WO2019177345A1 - 초고감도 바이오마커 다중 검출 방법 - Google Patents

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WO2019177345A1
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홍성철
이종진
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an ultra-sensitive biomarker multiple detection method, and more particularly, a) attaching at least one biomarker included in a sample obtained from an individual to a surface of a substrate; b) binding the detection antibodies that specifically bind to the biomarker having a docking strand attached to the biomarker of step a); c) bonding the imager strands alone to which the fluorescent molecules are bound to the docking strand of step b) or combining donor strands and acceptor strands together; And d) detecting the fluorescence signal generated in step c); Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining the different imager strands or different combinations of the donor strand and the acceptor strand to repeat steps c) and d) as many as the biomarker type to be detected.
  • the present invention relates to a biomarker multiple detection method and an ultra-sensitive biomarker multiple detection kit using the same.
  • biomarker levels for diseases vary from person to person, so individual databases are needed, and frequent diagnosis is essential for the establishment of individual databases and early diagnosis of the disease. To this end, biofluid such as blood required for diagnosis should be minimized, and the cost of diagnosis should be low.
  • biofluid such as blood required for diagnosis should be minimized, and the cost of diagnosis should be low.
  • biomarker levels since several biomarker levels are changed at the same time for one disease, and one biomarker is changed by several diseases, only one biomarker level cannot accurately diagnose the disease. Therefore, in order to accurately diagnose various diseases, various kinds of biomarkers must be measured at the same time. As a result, multi-diagnosis function that can analyze high sensitivity and various biomarkers at the same time is essential for early diagnosis of diseases using biomarkers.
  • ELISA-based technologies commonly used for conventional biomarker detection have sensitivity levels ranging from tens to tens of pg / ml, requiring more than tens of microliters of blood.
  • blood and detection kits in proportion to the number are required to detect multiple biomarkers. This causes the psychological and physical burden of the subject due to a large amount of blood collection and the economic burden of using a plurality of detection kits, and thus the use of biomarkers for early diagnosis of the disease is extremely limited.
  • biomarkers are mainly used for prognostic observation after certain diseases have occurred.
  • the present inventors endeavored to find a method capable of simultaneously analyzing various biomarkers at a high speed while maintaining high sensitivity, and thus applying the FRET-PAINT technology to the monomolecular fluorescence microscope technology, the biomarker was faster. It was confirmed that the detection of to complete the present invention.
  • step a) binding the detection antibodies that specifically bind to the biomarker having a docking strand attached to the biomarker of step a);
  • step b) bonding the imager strands alone to which the fluorescent molecules are bound to the docking strand of step b) or combining donor strands and acceptor strands together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining the different imager strands or different combinations of the donor strand and the acceptor strand to repeat steps c) and d) as many as the biomarker type to be detected. It is to provide a biomarker multiple detection method characterized in that.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • the present invention provides a biomarker multiple detection kit for coupling a detection antibody having a docking strand attached to a biomarker and detecting the docking strand according to a combination of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand. .
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • step b) binding the imager strand to which the fluorescent molecules are bound to the RNA of step a) alone or to bind the donor strand and the acceptor strand together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining different imager strands or different combinations of donor strands and acceptor strands to repeat steps b) and c) as many RNA types as desired. It is to provide a biomarker multiple detection method.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • biomarker multiple detection kit for detecting a signal according to the binding of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand to RNA.
  • step a) binding the detection antibodies that specifically bind to the biomarker having a docking strand attached to the biomarker of step a);
  • step b) bonding the imager strands alone to which the fluorescent molecules are bound to the docking strand of step b) or combining donor strands and acceptor strands together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining the different imager strands or different combinations of the donor strand and the acceptor strand to repeat steps c) and d) as many as the biomarker type to be detected. It provides a biomarker multiple detection method characterized in that.
  • the present invention provides a kit for detecting a biomarker multiplexed by coupling a detection antibody to which a docking strand is attached to a biomarker, and detecting the docking strand according to a combination of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand.
  • step b) binding the imager strand to which the fluorescent molecules are bound to the RNA of step a) alone or to bind the donor strand and the acceptor strand together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining different imager strands or different combinations of donor strands and acceptor strands to repeat steps b) and c) as many RNA types as desired.
  • a biomarker multiple detection method is provided.
  • kits for detecting a biomarker multiplexed to detect a signal according to the binding of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand to RNA are provided.
  • the present invention is a.
  • step a) binding the detection antibodies that specifically bind to the biomarker having a docking strand attached to the biomarker of step a);
  • step b) bonding the imager strands alone to which the fluorescent molecules are bound to the docking strand of step b) or combining donor strands and acceptor strands together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining the different imager strands or different combinations of the donor strand and the acceptor strand to repeat steps c) and d) as many as the biomarker type to be detected. It provides a biomarker multiple detection method characterized in that.
  • Step a) of the present invention is a step of attaching at least one biomarker included in the sample obtained from the individual to the surface of the substrate.
  • at least one biomarker included in the sample obtained from the individual is attached to the surface of the substrate.
  • one or two or more biomarkers are attached to the surface of the substrate.
  • the term 'subject' refers to an animal to be diagnosed with various diseases, and may preferably be an animal including a mammal, especially a human, and more preferably a patient in need of treatment. May be).
  • sample' of the present invention is obtained from an individual suspected of a disease, but is not limited thereto, and may be selected from the group consisting of tissue, blood, serum, plasma, saliva, mucosal fluid and urine, and most preferably Blood, plasma, serum, saliva, tissue fluid or urine.
  • the sample may be diluted with a solution containing no biomarker, and the concentration of the biomarker included in the sample may vary greatly from fg / ml to mg / ml depending on the type.
  • the biomarker may be diluted in various proportions such that an appropriate number of biomarker molecules is detected in the image sensor.
  • it is characterized in that it is performed for the same sample diluted in different ratios, and most preferably can be used diluted to a weight ratio of 1:10 to 1000.
  • Step b) of the present invention is a step of binding a detection antibody that specifically binds to the biomarker attached to the docking strand (docking strand) to the biomarker of step a).
  • the 'antibody' is used in the broadest sense of the present invention, and includes a capture antibody and a detection antibody.
  • monoclonal antibodies monoclonal antibodies, including full length monoclonal antibodies
  • polyclonal antibodies polyclonal antibodies
  • multispecific antibodies eg bispecific antibodies
  • antibody fragments eg, variable. Regions and other portions of antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • the antibodies of the present invention include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and include chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • Fab, F (ab) 2, Fab ', F (ab') 2, Fv, diabody (nabody), nanobody (nanobody) or scFv may be included, more preferably scFv, Fab, Nanobodies and immunoglobulin molecules.
  • Attaching the docking strand to the detection antibody can be carried out by combining conventional protein molecules and nucleic acid molecules known in the art, for example, using a compound having two different reactors simultaneously The binding reaction between the nucleic acid molecule and the protein molecule can be performed.
  • SMCC succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • NHS-ester which reacts to amine
  • maleimide which reacts to thiol.
  • the docking strand can be attached to the detection antibody by reacting with the amine group at the N-terminus or lysine of the detection antibody.
  • the attachment method of this invention can also use a commercial kit.
  • the 'detection antibody' is a primary antibody and the docking strand is attached to the primary antibody.
  • the detection antibody is a combination of a primary antibody and a secondary antibody in order to speed up the measurement, characterized in that the docking strand is attached to the secondary antibody.
  • the "primary antibody” refers to an immunoglobulin that specifically binds to a biomarker, and the type of antibody is not limited.
  • an anti-tubulin antibody, anti-Tom20 (anti-Tom20) or anti-Th20 (anti-Th20) antibody was used.
  • the "secondary antibody” refers to an antibody that binds to a primary antibody bound to a biomarker, and the type of antibody used is not limited.
  • a donkey anti-rabbit IgG (donkey anti-rabbit IgG) antibody or a donkey anti-rat IgG (anti-rat IgG) antibody was used.
  • step c) of the present invention an imager strand having fluorescent molecules bonded to the docking strand of step b) is combined alone or a donor strand and an acceptor strand are formed. Joining together.
  • the 'docking strand', 'donor strand' and 'acceptor strand' may be selected from the group consisting of complementary binding DNA, RNA, PNA, LNA. It can be a single strand. Docking strands are strands that are bound to the detection antibody, and imager strands, donor strands and acceptor strands are strands that complementarily bind to the docking strands.
  • the 'imager strand' is characterized in that it is used when using the DNA-PAINT technology
  • the donor strand and acceptor strand is characterized in that it is used when using the FRET-PAINT technology.
  • the base sequence of the 'imager strand' is characterized in that each has a different base sequence according to the type of biomarker to be detected, for example, when binding to two different biomarkers, respectively Are characterized in that the two imager strands differ at least one base. This means that the base sequence of each imager strand to be bound is different depending on the type of biomarker, regardless of the number.
  • the 'donor strand' and the 'acceptor strand' are characterized by having different base sequences according to the types of biomarkers to be detected. For example, when detecting N different biomarkers, N donor strands and N acceptor strands are used, indicating that their base sequences are different. That is, each donor strand has at least one or more bases different from each other, and each acceptor strand that binds to a different biomarker also has at least one or more bases, and the base sequences of each donor strand and the acceptor strand are all different. It means different.
  • the 'acceptor strand' has the same nucleotide sequence for all biomarkers to be detected or the same for some biomarkers, and the 'donor strand' is different from the nucleotide sequence of the acceptor strand.
  • the biomarker type may have a different base sequence.
  • the base sequences of donor strands that bind to different biomarkers, respectively differ in at least one or more bases, but one acceptor strand having the same base sequence can be used for detection. .
  • the 'donor strand' has the same base sequence for all biomarkers to be detected or the same base for some biomarkers, and the 'acceptor strand' is different from the base sequence of the donor strand and detects
  • Each biomarker may have a different base sequence.
  • acceptor strands that bind to different biomarkers each differ in at least one or more bases, but one donor strand may be used for detection.
  • the base sequence of the 'docking strand' in the present invention is characterized in that it comprises a base sequence complementary to the base sequence of the imager strand, the 'docking strand' is in both the donor strand and the acceptor strand It is characterized by including a base sequence complementary to.
