WO2017150890A1 - 3차원 액체 경로를 갖는 검출 키트 - Google Patents

3차원 액체 경로를 갖는 검출 키트 Download PDF

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WO2017150890A1
WO2017150890A1 PCT/KR2017/002206 KR2017002206W WO2017150890A1 WO 2017150890 A1 WO2017150890 A1 WO 2017150890A1 KR 2017002206 W KR2017002206 W KR 2017002206W WO 2017150890 A1 WO2017150890 A1 WO 2017150890A1
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flow path
reagent solution
path forming
detection kit
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PCT/KR2017/002206
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권요셉
최종순
한귀남
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한국기초과학지원연구원
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a detection kit having a three-dimensional liquid path, and more particularly, to increase the sensitivity of detecting a detection target through a reagent that amplifies a signal, and to perform the detection in one sliding operation. It relates to a detection kit having a.
  • POC Point of Care
  • LFA Lateral Flow Assay
  • PADs with different geometry geometries have been developed to maintain fluid simplicity as well as to control fluid flow.
  • the three-dimensional extension of the one-dimensional lateral flow may enable flow control of the fluid in the three-dimensional fluid network by stacking papers containing hydrophilic and hydrophobic channels.
  • stacking papers containing hydrophilic and hydrophobic channels it is extremely important to develop fluid arrivals at a time, only one at a time, for analysis in one pass, so that an ideal POC device for an inexperienced end user is in place. Trying hard.
  • Norovirus is currently an extremely infectious pathogen that is considered the major cause of non-bacterial pandemic of gastroenteritis worldwide. According to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), approximately 19 million to 20 million infections occur, and 56000 to 71000 hospitalizations and 570 to 800 deaths each year. Noroviruses can be spread by ingesting contaminated food or water, contact between individuals and individuals, or by contacting viruses or objects or surfaces contaminated with the virus. Unfortunately, there are currently no vaccines or antiviral drugs to combat norovirus infection. For this reason, rapid and sensory detection of norovirus for public health care in both developed and developing countries is essential to prevent or reduce the occurrence of norovirus. To date, several methods are possible for human norovirus detection.
  • RT-PCR Real-Time reverse transcription Polymerase Chain Reaction
  • LFA is a possible method that is decent due to its rapid, inexpensive and simple advantages in POC devices for detecting noroviruses, but has the problem of insufficient sensitivity mentioned above.
  • the inventors of the present invention have studied hydrophobic wax-patterned layers while investigating a device for amplifying a signal in which a plurality of solutions can be sequentially reached without a peripheral device in a single operation.
  • a detection kit having a 3D liquid path formed by stacking with to complete the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a detection kit in which a plurality of solutions can be sequentially reached and the sensitivity of the detection signal is improved.
  • At least one sample solution inlet for injecting a sample solution And at least one reagent solution inlet for injecting reagent solution; And a diagnostic unit provided with a detection window;
  • a converging part in contact with and partially in contact with the sample solution absorbing part; And a lower flow path forming layer including a reagent solution diffusion part in contact with and in contact with the reagent solution absorbing part to diffuse the reagent solution.
  • a detection unit including a detection passage located in correspondence with the detection window and in communication with the converging unit.
  • the diagnosis part is fastened and fixed on the lower case, and the injection part to which the upper flow path forming part is fastened is opened or closed by sliding on the lower case, and in the open state, the upper flow path forming part and the lower flow path are formed.
  • the unit provides a detection kit characterized in that it is not in communication.
  • step 1 Leaving the injection part of the detection kit open by sliding and injecting a sample solution and a reagent solution into the sample solution inlet and the reagent solution inlet of the detection kit, respectively (step 1);
  • It provides a detection method comprising the step (step 3) of confirming the change of the detection window of the detection kit.
  • the detection kit according to the present invention is fast, inexpensive, and has a merit that a plurality of solutions can be sequentially reached without peripheral equipment in one operation, and has an effect of improving detection sensitivity by signal amplification.
  • FIGS. 1A, 1B, and 1C are schematic diagrams showing an example of a detection kit according to the present invention.
  • FIGS. 2 to 9 are schematic diagrams showing an example of an upper flow path forming unit, a detection unit, and a lower flow path forming unit of the detection kit according to the present invention
  • Example 10 is a photograph showing a diffusion state after injecting yellow and red dyes in Example 1 according to the present invention.
  • Example 11 is a photograph showing a diffusion state after injecting distilled water into Example 2 according to the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the detection intensity according to the mouse IgG pathogen concentration and the presence of a signal enhancer of Examples 3a and 3b according to the present invention
  • FIG. 14A is a schematic diagram showing an example of the signal enhancement mechanism of Embodiment 3A according to the present invention.
  • Figure 14b is a photograph showing the detection results according to the presence or absence of a signal enhancer in the sample solution containing 500 ng / mL mouse IgG concentration in Examples 3a and 3b according to the present invention
  • 16 is a graph showing the detection intensity according to the Norovirus GII.4 replication number and the presence of a signal enhancer of Examples 4a and 4b according to the present invention
  • Example 17 is a graph showing the detection results according to the norovirus GII.4 replication number log value and the intensity log value of Example 4a according to the present invention.
  • Example 18 is a graph showing a signal enhancement ratio with time compared to Example 4b of Example 4a according to the present invention.
  • FIG. 19 is a schematic view showing an example of two upper flow path forming layers, a first lower flow path forming layer, and two second lower flow path forming layers in Examples 4a and 4b according to the present invention.
