WO2020159069A1 - 압타머를 이용한 다중 multiplex pcr 방법 - Google Patents

압타머를 이용한 다중 multiplex pcr 방법 Download PDF

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WO2020159069A1
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target molecule
target
pcr
detection
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김기석
신의수
강주형
여민영
이광현
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주식회사 압타머사이언스
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    • C12Q2563/143—Magnetism, e.g. magnetic label

Definitions

  • the present invention provides a method for detecting a target molecule and a composition for detecting the target molecule, comprising an aptamer that recognizes a target site of the target molecule, and using the aptamer as a template for polymerase chain reaction (PCR). .
  • PCR polymerase chain reaction
  • An aptamer is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that is characterized by binding to a specific target with high affinity and specificity.
  • Aptamers can generally be obtained through the systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) process.
  • the aptamer discovered in this way is used for diagnostic or therapeutic purposes because it has the property of specifically binding to various target molecules ranging from chemical molecules of small targets such as antibodies to proteins to have a dissociation constant of picomolar level. .
  • Aptamers have the advantage of being easier to produce than antibodies, and can be stored at room temperature, so that they are more stable than antibodies. Due to the effect of the aptamer having superior properties compared to antibodies, many studies have been conducted using it as a biomarker and a biosensor for diagnosing it.
  • Enzyme immunoassay is used as an immunodiagnostic method related to the detection and quantification of physiologically important molecules.
  • the enzyme immunoassay method is 1) a method of coating an antigen on a plate, and then binding the antibody to analyze and confirm the signal, 2) coating the antibody on a plate, treating the antigen, and again processing the antibody on the sandwich There is a way.
  • a double sandwich technique is frequently used, in order to detect and quantify a protein, a target biomarker protein is attached to an antibody immobilized on a surface, and another antibody is attached to a target, thereby measuring the amount of a target substance.
  • a typical method of molecular diagnosis is a method of amplifying a large amount of specific DNA in a short time by a polymerase chain reaction, and thus, it is a method of increasing sensitivity because it can be confirmed with a small amount of sample.
  • a method called Immuno-PCR can be used by grafting these diagnostic methods. This method is a diagnostic method that binds DNA to the ends of antibodies used in enzyme immunoassays and amplifies them to detect even small amounts of proteins. It shows a sensitivity of 100-10000 times. Problems in Immuno-PCR have the same problems as the above enzyme immunity analysis method because of using antibodies, besides, it is not easy to immobilize oligo-DNA on antibodies, and there is a difficulty in commercialization due to low yield.
  • the present inventors overcame all of the disadvantages of the antibody-based technology, and as a result of diligent efforts to develop a technology capable of detecting and quantifying one or more target molecules, the nucleic acid aptamer is used as a template for polymerase chain reaction (PCR)
  • PCR polymerase chain reaction
  • One object of the present invention is to provide a method for detecting a target molecule, comprising an aptamer that recognizes a target site of the target molecule, and using the aptamer as a template for polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting a target molecule, comprising an aptamer that recognizes a target site of the target molecule, and using the aptamer as a template for polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the aptamer of the present invention has excellent binding affinity to a specific biomarker, and thus, the aptamer bound to the biomarker is beaten out, and a primer corresponding to the aptamer is used to diagnose and diagnose the biomarker through real-time polymerase chain reaction. It can be used to quantify. In addition, by diagnosing and quantifying three or more biomarkers using three or more aptamers and primers, multiple types of biomarkers can be used for simultaneous multiple diagnosis.
  • 1 is a simple diagram for an aptamer-based multiple polymerase chain reaction.
  • Figure 2 shows the results of finding the concentration conditions of bovine serum albumin (bovine serum albumin, BSA) suitable for minimizing the detection aptamer non-specifically binding to magnetic beads.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 3 shows the results of finding the conditions of dextran sulfate (dextran sulfate, DxSO4) suitable for minimizing the detection aptamer non-specifically binding to the magnetic beads.
  • Figure 4 shows the results of amplification curves in real-time polymerase chain reaction in target biomarkers and non-target biomarkers for each aptamer pair in a single diagnosis. Specifically, when the target biomarker is present, it can be confirmed that the aptamer binds and the amplification curve appears early.
  • FIG. 5 shows a comparison of amplification curves in a real-time polymerase chain reaction and amplification curves in multiple diagnosis in a method using an aptamer pair of a target biomarker during single diagnosis. Specifically, in the presence of the same biomarker, it can be confirmed that the amplification curves of each target aptamer appear identically in the single diagnosis and the multiple diagnosis.
  • Figure 6 shows the amplification curve in the polymerase chain reaction for the performance test of each aptamer for a target biomarker in a multiple diagnostic method using an aptamer pair. Specifically, it can be confirmed that detection is possible even when the amount of the target biomarker is small.
  • Figure 7 shows the results of amplification curves in real-time polymerase chain reaction in target biomarkers and non-target biomarkers for each single pressure timer with a single diagnosis. Specifically, when the target biomarker is present, it can be confirmed that the aptamer binds and the amplification curve appears early.
  • FIG. 8 shows a comparison of the amplification curve in the real-time polymerase chain reaction and the amplification curve in multiple diagnosis in a method using a single pressure timer of a target biomarker during single diagnosis. Specifically, in the presence of the same biomarker, it can be confirmed that the amplification curves of each target aptamer appear identically in the single diagnosis and the multiple diagnosis.
  • Figure 9 shows the amplification curve in the polymerase chain reaction for the performance test of each aptamer for the target biomarker in a multiple diagnostic method using a single aptamer. Specifically, it can be confirmed that detection is possible even when the amount of the target biomarker is small.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object comprises an aptamer that recognizes a target site of a target molecule, and using the aptamer as a template for polymerase chain reaction (PCR), a method for detecting a target molecule to provide.
  • PCR polymerase chain reaction
  • enzyme immunoassay or Immuno-PCR is used as a method for detecting and quantifying general target molecules.
  • enzyme immunoassay ELISA
  • Immuno-PCR there are problems such as reproducibility, stability, cost-sensitivity to detection of multiple biomarkers simultaneously, and the method of immobilizing oligo-DNA on antibodies. It is not easy and there is a difficulty in commercialization due to low yield.
  • an aptamer bound to the target molecule can be used as a template for PCR, and multiple separate aptamers can be used. When used, it can be said to have great significance in that multiple and simultaneous detection is possible.
  • the method of the present invention specifically comprises: (i) contacting a target molecule with an aptamer that recognizes a target site of the target molecule; And (ii) performing a polymerase chain reaction (PCR) using a aptamer formed of the complex by the contact as a template among complexes of the target molecule and the complex of the target molecule, but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Target molecule in the present invention means a substance that can be detected by the aptamer of the present invention.
  • the target molecule is a protein, peptide, carbohydrate, polysaccharide, glycoprotein, hormone, receptor, antigen, antibody, virus, cofactor, drug that can be captured by a capture aptamer and is present in a separate sample, drug, It may be one or more selected from the group consisting of dyes, growth factors and controlled substances, but is not limited thereto.
  • the target molecule or target site may be one or more, and is included without limitation as far as the aptamer can recognize.
  • the target molecule is a first capture aptamer or a protein capable of binding to the first capture aptamer It is not limited to that kind. Specifically, it may be one or more selected from the group consisting of animal cell membrane proteins, plant cell membrane proteins, microbial cell membrane proteins, and viral proteins, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, IR, ErbB2, and VEGFR2 were used as target molecules.
  • sample may be one or more selected from the group consisting of biological samples, environmental samples, chemical samples, pharmaceutical samples, food samples, agricultural samples, and livestock samples, specifically, whole blood , White blood cells, peripheral blood mononuclear cells, plasma, serum, sputum, breath, urine, semen, saliva, meningeal fluid, amniotic fluid, Glandular fluid, lymph fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, cell, cell extract, stool ), tissue extract, tissue biopsy, and one or more selected from cerebrospinal fluid, but is not limited thereto.
  • aptamer refers to a special kind of single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid or peptide having a stable tertiary structure in itself and a characteristic capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity. it means.
  • the aptamer may be DNA, RNA, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the aptamer may be unmodified, that is, a natural aptamer or a modified aptamer.
  • the modified aptamer may include at least one chemical modification, and the at least one chemical modification is chemical at one or more positions independently selected from ribose positions, deoxyribose positions, phosphate positions and base positions.
  • the chemical modifications are 2'-position sugar modification, 2'-fluoro (2'-F), 2'-O-methyl, purine modification at 8-position, cytosine exo Modifications in cyclic amines, substitution of 5-bromouracil, substitution of 5-bromodeoxyuridine, substitution of 5'-bromodeoxycytidine (5- bromodeoxycitidine) may be selected from the group consisting of substitution, backbone modification, methylation, 3'cap and 5'-cap, but is not limited thereto.
  • the base used in addition to the modified base may be selected from the group consisting of bases of A, G, C, T, and their deoxy form (eg, 2'-deoxy form), unless otherwise specified.
  • the modified base refers to a modified form in which the 5-position of dU (deoxyuracil) is substituted with a hydrophobic functional group, and may be used in place of the base'T'.
  • the hydrophobic functional group may be at least one selected from the group consisting of benzyl group, naphthyl group, pyrrolebenzyl group, tryptophan, and the like.
  • the 5-position of the dU base is substituted with a hydrophobic functional group to be modified, and thus has an advantage of significantly increasing affinity with periostin as compared to the case where it is not modified.
  • Table 1 shows unmodified aptamers and modified aptamers.
  • the aptamer of step (i) may be a aptamer pair consisting of a capture aptamer that recognizes a target site and a detection aptamer that recognizes a target site and is used as a template, or a single aptamer used as a template and a target aptamer pair.
  • the aptamer pair or single aptamer is not limited thereto, and may be present as many as each molecule or target site according to the target molecule or target site.