  • the 'fluorescent molecule' refers to a detectable fluorescent dye compound bound to an imager strand, a donor strand and an acceptor strand, but is not limited thereto, a rodamine fluorescent molecule, Alexa Fluorescent molecule, FITC (fluorescein isothiocyanate) fluorescent molecule, 5-carboxy fluorescein (FAM) fluorescent molecule, Atto fluorescent molecule, BODIPY fluorescent molecule, CF fluorescent molecule, Cy fluorescent molecule, DyLight Fluor fluorescent molecule and Texas Red fluorescent molecule Or fluorescein, most preferably Alexa Fluor, Atto, BODIPY, CF, Cy, DyLight Fluor.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • FAM 5-carboxy fluorescein
  • the wavelength of the maximum emission spectrum of the fluorescent molecules bound to the donor strand (donor strand) is shorter than the wavelength of the maximum absorption spectrum of the fluorescent molecules coupled to the acceptor strand (acceptor strand) do.
  • Step d) of the present invention includes the step of detecting the fluorescence signal generated in step c), the pre-bonded imager strand; Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining the different imager strands or different combinations of the donor strand and the acceptor strand to repeat steps c) and d) as many as the biomarker type to be detected. Characterized in that.
  • the 'fluorescent signal' is generated when the imager strands are coupled to the docking strands or the donor strands and the acceptor strands are combined at the same time.
  • the imager strands are coupled to the docking strands.
  • the fluorescent signal may occur when the fluorescent molecules (donors) bound to the donor strand and the fluorescent molecules (acceptors) bound to the acceptor strands are positioned very close to each other by the docking strands.
  • the fluorescent signal generated as described above may be detected using a high sensitivity image sensor (EMCCD, sCMOS, iCMOS, etc.).
  • the "biomarker” refers to a biological material that can represent diseases, health conditions, physiological conditions, etc., and is used in many scientific fields. It is also used to measure or evaluate bioprocessing, pathogenic processes, and pharmacological processes for treatment. For example, it can be used as a substance to identify specific stages of a disease to detect the presence of antibodies that indicate infection, and to determine the state or change of proteins related to disease progression and the sensitivity of the disease to a given treatment method. do.
  • the biochemical biomarker may be a polypeptide, a peptide, a nucleic acid, a protein or a metabolite which can be detected in a living body such as blood, saliva, urine, and the like, but is not limited thereto, interleukin, CD24, CD40, integrin ( intgrin), cystatin, interferon, interferon, tumor necrosis factor (TNF), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR.
  • interleukin CD24, CD40, integrin ( intgrin), cystatin, interferon, interferon, tumor necrosis factor (TNF), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR.
  • FGF FGF, BRAF, GREB, FRS, LZTS, CCN, Mucin, leptin, apolipoprotein, tyrosine, neuronal adhesion molecule-like protein, fibronectin, glucose, uric acid, carbonic anhydrase or cholesterol have.
  • the biomarker may be directly attached to the surface of the substrate without using the capture antibody for speed and convenience of the measurement process, and in order to increase the accuracy of the measurement result, the biomarker molecule is fixed to the surface of the substrate.
  • the antibody may be attached via an antigen-antibody reaction.
  • the cover slip When the biomarker is directly attached to the surface of the substrate, for example, the cover slip may be coated with a bead solution, followed by culturing and fixing cells corresponding to the sample.
  • the capture antibody when used by adsorbing on the substrate, such attachment may be achieved by diluting the capture antibody with 0.06M carbonate buffer or bicarbonate buffer, for example, pH 9.5, and contacting the dilution solution with the substrate at a constant temperature for a certain time. have.
  • the capture antibody adsorbed on the substrate forms a conjugate with the biomarker in the sample when the sample or processed sample is processed on the substrate. After the conjugate is formed, the non-specifically bound antibody or contaminants are removed. It may be desirable to wash with a washing buffer such as Tween 20 or a cleaning agent such as distilled water for the purpose.
  • the method of the present invention is not one-time, and the fluorescence signal generated after binding the imager strand having the fluorescent molecules bound to the docking strand is detected. After removing the bound imager strands, the different imager strands are then combined to detect the fluorescence signal. This process may be repeated as many as the number of biomarkers.
  • a donor strand and an acceptor strand having fluorescent molecules bound to the docking strand are combined, and then a generated fluorescence signal is detected. It can be repeated to detect the fluorescent signal. This process may be repeated several times, and preferably, the biomarker may be detected by repeating the number of biomarker types.
  • a donor strand of 9 bases can have 262,144 nucleotide sequences corresponding to 9 squared of 4, which is greater than the number of all proteins in the human body, so docking strands and billions of docking strands with different nucleotide sequences for all biomarkers By assigning the acceptor strands all biomarkers can be measured sequentially.
  • the present invention is a.
  • the present invention provides a kit for detecting a biomarker multiplexed by coupling a detection antibody to which a docking strand is attached to a biomarker, and detecting the docking strand according to a combination of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand.
  • the “kit” includes: i) a substrate, ii) a capture antibody, iii) a primary detection antibody coupled to a docking strand; Or a primary detection antibody to which the docking strand is not bound and a secondary detection antibody to which the docking strand is bound, iv) an imager strand to which fluorescent molecules are bound; Or a donor strand and an acceptor strand.
  • it may be composed of a substrate, a capture antibody, a primary detection antibody coupled to a docking strand, a donor strand and an acceptor strand.
  • the docking strand, the imager strand, the donor strand and the acceptor strand are characterized in that each selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA.
  • “Substrate” of the present invention may be a surface treatment so that the biomarker included in the sample can be directly attached to the surface of the substrate or to attach a capture antibody that can capture the biomarker.
  • the capture antibody may be previously attached to the surface of the substrate. It may also be selected from the group consisting of slide glass, coverslip, quartz, plastic, preferably the substrate may be a # 1 or # 1.5 coverslip.
  • the kit of the present invention can preferably be used for the detection of biomarkers using the docking strand, donor strand and acceptor strand of the present invention.
  • the kits of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art for use in microscopy, ELISA or detection thereof.
  • the kit of the present invention may further include a tube, a well plate, an instruction sheet describing a method of use, etc., which will be used to mix each component as necessary.
  • kit of the present invention may be a research use only (RUO), an investment use only (IUO) kit or an in vitro diagnotic (IVD).
  • IVD kits also include in vitro companion diagnostics (IVD-CDx) kits.
  • the present invention is a.
  • step b) binding the imager strand to which the fluorescent molecules are bound to the RNA of step a) alone or to bind the donor strand and the acceptor strand together;
  • Pre-bonded imager strands Or removing the donor strand and the acceptor strand, and combining different imager strands or different combinations of donor strands and acceptor strands to repeat steps b) and c) as many RNA types as desired.
  • a biomarker multiple detection method is provided.
  • Step a) of the present invention is a step of attaching at least one RNA contained in a sample obtained from an individual to the surface of the substrate.
  • RNA to be detected in the present invention includes a small RNA such as miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA, siRNA, piRNA, exRNA, scaRNA, and preferably may be microRNA.
  • MicroRNA miRNA
  • miRNA miRNA
  • the present invention is a small non-expressing RNA molecule composed of about 22 bases, and functions to regulate gene expression after RNA silencing and transcription, and is found in various biological fluids such as blood and urine. Its figures change due to various diseases, and are attracting attention as biomarkers.
  • the capture probe having a base sequence complementary to a portion of the RNA to be detected is fixed to the substrate, and then the RNA is complementarily bound to the capture probe. Attach to the surface.
  • the 'sample' may be diluted with a solution that does not contain RNA, and the RNA concentration contained in the sample may vary greatly depending on the type thereof, and thus diluted in various ratios so that an appropriate number of RNA molecules can be detected in the image sensor. Can be.
  • step b) of the present invention an imager strand in which a fluorescent molecule is bound to the RNA of step a) is bound alone or a donor strand and an acceptor strand are bound together. This is the step.
  • the present invention is characterized by determining the base sequence of the imager strand or donor strand and acceptor strand so as to complementarily bind to the RNA single-stranded site that is not complementary to the capture probe.
  • the capture probe, imager strand, donor strand and acceptor strand of the present invention may be selected from the group consisting of DNA, RNA, PNA, LNA.
  • Step c) of the present invention includes the step of detecting the fluorescence signal generated in step b), removing the bound strands, and repeating steps b) and c) the number of RNA types to be detected It features.
  • 'Fluorescent signal' in the method of the present invention is characterized in that occurs when the imager strand is bonded to the RNA single strand site that is not complementary to the capture probe or the donor strand and acceptor strand at the same time, More specifically, the imager strand binds to a single strand of RNA that is not complementary to the capture probe and stays for a predetermined time, or the fluorescent molecule (donor) and the acceptor strand are bound to the donor strand. Fluorescence signals can occur when (acceptors) are located very close to a certain time by RNA.
  • the fluorescence signal generated as described above may be detected using an ultra-sensitivity image sensor (EMCCD, sCMOS, iCMOS, etc.).
  • kits for detecting a biomarker multiplexed to detect a signal according to the binding of the imager strand or the donor strand and the acceptor strand to RNA are provided.
  • the 'kit' includes a substrate, a capture probe, an imager strand, a donor strand, and an acceptor strand to which fluorescent molecules are bound, and preferably, the substrate, the capture probe, the donor strand, and the acceptor strand. It can be configured as.
  • the 'substrate' of the present invention may be a surface probe so that the capture probe is previously attached or attached to the capture probe, it may be selected from the group consisting of slide glass, coverslip, quartz, plastic. Preferably the substrate may be # 1 or # 1.5 coverslips.
  • the docking strand in order to check whether the FRET-PAINT can be examined under a microscope, the docking strand is fixed on the quartz surface and then injected with a donor strand and an acceptor strand to which the fluorescent molecules are coupled, and then a single molecule image is taken. As a result, it was confirmed that the fluorescence intensity appeared clearly according to the donor strand and the acceptor strand concentration (see Example 1, FIG. 1C).
  • the same experiment was performed using two FRET pairs (Cy3-Cy5 and Alexa488-Cy5).
  • the Cy3-Cy5 FRET pair confirmed that the fluorescence signal was the highest when the gap between the donor strand and the acceptor strand was 6 nt (see Example 1, FIG. 1D).