  • FIG. 19 is a schematic view showing an example of two upper flow path forming layers, a first lower flow path forming layer, and two second lower flow path forming layers in Examples 4a and 4b according to the present invention.
  • the present invention is a.
  • a sample solution absorbing part 11 coupled to a lower portion of the injection part and corresponding to the sample solution injection hole;
  • a detection unit 40 corresponding to the detection window 55 and including a detection passage 42 communicating with the convergence unit 21.
  • the diagnosis part 52 is fastened and fixed on the lower case 60, and the injection part 51 to which the upper flow path forming part 70 is fastened is opened by sliding on the lower case 60. Or in the closed state, and in the open state, the upper flow path forming unit 70 and the lower flow path forming unit 80 provides a detection kit 100, characterized in that not in communication.
  • LFA Paper-based Lateral Flow Assay
  • POC point of care
  • sensing signals nanoparticles, carbon nanotubes, quantum dots, fluorescent dyes, etc.
  • amplification means enzyme reactions and metal precipitations
  • they may not be sufficient to increase the sensitivity and require multiple amplification steps (continuous reagent addition or washing) for visual or electrochemical detection.
  • Detection kit 100 is fast, inexpensive in the POC device, a plurality of solutions can be sequentially reached without peripheral equipment in one operation to meet the device for amplifying the signal, hydrophobic wax- It is a detection kit having a 3D liquid path formed by stacking in a patterned layer.
  • the lower channel forming layer 20 may be a first lower channel forming layer 20, and the lower channel forming unit 80 may be the first lower channel forming layer 20.
  • a second lower flow path forming layer 30 and 30a which is disposed at a lower portion, and has a lower flow path 31 through which the reagent solution flows from the reagent solution diffusion part 22 and converges to the converging part 21; ) May further include.
  • the detector 40 may further include an absorber 43 provided at one end of the detection passage 42.
  • the injection unit 51 may be provided with at least one or more sample solution inlets 53 for injecting at least one or more sample solutions.
  • the upper case 60 may be provided with at least one reagent solution inlet 54 for injecting at least one reagent solution.
  • the diagnosis unit 52 may be provided with at least one or more to confirm the detection results described below.
  • the upper case 50 may include the injection unit 51 and the diagnosis unit 52, and close the upper portion of the detection kit 100.
  • the lower case 60 may be fastened to correspond to the upper case 50, and a stacked layer forming a three-dimensional flow path between the upper case and the lower case. And layers indicating the detection result.
  • the upper flow path forming part 70 is fastened to the lower portion of the injection part 51, and the sample solution absorbing part 11 corresponding to the sample solution injection port 53 and At least one or more upper flow path forming layers 10 forming the reagent solution absorbing part 12 corresponding to the reagent solution inlet 54 may be stacked.
  • FIGS. 6 to 9 illustrate an example of an upper flow path forming unit in which only one layer of the upper flow path forming layer 10 is stacked, and an example of an upper flow path forming unit in which the upper flow path forming layer is stacked in two layers is illustrated in FIGS. 6 to 9. Shown.
  • an upper flow path forming layer 10a for extending or further adding the sample solution absorbing part 11 and the reagent solution absorbing part 12 or changing the geometry of the upper flow path forming part 70 may be further included. , Do not limit it.
  • the lower flow path forming part 80 is located below the upper flow path forming part, and the converging part 21 is in contact with and communicates with the sample solution absorbing part 11.
  • a first lower flow path forming layer 20 including a reagent solution diffuser 22 in which a part of the reagent solution absorber 12 is in contact with and in communication with the reagent solution absorber 12.
  • the lower flow path forming part 80 may include a second lower flow path forming layer 30 positioned below the first lower flow path forming layer 20, and the lower flow path forming layer may be stacked with at least one layer.
  • the lower flow path 31 that flows from the reagent solution diffusion part 22 and converges to the convergence part 21 may be formed.
  • FIGS. 6 to 9 illustrate an example of the lower flow path forming part 80 in which only one layer of the second lower flow path forming layer 30 is stacked, and the lower flow path forming part in which the second lower flow path forming layer is stacked in two layers.
  • An example is shown in FIGS. 6 to 9.
  • the second lower flow path forming layer 30a may be further included, but not limited thereto, to extend or further add the lower flow path 31 in the lower flow path forming part 80, or to change the geometry.
  • the reagent solution inlet 54 may include reagent inlets as many as the number of reagent solutions, and the lower channel forming unit 80 may further include a third lower channel formed by stacking another lower channel (not shown).
  • the forming layer (not shown) may further include as many reagent solutions.
  • the detection unit 40 is located in correspondence with the detection window 55 of the diagnosis unit 52 and the detection passage 42 in communication with the converging unit 21 and One end of the detection flow path includes an absorbing portion 43 for absorbing the solution passing through the detection flow path.
  • the detection passage may further include a storage unit 41 storing the first reactant, a reaction unit 44 on which the second reactant is fixed, and a control unit (not shown) for comparing the detection result.
  • FIG. 2 illustrates an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to one sample solution inlet 53 and one reagent solution inlet 54.
  • An upper flow path forming layer 10 in which one layer is stacked and one sample solution absorbing part 11 and one reagent solution absorbing part 12 are formed, one converging part 21 and one reagent solution diffusing part.
  • FIG. 3 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to two sample solution inlets 53 and one reagent solution inlet 54 is illustrated.