  • the aptamer pair or single aptamer may be one target molecule or one aptamer pair or single aptamer having high affinity and specificity to one target site, one or more target molecules or one or more target sites It may be one or more pairs of aptamers that bind to or a single aptamer.
  • the target molecule is 1 type of aptamer, 1 type of aptamer, 2 types of aptamer, 3 types of aptamer, etc. Is set. In this case, since multiple target sites may exist in the target molecule, more types of aptamers may exist than the target molecule type.
  • the target molecule suspended in the sample, and in the case of a single aptamer, the target molecule may be immobilized on a support, but is not limited thereto.
  • the method using the aptamer pair may include the step of performing the following steps. Specifically, (a) forming a first complex by binding the first capture aptamer to a solid support; (b) binding a target molecule to the first complex of step (a); (c) forming a second complex by binding a second capture aptamer to the target molecule of step (b); And (d) separating the second capture aptamer from the second complex of step (c) to perform a polymerase chain reaction (PCR), but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Step (a) is a step of forming a first complex by binding the first capture aptamer to a solid support.
  • first capture aptamer means that a target site of a target molecule present in an isolated sample can be recognized after binding to a solid support.
  • first capture aptamer may be a conjugated label material at the 5'end of the aptamer, and the term may be used interchangeably with the capture aptamer.
  • the first capture aptamer may be labeled with a detectable molecule such as, for example, radioactive isotopes, fluorescent compounds, bioluminescent compounds, chemiluminescent compounds, metal chelators or enzymes. Specifically, it can be labeled by incorporating a detectable label by a method selected from the group containing spectral, photochemical, fluorescent, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • detectable molecules include radioactive materials (32 P , 35 S , 3 H, 125 I), fluorescent dyes (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acety laminofluorene, digoxygenin) or biotin.
  • the first capture aptamer according to the present invention may be a biotin conjugated to the 5'-end, but is not limited thereto.
  • the method may further include the step of selectively removing the first capture aptamer not bound to the first complex, but is not limited thereto.
  • washing was performed with a washing solution 1 to remove the capture aptamer that is not bound to the first complex.
  • the "solid support” includes magnetic beads, polymer beads, agarose beads, polystyrene beads, acrylamide beads, solid core beads bead, porous bead, paramagnetic bead, glass bead, controlled pore bead, microtiter well, cyclo-olefin copolymer substrate (cycloolefin copolymer substrate), membrane, plastic substrate, nylon, Langmuir-Blodgett films, glass, germanium substrate, silicon substrate ), silicon wafer chips, flow through chips, microbeads, polytetrafluoroethylene substrates, polystyrene substrates, gallium arsenide substrates ), may be one or more selected from the group consisting of a gold substrate and a silver substrate, and may specifically be a magnetic bead, but is not limited thereto.
  • the step (a) may further include a step of blocking with a blocking solution to prevent non-specific binding before binding the aptamer to the solid support, but is not limited thereto.
  • the blocking solution may be one or more selected from the group consisting of BSA, salmon sperm DNA, herring sperm DNA, skim milk, and casein, More specifically, it may be a BSA, but is not limited thereto.
  • Step (b) is a step of binding the target molecule to the first complex of step (a).
  • the method may further include the step of selectively removing the target molecule not bound to the first complex, but is not limited thereto.
  • washing was performed with a washing solution 1 to remove target molecules not bound to the first complex.
  • Step (c) is a step of forming a second complex by binding a second capture aptamer to the target molecule of step (b).
  • the term "second capture aptamer” refers to a detection aptamer used as a template to recognize the target site of the first complex.
  • the second capture aptamer can be used in combination with the detection aptamer.
  • the method may further include the step of selectively removing the second capture aptamer that is not associated with the target site of the first complex, but is not limited thereto.
  • the first solution was washed with a washing solution 1 to remove the detection aptamer that is not bound to the target site.
  • the method is characterized in that one or more target molecules can be detected by an aptamer that recognizes one or more specific antigens by combining the complex with the target molecule bound to the first complex before step (c). It may be, but is not limited thereto.
  • Step (d) is a step of performing a polymerase chain reaction (PCR) by separating the second capture aptamer from the second complex of step (c).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • the term "polymerase chain reaction (PCR)" in the present invention uses a target nucleic acid as a template, and amplifies the target nucleic acid by repeating the process of denaturation, annealing and elongation reaction using primers specific to the target nucleic acid. It means the process.
  • the second capture aptamer may be separated from the second complex, and the polymerase chain reaction may be performed using primers specific to the aptamer, but is not limited thereto.
  • the polymerase chain reaction may be real time PCR, or multiplex-PCR, and may be repeated one or more times in the process of denaturation, annealing and extension reaction due to the characteristics of the polymerase chain reaction method.
  • the term "multiplex PCR (Multiplex-PCR)" of the present invention means that many target molecules in a sample can be simultaneously amplified.
  • one or more target molecules can be detected using the aptamer, but the present invention is not limited thereto.
  • the multiplex PCR can simultaneously detect and quantify (i) one or more target molecules and aptamers in one well or tube, or (ii) one or more wells or tubes.
  • one or more target molecules may be detected and quantified by reacting with the aptamer, but is not limited thereto.
  • the polymerization chain reaction (PCR) may be a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), but is not limited thereto.
  • Multiplex-PCR can be used in combination with quantitative PCR (Quantitative PCR; qPCR), real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).
  • quantitative PCR Quantitative PCR
  • real-time polymerase chain reaction real-time PCR
  • quantitative PCR Quantitative PCR
  • real-time polymerase chain reaction real-time PCR
  • qPCR is amplified through three steps such as denaturation, annealing and elongation as standard PCR, and then quantified by collecting data through fluorescence labeling.
  • the fluorescent label is made through the use of a dsDNA-binding dye, and in the probe-based qPCR, optimization and design of a target-specific probe in addition to the primer is required to simultaneously detect many target molecules in each sample Do.
  • the real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) is characterized in that using TaqMan probe PCR, intercalating fluorescent dye (intercalating fluorescent dye) for the detection and quantification of target molecules, but is not limited thereto Does not.
  • the method of the present invention is capable of single diagnosis or multiple diagnosis capable of simultaneous detection using an aptamer pair.
  • the method of using the single aptamer for the purposes of the present invention may include the step of performing the following steps. Specifically, (a) binding the target molecule to a solid support; (b) forming a complex by binding the capture aptamer to the target molecule of step (a); And (c) separating the capture aptamer from the complex of step (b) to perform a polymerase chain reaction (PCR), but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Each step of the method for detecting a target molecule using the single aptamer is the same as the method for detecting the target molecule using a pair of aptamers, and some terms and some performing steps are the same.
  • the method does not include, but is not limited to, binding the first capture aptamer to a solid support to form a first complex, and binding the target molecule to the solid support.
  • capture aptamer refers to a single aptamer used as a template to recognize the target site of the target molecular complex bound to a solid support.
  • capture aptamers can be used interchangeably with single aptamers.
  • the method may further include, but is not limited to, selectively removing the capture aptamer that is not bound to the target site of the target molecular complex bound to the solid support.
  • washing was performed with a washing solution 1 to remove a single aptamer not bound to the target site of the complex.
  • bound complex includes (a) a first complex that binds a first capture aptamer to a solid support (b) a complex that binds a target molecule to the first complex, and (c) a second target molecule.
  • the second complex bound to the capture aptamer, (d) the target molecule may be a complex bound to the solid support, or (e) a target molecule may be a complex bound to the capture aptamer, but is not limited thereto.
  • the method may further include the step of separating and amplifying the capture aptamer from the complex, and in addition, a method of commonly used polymerization chain reaction (PCR) may be added without limitation.
  • PCR polymerization chain reaction
  • the method of the present invention is capable of single-diagnosis or multi-diagnosis capable of simultaneous detection using a single aptamer.
  • aptamers a pair of aptamers or single aptamers
  • aptamers that are stable from high temperature and easy to store and distribute are used as a template for polymerase chain reaction. It suggests that you can.
  • sequence of primers can be selectively selected from each aptamer having a different base sequence, and that multiple (one or more) target molecules can be detected and quantified at the same time or without any sequence interference. Is to do.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object includes an aptamer that recognizes a target site of a target molecule, and uses the aptamer as a template for polymerase chain reaction (PCR), to detect a target molecule It is to provide a composition.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the target molecule is characterized by performing multiple PCRs with one or more species, and the aptamer recognizes a target aptamer and a target aptamer that recognizes a target aptamer and a target aptamer that is used as a template and a aptamer pair or target site. And a single aptamer used as a template, but is not limited thereto.
  • Example 1 Sandwich assay using aptamer pair
  • the magnetic beads prepared in Example 1-1 were reacted with 20 pmol of the capture aptamer in which biotin was conjugated to the 5'end of the aptamer.
  • binding solution 1 binding buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 20uM DxSO4
  • the mixture is reacted for 15 minutes at 600 rpm at room temperature.
  • wash three times with 100ul of washing solution 1 washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 20uM DxSO4.
  • Example 1-3 Target molecule binding
  • Example 2 2 pmol of the target molecule was added to the magnetic beads prepared in Example 1-2, and the mixture was reacted for 10 minutes at a room temperature condition of 600 rpm in a binding solution 1 of 100 ul in total.
  • the target molecule not bound to the capture aptamer is washed three times with 100 ul of washing solution 1.
  • Example 1-4 Detection aptamer binding and elution
  • Example 2 Multiple biomarker diagnostic method using a single pressure timer
  • the protein is diluted with a carbonate-bicarbonate solution (pH 9.6).
  • Enzyme immunoassay plate (ELISA-plate) 100 ul into each well, and reacted at 4° C., 600 rpm for 12 hours. The unreacted protein is washed once with 100ul of washing solution 1 at room temperature for 2 minutes and 600 rpm.