  • ultra-high resolution fluorescence imaging was measured, and DNA-PAINT and FRET-PAINT signal-to-noise ratios (SNRs) were compared at various DNA concentrations.
  • SNRs DNA-PAINT and FRET-PAINT signal-to-noise ratios
  • immunostaining was performed using tubulin antibody bound to a docking strand in cells, followed by observation of microtubules using DNA-PAINT method, and the same site using FRET-PAINT method. Microtubules were observed.
  • DNA-PAINT imaging speed and FRET-PAINT imaging speed were compared in an orderly manner. As a result, DNA-PAINT was photographed at 10 Hz for 30 minutes and FRET-PAINT was photographed at 10 Hz for 60 seconds. It was confirmed that the imaging speed of FRET-PAINT is faster than PAINT (see Example 2, FIGS. 2A-2E).
  • the donor strand and the acceptor strand are sequentially treated, and simultaneously treated with the following images.
  • the treatment of the donor strand and the acceptor strand sequentially was more effective for multiplexed imaging (see Example 3, FIGS. 3A to 3H).
  • the present invention provides an ultra-sensitive biomarker multiple detection method using a single molecule fluorescence microscope and DNA-PAINT or FRET-PAINT system. Since the method of the present invention can detect various biomarkers from very small amounts of biological fluids with a sensitivity 1000 times higher than conventional methods, it is useful for early diagnosis of various diseases including cancer by solving the problems of conventional biomarker diagnosis. Can be used.
  • 1A to 1K illustrate the principle and characteristics of FRET-PAINT.
  • FIG. 1A shows the docking strand (black), donor strand (blue) and acceptor strand (red) used for the characterization of FRET-PAINT
  • FIG. 1B shows a schematic of FRET-PAINT
  • 1C shows tracking of typical Cy5 fluorescence intensity times (1000 nM Donor_P1_Alexa488 and 100 nM Acceptor_P11_Cy5)
  • 1D shows normalized FRET efficiency as a function of donor-acceptor distance for Cy3-Cy5 (black) and Alexa488-Cy5 (red) pairs.
  • FIG. 1E shows a DNA-PAINT image of the docking strand (Docking_P0) with the surface immobilized at the indicated concentration of acceptor_P11_Cy3.
  • FIG. 1F shows the FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentrations of Acceptor_P6_Cy5 and Donor_P1_Cy3 fixed at 10 nM.
  • FIG. 1G shows a FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Acceptor_P6_Cy5 with Donor_P1_Cy3 fixed at 10 nM.
  • FIG. 1H shows a FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Donor_P1_Alexa488 with fixed Acceptor_P2_Cy5 at 10 nM.
  • FIG. 1I shows a FRET-PAINT image of Docking_P0 (Docking_P0) at the indicated concentration of Acceptor_P2_Cy5 with Donor_P1_Alexa488 fixed at 10 nM (Scale bar: 1 ⁇ m).
  • FIG. 1J shows the SNR (solid line) of DNA-PAINT at various Cy3 imager strand concentrations, FRET-PAINT (thick dotted line) and Cy3 acceptor strands on various Cy3 donor strands.
  • the graph shows the comparison of PAINT (dotted line).
  • 1K shows the SNR (solid line) of DNA-PAINT at various Cy3 imager strand concentrations, FRET-PAINT at FRET-PAINT (bold dotted line) and Cy5 acceptor strand concentrations at various Alexa488 donor strands.
  • the graph shows the comparison of the (dotted line).
  • FIG. 2A shows DNA-PAINT images reconstructed at the indicated acquisition time.
  • FIG. 2B shows a FRET-PAINT image of the same area as FIG. 2A reconstructed at the indicated acquisition time.
  • FIG. 2C shows the cumulative number of localized spots as a function of time for the DNA-PAINT image of FIG. 2A (solid line) and as a function of time for the FRET-PAINT image of FIG. 2B (dashed line).
  • Figure 2d shows the results of comparing the number of local single molecule spots per second of FRET-PAINT and DNA-PAINT.
  • Figure 2e graphically shows the results of comparing the spatial resolution of DNA-PAINT and FRET-PAINT against the imaging time. Error bars represent standard deviations.
  • 3A to 3H illustrate the multiplexing function of FRET-PAINT.
  • 3A shows a schematic of multiplexed images using donor and acceptor strand exchange schemes.
  • 3B to 3D show FRET-PAINT images of microtubules (b) and mitochondria (c) obtained using the method of FIG. 3A, and images d superimposed thereof.
  • 3E shows a schematic of the multiplexed image without buffer exchange.
  • 3F to 3H show FRET-PAINT images of microtubules (f) and mitochondria (g) and superimposed images (h) obtained using the method of FIG. 3E (MT: microtubules, MC: mitochondria, DS: donor strand, AS: acceptor strand, Scale bars: 5 ⁇ m).
  • FIGS. 4A and 4B show the results of measuring biomarkers using donor strands and acceptor strands by fixing biomarkers at concentrations of 10, 40, 100, 400, 1000, and 10000 pg / ml, respectively, in different chambers.
  • Figure 4b shows the results of measuring the biomarkers when the biomarkers of 1000 pg / ml and 10000 pg / ml concentration diluted to 1/10 and 1/100, respectively.
  • 4C graphically shows the number of points measured at each concentration of FIGS. 4A and 4B. 1000 pg / ml was diluted to 1/10 and multiplied by 10 to the number of dots, and 10000 pg / ml was diluted to 1/100 and multiplied by 100 to the number of dots.
  • Modified DNA oligonucleotides were purchased from Integrated DNA Technologies and Alexa 488 (Alexa Fluor 488 NHS Ester, catalog number: A20000) was purchased from Thermo Fisher Scientific. Cy3 (Cy3 NHS Ester, catalog number: PA13101) and Cy5 (Cy5 NHS Ester, catalog number: PA15101) were purchased from GE Healthcare Life Sciences and COS-7 cells were purchased from the Korean Cell Line Bank.
  • Anti-tubulin antibody catalog number: ab6160 was purchased from Abcam, anti-Tom20 antibody (sc-11415) was purchased from Santa Cruz Biotechnology, and donkey anti-rabbit IgG antibody.
  • the docking strand used in the present invention was conjugated to a secondary antibody using an Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit (catalog number: A-9202-001), which kit was used in Solulink. Purchased.
  • DNA oligonucleotides modified with amines were labeled with fluorescent materials with NHS ester chemical groups.
  • First 5 ⁇ l of 1 mM DNA was mixed with 25 ⁇ l of 100 mM sodium tetraborate buffer (pH 8.5), 5 ⁇ l of 20 mM fluorescent substance dissolved in DMSO was added and then incubated overnight at 4 ° C. Then 265 ⁇ l of distilled water, 900 ⁇ l of ethanol and 30 ⁇ l of 3M sodium acetate pH 5.2) were added and mixed. The mixture was incubated at ⁇ 20 ° C. for 1 hour and then centrifuged for 2 hours. The supernatant was then discarded and the DNA pellet was washed with cold ethanol. After ethanol was completely dried, the DNA pellet was resuspended in 50 ⁇ l of distilled water and the fluorescent labeling efficiency was measured.
  • the cover slip was diluted with distilled water with bead solution 1:10, heated in a hot plate at 100 ° C. for 10 minutes, washed with distilled water, and dried using N 2 gas.
  • COS-7 cells were grown on cover slips coated with beads and then fixed for 10 minutes. Then, microtubules were observed using 2% glutaraldehyde, and microtubules and mitochondria were prepared using a mixture of 3% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde dissolved in PBS buffer. Was observed. Fixed samples were then stored at 4 ° C. in PBS buffer until use.
  • the microtubules were treated with anti-tubulin antibody diluted 1: 100 in blocking solution (containing 5% BSA and 0.25% Triton X-100 in PBS buffer). After processing. Incubate overnight at 4 ° C. Immunostaining was performed. Free anti-tubulin was thoroughly washed with PBS buffer, and cells were incubated for 1 hour by treatment with a 100 nM secondary antibody conjugated with a docking strand (Docking_P1). Mitochondria were treated with anti-Tom20 antibody diluted 1: 100, incubated overnight at 4 ° C, followed by immunostaining, followed by washing of free anti-Tom20 antibody with PBS buffer. Cells were incubated for 1 hour by treatment with 100 nM secondary antibody conjugated with docking strand (Docking_P2).
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • HILO highly tilted and stacked optical sheet
  • the docking strands were fixed on the polymer-coated quartz slide surface using strapptavidin-biotin interactions, and donor and acceptor strands.
  • Alexa488, Cy3 and Cy5 are blue laser (473nm, 100mW, MBL-III-473-100 mW, CNI), green laser (532nm, 50mW, Compass 215M-50, Coherent) and red laser (642nm, 60mW, Excelsior- 642-60, Spectra-Physics). Cy3 signals were filtered using a 640dcxr dichroic mirror (Chroma) and Cy5 signals were filtered using a 740dcxr dichroic mirror (Chroma). Single-molecular images were recorded at a frame rate of 10 Hz using an electron multiplying charge coupled device (EMCD) camera (iXon Ultra DU-897U-CS0- # BV, Andor).
  • EMCD electron multiplying charge coupled device
  • FRET-PAINT used three DNA strands (docking strand, donor strand and acceptor strand).
  • the docking strand (Docking_P0) has biotin attached at the 5 'end, and there are two docking sites, donor strands or acceptor strands, respectively.
  • a relatively long acceptor strand was used to select a donor strand of shorter length than the acceptor strand, in order to increase the FRET probability upon joining the docking strand to the donor strand.
  • donor strands labeled Alexa488 Donor_P1_Alexa488) at the 3 'end
  • acceptor strands were labeled with Cy5 (Acceptor_P11_Cy5) at the 3' end.
  • the base sequence of each strand is as follows.
  • Donor_P1_Cy3 5'-TAATGAAGA-Cy3-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Donor_P1_Alexa488 5'-TAATGAAGA-Alexa488-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Acceptor_P2_Cy5 5'-Cy5-TATGTAGATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Acceptor_P6_Cy5 5'-TATG-Cy5-TAGATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Acceptor_P11_Cy5 5'-TATGTAGATC-Cy5-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • the docking strand was then fixed to the polymer-coated quartz surface using the streptavidin-biotin interaction (FIG. 1B). Then, donor strands (1000 nM) and acceptor strands (100 nM) were injected, followed by single molecule images of Cy5 by Alexa488 reacted using a blue laser.