  • 2nd lower flow path formation layer which has the 1st lower flow path formation layer 20 provided with), the absorption part provided with two detection flow paths 42, and one lower flow path 31 with which one layer was laminated
  • An example of (30) is shown.
  • FIG. 4 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to one sample solution inlet 53 and two reagent solution inlets 54 is illustrated.
  • 2nd lower flow path formation layer which has the 1st lower flow path formation layer 20 provided with), the absorption part provided with 1 detection flow path 42, and the 2nd lower flow path 31 which laminated one layer and converged a part.
  • An example of (30) is shown.
  • FIG. 5 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to two sample solution inlets 53 and two reagent solution inlets 54 is illustrated.
  • the second lower flow path forming layer 30 having the first lower flow path forming layer 20, the absorbing part having the two detection flow paths 42, and one layer being stacked and having two lower flow paths 31. An example is shown.
  • FIG. 6 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to one sample solution inlet 53 and one reagent solution inlet 54 is illustrated.
  • the second lower flow path forming layer 30 having the first lower flow path forming layer 20, the absorbing part having one detection flow path 42, and the two layers being stacked and having one lower flow path 31. An example is shown.
  • FIG. 7 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to two sample solution inlets 53 and one reagent solution inlet 54 is illustrated.
  • An example of (30) is shown.
  • FIG. 8 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to one sample solution inlet 53 and two reagent solution inlets 54 is illustrated.
  • An example of (30) is shown.
  • FIG. 9 an example of an upper flow path forming unit 70, a lower flow path forming unit 80, and a detection unit 40 corresponding to two sample solution inlets 53 and two reagent solution inlets 54 is illustrated.
  • Upper layer forming layer 10 two converging portions 21, and two reagent solution diffusion portions 22 in which two layers are stacked and two sample solution absorbing portions 11 and two reagent solution absorbing portions 12 are formed.
  • the second lower flow path forming layer 30 having the first lower flow path forming layer 20, the absorbing part having the two detection flow paths 42, and the two layers being stacked and having the two lower flow paths 31. An example is shown.
  • the injection part 51 to which the upper flow path forming part 70 is fastened is opened or closed by sliding on the lower case 60, and is opened. In the state, the upper flow path forming part 70 and the lower flow path forming part 80 do not communicate.
  • the sample solution inlet 53, the sample solution absorbing part 11, and the converging part 21 may be in communication with each other, and the reagent solution inlet ( 54), the reagent solution absorbing unit 12, the reagent solution diffusion unit 22, the lower passage 31, and the converging unit 21 may be in communication with each other.
  • the sample solution inlet 53 and the sample solution absorbing part 11 communicate with each other, and the reagent solution inlet 54 and the reagent solution absorbing part 12 are Although in communication with each other, the sample solution absorbing part 11 and the converging part 21 may be spaced apart from each other, and the reagent solution absorbing part 12 and the reagent solution diffusing part 22 may be spaced apart from each other. have.
  • the sample kit and the reagent solution are respectively injected into the sample solution inlet 53 and the reagent solution inlet 54 while the detection kit 100 is in the open state, the respective solutions do not flow toward the converging part.
  • the sample solution may be stored in the sample solution absorbing unit 11, and the reagent solution may be stored in the reagent solution absorbing unit 12.
  • the detection kit when the detection kit is operated and left in the closed state by sliding, the sample solution stored in the sample solution absorbing part may flow toward the converging part, and the reagent solution stored in the reagent solution absorbing part is the reagent. It may flow through the solution diffusion to the converging portion or may further pass through the lower flow path toward the converging portion.
  • the detection kit 100 may further include another sample solution inlet, a sample solution absorbing part and a converging part in which different sample solutions are stored or flowed, and another reagent solution inlet for storing or flowing different reagent solutions.
  • a reagent solution absorbing part, a reagent solution diffusion part, and a lower flow path may be further provided. At this time, the detection flow path may be further added in the same manner as the sample solution.
  • the respective sample solution is injected into each sample solution inlet, and then the detection kit is closed and the flow of the solution is started.
  • the detection result may appear toward the flow path.
  • each reagent solution is injected into each reagent solution inlet, and then the detection kit is closed and the flow of the solution begins. It may be directed to different convergence and detection flow paths, and to the same convergence and detection flow paths.
  • the formation layer 30 may be formed of a material that can penetrate the liquid, wherein the at least one upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, and the at least one second lower flow path forming layer 30 are formed. Hydrophobic wax is applied to the areas except for the reagent solution absorbing part 11, the sample solution absorbing part 12, the converging part 21, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 in Penetration may be impossible.
  • the material of the at least one upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, and the at least one second lower flow path forming layer 30 may include cellulose, nitrocellulose, and cellulose acetate. , Cellulose ester, cellulose / polyester, nylon, glass fiber, polyvinylidene fluoride (PVDF), polytetrafluoroethylene (PTFE), polypropylene (PP), polycarbonate ( PC), polyester (PE), polyamide (PA), and polysulfone (PS), but is not limited thereto as long as the material flows easily.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PP polypropylene
  • PC polycarbonate
  • PET polyester
  • PA polyamide
  • PS polysulfone
  • the material of the detection channel 42 is cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose ester, cellulose / polyester, nylon, glass fiber, polyvinyl Liden fluoride (PVDF), polytetrafluoroethylene (PTFE), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyester (PE), polyamide (PA) and polysulfone (PS), but liquid If the material is made of easy flow is not limited thereto.