  • the target molecule is placed in each well on the plate, and reacted at room temperature at 800 rpm for 1 hour. Wash 2 times with 100ul of washing solution 5 for 3 minutes at 600 rpm. Add 30 mM of 2 mM NaOH and react for 10 minutes at 600 rpm at room temperature to elute the detection aptamer.
  • a magnetic bead blocking test was performed for each BSA concentration. 20 ug of magnetic beads coated with streptavidin was transferred to a 1.5 ml tube, and the buffer was removed using a magnetic stand. Specifically, it is washed three times with 100ul of SB17 buffer. In a state in which only the magnetic beads are left, 100 ul of blocking solution 2 (blocking buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 3% or 10% BSA) is added to the tube and blocked for 1 hour at 600 rpm at room temperature. To remove the remaining blocking solution, wash three times with 100ul of SB17 buffer.
  • blocking buffer 1xSB17, 0.05% tween20, 3% or 10% BSA
  • the magnetic beads prepared above were reacted with 20 pmol of capture aptamer (SEQ ID NO: A1 or A3 or A5) in which biotin was conjugated to the 5'end of the aptamer, respectively. It reacts for 15 minutes at room temperature condition of 600 rpm in the binding solution 1 of 100ul in total. To remove the immobilized capture aptamer, wash 3 times with 100 ul of washing solution 1.
  • capture aptamer SEQ ID NO: A1 or A3 or A5
  • Real time PCR mixture solution 1 (1x Taq buffer (solgent), 0.2 mM dNTP, 0.2 uM primer (P1 or P2 or P3 or P4 or P5 or P6), 5 mM MgCl2, 1x SYBR, 0.05 U Taq Polymerase (solgent) is prepared.
  • 18ul of the real-time polymerase reaction solution prepared and 2ul of the eluted detection aptamer are added. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment.
  • the real-time polymerase reaction proceeds once at 95°C for 10 minutes as the first process, and then at 95°C for 15 seconds and at 60°C for 1 minute 40 times for the second process.
  • the magnetic beads prepared above were reacted with 20 pmol of capture aptamer (SEQ ID NO: A1 or A3 or A5) conjugated with biotin at the 5'end of the aptamer, respectively.
  • the mixture is reacted at 600 rpm for 15 minutes at room temperature.
  • wash three times with 100ul of washing solution 2 washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20).
  • Target molecules or non-target molecules (recombinant human insulin receptor protein, R&D systems, 1544-IR-050) or ErbB2 (recombinant human ErbB2 protein, R&D systems, 1129ER-050) or VEGFR2( human VEGF R2 protein, Acro biosystems, KDR-H5227))
  • the target molecule that is not bound to the capture aptamer is washed three times with 100 ul of washing solution 2.
  • Real time PCR mixture solution 2 (real time PCR mixture solution; 1x Taq buffer (solgent), 0.2 mM dNTP, 0.2 uM primer (P2 or P4 or P6), 5 mM MgCl2, 1x SYBR, 0.05 U Taq polymerase (solgent))
  • 18ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment.
  • the real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Figure 3a is a real-time polymerase reaction results for VEGFR2 according to the concentration of DxSO4 in the binding solution. As the concentration of DxSO4 increases, you can see that the graph moves to the right. Since the same amount of protein and aptamer is used, there is a gap between the two graphs, so it can be said that there is sensitivity to the target molecule. If you check the graph by concentration, you can see that it is appropriate to use 20uM or 40uM with a large gap. As a result of using other target molecules, it was confirmed that the results in the same pattern as in FIG. 3A appeared.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. 18ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Figure 3b is a real-time polymerase reaction results for VEGFR2 according to the concentration of DxSO4 in the washing solution. As with the binding solution, it can be seen that the graph moves to the right as the concentration of DxSO4 increases. If you check the graph by concentration, you can see that it is appropriate to use 20uM or 40uM with a large gap. As a result of using other target molecules, it was confirmed that the results of the aspect shown in FIG.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. 18ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Figure 3c is a real-time polymerase reaction results for VEGFR2 according to the concentration of DxSO4 in the binding solution and washing solution.
  • Experimental Example 2-1 and Experimental Example 2-2 it can be seen that the graph moves to the right as the concentration of DxSO4 increases.
  • the effect is inferior to that of FIGS. 3A and 3B.
  • FIG. 3A and 3B As a result of using other target molecules, it was confirmed that the results of the aspect shown in FIG.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. Mix 18ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in the real time PCR tube with 2ul of eluted detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • detection aptamers SEQ ID NOs: A2, A4, and A6 were added in 2 pmol each to prepare a detection binding solution 1 of 100 ul in total.
  • 100 ul of the detection binding solution was added, and the mixture was reacted for 10 minutes at 600 rpm at room temperature.
  • the unreacted detection aptamer is washed three times with 100 ul of washing solution 4.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared.
  • Detection aptamer eluted from one sample is analyzed with each primer in three tubes.
  • Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment.
  • the real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • 3 types of detection aptamers (SEQ ID NOs: A2, A4, A6) were added in 2 pmol each to prepare a detection binding solution 1 of 100 ul in total.
  • 100 ul of the detection binding solution was added, and the mixture was reacted for 10 minutes at 600 rpm at room temperature.
  • the unreacted detection aptamer is washed three times with 100 ul of washing solution 4.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared.
  • Detection aptamer eluted from one sample is analyzed with each primer in three tubes.
  • Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment.
  • the real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Figure 6 shows the results of testing the performance of the simultaneous multi-diagnosis system. Even if the amount of the target molecule was reduced to 5 fmol, it was confirmed that multiple diagnosis was performed, and the same experimental results were obtained for each target molecule.
  • the protein is diluted with a carbonate-bicarbonate solution (0.05M, pH 9.6).
  • Enzyme immunoassay plate 100 ul of target protein and non-target molecule diluted in each well are added and reacted at 4°C, 600 rpm for 12 hours. The unreacted protein is washed once with 100ul of washing solution 1 at room temperature for 2 minutes and 600 rpm.
  • Detection aptamer (A2 or A4 or A6) is added to each well of the plate, and reacted at 800 rpm for 1 hour at room temperature. Wash 2 times with 100ul of washing solution 1, 3 times at 600rpm. Add 30 mM of 2 mM NaOH and react for 10 minutes at 600 rpm at room temperature to elute the detection aptamer.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. 18 ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2 ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once in 96°C 15 seconds, 55°C 10 seconds, and 70°C 30 minutes once, and in the second process, 96°C 15 seconds, 70°C and 1 minute 40 times.
  • the graph appears in the front, and the non-target molecule appears in the back, confirming the result of aptamer binding to the target molecule.
  • the protein is diluted with a carbonate-bicarbonate solution (0.05M, pH 9.6).
  • Enzyme immunoassay plate 100 ul of each mixed protein diluted in each well is added and reacted at 4°C, 600 rpm for 12 hours. The unreacted protein is washed once at 600 rpm for 2 minutes at room temperature with 100 ul of washing solution 1.
  • the detection aptamer mixture (A2, A4, A6) is added to each well of the plate, and reacted at 800 rpm for 1 hour at room temperature. Wash 2 times with 100ul of washing solution 1, 3 times at 600rpm. Add 30 mM of 2 mM NaOH and react for 10 minutes at 600 rpm at room temperature to elute the detection aptamer.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. 18 ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2 ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Example 6 samples prepared with the target molecule were prepared together to prepare 4 samples, and the experimental results shown in FIG. 8 were obtained. As a result of comparing the conditions in the multiple diagnosis and the single diagnosis, it was confirmed that the results of the multi-diagnosis method developed by this study are almost similar to the results in the single diagnosis.
  • the protein is diluted to 1 pmol to 5 fmol using a carbonate-bicarbonate solution (0.05M, pH 9.6).
  • Enzyme immunoassay plate 100 ul of each mixed protein diluted in each well is added and reacted at 4°C, 600 rpm for 12 hours. The unreacted protein is washed once with 100ul of washing solution 1 at room temperature for 2 minutes and 600 rpm.
  • the detection aptamer mixture (A2, A4, A6) is added to each well of the plate, and reacted at 800 rpm for 1 hour at room temperature. Wash 2 times with 100ul of washing solution 1, 3 times at 600rpm. Add 30 mM of 2 mM NaOH and react for 10 minutes at 600 rpm at room temperature to elute the detection aptamer.
  • a real-time polymerase reaction solution 2 is prepared. 18 ul of the real-time polymerase reaction solution prepared in a real time PCR tube is mixed with 2 ul of each detected detection aptamer. Samples were analyzed using Applied biosystems 7500 real time PCR system equipment. The real-time polymerase reaction proceeds once at 96°C for 15 seconds, 55°C for 10 seconds, and 70°C for 30 minutes, and then for the second process, 96°C for 15 seconds and 70°C for 1 minute and 40 times.
  • Figure 9 shows the results of testing the performance of the simultaneous multi-diagnosis system. Even if the amount of the target molecule was reduced to 5 fmol, it was confirmed that multiple diagnosis was performed, and the same experimental results were obtained for each target molecule.
  • aptamer and primer sequences used in the present invention are shown in Table 1 and Table 2 below.

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Abstract

본 발명은 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출 방법 및 표적 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

Description

압타머를 이용한 다중 MULTIPLEX PCR 방법
본 발명은 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출 방법 및 표적 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
압타머(aptamer)는 특정 표적에 높은 친화도와 특이성으로 결합하는 특징을 갖는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)이다. 압타머는 일반적으로 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)과정을 통하여 얻을 수 있다. 이와 같은 방법으로 발굴된 압타머는 항체와 같이 작은 표적의 화학분자부터 단백질에 이르기까지 다양한 표적분자에 피코몰 수준의 해리상수를 가질 만큼 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있으므로 진단이나 치료 목적으로 사용된다. 압타머는 항체에 비해서 생산이 용이하고, 상온 보관이 가능하여 항체보다 안정성이 높은 장점이 있다. 이와 같이 항체에 비해 우수한 성질을 갖는 압타머의 효과로 인해 바이오마커 및 이를 진단하는 바이오센서로 사용하는 연구가 많이 진행되고 있다.