  • microtubules of COS-7 cells were immunostained using an anti-tubulin antibody to which Docking_P1 is bound.
  • DNA-PAINT recorded a total of 18000 frames at a rate of 10 Hz for 30 minutes (Fig. 2a), while FRET-PAINT recorded a total of 600 frames at a rate of 10 Hz for 60 seconds. (FIG. 2B).
  • the imaging speed of FRET-PAINT was increased by 29 times compared to DNA-PAINT (FIG. 2C), and the imaging speed was increased by 32 times even with the average value measured for different sites (FIG. 2D).
  • FIG. 2E the imaging speed of FRET-PAINT was increased 36 times
  • Microtubules and mitochondria of COS-7 cells were immunostained using anti-tubulin antibodies with Docking_P1 and anti-Th20 antibodies with Docking_P2, respectively.
  • multiplexed images were obtained using two approaches.
  • Micron tubes were observed by injecting 20nM Donor_P1_Alexa488 and 10nM Acceptor_P2_Cy5 according to the approach according to FIG. 3A (processing of donor and acceptor strands sequentially) (FIG. 3b), and 10nM Donor_P2_Alexa499 and 10nM Acceptor_P2_Cy5 were observed by mitochondria (injection). 3c and 3d).
  • FIG. 3A processing of donor and acceptor strands sequentially
  • 10nM Donor_P2_Alexa499 and 10nM Acceptor_P2_Cy5 were observed by mitochondria (injection).
  • the two approaches showed no difference in imaging time, but when the donor strand and the acceptor strand were processed simultaneously, it was confirmed that crosstalk occurred between the microtubule and the mitochondrial image, and thus, the donor strand and the acceptor strand. It was found that the case of sequentially processing was more effective for multiplexed imaging.
  • Biomarkers at concentrations of 10, 40, 100, 400, 1000, and 10000 pg / ml were fixed in different chambers and the number of dots (individual biomarker molecules) displayed on the screen was measured using donor strands and acceptor strands ( 4a). It can be seen that the number of dots appearing on the screen increases in proportion to the concentration, and at a concentration of 1000 pg / ml or more, the dots start overlapping and cannot count the correct number.
  • the biomarkers at concentrations of 1000 and 10000 pg / ml were diluted to 1/10 and 1/100, respectively, and fixed in different chambers.
  • the method of the present invention can detect various biomarkers from a very small amount of biological fluids with a sensitivity 1000 times higher than that of the conventional method, it solves the problems of the conventional biomarker diagnosis to solve various diseases including cancer. It can be useful for early diagnosis.

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Abstract

본 발명은 초고감도 바이오마커 다중 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계; b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계; c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다.

Description

초고감도 바이오마커 다중 검출 방법
본 출원은 2018년 3월 13일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0029473호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 초고감도 바이오마커 다중 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계; b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계; c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법 및 이를 이용한 초고감도 바이오마커 다중 검출 키트에 관한 것이다.
질병에 대한 바이오마커 수치 변화는 개인별로 그 양상이 다르므로 개인별 데이터베이스가 필요하고, 개인별 데이터베이스 구축과 질병의 조기 진단을 위해서 잦은 진단은 필수이다. 이를 위해서는 진단에 필요한 혈액 등의 생체액(biofluid)을 최소로 해야 하며, 진단 비용이 저렴해야 한다. 또한 하나의 질병에 대해 여러 바이오마커 수치가 동시에 변하고, 하나의 바이오마커는 여러 질병에 의해 수치가 변하므로 한 가지 바이오마커 수치만으로는 정확한 진단을 할 수 없다. 따라서 다양한 질병을 정확하게 진단하기 위해서는 다양한 종류의 바이오마커를 동시에 측정할 수 있어야 한다. 결국 바이오마커를 이용한 질병의 조기 진단을 위해서는 높은 민감도와 다양한 바이오마커를 동시에 분석할 수 있는 다중 진단 기능이 필수이다.
기존 바이오마커 검출에 주로 사용되는 ELISA 기반의 기술은 수~수십 pg/ml 수준의 민감도를 가지며 이로 인해 수십 마이크로리터 이상의 혈액을 필요로 한다. 또한 다중 검출이 불가능하므로 다수의 바이오마커를 검출하기 위해서는 수에 비례하는 혈액 및 검출 키트를 필요로 한다. 이는 다량의 채혈에 따른 피검자의 심리적, 신체적 부담 및 다수의 검출 키트 사용에 따른 경제적 부담을 유발하며 이로 인해 질병의 조기 진단을 위한 바이오마커 사용은 극히 제한되어 있는 상태이다. 현재 바이오마커는 주로 특정 질병이 발생한 후 예후 관찰용으로 사용되고 있다.
단분자 형광현미경 기술의 개발로 분자를 하나씩 관찰할 수 있게 되었고 이를 바이오마커 검출에 적용함으로써 민감도는 fg/ml 수준으로 1000배 가량 증가하게 되었다(Nature 473, 484-488, 2011). 통상적으로 사용하는 형광 이미징에서는 관찰하려는 분자에 형광분자를 고정하여, 서로 다른 종류의 바이오마커를 형광신호를 이용해 구분하는 방법을 사용한다. 이 때 각각 서로 다른 색의 형광분자를 고정하고 색깔 차이를 이용해 바이오마커의 종류를 구분하는 방법을 사용하나, 통상의 이미지 센서로 구분하여 관찰할 수 있는 형광분자의 종류는 3~4가지 정도이다. 따라서, 단분자 형광현미경 기술을 사용할 경우, 민감도는 fg/ml로 기존 방법에 비해 1000배 가량 증가하나 검출할 수 있는 바이오마커의 종류는 여전히 3~4 가지 정도로 제한된다.
한편, 단분자 형광현미경 기술에 DNA-PAINT 기술(Nature Methods 11, 313-318, 2014)을 적용함으로써 높은 민감도를 유지하는 동시에 다양한 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다. 관찰하고자 하는 바이오마커에 형광분자 대신 도킹 스트랜드가 결합되어 있는 검출항체를 붙이고, 도킹 스트랜드에 잠시 (수 초 이내) 붙었다가 떨어지는 이미저 스트랜드에 형광분자를 붙인 후 도킹 스트랜드에 결합된 이미저 스트랜드의 형광 신호를 검출함으로써 높은 민감도를 유지한 채 한 가지 색의 형광분자로 많은 종류의 바이오마커를 검출할 수 있다.
그러나, DNA-PAINT 기술을 이용할 경우 이미저 스트랜드가 도킹 스트랜드에 결합했는지 여부와 무관하게 모든 이미저 스트랜드가 형광 신호를 방출하므로 높은 노이즈가 생성되며, 이로 인해 이미저 스트랜드의 농도는 수 nM~수십 nM로 제한되어 검출 속도가 느려지는 단점이 발생한다.
이에, 단분자 형광현미경의 높은 민감도를 유지하면서 다양한 바이오마커를 동시에 분석하는 방법에 대한 개발이 요구된다.
이에 본 발명자들은 높은 민감도를 유지하는 동시에 다양한 바이오마커를 동시에 빠른 속도로 분석할 수 있는 방법을 찾기 위하여 노력한 결과, 단분자 형광현미경 기술에 FRET-PAINT 기술을 적용할 경우, 보다 빠른 속도로 바이오마커를 검출하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계;
c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체,
b) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 RNA를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 RNA에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
RNA에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계;
c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체,
b) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 RNA를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 RNA에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
RNA에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계;
c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다.
상기 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명의 a) 단계는 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계이다. 바람직하게는 1종 또는 2종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어‘개체(subject)’란 여러 질환의 진단 대상이 되는 동물을 의미하는 것으로, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.
본 발명의 ‘시료’는 질환이 의심되는 개체로부터 분리 수득되는 것으로서, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점막액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 침, 조직액 또는 소변일 수 있다.
또한 본 발명에서 시료는 바이오마커가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 시료에 포함된 바이오마커의 농도는 종류에 따라 fg/ml부터 mg/ml까지 매우 크게 차이가 날 수 있다. 바람직하게는 이미지 센서에 적당한 수의 바이오마커 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다. 바람직하게는 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행되는 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1000의 중량비로 희석하여 사용할 수 있다.
본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계이다.
본 발명에서 상기 ‘항체’는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 포획항체와 검출항체를 포함한다. 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어. 가변 영역 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다. 또한 본 발명의 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하고, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함한다. 바람직하게는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), 나노바디(nanobody) 또는 scFv를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자일 수 있다.
검출항체에 도킹 스트랜드를 부착하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 단백질 분자와 핵산 분자를 결합시키는 방법에 의해서 수행될 수 있으나, 예를 들어, 두 개의 서로 다른 반응기를 동시에 가지고 있는 화합물을 사용하여 핵산 분자와 단백질 분자 간의 결합 반응을 수행하여 부착할 수 있다. 일례로 SMCC (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)는 아민(amine)에 반응하는 NHS-ester와 싸이올(thiol)에 반응하는 maleimide를 가지고 있는데, 싸이올기가 부착되어 있는 도킹 스트랜드를 SMCC와 반응시킨 후 그 결과물을 검출항체와 반응시키면 검출항체의 N-말단 또는 라이신에 있는 아민기와 반응하여 검출항체에 도킹 스트랜드를 붙일 수 있다. 본 발명의 부착 방법은 상용의 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 측정의 정확성을 위해 상기 ‘검출항체’는 1차 항체이며, 도킹 스트랜드가 1차 항체에 부착된 것을 특징으로 한다. 또한 측정 속도를 빠르게 하기 위해 상기 검출항체는 1차 항체 및 2차 항체의 조합이며, 도킹 스트랜드가 2차 항체에 부착된 것을 특징으로 한다.
상기 ‘1차 항체’는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 의미하며 항체의 종류는 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체, 항-Tom20(anti-Tom20) 또는 항-Th20(anti-Th20) 항체를 사용하였다.