  • PVDF polyvinyl Liden fluoride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PP polypropylene
  • PC polycarbonate
  • PET polyester
  • PA polyamide
  • PS polysulfone
  • the absorber 43 is made of cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose ester, cellulose / polyester, nylon, glass fiber, polyvinyl. Liden fluoride (PVDF), polytetrafluoroethylene (PTFE), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyester (PE), polyamide (PA) and polysulfone (PS), but liquid If the material is made of easy flow is not limited thereto.
  • PVDF Liden fluoride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PP polypropylene
  • PC polycarbonate
  • PET polyester
  • PA polyamide
  • PS polysulfone
  • the storage unit 41 of the detection channel 42 includes a first reactant, and the first reactant is an antibody, peptide, At least one selected from the group consisting of proteins, DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNAs), and aptamers, and at least one selected from the group consisting of absorbers, fluorescent materials, luminescent materials, and electrochemical signal generators
  • the first reactant is an antibody, peptide, At least one selected from the group consisting of proteins, DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNAs), and aptamers, and at least one selected from the group consisting of absorbers, fluorescent materials, luminescent materials, and electrochemical signal generators
  • PNAs peptide nucleic acids
  • the material of the storage part 41 may be glass fiber, polyester, rayon-based membrane, etc., but is not limited thereto.
  • the light emitting material may include metal nanoparticles (colloids), dyes, enzymes, quantum dots, fluorescent dyes and microbeads, but is not limited thereto.
  • the electrochemical signal generators include enzymes, metal nanoparticles, quantum dots, Ferrocene, Ferrocene derivatives, Ferrocyanide ((Fe (CN) 6 ) 4- ), lutetium complexes ((Ru (bpy) 3 ) 2+ ), and the like. Can be used, but is not limited thereto.
  • the second reactant fixed to the reaction unit 44 of the detection channel 42 may be an antibody, peptide, protein, DNA, RNA, PNAs (peptide nucleic acids), aptamers (aptamers) and the like can be used, and preferably antibodies can be used, but are not limited thereto.
  • the sample solution may include or may not include a detection target to be detected.
  • the detection target may be isolated proteins, viruses, bacteria and isolated DNA, but is not limited thereto.
  • the reagent solution may include phosphate, PBS (Phosphate-buffered saline), Trisodium citrate, acetate, MES, HEPES, glycine buffer solution, but not limited thereto. It is not.
  • the detection kit 100 may have a long path by separating the respective paths through which the sample solution and the reagent solution flow, and relatively bypassing the path through which the reagent solution flows. Therefore, the sample solution that converges through the sample solution absorbing part 11 to the converging part 21 first reaches the detection flow path 42 of the detecting part, and then the reagent solution absorbing part 12 and the reagent solution diffusion part. The reagent solution converged to the converging portion 21 via the 22 and the lower flow passage 31 can reach the detection flow passage 42 of the detection portion.
  • the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 may further include a signal enhancer for increasing visibility of the first reactant.
  • the detection target included in the reagent solution flowing into the detection flow path 42 is fixed to the reaction part 44 together with the first reactant of the storage part 41. It can be captured by the second reactant and fixed to form a sandwich structure.
  • the reagent solution sequentially introduced after the sample solution including the detection target passes through the reagent solution absorbing unit 12, the reagent solution diffusion unit 22, and the lower flow path 31, and the reagent solution absorbing unit and the reagent solution.
  • the signal enhancer contained in the diffusion part and the lower flow path is dissolved by the reagent solution, and then the reagent solution in which the signal enhancer is dissolved is introduced into the reaction part of the detection flow path, thereby amplifying the visibility of the first reactant having the sandwich structure.
  • the antibody in which the gold nanoparticles that capture the virus flows in the storage unit 41 captures the virus and then flows through the reaction unit.
  • the virus captured by the antibody to which the gold nanoparticles are bound is again captured and fixed in the reaction part to form a sandwich structure.
  • the reagent solution in which the signal enhancer is sequentially introduced into the detection flow path is introduced into the reaction part in which the sandwich structure is formed, and the gold ions contained in the signal enhancer contain gold nanoparticles bound to the sandwich structured antibody. Due to this reduction, particles having a larger size are formed, whereby visibility can be amplified.
  • the signal enhancer may use metal ions, quantum dots, magnetic nanoparticles, enzyme substrates, tripropylamine (TPA), hydrogen peroxide (H 2 0 2 ), glucose (Glucose) and Ferrocyanide, and preferably metal ions. May be, but is not limited thereto.
  • the signal enhancer may be included in the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution spreading part 22, and the lower flow path 31 to dissolve and flow when the reagent solution diffuses, and the reagent solution absorbing part 12 may be used.
  • the signal enhancer may not be included in the reagent solution diffusion unit 22 and the lower passage 31. In this case, the signal enhancer may be dissolved in the reagent solution in advance and injected into the detection kit.
  • the signal enhancer is impregnated in the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 in advance, the structure of the detection kit is simplified, and thus the storage and transportation becomes easy.
  • the inconvenience of the user mixing and injecting each signal enhancer is eliminated, and thus can be utilized as a more user-friendly detection kit.
  • ELISA which is an immunoassay by antibody-enzyme binding reaction
  • indirect ELISA sandwich ELISA
  • competitive ELISA it is preferable to apply sandwich ELISA.
  • the specific antigen which is a target substance in blood or serum sample, with high sensitivity
  • reacting the sample to be analyzed on the partial surface on which the antibody that binds the antigen is immobilized causes the specific antigen of the antibody immobilized by the antigen-antibody reaction. Only combined.