생리학적 중요한 분자들의 검출 및 정량에 관련된 면역진단법으로는 효소면역분석법(ELISA)을 사용한다. 효소면역분석법은 1) 항원를 플레이트(plate)에 코팅시킨 후, 항체를 결합시켜 신호를 분석하여 확인하는 방법, 2) 항체를 플레이트에 코팅시킨 후 항원을 처리하고, 그 위에 다시 항체를 처리하는 샌드위치방법이 있다. 이중 샌드위치기법이 많이 사용되는데, 단백질을 검출 및 정량을 하기 위해서 표면에 고정된 항체에 표적 바이오마커 단백질이 붙게 되고, 이를 표적에 또 다른 항체가 붙게 되면서 표적 물질의 양을 측정할 수 있다. 상기 분석법은 항체와 효소를 이용한다는 점에서 1) 재현성 및 배치-투-배치 변화(batch-to-batch variation)에 따른 문제점, 2) 유통과 보관 시에 온도 영향을 많이 받고, 3) 하나의 well에 하나의 바이오마커를 검출할 수 있어 다수의 바이오마커를 동시에 검출이 어렵다는 점과 4) 효소를 이용한 검출 반응으로, 시료 내 항원의 양이 적다면 검출이 어렵다는 문제점이 존재한다.
분자진단의 대표적인 방법은 중합효소연쇄반응으로 미량의 특정 DNA를 짧은 시간내에 많은 양으로 증폭시키는 방법으로 적은 양의 시료로 확인이 가능하기 때문에 민감도를 높일 수 있는 방법이다. 또한 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 시료의 검출 및 정량이 가능하다. 이러한 진단법을 접목하여 Immuno-PCR 이라는 방법이 사용할 수 있는데, 이 방법은 효소면역분석법에 사용되는 항체의 끝에 DNA를 결합시켜 이를 증폭시켜 소량의 단백질이라도 검출이 가능하도록 하는 진단법으로 일반적인 효소면역분석법에 비해 100-10000배의 민감도를 나타낸다. Immuno-PCR에서의 문제점은 항체를 이용하기 때문에 상기의 효소면역분석법과 같은 문제점을 가지고 있고, 그 외에도 항체에 oligo-DNA를 고정화시키는 방법이 쉽지 않고, 수율이 낮아 상업화의 어려움이 존재한다.
본 발명자들은 항체 기반 기술의 단점을 모두 극복하고, 1개 이상의 표적 분자의 검출 및 정량을 할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 핵산인 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법을 고안하였으며, 상기 방법은 1개 이상의 표적 분자의 검출 및 정량을 할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 압타머는 특정 바이오마커에 결합 친화도가 우수하며, 이에 상기 바이오마커에 결합한 압타머를 때어내어 상기 압타머에 해당하는 프라이머를 사용하여, 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 바이오마커를 진단 및 정량하는데 사용될 수 있다. 또한 셋 이상의 압타머와 프라이머를 사용하여 셋 이상의 바이오마커를 진단 및 정량을 함으로써 여러 종류의 바이오마커를 동시 다중진단에 사용될 수 있다.
도 1은 압타머 기반 다중 중합효소연쇄반응에 대한 간단한 도식이다.
도 2는 자성 비드에 비특이적으로 결합하는 디텍션 압타머를 최소화시키기에 적합한 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)의 농도 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 자성 비드에 비특이적으로 결합하는 디텍션 압타머를 최소화시키기에 적합한 덱스트란설페이트(dextran sulfate, DxSO4)의 조건을 찾은 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 단일진단으로 각각의 압타머쌍에 대한 표적 바이오마커와 비표적 바이오마커에서의 실시간 중합효소연쇄반응에서의 증폭 곡선 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는, 표적 바이오마커가 존재할 시에는 압타머가 결합하여 증폭곡선이 일찍 나타나는 것을 확인 할 수 있다.
도 5는 단일진단시의 표적 바이오마커의 압타머쌍을 이용한 방법에서 실시간 중합효소연쇄반응에서의 증폭곡선과 다중진단시 증폭 곡선을 비교하여 나타낸 것이다. 구체적으로는, 동일한 바이오마커의 존재시 각각의 표적 압타머의 증폭곡선이 단일진단과 다중진단에 동일하게 나타나는 것을 확인 할 수 있다.
도 6은 압타머쌍을 이용한 다중진단법에서 표적 바이오마커에 대한 각각의 압타머의 성능테스트에 대한 중합효소연쇄반응에 증폭 곡선을 나타낸 것이다. 구체적으로는 표적 바이오마커의 양이 작아져도 검출이 가능하다는 것을 확인 할 수 있다.
도 7은 단일진단으로 각각의 단일압타머에 대한 표적 바이오마커와 비표적 바이오마커에서의 실시간 중합효소연쇄반응에서의 증폭 곡선 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는, 표적 바이오마커가 존재할 시에는 압타머가 결합하여 증폭곡선이 일찍 나타나는 것을 확인 할 수 있다.
도 8은 단일진단시의 표적 바이오마커의 단일압타머를 이용한 방법에서 실시간 중합효소연쇄반응에서의 증폭곡선과 다중진단시 증폭 곡선을 비교하여 나타낸 것이다. 구체적으로는, 동일한 바이오마커의 존재시 각각의 표적 압타머의 증폭곡선이 단일진단과 다중진단에 동일하게 나타나는 것을 확인 할 수 있다.
도 9는 단일압타머를 이용한 다중진단법에서 표적 바이오마커에 대한 각각의 압타머의 성능테스트에 대한 중합효소연쇄반응에 증폭 곡선을 나타낸 것이다. 구체적으로는 표적 바이오마커의 양이 작아져도 검출이 가능하다는 것을 확인 할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출 방법을 제공한다.
일반적인 표적 분자의 검출 및 정량 방법으로 효소면역분석법(ELISA) 또는 Immuno-PCR을 이용하는 경우가 대부분이다. 효소면역분석법(ELISA) 또는 Immuno-PCR의 경우, 항체와 효소를 이용한다는 점에서 재현성, 안정성, 다수의 바이오마커의 동시 검출 비용이성 등의 문제점이 있으며, 항체에 oligo-DNA를 고정화시키는 방법이 쉽지 않고, 수율이 낮아 상업화의 어려움 있다. 그러나, 본 발명의 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법을 이용하는 경우, 표적 분자에 결합한 압타머를 PCR의 주형으로 사용할 수 있으며, 다수의 별도의 압타머를 이용할 경우, 다중, 동시검출이 가능하다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.
본 발명의 방법은 구체적으로 (i) 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머와 표적 분자를 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 접촉에 의해 복합체를 형성한 압타머 및 표적 분자의 복합체 중 결합된 압타머를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 "표적 분자"는 본 발명의 압타머로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로 포획 압타머가 결합할 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자(cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제물질(controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 분자 또는 표적 부위는 1종 이상일 수 있으며, 압타머가 인식할 수 있는 한 제한없이 포함된다.
또한, 본 발명의 목적상 압타머가 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있도록 하는 목적 물질로서, 본 발명의 목적상 표적 분자는 제1 포획 압타머 또는 제1 포획 압타머에 결합할 수 있는 단백질이면 그 종류에 제한되지 않는다. 구체적으로 동물의 세포막 단백질, 식물의 세포막 단백질, 미생물의 세포막 단백질 및 바이러스의 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 IR, ErbB2, 및 VEGFR2을 표적 분자로 하였다.
또한, 상기 용어 "시료"는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이러지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로, 전혈(whole blood), 백혈구, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입김(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "압타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 3차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산, 이중 가닥 핵산 또는 펩티드를 의미한다. 구체적으로 상기 압타머는 DNA, RNA 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 압타머는 비변형, 즉 천연 압타머 이거나, 변형 압타머일 수 있다. 구체적으로, 상기 변형 압타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 화학적 변형은 리보오스 위치, 데옥시리보오스 위치, 포스페이트 위치 및 염기 위치로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서의 화학적 치환을 의미한다. 또한, 상기 화학적 변형은 2'-위치의 당 변형(2'-position sugar modification), 2'-플루오로(2'-F), 2'-O-메틸, 8-위치의 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민(exocyclic amines)에서의 변형, 5-브로모우라실(5-bromouracil)의 치환, 5-브로모덱오시우리딘(5-bromodeoxyuridine)의 치환, 5'-브로모데옥시시티딘(5-bromodeoxycitidine)의 치환, 기본골격(backbone) 변형, 메틸화, 3' 캡(3' cap) 및 5'-캡(5' cap)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 변형된 염기 이외에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태 (예컨대, 2'-deoxy 형태)의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 변형된 염기는 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태를 의미하는 것으로, 염기 'T'를 대체하여 사용되는 것일 수 있다. 또한, 소수성 작용기는 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 트립토판 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같이 dU 염기의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 페리오스틴과의 친화력(affinity)이 현저하게 높아지는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 비변형 압타머 및 변형 압타머를 표 1에 나타내었다.
상기 (i) 단계의 압타머는 표적 부위를 인식하는 포획 압타머 및 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 디텍션 압타머로 이루어진 압타머쌍 또는 표적 부위를 인식 및 주형으로 사용되는 단일 압타머인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 압타머 쌍 또는 단일 압타머는 표적 분자 또는 표적 부위의 종류에 따라 각 분자 또는 표적 부위의 종류만큼 존재하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 압타머 쌍 또는 단일 압타머는 하나의 표적 분자 또는 하나의 표적 부위에 높은 친화도 및 특이성을 갖는 하나의 압타머 쌍 또는 단일 압타머 일 수 있으며, 하나 이상의 표적분자 또는 하나 이상의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 압타머 쌍 또는 단일 압타머일 수 있다. 또 하나의 예로, 표적 분자가 1종류일 경우 1종류의 압타머, 2종류일 경우 2종류의 압타머, 3종류일 경우 3종류의 압타머 등인 것으로, 그 종류에 따라 종류별로 압타머의 개수가 정해진다. 이 경우, 표적 분자에 다수의 표적 부위가 존재할 수 있는 바, 표적 분자 종류보다 더 많은 종류의 압타머가 존재할 수 있다.