상기 ‘2차 항체’는 바이오마커에 결합한 1차 항체에 결합하는 항체를 의미하고 사용하는 항체의 종류는 제한되지 않는다. 본 발명에서는 당나귀 항-래빗 IgG(Donkey anti-rabbit IgG) 항체 또는 당나귀 항-랫 IgG(donkey anti-rat IgG) 항체를 사용하였다.
본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계이다.
본 발명에서 상기 ‘도킹 스트랜드(docking strand)’, ‘도너 스트랜드(donor strand)’ 및 ‘억셉터 스트랜드(acceptor strand)’는 상보적 결합이 가능한 DNA, RNA, PNA, LNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 단일 가닥(single strand)이다. 도킹 스트랜드는 검출항체에 결합되어 있는 가닥이며, 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드는 도킹 스트랜드에 상보적으로 결합하는 가닥을 의미한다. 또한 상기 ‘이미저 스트랜드(imager strand)’는 DNA-PAINT 기술을 이용할 경우에 사용하는 것을 특징으로 하며, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드는 FRET-PAINT 기술을 이용할 경우 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에서 상기 ‘이미저 스트랜드’의 염기서열은 검출하는 바이오마커의 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하며, 예를 들어, 두 가지의 서로 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 경우에는, 두 개의 이미저 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다른 것을 특징으로 한다. 이는 개수에 상관없이 바이오마커의 종류에 따라 결합하는 각각의 이미저 스트랜드의 염기서열이 모두 상이한 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서 상기 ‘도너 스트랜드’ 및 ‘억셉터 스트랜드’는 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, N 가지의 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우 N개의 도너 스트랜드와 N가지의 억셉터 스트랜드가 이용되며, 이들의 염기서열이 상이한 것을 나타낸다. 즉, 도너 스트랜드에 대해서 각각의 도너 스트랜드가 최소 하나 이상의 염기가 다르며, 상이한 바이오마커에 결합하는 각각의 억셉터 스트랜드도 최소 하나 이상의 염기가 다르며, 각각의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열이 모두 상이한 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서는 ‘억셉터 스트랜드’는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, ‘도너 스트랜드’는 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 도너 스트랜드의 염기서열은 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 동일한 염기서열을 가진 한 가지 억셉터 스트랜드를 검출에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 ‘도너 스트랜드’는 전체 검출대상 바이오마커에 대해서 동일하거나, 일부 바이오마커에 대해서 동일한 염기서열을 가지고, ‘억셉터 스트랜드’는 상기 도너 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 두 가지 서로 상이한 바이오마커를 검출하는 경우, 상이한 바이오마커에 각각 결합하는 억셉터 스트랜드는 최소 하나 이상의 염기가 다르나, 한 가지 도너 스트랜드를 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 ‘도킹 스트랜드’의 염기서열은 상기 이미저 스트랜드의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 ‘도킹 스트랜드’는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 모두에 대해 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 ‘형광분자’는 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드에 결합되어 있는 검출가능한 형광 색소 화합물을 의미하며, 이에 한정되지는 않으나, 로다민(Rodamine) 형광분자, 알렉사(Alexa) 형광분자, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광분자, FAM(5-carboxy fluorescein) 형광분자, Atto 형광분자, BODIPY 형광분자, CF 형광분자, Cy 형광분자, DyLight Fluor 형광분자 및 텍사스 레드(Texas Red) 형광분자 또는 플루오레세인(fluorescein)일 수 있고, 가장 바람직하게는 Alexa Fluor, Atto, BODIPY, CF, Cy, DyLight Fluor일 수 있다.
본 발명에서 상기 도너 스트랜드(donor strand)에 결합되어 있는 형광분자의 발광스펙트럼 최대값의 파장이 상기 억셉터 스트랜드(acceptor strand)에 결합되어 있는 형광분자의 흡광스펙트럼 최대값의 파장보다 짧은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 d) 단계는 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 ‘형광신호’는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하거나 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생하는 것을 특징으로 하며, 구체적으로는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광분자(도너)와 억셉터 스트랜드에 결합된 형광분자(억셉터)가 도킹 스트랜드에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광 신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 고감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명에서, 상기 ‘바이오마커’는 질병이나 건강 상태, 생리 상태 등을 나타내 줄 수 있는 생체 물질을 의미하며, 많은 과학적 분야에 이용되고 있다. 이는 생물처리과정, 병원성을 일으키는 과정, 치료를 위한 약리학적 과정의 측정 또는 평가에도 이용된다. 예를 들면, 감염을 나타내는 항체의 존재를 파악하는 질병의 특정한 단계를 파악하는 물질로 이용되기도 하며, 병의 진행과 관련있는 단백질의 상태나 변화 및 주어진 치료 방법에 대한 병의 민감도를 확인하는데 이용된다.
상기 생화학적 바이오마커는 혈액, 타액, 소변 등의 생체에서 검출할 수 있는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 단백질 또는 대사물질일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 인터루킨(interleukin), CD24, CD40, 인테그린(intgrin), 시스타틴(cystatin), 인터페론(interferon), TNF(tumor necrosis factor), MCP, VEGF, GLP, ICA, HLA-DR, ICAM, EGFR. FGF, BRAF, GREB, FRS, LZTS, CCN, 뮤신(Mucine), 렙틴(leptin), 아포리포단백질, 티로신, 신경세포 접착분자 유사 단백질, 파이브로넥틴, 포도당, 요산, 탄산탈수효소 또는 콜레스테롤 등일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 바이오마커는 측정 과정의 속도 및 편의성을 위해 포획항체에 의하지 않고 기판의 표면에 직접 부착될 수 있으며, 측정 결과의 정확성을 높이기 위해 바이오마커 분자는 기판의 표면에 고정되어 있는 포획항체에 항원-항체 반응을 통해 부착될 수 있다.
상기 바이오마커를 기판의 표면에 직접 부착하는 경우, 예를 들어 커버 슬립을 비드 용액으로 코팅한 다음 시료에 해당하는 세포를 배양하여 고정시켜 사용할 수 있다. 또한 상기 포획 항체를 기판에 흡착시켜 사용할 경우, 이러한 부착은 예컨대 pH 9.5인 0.06M 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획 항체를 희석시키고 하고 그 희석액을 기판에 일정 온도에서 일정 시간 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 그 다음 기판에 흡착된 포획 항체는 기판에 시료 또는 가공된 시료를 처리할 경우 그 시료 중의 바이오마커와 결합체를 형성하게 되며, 결합체가 형성된 후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법은 일회성이 아니며, 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드를 결합시킨 다음 발생하는 형광 신호를 검출한다. 그 다음 결합되어 있는 이미저 스트랜드를 제거한 후, 상이한 이미저 스트랜드를 결합시켜 형광 신호를 검출한다. 이러한 과정을 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 수행할 수 있다.
또한, 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(accetpor strand)를 결합킨 다음, 발생하는 형광 신호를 검출한다, 그 다음 결합되어 있는 스트랜드를 제거한 후, 동일한 방법을 반복하여 형광 신호를 검출할 수 있다. 이러한 과정을 여러번 반복하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 바이오마커를 검출 할 수 있다.
예를 들어, 9개의 염기로 이루어진 도너 스트랜드는 4의 9제곱에 해당하는 262,144개의 염기서열을 가질 수 있고 이는 인체 내 모든 단백질의 수보다 크므로 모든 바이오마커에 서로 다른 염기서열의 도킹 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 배정함으로써 모든 바이오마커를 순차적으로 측정할 수 있다.
본 발명은
a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체,
b) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공한다.
상기 ‘키트’는 i) 기판, ii) 포획항체, iii) 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체; 또는 도킹 스트랜드가 결합되지 않은 1차 검출항체 및 도킹 스트랜드가 결합된 2차 검출항체, iv) 형광분자가 결합된 이미저 스트랜드; 또는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 기판, 포획항체, 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드로 구성될 수 있다.
본 발명에서 상기 도킹 스트랜드, 상기 이미저 스트랜드, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 ‘기판’은 시료에 포함되어 있는 바이오마커가 직접 기판의 표면에 부착되거나 바이오마커를 포획할 수 있는 포획항체를 부착할 수 있도록 표면처리가 되어있을 수 있다. 또는 기판의 표면에 포획항체가 미리 부착되어 있을 수 있다. 또한 슬라이드 글래스, 커버슬립, 석영, 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 이용하여 바이오마커의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 현광현미경, ELISA나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 RUO(research use only), IUO(investigational use only) 키트 또는 IVD(in vitro diagnotic)일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx(in vitro companion diagnostics) 키트도 포함된다.
본 발명은
a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 RNA를 기판의 표면에 부착하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 RNA에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다.
상기 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명의 a) 단계는 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 RNA를 기판의 표면에 부착하는 단계이다.
상기에서 ‘RNA(ribonucleic acid)’ 는 바이오마커로 기능할 수 있어 검출대상이 될 수 있는 RNA를 나타내며, 바람직하게는 비-코딩 RNA(Non-coding RNA)일 수 있다. 상기 비-코딩 RNA는 특정 단백질에 대한 아미노산 코드가 없는 RNA의 유형으로, 유전자 서열을 번역하는 mRNA와 달리 다양한 형태로 존재하며, mRNA 부산물, 분해물 또는 별도의 전사과정을 통해 생성될 수 있으며, 염색체 활동이나 단백질 발현을 조절하는 역할 등을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서의 검출 대상이 되는 RNA는 miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA, siRNA, piRNA, exRNA, scaRNA와 같은 작은 RNA를 포함하며, 바람직하게는 마이크로 RNA일 수 있다.
본 발명의 ‘마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)’는 약 22개의 염기로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는데 혈액, 소변 등 다양한 생체액에서 발견되고 다양한 질병에 의해 그 수치가 변화하여 바이오마커로서 각광받고 있다.
본 발명에서는 RNA는 항원-항체 반응으로 포획할 수 없으므로, 검출하고자 하는 RNA의 일부와 상보적인 염기서열을 갖는 포획프로브를 기판에 고정한 후, 이 포획프로브와 상보적으로 결합하도록 하여 RNA를 기판의 표면에 부착한다.
본 발명에서 상기 ‘시료’는 RNA가 포함되지 않은 용액으로 희석될 수 있으며, 시료에 포함된 RNA 농도는 그 종류에 따라 매우 크게 차이 나므로 이미지 센서에 적당한 수의 RNA 분자가 검출되도록 다양한 비율로 희석될 수 있다.