  • another antibody secondary antibody
  • branch optical energy is generated.
  • the optical energy can be induced by luminescence and color development by the sandwich method as described above, and detected by an ultraviolet detector to detect the presence of antigen.
  • a fluorescent material may be applied by attaching a fluorescent material instead of the enzyme of the secondary antibody.
  • nanoparticles or quantum dots may be attached to the secondary antibody to enhance the sensitivity of the sensor.
  • an electrochemical method may be used. Electrodes are formed on the part to be detected and the electrical mediator is used to induce charges, and the movement of electrons is generated by the biochemical redox reaction occurring on the surface of the reaction part. Current or conductivity changes can occur and biochemical reactions can be measured as electrical signal changes.
  • the injection part 51 of the detection kit is left open by sliding, and the sample solution and the reagent solution are respectively placed in the sample solution inlet port 53 and the reagent solution inlet port 54 of the detection kit 100.
  • Injecting step 1;
  • step 3 Checking the change of the detection window 55 of the detection kit (step 3) provides a detection method comprising a.
  • FIG. 1A an example of a detection method according to the present invention is schematically shown in FIG. 1A through a schematic diagram.
  • step 1 leaves the injection unit 51 of the detection kit 100 in an open state by sliding, and the sample solution injection port 53 of the detection kit and Injecting the sample solution and the reagent solution to the reagent solution inlet 54, respectively.
  • the sample solution of step 1 may or may not include a detection target, and the detection target may be isolated proteins, viruses, bacteria, and separated DNA, but is not limited thereto.
  • the reagent solution of step 1 may be a buffer solution, but is not limited thereto.
  • step 1 the sample solution inlet 53 and the sample solution absorbing part 11 of the detection kit 100 communicate with each other, and the reagent solution inlet 54 and the reagent solution absorbing part 12 communicate with each other.
  • the sample solution absorbing part 11 and the converging part 21 may be spaced apart from each other, and the reagent solution absorbing part 12 and the reagent solution diffusion part 22 may be spaced apart from each other.
  • step 1 when the sample solution and the reagent solution are respectively injected into the sample solution inlet port 53 and the reagent solution inlet port 54 of the detection kit 100, the converging part Each solution does not flow toward the sample solution, the sample solution may be stored in the sample solution absorbing unit 11, and the reagent solution may be stored in the reagent solution absorbing unit 12.
  • step 2 is a step of leaving the injection part 51 in the closed state by sliding.
  • the sample solution stored in the sample solution absorbing part 11 may flow toward the converging part, and the reagent solution absorbing part 12
  • the reagent solution stored in may flow through the reagent solution diffusion part and the lower flow path toward the converging part.
  • the lower flow path may be excluded, in which case the reagent solution may flow directly from the diffusion portion toward the converging portion.
  • the sample solution and the reagent solution may simultaneously start the liquid flow toward the detection flow path 42 of the detection kit 100.
  • the sample solution may first reach the converging portion 21 due to a relatively short path leading to the sample solution absorbing portion 11 and the converging portion 21, and the reagent solution may be a reagent solution absorbing portion 12,
  • the relatively long path leading to the reagent solution diffusion part 22 and the lower flow path 31 may reach the convergence part later than the sample solution.
  • the lower flow path may be excluded.
  • the reagent solution passes through the reagent solution absorbing unit 12, reagent solution diffusion unit 22 and the lower flow path 31, the reagent solution absorbing unit 12, reagent solution diffusion unit 22 and the lower portion
  • the signal enhancer included in the flow path 31 may be dissolved, and the converging portion may be reached by including the dissolved signal enhancer.
  • step 3 is a step of confirming the change of the detection window 55 of the detection kit 100.
  • the sample solution that has reached the convergence part in step 2 may be captured and flow in the first reactant of the storage part 41 if it includes the detection target, and if the sample solution does not include the detection target, Can flow without reaction. If the sample solution includes a detection target, the capture agent flows while being captured by the first reactant in the reservoir, and is subsequently captured and fixed by the second reactant in the reaction unit 44. By dissolving the reagent solution, the visibility of the detection target fixed to the reaction part can be improved.
  • the color of the reaction unit in the detection channel 55 inside the detection channel changes, thereby making it possible to diagnose the detection target in the sample solution.
  • the upper flow path forming part 70 in which the upper flow path forming layer 10 forming the reagent solution absorbing part 12 corresponding to the reagent solution inlet is stacked in two layers is prepared.
  • a converging portion 21 in contact with and in contact with the sample solution absorbing portion 11; And a reagent solution diffusion part 22 in contact with and in contact with the reagent solution absorbing part 12 and to which the reagent solution is diffused.
  • a second lower flow path forming layer 30 positioned below the first lower flow path forming layer, and having a reagent solution flowing from the reagent solution diffusion part and converging to a converging part; A flow path forming portion 80 was prepared.
  • a detection passage 42 positioned corresponding to the detection window 55 and in communication with the converging portion 21; And a detector 40 including an absorbing portion 43 provided at one end of the detection passage.
  • the diagnosis part 52 is fastened and fixed on the lower case 60, and the injection part 51 to which the upper flow path forming part 70 is fastened is opened by sliding on the lower case 60. Or in the closed state, in the open state, the upper flow path forming portion 70 and the lower flow path forming portion 80 was provided with a detection kit 100, characterized in that the communication is not.
