륨/칼륨-트랜스포팅 ATPase γ 펩타이드, 카텝신(Cathepsin) D, 핵 매트릭스 단백질(Nuclear Matrix Protein) 22, 방광암 관련 항원, 칼레티쿨린(Calreticulin), 크루스테린(Clusterin), 또는 α-1B-당단백질인 것을 특징으로 하는 방법.