본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계의 RNA에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계이다.
본 발명에서는 상기 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 RNA 단일 가닥 부위와 상보적으로 결합할 수 있도록 이미저 스트랜드 또는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드의 염기서열을 정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 포획프로브, 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드는 DNA, RNA, PNA, LNA로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 기결합된 스트랜드를 제거하고, 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 RNA 종류 개수만큼 반복하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 방법에서 ‘형광신호’는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 RNA 단일 가닥 부위에 이미저 스트랜드가 결합하거나 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생하는 것을 특징으로 하며, 보다 구체적으로는 포획프로브와 상보적으로 결합하고 있지 않은 RNA 단일 가닥 부위에 이미저 스트랜드가 결합하여 일정시간 머무르거나, 도너 스트랜드에 결합된 형광분자(도너)와 억셉터 스트랜드에 결합된 형광분자(억셉터)가 RNA에 의해 일정시간 매우 가까이 위치하였을 때 형광 신호가 발생할 수 있다. 상기와 같이 발생한 형광신호는 초감도 이미지 센서(EMCCD, sCMOS, iCMOS 등)를 이용하여 검출할 수 있다.
또한 본 발명은
a) 형광분자가 결합된
i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
를 포함하며,
RNA에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 ‘키트’는 기판, 포획프로브, 형광분자가 결합된 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 기판, 포획프로브, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드로 구성될 수 있다.
본 발명의 상기 ‘기판’은 포획프로브가 미리 부착되어 있거나 포획프로브를 부착할 수 있도록 표면처리된 것일 수 있으며, 슬라이드 글래스, 커버슬립, 석영, 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 기판은 #1 또는 #1.5 커버슬립일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 확인하기 위하여, 석영 표면에 도킹 스트랜드를 고정시킨 다음 형광분자가 결합된 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 주입한 후, 단일분자 이미지를 촬영한 결과 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드 농도에 따라 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 1, 도 1c 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서 2개의 FRET 페어(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)를 이용하여 동일한 실험을 실행한 결과, Alexa488-Cy5 FRET 페어는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt 일 때, Cy3-Cy5 FRET 페어는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt 일 때 형광신호가 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 1, 도 1d 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 초고해상도 형광 이미징을 측정하였고, 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교한 결과, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 발생하였고, FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 발생하는 것으로 보아, DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 1, 도 1e 내지 1k 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체를 사용하여 면역 염색을 한 다음 DNA-PAINT 방식을 이용하여 미세소관을 관찰하였고, FRET-PAINT 방식을 이용하여 동일한 부위의 미세소관을 관찰하였다. 또한 DNA-PAINT 이미징 속도와 FRET-PAINT 이미징 속도를 정령화하여 비교한 결과, DNA-PAINT는 10Hz 속도로 총 30분 동안 촬영하였고, FRET-PAINT는 10Hz 속도로 총 60초 동안 촬영하였으며, DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 이미징 속도가 더 빠른 것을 확인하였다(실시예 2, 도 2a 내지 도 2e 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 세포에 도킹 스트랜드가 결합된 튜블린 항체와 Th20 항체를 처리한 다음, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 방법과, 동시에 처리하는 방법으로 처리한 다음 이미지를 관찰한 결과, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다(실시예 3, 도 3a 내지 도 3h 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 바이오마커 농도에 따라 화면에 나타난 분자의 개수를 측정한 결과 10 pg/mg~400 pg/ml 범위에서는 개별 분자가 잘 구분되어 바이오마커 농도를 측정할 수 있으나 1000 pg/ml 이상 농도에서는 분자들이 겹치기 시작해 정확한 농도를 측정할 수 없음을 확인하였다. 대략 100 pg/ml의 농도가 되도록 적당한 비율로 희석한 후 분자의 개수를 측정하고 희석한 비율로 나눠 바이오마커 농도를 구할 경우 본래 바이오마커 농도를 정확하게 측정할 수 있음을 확인하였다. 현재 널리 쓰이는 바이오마커 농도(수 pg/ml~수십 ng/ml) 범위에서 정확한 측정이 가능함을 확인하였다(실시예 4, 도 4a 내지 도 4c 참조).
따라서, 본 발명은 단분자 형광현미경과 DNA-PAINT 또는 FRET-PAINT 시스템을 이용한 초고감도 바이오마커 다중 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기존의 방식에 비해 1000배 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있기 때문에, 기존 바이오마커 진단의 문제점을 해결하여 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1k는 FRET-PAINT의 원리와 특성을 나타낸 것이다.
도 1a는 FRET-PAINT의 특성화에 사용된 도킹 스트랜드(검정), 도너 스트랜드(파랑) 및 억셉터 스트랜드(빨강)를 나타낸 것이며, 도 1b는 FRET-PAINT의 도식도를 나타낸 것이다. 도 1c는 대표적인 Cy5 형광 강도 시간을 추적한 것을 나타낸 것이다(1000 nM Donor_P1_Alexa488 및 100 nM Acceptor_P11_Cy5). 도 1d는 Cy3-Cy5 (검정) 및 Alexa488-Cy5 (빨강) 페어 대한 도너(donor)-억셉터(acceptor) 거리의 기능으로서 표준화된 FRET 효율을 나타낸 것이다.
도 1e는 억셉터_P11_Cy3의 표시된 농도에서 표면을 고정시킨 도킹 스트랜드(Docking_P0)의 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1f는 10nM에서 고정된 Acceptor_P6_Cy5와 Donor_P1_Cy3의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1g는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Cy3와 함께 Acceptor_P6_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1h는 10nM에서 고정된 Acceptor_P2_Cy5와 함께 Donor_P1_Alexa488의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 1i는 10nM에서 고정된 Donor_P1_Alexa488과 함께 Acceptor_P2_Cy5의 표시된 농도에서 도킹_P0(Docking_P0)의FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다(Scale bar: 1μm).
도 1j는 다양한 Cy3 이미지(Cy3 imager) 스트랜드 농도에서 DNA-PAINT의 SNR(실선), 다양한 Cy3 도너(Cy3 donor) 스트랜드에서 FRET-PAINT(굵은 점선) 및 Cy3 억셉터(Cy3 acceptor) 스트랜드에서 FRET-PAINT(점선)의 비교를 그래프로 나타낸 것이다. 도 1k는 다양한 Cy3 이미지(Cy3 imager) 스트랜드 농도에서 DNA-PAINT의 SNR(실선), 다양한 Alexa488 도너(donor) 스트랜드에서 FRET-PAINT(굵은 점선) 및 Cy5 억셉터(acceptor) 스트랜드 농도에서 FRET-PAINT(점선)의 비교를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 표시된 획득 시간에 재구성된 DNA-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2b는 표시된 획득 시간에 재구성된 도 2a와 동일한 영역의 FRET-PAINT 이미지를 나타낸 것이다. 도 2c는 도 2a의 DNA-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수(실선) 및 도 2b의 FRET-PAINT 이미지에 대한 시간의 함수(점선)로서 국소성 스팟(localized spot)의 누적 개수를 나타낸 것이다. 도 2d는 FRET-PAINT와 DNA-PAINT의 초당 국소 단일 분자 스팟 개수를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 2e는 이미징 시간에 대하여 DNA-PAINT 및 FRET-PAINT의 공간 해상도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 오차막대는 표준편차를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3h는FRET-PAINT의 다중화 기능을 나타낸 것이다.
도 3a는 도너 및 억셉터 스트랜드 교환 체계를 사용하는 다중화된 이미지를 도식도로 나타낸 것이다. 도 3b 내지 도 3d는 도 3a의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(microtubule, b) 및 미토콘드리아(mitochondria, c)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(d)를 나타낸 것이다. 도 3e는 버퍼 교환 없이 다중화된 이미지를 도식도로 나타낸 것이다. 도 3f 내지 도 3h는 도 3e의 방법을 사용하여 획득한 미세소관(f) 및 미토콘드리아(g)의 FRET-PAINT 이미지 및 이들을 중첩한 이미지(h)를 나타낸 것이다(MT: 미세소관(microtubule), MC: 미토콘드리아(mitochondria), DS: 도너 스트랜드(donor strand), AS: 억셉터 스트랜드(acceptor strand), Scale bars: 5μm).
도 4a 내지 도 4c는 다양한 농도 범위의 바이오마커를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 챔버에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 1000 pg/ml 과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100으로 희석하여 사용한 경우 바이오마커를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4c는 도 4a 및 4b의 각각의 농도에서 측정한 점의 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 1000 pg/ml는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱했고, 10000 pg/ml는 1/100로 희석해 센 점의 수에 100을 곱하여 측정하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 시약 및 재료
변형된 DNA 올리고뉴클레오티드(Modified DNA oligonucleotides)는 Integrated DNA Technologies에서 구입하였고, Alexa 488(Alexa Fluor 488 NHS Ester, catalog number: A20000)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. Cy3(Cy3 NHS Ester, catalog number: PA13101) 및 Cy5(Cy5 NHS Ester, catalog number: PA15101)는 GE Healthcare Life Sciences에서 구입하였고, COS-7 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 항-튜블린 항체(Anti-tubulin antibody; catalog number: ab6160)는 Abcam에서 구입하였고, 항-Tom20 항체(Anti-Tom20 antibody; sc-11415)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였으며, 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Donkey anti-rabbit IgG antibody; catalog number: 711-005-152) 및 당나귀 항-랫 IgG 항체(donkey anti-rat IgG antibody; catalog number: 712-005-153)는 Jackson ImmunoResearch Laboratories에서 구입하였다. 카르복실 라텍스 비드(Carboxyl latex beads; catalog number: C37281)는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였고, 파라포름알데히드(Paraformaldehyde; catalog number: 1.04005.1000)는 Merck에서 구입하였고, 글루타알데히드(Glutaraldehyde; catalog number: G5882), 트리톤 X-100(Triton X-100; catalog number: T9284) 및 BSA(Bovine Serum Albumin; catalog number: A4919)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 본 발명에서 사용한 도킹 스트랜드는 항체-올리고뉴클레오티드 올인원 접합 키트(Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit; catalog number: A-9202-001)를 사용하여 2차 항체에 접합하였으며, 상기 키트는 Solulink에서 구입하였다.