상기 압타머쌍을 이용할 경우, 시료내에 부유하여 존재하는 표적 분자를 검출할 수 있으며, 단일 압타머의 경우, 표적 분자가 지지체에 고정되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 경우, 상기와 같은 압타머쌍 또는 단일 압타머를 사용하는 것일 수 있으며, 그에 관한 구체적인 방법에 대하여는 하기와 같다.
본 발명의 목적상 상기 압타머쌍을 사용하는 방법은 하기의 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, (a) 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합하여 제1 복합체를 형성하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 제1 복합체에 표적 분자를 결합시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 표적 분자에 제2 포획 압타머를 결합하여 제2 복합체를 형성하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 제2 복합체로부터 제2 포획 압타머를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머쌍을 사용하여 표적 분자의 검출 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계는 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합하여 제1 복합체를 형성하는 단계이다.
본 발명에서 용어 "제1 포획 압타머"는 고체 지지체에 결합한 뒤, 분리된 시료내에 존재하는 표적 분자의 표적 부위를 인식할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 제1 포획 압타머는 압타머의 5'말단에 표지물질이 컨쥬게이션된 것일 수 있으며, 상기 용어는 캡쳐 압타머와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 제1 포획 압타머는 예를 들어 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소와 같은 검출 가능한 분자로 표지 될 수 있다. 구체적으로, 분광, 광화학, 형광, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출 가능한 표지를 혼입함으로써 표지할 수 있다. 유용한 검출 분자로는 방사성 물질 (32P, 35S, 3H, 125I), 형광 염료 (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acety laminofluorene, digoxygenin) 또는 비오틴 등이 있다. 일 예로, 본 발명에 따른 제1 포획 압타머는 5'- 말단에 비오틴이 컨쥬게이션 된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 제1 복합체와 결합되지 않은 제1 포획 압타머를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 일 실시예에서는 제1 복합체와 결합되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해 세척용액 1로 세척하였다.
상기 "고체 지지체"는 자성비드(magnetic bead), 폴리머 비드(polymer bead), 아가로오스 비드(agarose bead), 폴리스티렌 비드(polystyrene bead), 아크릴아마이드 비드(acrylamide bead), 솔리드 코어 비드(solid core bead), 다공성 비드(porous bead), 상자성 비드(paramagnetic bead), 유리 비드(glass bead), 조절된 공극을 가지는 비드(controlled pore bead), 미량역가 웰(microtiter well), 시클로-올레핀 공중합체 기질(cycloolefin copolymer substrate), 막(membrane), 플라스틱 기질(plastic substrate), 나일론(nylon), 랭뮤어-블러짓 필름(Langmuir-Blodgett films), 유리, 게르마늄 기질(germanium substrate), 실리콘 기질(silicon substrate), 실리콘 웨이퍼 칩(silicon wafer chips), 유통 칩(flow through chips), 마이크로 비드(microbead), 폴리테트라플로오로에틸렌 기질(polytetrafluoroethylene substrate), 폴리스티렌 기질(polystyrene substrate), 갈륨 비소 기질(gallium arsenide substrate), 금 기질 및 은 기질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 구체적으로 자성비드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 단계에서 상기 압타머를 고체 지지체와 결합하기 전에 비특이적 결합을 막기 위해 블로킹 용액으로 블로킹을 하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 블로킹 용액은 BSA, 연어정자 DNA(salmon sperm DNA), 청어정자 DNA(herring sperm DNA), 탈지우유(skim milk), 카제인(casein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 BSA 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
(b) 단계는 상기 (a) 단계의 제1 복합체에 표적 분자를 결합시키는 단계이다.
본 발명의 목적상 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합시킨 제1 복합체에 표적 분자를 결합하는 단계로서, 상기 표적 분자는 전술한 바와 같이 압타머가 높은 친화성 및 특이성으로 결합할 수 있도록 하는 목적 물질을 의미한다.
상기 방법은 제1 복합체와 결합되지 않은 표적 분자를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 일 실시예에서는 제1 복합체와 결합되지 않은 표적 분자를 제거하기 위해 세척용액 1로 세척하였다.
(c) 단계는 상기 (b) 단계의 표적 분자에 제2 포획 압타머를 결합하여 제2 복합체를 형성하는 단계이다.
본 발명에서 용어 "제2 포획 압타머"는 제1 복합체의 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 디텍션 압타머를 의미한다. 본 발명의 목적상 제2 포획 압타머는 디텍션 압타머와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 방법은 제1 복합체의 표적 부위와 결합되지 않은 제2 포획 압타머를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 일 실시예에서는 제1 복합체의 표적 부위와 결합되지 않은 디텍션 압타머를 제거하기 위해 세척용액 1로 세척하였다.
또한, 본 발명의 목적상 상기 방법은 (c) 단계 전에 제1 복합체에 표적 분자가 결합된 복합체를 합쳐 1종 이상의 특정 항원을 인지하는 압타머로 1종 이상의 표적 분자를 검출할 있는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
(d) 단계는 상기 (c) 단계의 제2 복합체로부터 제2 포획 압타머를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계이다.
본 발명에서의 용어 "중합효소연쇄반응(PCR)"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 제2 복합체로부터 제2 포획 압타머를 분리하여 상기 압타머에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 중합효소연쇄반응은 real time PCR, 또는 Multiplex-PCR 일 수 있으며, 중합효소연쇄반응 방법의 특징상 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 1회 이상 반복 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "다중 PCR(Multiplex-PCR)"은 시료 속의 많은 표적 분자를 동시에 증폭할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명에서는 상기 압타머를 이용하여 1종 이상의 표적 분자를 검출 가능하도록 하였으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다중 PCR은 (i) 하나의 웰(well) 또는 튜브(tube)에서 하나 이상의 표적분자와 압타머를 동시에 반응하여 동시에 검출 및 정량하거나, (ii) 하나 이상의 웰(well) 또는 튜브(tube)에서 하나 이상의 표적분자와 압타머를 반응하여 동시에 검출 및 정량하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 목적상 중합연쇄반응(PCR)은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 용어 '다중 PCR(Multiplex-PCR)'은 정량적 PCR (Quantitative PCR; qPCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)과 혼용되어 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 정량적 PCR (Quantitative PCR; qPCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 수 많은 응용분야에서 핵산을 검출, 정량화하는데 사용된다.
qPCR은 표준 PCR처럼 변성, 어닐링 및 신장과 같은 3 단계를 거쳐 증폭되고, 이후, 형광 라벨링을 통해 데이터 수집함으로써 정량화를 가능하게 한다. 구체적으로, 염료 기반 qPCR의 경우에는 형광 표지는 dsDNA 결합 염료의 사용을 통해 이루어지고, 프로브 기반 qPCR에서는 각 시료에서 많은 표적 분자를 동시에 검출하기 위해, 프라이머 이외에 표적 특이적인 프로브의 최적화 및 설계가 필요하다.
본 발명의 목적상 상기 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 표적 분자의 검출 및 정량을 위해 TaqMan probe PCR, 삽입성 형광염료(intercalating fluorescent dye)를 사용하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 압타머쌍을 이용하여 단일진단을 한 결과, 표적 분자의 그래프가 앞쪽에 나타나는 것을 확인하였으며, 다중진단의 경우에도 단일진단의 결과와 일치하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). 또한, 동시 다중진단 시스템의 성능을 확인한 결과에서도 각각의 표적 분자에서 다중진단의 효과가 나타남을 확인하였다(도 6).
상기 결과를 통해 항체를 사용하는 종래 기술과 달리, 본 발명의 방법은 압타머쌍을 이용하여 동시에 검출이 가능한 단일진단 또는 다중진단이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 목적상 상기 단일 압타머를 사용하는 방법은 하기의 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, (a) 표적 분자를 고체 지지체에 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 분자에 포획 압타머를 결합하여 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 복합체로부터 포획 압타머를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단일 압타머를 사용하여 표적 분자의 검출 방법의 각 단계는 압타머쌍을 사용하여 표적 분자를 검출하는 방법과 일부 용어 및 일부 수행 단계는 동일하다.
상기 방법은 압타머쌍을 사용하는 방법과는 달리 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합하여 제1 복합체를 형성하는 단계가 없으며, 표적 분자를 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "포획 압타머"는 고체 지지체에 결합된 표적 분자 복합체의 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 단일 압타머를 의미한다. 본 발명의 목적상 포획 압타머는 단일 압타머와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 방법은 고체 지지체에 결합된 표적 분자 복합체의 표적 부위와 결합되지 않은 포획 압타머를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 복합체의 표적 부위와 결합되지 않은 단일 압타머를 제거하기 위해 세척용액 1로 세척하였다.
상기 본 발명의 용어 "결합된 복합체"는 (a) 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합시킨 제1 복합체 (b) 제1 복합체에 표적 분자를 결합된 복합체, (c) 표적 분자에 제2 포획 압타머를 결합한 제2 복합체, (d) 표적 분자를 고체 지지체에 결합된 복합체, 또는 (e) 표적 분자에 포획 압타머를 결합한 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 상기 복합체로부터 포획 압타머를 분리하여 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 일반적으로 사용되는 중합연쇄반응(PCR)의 방법은 제한 없이 추가될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 단일 압타머를 이용하여 단일진단을 한 결과, 표적 분자의 그래프가 앞쪽에 나타나는 것을 확인하였으며, 다중진단의 경우에도 단일진단의 결과와 일치하는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8). 또한, 동시 다중진단 시스템의 성능을 확인한 결과에서도 각각의 표적 분자에서 다중진단의 효과가 나타남을 확인하였다(도 9).