  • the upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, the second lower flow path forming layer 30, and the absorber 43 are made of cellulose, and the detection flow path 42 is made of nitrocellulose. .
  • the sample solution absorbing portion 11 the reagent solution absorbing portion 12, the converging portion 21, the reagent solution diffusion portion 22, the lower flow passage 31, the detection flow passage of each layer of the detection kit 100 Except for 42 and the absorbing portion 43, the hydrophobic wax was coated to prevent the penetration of liquid.
  • Example 2 A three-dimensional liquid path and a dye-impregnated detection kit
  • the upper flow path forming part 70 in which the upper flow path forming layer 10 forming the reagent solution absorbing part 12 corresponding to the reagent solution inlet is stacked in two layers is prepared.
  • a converging portion 21 in contact with and in contact with the sample solution absorbing portion 11; And a reagent solution diffusion part 22 in contact with and in contact with the reagent solution absorbing part 12 and to which the reagent solution is diffused.
  • a second lower flow path forming layer 30 positioned below the first lower flow path forming layer, and having a reagent solution flowing from the reagent solution diffusion part and converging to a converging part; A flow path forming portion 80 was prepared.
  • a detection passage 42 positioned corresponding to the detection window 55 and in communication with the converging portion 21; And a detector 40 including an absorbing portion 43 provided at one end of the detection passage.
  • Some layers of the reagent solution absorbing part 12 and some layers of the lower flow path 22 each contain blue and yellow dyes, and the diagnostic part 52 is fastened and fixed on the lower case 60.
  • the injection part 51 to which the upper flow path forming part 70 is fastened is opened or closed by sliding on the lower case 60, and in the open state, the upper flow path forming part 70 and the lower part.
  • the flow path forming portion 80 was provided with a detection kit 100 characterized in that it is not in communication.
  • the upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, the second lower flow path forming layer 30, and the absorber 43 are made of cellulose, and the detection flow path 42 is made of nitrocellulose. .
  • the sample solution absorbing portion 11 the reagent solution absorbing portion 12, the converging portion 21, the reagent solution diffusion portion 22, the lower flow passage 31, the detection flow passage of each layer of the detection kit 100 Except for 42 and the absorbing portion 43, the hydrophobic wax was coated to prevent the penetration of liquid.
  • the upper flow path forming part 70 in which the upper flow path forming layer 10 forming the reagent solution absorbing part 12 corresponding to the reagent solution inlet is stacked in two layers is prepared.
  • a converging portion 21 in contact with and in contact with the sample solution absorbing portion 11; And a reagent solution diffusion part 22 in contact with and in contact with the reagent solution absorbing part 12 and to which the reagent solution is diffused.
  • a second lower flow path forming layer 30 positioned below the first lower flow path forming layer, and having a reagent solution flowing from the reagent solution diffusion part and converging to a converging part; A flow path forming portion 80 was prepared.
  • a detection passage 42 positioned corresponding to the detection window 55 and in communication with the converging portion 21; And a detection unit 40 including an absorbing unit 43 provided at one end of the detection channel, wherein the detection channel is a storage unit 41 storing a mouse IgG antibody (chlorine) to which gold nanoparticles are bound.
  • the detection channel is a storage unit 41 storing a mouse IgG antibody (chlorine) to which gold nanoparticles are bound.
  • a reaction part 44 to which a mouse IgG antibody (goat) was immobilized and a control part (not shown) to which an anti-goat antibody (rabbit) was immobilized were prepared.
  • the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 include a signal enhancer including gold ions, and the diagnostic part 52 is disposed on the lower case 60. It is fastened and fixed to the injection portion 51 is fastened to the upper flow path forming portion 70 is opened or closed state by sliding on the lower case 60, the upper flow path is formed in the open state
  • the part 70 and the lower flow path forming part 80 were provided with the detection kit 100, which is not in communication with each other.
  • the upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, the second lower flow path forming layer 30, and the absorber 43 are made of cellulose, and the detection flow path 42 is made of nitrocellulose. .
  • the sample solution absorbing portion 11 the reagent solution absorbing portion 12, the converging portion 21, the reagent solution diffusion portion 22, the lower flow passage 31, the detection flow passage of each layer of the detection kit 100 Except for 42 and the absorbing portion 43, the hydrophobic wax was coated to prevent the penetration of liquid.
  • the detection kit 100 configured in the same manner as in Example 3a, except that the signal enhancer is not included in the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 of Example 3a. It was provided.
  • the upper flow path forming part 70 in which the upper flow path forming layer 10 forming the reagent solution absorbing part 12 corresponding to the reagent solution inlet is stacked in two layers is prepared.
  • a converging portion 21 in contact with and in contact with the sample solution absorbing portion 11; And a reagent solution diffusion part 22 in contact with and in contact with the reagent solution absorbing part 12 and to which the reagent solution is diffused.
  • a second lower flow path forming layer 30 positioned below the first lower flow path forming layer, and having a reagent solution flowing from the reagent solution diffusion part and converging to a converging part; A flow path forming portion 80 was prepared.
  • a detection passage 42 positioned corresponding to the detection window 55 and in communication with the converging portion 21; And a detection part 40 including an absorbing part 43 provided at one end of the detection flow path, wherein the detection flow path is a capsid protein VP1 antibody (rabbit) which is a norovirus GII.4 antibody to which gold nanoparticles are bound.
  • the detection flow path is a capsid protein VP1 antibody (rabbit) which is a norovirus GII.4 antibody to which gold nanoparticles are bound.