2. DNA 형광표지
아민으로 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드는 NHS 에스테르 화학 그룹을 갖는 형광 물질로 표지하였다. 먼저 1 mM DNA 5 ㎕를 100 mM 소듐 테트라 보레이트 완충액(pH 8.5) 25 ㎕와 혼합하였고, DMSO에 용해된 20 mM 형광 물질 5 ㎕를 첨가한 뒤, 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 그 다음 265㎕의 증류수, 900㎕의 에탄올 및 30㎕의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 1 시간 동안 배양한 뒤, 2시간 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 버리고 DNA 펠릿을 차가운 에탄올로 세척하였다. 에탄올이 완전히 건조시킨 후, DNA 펠릿을 50 ㎕의 증류수에 재현탁 시키고 형광 표지 효율을 측정하였다.
3. 세포배양 및 고정
DNA-PAINT 이미징의 표류 보정을 위해 유리 커버 슬립을 카복시 라텍스 비즈로 코팅하였다.
커버 슬립을 비드 용액 1:10으로 증류수로 희석하고, 100℃의 핫 플레이트에서 10 분동안 가열한 후 증류수로 씻어준 다음, N 2 가스를 이용하여 건조시켰다. COS-7 세포를 비드로 코팅된 커버 슬립에서 성장시킨 다음 10분 동안 고정시켰다. 그 다음 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 이용하여 미세소관(microtubule)을 관찰하였고, 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 0.1% 글루타르알데히드를 PBS 버퍼에 용해시킨 혼합물을 사용하여 미세소관과 미토콘드리아를 관찰하였다. 그 다음 고정 샘플은 사용전까지 PBS 버퍼에 4℃에서 보관하였다.
4. 면역염색법
커버 슬립에서 세포를 배양하여 고정한 뒤, 미세소관을 차단 용액(PBS 버퍼에 5% BSA 및 0.25 % Triton X-100 함유)에 1:100으로 희석시킨 항-미세 소관 항체(anti-tubulin antibody)를 처리한 뒤. 4℃에서 밤새 배양한 다음. 면역염색을 실시하였다. PBS 버퍼로 자유 항-미세소관(free anti-tubulin)을 완전히 세척하였고, 세포에 도킹 스트랜드(Docking_P1)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다. 미토콘드리아는 1:100으로 희석된 항-Tom20 항체를 처리한 뒤, 4℃에서 밤새 배양한 다음 면역 염색을 실시하였다, 그 다음 PBS 버퍼로 자유 항-Tom20 항체(free anti-Tom20 antibody)를 세척하였고, 세포를 도킹 스트랜드(Docking_P2)가 접합된 100 nM 2차 항체를 처리하여 1 시간 동안 항온 배양하였다.
5. 단일-분자 이미징
단일-분자 이미징의 경우, 프리즘-형 TIRF(total internal reflection fluorescence) 현미경 검사법과 고도로 경사지고 적층 된 광학 시트 (HILO) 현미경 검사법을 사용하였다. 상기 현미경은 상업용의 거꾸로 된 현미경(IX71, Olympus)을 수정하고 100X1.4 NA 유면 대물 렌즈(UPlanSApo, Olympus)를 장착하여 제작하였다.
도 1의 데이터를 얻기 위하여, 스트랩타비딘(straptavidin)-비오틴(biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영 슬라이드(polymer-coated quartz slide) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시키고, 도너 및 억셉터 스트랜드를 이미징 채널에 첨가 하였다. Alexa488, Cy3 및 Cy5는 각각 청색 레이저(473nm, 100mW, MBL-III-473-100 mW, CNI), 녹색 레이저(532nm, 50mW, Compass 215M-50, Coherent) 및 적색 레이저 (642nm, 60mW, Excelsior-642-60, Spectra-Physics)를 사용하여 확인하였다. Cy3 신호는 640dcxr 다이크로익 미러(dichroic mirror; Chroma)를 사용하여 필터링하였고, Cy5 신호는 740dcxr 다이크로익 미러(Chroma)를 사용하여 필터링 하였다. 단일-분자 이미지는 EMCCD(electron multiplying charge coupled device) 카메라 (iXon Ultra DU-897U-CS0- # BV, Andor)를 사용하여 10Hz의 프레임 속도로 기록하였다.
6. FRET 페어 특성
도 1d에서 프레임 당 검출된 광자(photon)를 특징짓기 위하여, 2nt, 4nt, 6nt 및 11nt Cy3-Cy5(Alexa488-Cy5) FRET 페어에 대하여 각각 13997(8096), 11021(5100), 11208(3451), 및 17051(3980) 단일-분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다. 도 1j- 1k에서 SNR을 특징짓기 위하여, Cy3, Cy3-Cy5 페어 및 Alexa 488-Cy5 페어는 각각 795, 2322 및 742단일-분자 스팟(single-molecule spot)을 수득하였다
7. 드리프트 보정(Drift correction)
DNA-PAINT를 이용한 초 고해상도 이미징을 위해 우리는 이미지 상관법을 기반으로 하는 자동 집계 및 드리프트 보정 시스템을 사용하였다. 촬영 전, 하나의 in-focus 밝은 필드 이미지 및 두 개의 out-of-focus 이미지를 촬영하였다. 이 세 개의 참조 이미지는 x, y 및 z 축 드리프트를 추적하는 데 사용되었다. 피에조 스테이지(piezo stage; PZ-2000, Applied Scientific Instrumentation)를 사용하여 z 방향의 드리프트를 실시간으로 보정한 반면, xy 평면의 드리프트는 이미지 분석하는 동안에 보정하였다.
실시예 1: FRET-PAINT 특성 확인
표면에 고정된 DNA 스트랜드 및 TIRF 현미경을 사용하여 FRET-PAINT가 현미경으로 검사가 가능한지 여부를 확인하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, FRET-PAINT는 3개의 DNA 스트랜드(도킹 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드)를 사용하였다. 도킹 스트랜드(Docking_P0)에는 5‘말단에 바이오틴(biotin)이 붙어있고, 각각 도너 스트랜드 또는 억셉터 스트랜드인 두 개의 도킹 사이트가 있다. 본 발명에서는 도너 스트랜드에 대한 도킹 스트랜드의 결합시 FRET 확률을 증가시키기 위해, 상대적으로 긴 억셉터 스트랜드를 사용한 반면, 억셉터 스트랜드보다 짧은 길이의 도너 스트랜드를 선택하였다. 또한, 도너 스트랜드는 3' 말단에 Alexa488(Donor_P1_Alexa488)을 표지한 반면, 억셉터 스트랜드는 3' 말단에 Cy5(Acceptor_P11_Cy5)로 표지하였다.
각 스트랜드의 염기서열은 다음과 같다.
Docking_P0 = 5’-Biotin-TTGATCTACATATTCTTCATTA-3’(서열번호 1)
Donor_P1_Cy3 = 5’-TAATGAAGA-Cy3-3’(서열번호 2)
Donor_P1_Alexa488 = 5’-TAATGAAGA-Alexa488-3’(서열번호 2)
Acceptor_P2_Cy5 = 5’-Cy5-TATGTAGATC-3’(서열번호 3)
Acceptor_P6_Cy5 = 5’-TATG-Cy5-TAGATC-3’ (서열번호 3)
Acceptor_P11_Cy5 = 5’-TATGTAGATC-Cy5-3’(서열번호 3)
그 다음, 스트렙타비딘-바이오틴(streptavidin - biotin) 상호작용을 이용하여 중합체-코팅된 석영(quartz) 표면에 도킹 스트랜드를 고정시켰다(도 1b). 그 다음 도너 스트랜드(1000 nM) 및 억셉터 스트랜드(100 nM)를 주입 한 후, 블루 레이저를 사용하여 반응시킨 Alexa488에 의해 Cy5의 단일 분자 이미지를 촬영하였다.
그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 높은 도너 및 억셉터 농도에서 시간에 따른 Cy5 형광 강도가 명확하게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 2개의 FRET 페어(Cy3-Cy5 및 Alexa488-Cy5)에 대하여 최대의 FRET 신호를 주는 FRET 프로브의 위치를 찾기 위하여, Cy3 (Donor_P1_Cy3)가 3’말단에 표지된 억셉터 스트랜드, Alex488 (Donor_P1_Alexa488)이 3 '말단에 표지된 억셉터 스트랜드 및 다양한 위치에 Cy5가 표지된 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5, P4_Cy5, P6_Cy5 및 P11_Cy5)로 상기와 동일한 방법의 실험을 실시하였다.
그 결과 도 1d에 나타난 바와 같이, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 2nt 일 때, Alexa488-Cy5 FRET 페어가 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 반면, Cy3-Cy5 FRET 페어는 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드의 갭이 6 nt 일 때 가장 높은 Cy5 신호를 나타내는 것을 확인하였다.
그 다음, HILO(Highly Inclined and Laminated Optical sheet) 현미경을 사용하여 초고해상도 형광 이미징을 측정하였고, 다양한 DNA 농도에서 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 신호에 대한 노이즈 비율(signal-to-noise ratio, SNR)을 비교하였다.
그 결과 도 1e 내지 i에 나타난 바와 같이, DNA-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 5nM 이상일 때 단일-분자 이미지에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1e). 반면, Cy3-Cy5 페어 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 100nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였고(도 1f, 도 1g), Alexa488-Cy5 페어 FRET-PAINT의 경우에는 DNA 농도가 150nM 이상인 경우에 노이즈가 생기는 것을 확인하였다(도 1h, 도 1i).
이에 DNA-PAINT에 비해 FRET-PAINT의 경우 더 높은 이미저 농도에서 동일한 SNR을 얻을 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 예를 들어, 도 1j 및 1k에 나타난 바와 같이, 3.3 SNR을 얻기 위해, DNA-PAINT의 경우는 5nM 이미저 농도를 사용하였으며, 동일한 SNR을 얻기 위해, Cy3-Cy5 페어 FRET-PAINT의 경우는 180nM 도너 및 120nM 억셉터 농도를 사용하였고, Alexa488-Cy5 페어 FRET-PAINT의 경우에는 250nM 도너 및 90nM 억셉터 농도를 사용하였다.