상기 결과를 통해 항체를 사용하는 종래 기술과 달리, 본 발명의 방법은 단일 압타머를 이용하여 동시에 검출이 가능한 단일진단 또는 다중진단이 가능함을 확인하였다.
이는 고온으로부터 안정하고 보관 및 유통이 용이한 압타머(압타머쌍 또는 단일 압타머)를 중합효소연쇄반응의 주형으로 사용하는 경우, 한 번의 반응으로 생체 내 다수(1개 이상)의 표적 분자를 검출할 수 있음을 시사하는 것이다.
또한, 염기서열이 다른 각각의 압타머로부터 프라이머(primers)의 서열을 선택적으로 선정하고 염기서열 간섭(interference)없이 다수(1개 이상)의 표적 분자를 일시 또는 동시에 검출 및 정량할 수 있음을 시사하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 표적 분자는 1종 이상으로 다중 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하며, 상기 압타머는 표적 부위를 인식하는 포획 압타머 및 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 디텍션 압타머로 이루어진 압타머쌍 또는 표적 부위를 인식 및 주형으로 사용되는 단일 압타머인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 압타머 쌍을 이용한 샌드위치방식 어세이
실시예 1-1. BSA를 이용한 스트렙타아비딘 자성 비드 블로킹
스트렙타아비딘이 코팅된 자성 비드 20ug(2ul)을 1.5ml 튜브에 옮겨 담는다. 마그네틱 스탠드를 이용하여 버퍼를 제거한다. SB17버퍼(1xSB17(5mM EDTA, 200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM MgCl2, 25mM KCl, ph7.5), 0.05% tween20) 100ul로 3번 세척한다. 자성 비드만 남은 상태에서 100ul의 블로킹용액1(blocking buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 10% BSA)을 넣는다. Eppendorf ThermoMixer C를 이용하여 600rpm의 상온 조건에서 1시간 동안 블로킹한다. 블로킹 후 남아있는 블로킹 용액을 제거하기 위해, SB17버퍼 100ul로 3회 세척한다.
실시예 1-2. 스트렙타아비딘 자성 비드에 캡쳐 압타머의 고정화
상기 실시예 1-1에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머 20pmol과 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액 1(binding buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 20uM DxSO4)에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 1(washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 20uM DxSO4)로 3회 세척한다.
실시예 1-3. 표적 분자 바인딩
실시예 1-2에서 제조한 자성 비드에 표적 분자 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 1로 3회 세척한다.
실시예 1-4. 디텍션 압타머 바인딩 및 용출
실시예 1-3에서 제조한 자성 비드에 디텍션 압타머 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액 1로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시예 2: 단일압타머를 이용한 다중 바이오마커 진단 방법
실시예 2-1. 플레이트 웰에 단백질의 고정화
표적 분자를 고정하기 위해, 카보네이트-바이카보네이트 용액(pH 9.6)을 이용하여 단백질을 희석한다. 효소면역분석법 플레이트(ELISA-plate) 각 웰(well)에 100ul씩 넣어 4℃, 600rpm, 12시간 반응시킨다. 반응하지 않은 단백질은 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분, 600rpm으로 1회 세척한다.
실시예 2-2. BSA를 이용한 플레이트 웰 블로킹
상기의 플레이트에 200ul의 블로킹용액(3% BSA)을 넣고, 상온에서 1시간, 600rpm으로 블로킹시킨다. 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분간 600rpm으로 2회 세척한다.
실시예 2-3. 압타머 바인딩 및 용출
상기의 플레이트에 표적 분자를 각 웰에 넣고, 상온에서 800rpm으로 1시간 동안 반응시킨다. 100ul의 세척용액 5로 2분, 600rpm으로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시예 3: 다중 실시간 중합효소 연쇄반응
실시간 중합 효소 반응 용액 (real time PCR mixture solution; 1x Taq buffer(solgent), 0.2mM dNTP, 0.2uM primer, 5mM MgCl2, 1x SYBR, 0.05U Taq polymerase(solgent))을 제조한다. real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul와 용출된 디텍션 압타머 2ul를 넣는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
실험예 1: 자성 비드의 BSA 농도별 블로킹 테스트를 통한 디텍션 압타머의 비특이 신호 제거
자성 비드와 압타머 사이의 비특이 신호를 제거하기 위해, BSA 농도별로 자성 비드 블로킹 테스트를 진행하였다. 스트렙타아비딘이 코팅된 자성 비드 20ug을 1.5ml 튜브에 옮겨 담고, 마그네틱 스탠드를 이용하여 버퍼를 제거하였다. 구체적으로, SB17버퍼 100ul로 3번 세척한다. 자성 비드만 남은 상태에서 튜브에 100ul의 블로킹용액 2(blocking buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 3% 또는 10% BSA)을 넣고, 600rpm의 상온 조건에서 1시간 동안 블로킹한다. 남아있는 블로킹 용액을 제거하기 위해, SB17버퍼 100ul로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머(서열번호 A1 또는 A3 또는 A5) 20pmol와 각각 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 1로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 자성 비드에 바인딩된 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 1(real time PCR mixture solution; 1x Taq buffer(solgent), 0.2mM dNTP, 0.2uM primer(P1 또는 P2 또는 P3 또는 P4 또는 P5 또는 P6), 5mM MgCl2, 1x SYBR, 0.05U Taq polymerase(solgent))을 제조한다. real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul와 용출된 디텍션 압타머 2ul를 넣는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 95℃ 10분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 95℃ 15초, 60℃ 1분 40회를 진행한다.
위와 같은 방식으로 한 종의 압타머(IR)를 이용하여, 6개의 샘플을 준비하여 도 2와 같은 실험 결과를 얻었다.
그 결과, 도 2에서 나타내듯이 스트렙타아비딘에 캡쳐 압타머가 블로킹 용액에 상관없이 붙어있는 것을 알 수 있으나 디텍션 압타머의 경우에는 BSA의 농도에 따라 비특이 결합이 거의 없어진다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: DxSO4 농도별 테스트를 통한 디텍션 압타머의 비특이 신호 제거
비특이 신호를 제거하기 위해 각 단계에서 competitor로 사용되는 DxSO4 농도별 테스트를 진행하였다.
실험예 2-1: 바인딩 단계에서 DxSO4 농도별 테스트
스트렙타아비딘이 코팅된 자성 비드 20ug(2ul)을 1.5ml 튜브에 옮겨 담는다. 마그네틱 스탠드를 이용하여 버퍼를 제거한다. SB17버퍼 100ul로 3번 세척한다. 자성 비드만 남은 상태에서 100ul의 블로킹용액1(blocking buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 10% BSA)을 넣는다. Eppendorf ThermoMixer C를 이용하여 600rpm의 상온 조건에서 1시간동안 블로킹한다. 블로킹 후 남아있는 블로킹 용액을 제거하기 위해, SB17버퍼 100ul로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴(biotin)이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머(서열번호 A1 또는 A3 또는 A5) 20pmol와 각각 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액 2(binding buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 0uM 또는 20uM 또는 40uM 또는 60uM DxSO4)에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 2(washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20)로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 표적 분자 또는 비-표적 분자(IR(recombinant human insulin receptor protein, R&D systems, 1544-IR-050) 또는 ErbB2(recombinant human ErbB2 protein, R&D systems, 1129ER-050) 또는 VEGFR2(human VEGF R2 protein, Acro biosystems, KDR-H5227)) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 2에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 2로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 디텍션 압타머(서열번호 A2 또는 A4 또는 A6) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 2에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액2로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2(real time PCR mixture solution; 1x Taq buffer(solgent), 0.2mM dNTP, 0.2uM primer(P2 또는 P4 또는 P6), 5mM MgCl2, 1x SYBR, 0.05U Taq polymerase(solgent))을 제조한다. real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
바인딩 단계에서 DxSO4의 농도별 영향을 보기 위해, 0, 20, 40, 60uM DxSO4 농도에 따른 표적과 비-표적 분자에 대하여 위와 같은 방식으로 8개의 샘플을 준비하였으며, 도 3a와 같은 실험 결과를 얻었다.
도 3a는 바인딩용액에 DxSO4 농도에 따른 VEGFR2에 대한 실시간 중합효소반응 결과이다. DxSO4의 농도가 높아질수록 그래프가 오른쪽으로 이동하는 것을 확인 할 수 있다. 동일한 양의 단백질과 압타머를 사용하였기 때문에 두 그래프의 간격이 있어야 표적 분자에 대한 민감도가 있다고 할 수 있다. 농도별 그래프를 확인하여 보면 간격이 많이 벌어진 20uM 또는 40uM을 사용하는 것이 적절하다는 것을 확인 할 수 있다. 다른 표적 분자를 사용한 결과도 도3a와 같은 양상의 결과가 나타남을 확인하였다.
실험예 2-2: 세척 단계에서 DxSO4 농도별 테스트
상기 실험예 2-1에서 자성 비드를 블로킹하는 과정 후 세척과정까지는 동일한 방법으로 진행하였다. 상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머(서열번호 A1 또는 A3 또는 A5) 20pmol와 각각 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액 3(binding buffer: 1xSB17, 0.05% tween20)에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 3(washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 0uM 또는 20uM 또는 40uM 또는 60uM DxSO4)로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 표적 분자 또는 비-표적 분자(IR 또는 ErbB2 또는 VEGFR2) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 3에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 3으로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 디텍션 압타머(서열번호 A2 또는 A4 또는 A6) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 3에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액3로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2을 제조한다. real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
세척 단계에서 DxSO4의 농도별 영향을 보기 위해, 0, 20, 40, 60uM DxSO4 농도에 따른 표적과 비-표적 분자에 대하여 위와 같은 방식으로 8개의 샘플을 준비하였으며, 도3b와 같은 실험 결과를 얻었다.