  • the storage unit 41, the reaction unit 44 to which the norovirus GII.4 antibody (rat) was fixed, and the control unit (not shown) to which the anti-rabbit antibody (chlorine) was fixed were prepared.
  • a part of the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22 and the lower flow path 31 includes a signal enhancer containing gold ions
  • the diagnostic part 52 includes a lower case 60 Is fastened and fixed on the upper part
  • the injection part 51 to which the upper flow path forming part 70 is fastened is opened or closed by sliding on the lower case 60, and in the open state
  • the flow path forming unit 70 and the lower flow path forming unit 80 were provided with a detection kit 100 characterized in that the communication is not in communication.
  • the upper flow path forming layer 10, the first lower flow path forming layer 20, the second lower flow path forming layer 30, and the absorber 43 are made of cellulose, and the detection flow path 42 is made of nitrocellulose. .
  • the sample solution absorbing portion 11 the reagent solution absorbing portion 12, the converging portion 21, the reagent solution diffusion portion 22, the lower flow passage 31, the detection flow passage of each layer of the detection kit 100 Except for 42 and the absorbing portion 43, the hydrophobic wax was coated to prevent the penetration of liquid.
  • the detection kit 100 configured in the same manner as in Example 4a except that the signal enhancer is not included in the reagent solution absorbing part 12, the reagent solution diffusion part 22, and the lower flow path 31 of Example 4a. It was provided.
  • the detection kit provided in Example 2 was left open, and distilled water was injected into each of the two inlets, and the detection kit was closed. As a result, distilled water injected into the sample solution inlet was first. After reaching the detection flow path, the distilled water injected into the reagent solution inlet was dissolved in the blue and yellow dyes impregnated in the reagent solution absorbing portion and the lower flow path.
  • mouse IgG pathogens In order to confirm the detection of mouse IgG pathogens of the detection kit according to the present invention, 0.1 ng / mL to 50 ⁇ g / mL of mouse IgG pathogens was injected into the sample solution inlet of each detection kit provided in Examples 3a and 3b. Injecting a solution containing, 200 ⁇ L of distilled water was injected into the reagent solution inlet to analyze the detection results, it is shown in Figure 12.
  • Example 3a impregnated with a signal enhancer was found to significantly improve the detection signal intensity by about three times, and it was confirmed that the detection sensitivity was improved up to 100 times at the same signal intensity.
  • Example 4a and Example 4b sample solution Norovirus GII.4 replication number 3.9510 7.9010 5 mL -1 to the inlet of a detection kit comprising in 7 mL - A solution containing about 1 was injected and 200 ⁇ L of distilled water was injected into the reagent solution inlet, and the detection result was analyzed.
  • Example 4a including the signal enhancer was confirmed that the detection intensity improved by about five times, and it was confirmed that the detection sensitivity of up to 100 times improved at the same intensity.
  • the norovirus minimum detection limit (LOD) of the detection kit of Example 4b was 1.5810 7 replications / mL
  • the norovirus minimum detection limit (LOD) of the detection kit of Example 4a was 9.510 4 replications / mL
  • the minimum limit of quantitation (LOQ) was found to be 6.310 5 replicates / mL.
  • Example 4a confirmed through FIG. 17 that the intensity increases with a linear ratio with a slope of 0.986 with respect to the log value of the norovirus replication number.
  • Example 4a confirmed through FIG. 18 that the detection signal enhancement ratio (Example 4a intensity / Example 4b intensity) increased with time.
  • the solution diffusion, mixing, mouse IgG pathogen detection, norovirus detection performance of the detection kit according to the present invention was confirmed, and the reagent solution containing the sample solution and the signal enhancer at a time difference through a plurality of 3D liquid paths was detected.
  • the reagent solution containing the sample solution and the signal enhancer at a time difference through a plurality of 3D liquid paths was detected.
  • the norovirus GII.4 detection limit of the detection kit according to the present invention was found to be 9.510 4 copies / mL, which has an improved limit than the detection limit of 10 7 copies / mL of the conventional LFA detection kit.
  • the detection kit according to the present invention is fast, inexpensive, and has the advantage that a plurality of solutions can be reached sequentially without peripheral equipment in one operation, and has an effect of improving detection sensitivity by signal amplification.
  • the detection kit according to the present invention is fast, inexpensive, and has the advantage that a plurality of solutions can be sequentially reached without peripheral equipment in one operation, and signal amplification improves detection sensitivity.

Abstract

본 발명은 3차원 액체 경로를 갖는 검출 키트에 관한 것으로, 상세하게는 신호를 증폭하는 시약을 통해 검출 타겟을 검출하는 민감도를 높이고, 슬라이딩(sliding) 동작 한 번에 검출이 진행되도록 3차원 액체 경로를 가지는 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출 키트는 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능한 장점이 있고, 신호 증폭으로 검출 민감도가 향상된 효과가 있다.

Description

3차원 액체 경로를 갖는 검출 키트
본 발명은 3차원 액체 경로를 갖는 검출 키트에 관한 것으로, 상세하게는 신호를 증폭하는 시약을 통해 검출 타겟을 검출하는 민감도를 높이고, 슬라이딩(sliding) 동작 한 번에 검출이 진행되도록 3차원 액체 경로를 가지는 검출 키트에 관한 것이다.