실시예 2: DNA-PAINT 및 FRET-PAINT 초고해상도 이미지 확인
기존의 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 초고해상도 이미징 속도를 비교하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다
먼저 상기 기재된 실험방법에 따라, COS-7 세포의 미세소관을 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체를 사용하여 면역 염색하였다.
그 다음 DNA-PAINT의 경우, 1nM Cy5-표지된 이미저 스트랜드(imager strand; (Acceptor_P2’_Cy5)를 주입한 후, 미세소관을 이미지화 하였다. 또한, FRET-PAINT의 경우, 30nM 도너 스트랜드(Donor_P1_Alexa488) 및 20 nM 억셉터 스트랜드(Acceptor_P2_Cy5)를 주입한 후, 동일한 부위의 미세소관을 이미지화하였다. 단일-분자 이미지는 도너 및 억셉터 스트랜드의 결합을 감지할 수 있는 속도인 10Hz 프레임 속도로 기록하였다.
또한, DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 정량적으로 비교하기 위하여, 도 2a 및 b에서 스폿 수를 측정하였고, 9개의 부위에서 동일하게 측정하여 평균적인 속도를 비교하였다. 또한 다음의 식을 이용하여, 컨볼루션된 해상도(convolved resolutions)를 정량화하여 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교하였다. DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 국소화 정밀도는 각각 6.9 nm와 11.1 nm이다.
식: ((국소화 정확도(localization precision))2 + (나이퀴스트 해상도(Nyquist resolution))2)1/2
그 결과를 도 2a 내지 도 2e에 나타내었다.
DNA-PAINT는 10Hz의 속도로 총 18000개의 프레임이 기록되어 총 30분 동안 촬영한 반면(도 2a), FRET-PAINT는 10Hz의 속도로 총 600개의 프레임이 기록되어 총 60초 동안 촬영한 것으로 나타났다(도 2b). 또한 DNA-PAINT에 비하여 FRET-PAINT의 이미징 속도가 29배 증가하는 것으로 나타났고(도 2c), 각기 다른 부위에 대하여 측정한 평균 값으로도 이미징 속도가 32배 증가하는 것으로 나타났다(도 2d). 또한 상기 컨볼루션 해상도로 DNA-PAINT와 FRET-PAINT의 이미징 속도를 비교한 결과, FRET-PAINT의 이미징 속도가 36배 증가하는 것을 확인하였다(도 2e).
실시예 3: FRET-PAINT 다중화된 이미지(Multiplexed imaging)
FRET-PAINT 현미경의 다중화 능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
COS-7 세포의 미세소관과 미토콘드리아를 각각 Docking_P1이 결합되어 있는 항-튜블린(anti-tubulin) 항체 및 Docking_P2가 결합되어 있는 항-Th20(anti-Th20) 항체를 사용하여 면역 염색하였다. 본 발명에서는 두 가지 접근법을 사용하여 다중화된 이미지를 획득하였다.
그 결과를 도 3a 내지 도 3h에 나타내었다. 도 3a에 따른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 순차적으로 처리하는 방법)에 따라 20nM Donor_P1_Alexa488과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미세소관을 관찰하였고(도 3b), 10nM Donor_P2_Alexa499과 10nM Acceptor_P2_Cy5를 주입하여 미토콘드리아를 관찰하였다(도 3c 및 도 3d). 또한, 도 3e에 따른 또 다른 접근법(도너 및 억셉터 스트랜드 동시에 처리하는 방법)은 미세소관에 10nM Donor_P1_Cy3를 주입하고, 미토콘드리아에 20nM Donor_P2_Alexa488을 주입하였고, 10nM Acceptor_P2’_Cy5를 주입하는 방법으로 모든 DNA 프로브롤 동시에 주입한 다음, Cy3 여기(excitation)와 함께 처음으로 미세소관을 관찰(도 3f)한 다음, Allexa488 여기로 미토콘드리아를 관찰(도 3g 및 도 3h)하였다.
이를 통해, 두 가지 접근법은 이미징 시간에서 차이가 없었으나, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 동시에 처리하는 경우에는 미세소관과 미토콘드리아 이미지 사이에 혼선이 발생하는 것을 확인하였고, 이에, 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 순차적으로 처리하는 경우가 다중화 이미징에 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
실시예 4: 넓은 농도 범위의 바이오마커 측정
넓은 농도 범위의 바이오마커 측정능력을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
10, 40, 100, 400, 1000, 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 서로 다른 챔버에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점(개별 바이오마커 분자)의 수를 측정하였다(도 4a). 농도에 비례하여 화면에 나타나는 점의 수가 늘어남을 확인할 수 있고, 1000 pg/ml 이상의 농도에서는 점이 겹치기 시작해 정확한 수를 셀 수 없음을 확인하였다.
1000과 10000 pg/ml 농도의 바이오마커를 각각 1/10과 1/100로 희석하여 서로 다른 챔버에 고정하고 도너 스트랜드와 억셉터 스트랜드를 이용해 화면에 나타난 점의 수를 측정하였다(도 4b).
각 농도에서 센 점의 개수를 그래프로 나타내었다(도 4c). 1000 pg/ml 자료는 1/10로 희석해 센 점의 수에 10을 곱하여 얻었고, 10000 pg/ml는 1/100로 희석해 센 점의 수에 100을 곱하여 얻었다. 측정 결과를 선형으로 피팅하였을 때 상관 계수가 0.99997로 계산되었고 이로부터 고농도의 바이오마커를 희석 후 측정해도 정확한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 방법은 기존의 방식에 비해 1000배 더 높은 민감도로 다양한 바이오마커를 극소량의 생체액으로부터 검출할 수 있기 때문에, 기존 바이오마커 진단의 문제점을 해결하여 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (30)

  1. a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 바이오마커를 기판의 표면에 부착하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 바이오마커에 도킹 스트랜드(docking strand)가 부착된 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출항체를 각각 결합시키는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 도킹 스트랜드에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 또는 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
    기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 c) 및 d) 단계를 검출하고자 하는 바이오마커 종류 개수만큼 반복하여 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이미저 스트랜드는 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 도너 스트랜드는 상기 억셉터 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지고, 상기 억셉터 스트랜드는 동일한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 억셉터 스트랜드는 상기 도너 스트랜드의 염기서열과 상이하며, 검출하는 바이오마커 종류에 따라 각각 서로 다른 염기서열을 가지고, 상기 도너 스트랜드는 동일한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 도킹 스트랜드의 염기서열은 상기 이미저 스트랜드의 염기서열과 상보적이거나 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드 모두에 대해 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 침, 조직액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 시료는 바이오마커가 포함되어 있지 않은 용액으로 희석된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커 다중 검출 방법은 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 검출항체는 scFv, Fab, 나노바디(nanobody) 및 면역글로불린 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 검출항체는 1차 항체이며, 도킹 스트랜드가 1차 항체에 부착된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 검출항체는 1차 항체 및 2차 항체의 조합이며, 도킹 스트랜드가 2차 항체에 부착된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 형광분자는 Alexa Fluor, Atto, BODIPY, CF, Cy, DyLight Fluor로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 도너 스트랜드(donor strand)에 결합되어 있는 형광분자의 발광스펙트럼 최대값의 파장이 상기 억셉터 스트랜드(acceptor strand)에 결합되어 있는 형광분자의 흡광스펙트럼 최대값의 파장보다 짧은 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계에서 형광신호는 도킹 스트랜드에 이미저 스트랜드가 결합하거나 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드가 동시에 결합한 경우에 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커는 단백질 또는 대사물질인 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  17. a) 도킹 스트랜드가 결합된 1종 이상의 검출항체,
    b) 형광분자가 결합된
    i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
    ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
    를 포함하며,
    바이오마커에 상기 도킹 스트랜드가 부착된 검출항체를 결합시키고, 상기 도킹 스트랜드를 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 키트는
    i) 기판,
    ii) 포획항체,
    iii) 도킹 스트랜드가 결합된 1차 검출항체; 또는 도킹 스트랜드가 결합되지 않은 1차 검출항체 및 도킹 스트랜드가 결합된 2차 검출항체,
    iv) 형광분자가 결합된 이미저 스트랜드; 또는 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  19. 제17항에 있어서, 상기 도킹 스트랜드, 상기 이미저 스트랜드, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  20. 제18항에 있어서, 상기 기판은 시료에 포함되어 있는 바이오마커가 직접 기판의 표면에 부착되거나 바이오마커를 포획할 수 있는 포획항체를 부착할 수 있도록 표면처리된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 기판은 포획항체가 미리 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  22. 제18항에 있어서, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 커버슬립, 석영 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  23. a) 개체에서 취득한 시료에 포함되어 있는 1종 이상의 RNA를 기판의 표면에 부착하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 RNA에 형광분자가 결합되어 있는 이미저 스트랜드(imager strand)를 단독으로 결합시키거나 도너 스트랜드(donor strand) 및 억셉터 스트랜드(acceptor strand)를 함께 결합시키는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 발생하는 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하며,
    기결합된 상기 이미저 스트랜드; 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드;를 제거하고, 상이한 이미저 스트랜드 또는 상이한 조합의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 결합시켜 상기 b) 및 c) 단계를 검출하고자 하는 마이크로 RNA 종류 개수만큼 반복하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 a) 단계에서 시료는 RNA가 포함되어 있지 않은 용액으로 희석된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 바이오마커 다중 검출 방법은 서로 다른 비율로 희석된 동일한 시료에 대해서 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출 방법.
  26. a) 형광분자가 결합된
    i) 1종 이상의 이미저 스트랜드; 또는
    ii) 1종 이상의 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드
    를 포함하며,
    RNA에 상기 이미저 스트랜드 또는 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드의 결합에 따른 신호를 검출하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 키트는 기판, 포획프로브, 형광분자가 결합된 이미저 스트랜드, 도너 스트랜드 및 억셉터 스트랜드를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 포획프로브, 상기 이미저 스트랜드, 상기 도너 스트랜드 및 상기 억셉터 스트랜드는 DNA, RNA, PNA, LNA로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  29. 제27항에 있어서, 상기 기판은 포획프로브가 미리 부착되어 있거나 포획프로브를 부착할 수 있도록 표면처리된 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
  30. 제27항에 있어서, 상기 기판은 슬라이드 유리, 커버슬립, 석영, 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 다중 검출용 키트.
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