도3b는 세척용액에 DxSO4 농도에 따른 VEGFR2에 대한 실시간 중합효소반응 결과이다. 바인딩용액과 마찬가지로 DxSO4의 농도가 높아질수록 그래프가 오른쪽으로 이동하는 것을 확인 할 수 있다. 농도별 그래프를 확인하여 보면 간격이 많이 벌어진 20uM 또는 40uM을 사용하는 것이 적절하다는 것을 확인 할 수 있다. 다른 표적 분자를 사용한 결과도 도3b와 같은 양상의 결과가 나타남을 확인하였다.
*실험예 2-3: 바인딩 및 세척 단계에서 DxSO4 농도별 테스트
상기 실험예 1에서 자성 비드를 블로킹하는 과정 후 세척과정까지는 동일한 방법으로 진행하였다. 상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머(서열번호 A1 또는 A3 또는 A5) 20pmol와 각각 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액 2에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 3로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 표적 분자 또는 비-표적 분자(IR 또는 ErbB2 또는 VEGFR2) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액2에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 3으로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 디텍션 압타머(서열번호 A2 또는 A4 또는 A6) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액2에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액3로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액2를 제조한다. real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
세척과 바인딩 단계에서 DxSO4의 농도별 영향을 보기 위해, 0, 20, 40, 60uM DxSO4 농도에 따른 표적과 비-표적 분자에 대하여 위와 같은 방식으로 8개의 샘플을 준비하였으며, 도 3c와 같은 실험 결과를 얻었다.
도 3c는 바인딩용액과 세척용액에서 DxSO4 농도에 따른 VEGFR2에 대한 실시간 중합효소반응 결과이다. 상기 실험예 2-1과 실험예 2-2와 마찬가지로 DxSO4의 농도가 높아질수록 그래프가 오른쪽으로 이동하는 것을 확인 할 수 있다. 농도별 그래프를 확인하여 보면 간격이 많이 벌어진 20uM을 사용하는 것이 적절하다는 것을 확인 할 수 있으나 도 3a나 도 3b보다 효과는 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 다른 표적 분자를 사용한 결과도 도 3c와 같은 양상의 결과가 나타남을 확인하였다.
실험예 3: 압타머쌍을 이용한 단일진단방법
상기 실험예 2-1에서 자성 비드를 블로킹하는 과정 후 세척과정까지는 동일한 방법으로 진행하였다. 상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머(서열번호 A1 또는 A3 또는 A5) 20pmol와 각각 반응시킨다. 총 100ul의 바인딩용액1에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 4(washing buffer: 1xSB17, 0.05% tween20, 20uM DxSO4)로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 표적 분자 또는 비-표적 분자(IR 또는 ErbB2 또는 VEGFR2) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다.
상기에서 제조한 자성 비드에 디텍션 압타머(서열번호 A2 또는 A4 또는 A6) 2pmol을 넣어 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액4로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
위와 같은 방식으로 표적 분자와 비-표적 분자로 9개의 샘플을 준비하였으며, 도 4와 같은 실험 결과를 얻었다.
표적 분자의 경우 그래프가 앞쪽에 나타나는 것을 확인 할 수 있으며, 비-표적 분자는 뒤쪽에 나타나는 것으로 상기 실험예 1과 실험예 2에서의 조건으로의 결과를 확인하였다.
실험예 4: 압타머쌍을 이용한 단일 및 다중 진단 방법의 비교
실험예 3으로부터 단일진단이 가능한 것을 확인하였으며, 다중진단을 하였을 때도 같은 결과를 보이는지 확인하기 위해 다음과 같이 샘플을 준비하였다.
상기 실험예 2-1에서 자성 비드를 블로킹하는 과정 후 세척과정까지는 동일한 방법으로 진행하였다. 상기에서 제조한 자성 비드에 압타머의 5'말단에 비오틴이 컨쥬게이션된 캡쳐 압타머 3종(서열번호 A1, A3, A5) 20pmol과 각각 반응시킨다. 각각 총 100ul의 바인딩용액 1에서 600rpm의 상온 조건에서 15분 동안 반응한다. 고정되지 않은 캡쳐 압타머를 제거하기 위해, 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다.
단백질 3종(IR, ErbB2, VEGFR2) 각 2pmol씩 넣어, 총 100ul의 단백질 바인딩용액 1을 제조한다. 상기에서 제조한 자성 비드에 단백질이 포함된 바인딩 용액 100ul를 넣고, 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다.
디텍션 압타머 3종(서열번호 A2, A4, A6)을 각 2pmol씩 넣어, 총 100ul의 디텍션 바인딩용액 1을 제조한다. 상기에서 제조한 자성 비드에 100ul의 디텍션 바인딩용액을 넣고, 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 한 샘플에서 용출된 디텍션 압타머는 3개의 튜브에서 각각의 프라이머로 분석한다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
상기 실험예 3에서 표적 분자로 진행한 샘플을 같이 준비하여 4개의 샘플을 준비하였으며, 도 5와 같은 실험 결과를 얻었다.
다중진단과 단일진단에서 조건을 비교한 결과, 두 결과가 일치하여 본 연구결과로 개발된 다중진단법 결과가 단일진단에서의 결과와 일치하는 것을 확인 할 수 있었다.
실험예 5: 압타머쌍을 이용한 동시 다중진단 방법 성능 테스트
상기 실험예 4로부터 다중진단을 하였을 때의 결과 바탕으로 검출할 수 있는 표적 분자를 사용하여 상기 다중진단법의 성능을 점검하였다.
상기 실험예 4에서 캡쳐 압타머를 고정하는 과정까지 동일하게 진행한다. 단백질 3종(IR, ErbB2, VEGFR2)을 각 5fmol에서 2pmol까지 넣어, 총 100ul의 단백질 바인딩용액1을 제조한다. 상기에서 제조한 자성 비드에 단백질이 포함된 바인딩 용액 100ul를 넣고, 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 캡쳐 압타머와 바인딩 하지 않은 표적 분자를 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다.
디텍션 압타머 3종(서열번호 A2, A4, A6)을 각 2pmol씩 넣어, 총 100ul의 디텍션 바인딩용액1을 제조한다. 상기에서 제조한 자성 비드에 100ul의 디텍션 바인딩용액을 넣고, 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응한다. 반응하지 않은 디텍션 압타머를 100ul의 세척용액 4로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 한 샘플에서 용출된 디텍션 압타머는 3개의 튜브에서 각각의 프라이머로 분석한다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
도 6은 동시 다중진단 시스템의 성능을 테스트한 결과를 나타낸 것이다. 표적 분자의 양을 5fmol까지 줄여도 다중진단이 되는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 표적 분자에서 같은 실험 결과를 얻었다.
실험예 6: 단일 압타머를 이용한 단일 진단 방법
상기의 실험예 5와는 달리, 단일 압타머를 이용한 진단 방법을 진행하였다.
각각의 표적 분자를 고정하기 위해, 카보네이트-바이카보네이트 용액(0.05M, pH 9.6)을 이용하여 단백질을 희석한다. 효소면역분석법 플레이트(ELISA-plate) 각 웰(well)에 희석시킨 표적단백질과 비표적 분자를 100ul씩 각각 넣어 4℃, 600rpm, 12시간 반응시킨다. 반응하지 않은 단백질은 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분, 600rpm으로 1회 세척한다.
상기의 플레이트에 200ul의 블로킹용액3(3% BSA)을 넣고, 상온에서 1시간, 600rpm으로 블로킹시킨다. 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분간 600rpm으로 2회 세척한다.
상기의 플레이트 각 웰에 디텍션 압타머(A2 또는 A4 또는 A6)를 넣고, 상온에서 800rpm으로 1시간 동안 반응시킨다. 100ul의 세척용액1로 2분, 600rpm으로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
위와 같은 방식으로 표적 분자와 비-표적 분자로 9개의 샘플을 준비하였으며, 도 7과 같은 실험 결과를 얻었다.
표적 분자의 경우 그래프가 앞쪽에 나타나는 것을 확인 할 수 있으며, 비-표적 분자는 뒤쪽에 나타나는 것으로 압타머가 표적 분자에 결합하는 결과를 확인하였다.
실험예 7: 단일 압타머를 이용한 동시 다중진단 방법
실험예 6으로부터 단일진단이 가능한 것을 확인하였으며, 다중진단을 하였을 때도 같은 결과를 보이는지 확인하기 위해 다음과 같이 샘플을 준비하였다.
표적 분자를 고정하기 위해, 카보네이트-바이카보네이트 용액(0.05M, pH 9.6)을 이용하여 단백질을 희석한다. 효소면역분석법 플레이트(ELISA-plate) 각 웰(well)에 희석시킨 혼합단백질을 각각 100ul씩 넣어 4℃, 600rpm, 12시간 반응시킨다. 반응하지 않은 단백질은 100ul의 세척용액1으로 상온에서 2분, 600rpm으로 1회 세척한다.
상기의 플레이트에 200ul의 블로킹용액3(3% BSA)을 넣고, 상온에서 1시간, 600rpm으로 블로킹시킨다. 100ul의 세척용액1로 상온에서 2분간 600rpm으로 2회 세척한다.
상기의 플레이트 각 웰에 디텍션 압타머 혼합물(A2, A4, A6)를 넣고, 상온에서 800rpm으로 1시간 동안 반응시킨다. 100ul의 세척용액1로 2분, 600rpm으로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
상기예 6에서 표적 분자로 진행한 샘플을 같이 준비하여 4개의 샘플을 준비하였으며, 도 8와 같은 실험 결과를 얻었다. 다중진단과 단일진단에서 조건을 비교한 결과, 두 결과가 비슷한 증폭곡선이 나타나 본 연구결과로 개발된 다중진단법 결과가 단일진단에서의 결과와 거의 유사한 것을 확인 할 수 있었다.
실험예 8: 단일 압타머를 이용한 동시 다중진단 시스템 성능 테스트
상기 실험예 7로부터 다중진단을 하였을 때의 결과 바탕으로 검출할 수 있는 표적 분자를 사용하여 상기 다중진단법의 성능을 점검하였다.
각각의 표적 분자를 고정하기 위해, 카보네이트-바이카보네이트 용액(0.05M, pH 9.6)을 이용하여 단백질을 1pmol~5fmol까지 희석한다. 효소면역분석법 플레이트(ELISA-plate) 각 웰(well)에 희석시킨 혼합단백질을 100ul씩 각각 넣어 4℃, 600rpm, 12시간 반응시킨다. 반응하지 않은 단백질은 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분, 600rpm으로 1회 세척한다.
상기의 플레이트에 200ul의 블로킹용액 3(3% BSA)을 넣고, 상온에서 1시간, 600rpm으로 블로킹시킨다. 100ul의 세척용액 1로 상온에서 2분간 600rpm으로 2회 세척한다.
상기의 플레이트 각 웰에 디텍션 압타머 혼합물(A2, A4, A6)를 넣고, 상온에서 800rpm으로 1시간 동안 반응시킨다. 100ul의 세척용액 1로 2분, 600rpm으로 3회 세척한다. 2mM NaOH 30ul를 넣고 600rpm의 상온 조건에서 10분 동안 반응시켜 디텍션 압타머를 용출한다.
실시간 중합 효소 반응 용액 2를 제조한다. Real time PCR tube에 제조된 실시간 중합 효소 반응 용액 18ul를 용출된 각각의 디텍션 압타머 2ul와 섞는다. 샘플은 Applied biosystems 7500 real time PCR system 장비를 이용하여 분석하였다. 실시간 중합 효소 반응은 첫 번째 과정으로 96℃ 15초, 55℃ 10초, 70℃ 30분 1회 진행 후, 두 번째 과정으로 96℃ 15초, 70℃ 1분 40회를 진행한다.
도 9는 동시 다중진단 시스템의 성능을 테스트한 결과를 나타낸 것이다. 표적 분자의 양을 5fmol까지 줄여도 다중진단이 되는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 표적 분자에서 같은 실험 결과를 얻었다.
본 발명에서 사용된 압타머 및 프라이머 서열은 하기 표 1 및 표 2와 같다.
압타머 서열정보
서열번호 sequence # 서열(5'-3') 크기(bp)
1 Biotin-1652-49 5'- GCC TGN AAG GNN NAA GCN NGG CCN AAN GGN GCN ANC AGG CNC -3' 42
2 OH-1652-20 5'- GAG TGA CCG TCT GCC TGN NAN CCA CNA NGG CNN CNC ANN CAA ANA AGN GCG ANC GAN CAG CCA CAC CAC CAG CC -3' 74
3 Biotin-1194-35 5'- VCC VGG CAV GVV CGA VGG AGG CCV VVG AVV ACA GCC CAG A -3' 40
4 OH-1194-34-01 5'- GAG TGA CCG TCT GCC TGA VGV VAG AGV VVG CCV GAG VGC CVC GCA AGG GCG VAA CAA　CAG CCA CAC CAC CAG CC -3' 74
5 biotin-2041-19-06 5'- TGA CGA GCN ACG ACG NCN GGN GNA ANN NAN AAA GAC ACN GNG NAN ANC AAC AAC AGA -3' 57
6 OH-2041-06-01 5'- GAT GTG AGT GTG TGA CGA GCC NGA NAN NCN GCG NAN NAG CCC NAN NAA NGN NAC GGN AGC AAC AAC AGA ACA AGG AAA GG -3' 80
*N: BzdU, V: NapdU (변형핵산사용)
프라이머 서열정보
(5'-3) 길이
P1 정방향 CTG TAA GGT TTA AGC TTG GCC TAA TG 26
역방향 GGA CGA GCA GAG CCT GAT AGC 21
P2 정방향 GAG TGA CCG TCT GCC TGT TAT CCA C 25
역방향 GGC TGG TGG TGT GGC TGA TCG ATC 24
P3 정방향 CTG GCA TGT TCG ATG GAG GCC 21
역방향 GGA CGA GCA TCT GGG CTG TAA TC 23
P4 정방향 GAG TGA CCG TCT GCC TGA TGT TAG 24
역방향 GGC TGG TGG TGT GGC TGT TGT TAC 24
P5 정방향 GGA CGA GCACTA CGA CGT CTG 21
역방향 GGA CGA GCA CAC AGT GTC TTT ATA AA 26
P6 정방향 GGA CGA GCA CGA GTA AAT GAA TG 23
역방향 GGA CGA GCA GAA ATG CTC AAA C 22
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. (i) 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머와 표적 분자를 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 접촉에 의해 복합체를 형성한 압타머 및 표적 분자의 복합체 중 결합된 압타머를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 분자의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 1종 이상으로 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 표적 분자의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다중 PCR(multiplex PCR)은 (i) 하나의 웰(well) 또는 튜브(tube)에서 하나 이상의 표적분자와 압타머를 동시에 반응하여 동시에 검출 및 정량; 또는
    (ii) 하나 이상의 웰(well) 또는 튜브(tube)에서 하나 이상의 표적분자와 압타머를 반응하여 동시에 검출 및 정량하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 TaqMan probe PCR, 삽입성 형광염료(intercalating fluorescent dye)를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 분자의 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (i) 단계의 압타머는 표적 부위를 인식하는 포획 압타머 및 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 디텍션 압타머로 이루어진 압타머쌍 또는 표적 부위를 인식 및 주형으로 사용되는 단일 압타머인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 압타머 쌍 또는 단일 압타머는 표적 분자 또는 표적 부위의 종류에 따라 각 분자 또는 표적 부위의 종류로 존재하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 압타머는 변형 핵산 또는 비변형 핵산인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로, 상기 표적 분자의 검출 방법은 시료 내의 표적 분자를 검출하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자(cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제물질(controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학 샘플, 약제학적 샘플, 식품 샘플, 농업 샘플 및 가축 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시료는 전혈(whole blood), 백혈구, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells), 혈장, 혈청, 가래(sputum), 입깁(breath), 소변, 정액, 침(saliva), 뇌막액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 세포, 세포 추출물, 대변(stool), 조직 추출물, 조직 생검, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 PCR을 수행하는 단계는 표적 분자의 검출 및 정량을 수행하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 압타머쌍을 사용하는 방법은 하기의 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것인, 표적 분자의 검출 방법:
    (a) 제1 포획 압타머를 고체 지지체에 결합하여 제1 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 제1 복합체에 표적 분자를 결합시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 표적 분자에 제2 포획 압타머를 결합하여 제2 복합체를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 제2 복합체로부터 제2 포획 압타머를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계.
  15. 제6항에 있어서,
    상기 (c) 단계 전에 제1 복합체에 표적 분자가 결합된 복합체를 합쳐 1종 이상의 특정 항원을 인지하는 압타머로 1종 이상의 표적 분자를 검출할 있는 것을 특징으로 하는 것인, 표적 분자의 검출 방법;
  16. 제6항에 있어서,
    상기 단일압타머를 사용하는 방법은 하기의 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것인, 표적 분자의 검출 방법:
    (a) 표적 분자를 고체 지지체에 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 표적 분자에 포획 압타머를 결합하여 복합체를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 복합체로부터 포획 압타머를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서,
    상기 결합된 복합체 중 표적 분자와 결합되지 않거나, 복합체와 결합되지 않은 포획 압타머를 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  18. 제14항 또는 제16항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 압타머를 고체 지지체와 결합하기 전에 비특이적 결합을 막기 위해 블로킹 용액으로 블로킹을 하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 블로킹 용액은 BSA, 연어정자 DNA(salmon sperm DNA), 청어정자 DNA(herring sperm DNA), 탈지우유(skim milk), 카제인(casein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  20. 제14항 또는 제16항에 있어서,
    상기 고체 지지체는 자성비드(magnetic bead), 폴리머 비드(polymer bead), 아가로오스 비드(agarose bead), 폴리스티렌 비드(polystyrene bead), 아크릴아마이드 비드(acrylamide bead), 솔리드 코어 비드(solid core bead), 다공성 비드(porous bead), 상자성 비드(paramagnetic bead), 유리 비드(glass bead), 조절된 공극을 가지는 비드(controlled pore bead), 미량역가 웰(microtiter well), 시클로-올레핀 공중합체 기질(cycloolefin copolymer substrate), 막(membrane), 플라스틱 기질(plastic substrate), 나일론(nylon), 랭뮤어-블러짓 필름(Langmuir-Blodgett films), 유리, 게르마늄 기질(germanium substrate), 실리콘 기질(silicon substrate), 실리콘 웨이퍼 칩(silicon wafer chips), 유통 칩(flow through chips), 마이크로 비드(microbead), 폴리테트라플로오로에틸렌 기질(polytetrafluoroethylene substrate), 폴리스티렌 기질(polystyrene substrate), 갈륨 비소 기질(gallium arsenide substrate), 금 기질 및 은 기질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 핵산인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA, RNA 또는 이들의 조합인 것인, 표적 분자의 검출 방법.
  23. 표적 분자의 표적 부위를 인식하는 압타머를 포함하고, 상기 압타머를 중합효소연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하는, 표적 분자의 검출용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표적 분자는 1종 이상으로 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 표적 분자의 검출용 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것인, 표적 분자의 검출용 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 상기 압타머는 표적 부위를 인식하는 포획 압타머 및 표적 부위를 인식하고 주형으로 사용되는 디텍션 압타머로 이루어진 압타머쌍 또는 표적 부위를 인식 및 주형으로 사용되는 단일 압타머인 것인, 표적 분자의 검출용 조성물.
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