임상 분석, 식품 안전 및 환경 등을 비롯한 많은 분야에서 POC(Point of Care)에 대한 수요가 증가하고 있어, 세계 보건 기구 기준을 충족하는 검증된 바이오 센서를 개발하기 위한 많은 노력이 있어 왔다. 상기 POC에 대한 세계 보건 기구 기준은 가격이 저렴하고, 민감하고, 명확하고, 사용자 친화적이고, 신속하고, 튼튼하고, 장비 제약이 없고, 최종 사용자에게 전달 가능해야 한다.
최근, 종이 기반 분석 장비(PAD)는 싼 가격, 경량, 접근성 및 유체를 이동하기 위한 미세한 확산으로 인해 POC 적용에 큰 관심을 가져왔다. 특히, 종이 기반의 측방유동 분석(Lateral Flow Assay, LFA)은 가장 상업적으로 POC 장치에 이용 가능하고, 임신, 약물 남용, 임상 분석, 음식과 환경 등 다양한 분야에 범용적으로 사용된다. 상기 LFA는 저비용의 분석, 신속한 분석 시간, 간단한 조작, 외부 장비 불필요 및 대량 생산 등의 장점을 제공하며, 이는 검증된 기준과 밀접하게 부합한다. 다만, 비록 LFA가 POC에 가장 적합한 형태 일지라도, 감도 및 유체 유동의 제어에 한계가 존재한다.
상기 한계점을 극복하기 위하여, 현재 PAD에 대한 연구는 감지 신호의 향상 및 종이의 기하학적 구조를 변경하는 데 집중되고 있다(대한민국 등록특허 제10-1394221호). 예를 들어, 다양한 감지 라벨(나노 입자, 탄소 나노튜브, 양자점, 형광 염료 등) 및 증폭 수단(효소 반응 및 금속 석출)들이 감지 신호와 감도를 향상시키는 데 사용되고 있다. 하지만, 이들은 감도의 증가가 충분하지 못할 수 있고, 시각적 또는 전기화학적 검출을 위한 복수의 증폭 단계(연속적인 시약 첨가 또는 세척)가 필요하다.
이에, 다른 형태의 기하학적 구조를 갖는 PAD(3차원, 슬립 및 접힘 등)는 작동 간편성을 유지할 뿐만 아니라 유체의 유동을 제어하기 위해 개발되어 왔다.
한 예로, 1차원 측방 유동의 3차원 연장은 친수성 및 소수성 채널을 포함하는 종이들을 적층함으로써 3차원 유체 네트워크에서 유체의 유동 제어를 가능하게 할 수 있다. 다만, 이런 문제들을 해결하려는 노력에도 불구하고, 숙련되지 않은 최종 사용자를 위한 이상적인 POC 장치가 구비되도록, 단순히 한 번에 진행되는 분석을 위해, 한 번에 순차적으로 유체가 도달하도록 개발하기 위해 극도로 노력하고 있다.
현재 노로바이러스는 전 세계 위장염의 비세균성 유행성 발생의 주요 원인으로 간주되는 극도의 전염성 병원균이다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에 따르면, 대략 천 9백만 내지 2천 백만의 감염이 발생하고, 56000 내지 71000의 입원과 570 내지 800 명이 매년 사망하는 것으로 나타났다. 노로바이러스는 오염된 음식 또는 물의 섭취, 개인 대 개인의 접촉 및 바이러스로 오염된 물체 또는 표면을 접촉하여 전파될 수 있다. 불행히도, 현재 노로바이러스 감염 대처를 위한 백신 또는 항 바이러스 약물은 없다. 이런 이유로, 선진국과 개발 도상국 모두에서 공공 보건 의료를 위한 노로바이러스의 신속하고 감각적인 검출이 노로바이러스 발생을 막거나 감소시키는 데 필수적이다. 현재까지, 몇몇의 방법들이 인간의 노로바이러스 검출을 위해 가능하다. 예를 들어, 전자 현미경, 효소결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Aassay, ELISA), 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time reverse transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 및 면역 크로마토그래피 LFA법이 있다. 비록 상기 RT-PCR 법이 다른 방법들과 비교하여 고 감도로 가져, 노로바이러스를 검출하는 데 일반적으로 사용되고 있으나, 비싸고, 복잡한 장비 및 설정이 필요하며, 숙련된 사용자 및 많은 시간이 사용되는 준비 단계로 인해, POC 테스트의 사용에는 적합하지 않다.
반면 LFA는 노로바이러스를 검출하는 POC 장치에 있어 신속하고, 저렴하며 간단한 장점으로 괜찮은 가능성 있는 방법이나, 상기 언급한 불충분한 감도를 갖는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 POC 장치에 있어 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능하여 신호를 증폭하는 장치를 연구하던 중, 소수성의 왁스-패턴화된 층으로 적층되어 형성된 3D 액체 경로를 갖는 검출 키트를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능하고, 검출 신호의 감도가 향상된 검출 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
시료용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시료용액 주입구; 및 시약용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시약용액 주입구;가 구비된 주입부; 및 검출창이 구비된 진단부;를 포함하는 상부 케이스;
상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스;
상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부; 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부;를 형성하는 상부 유로 형성층이 적어도 1 층 이상 적층된 상부 유로 형성부;
상기 시료용액 흡수부와 일부가 접하며 연통된 수렴부; 및 상기 시약용액 흡수부와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부;를 포함하는 하부 유로 형성층;을 포함하는 하부 유로 형성부; 및
상기 검출창과 대응되어 위치하며 상기 수렴부와 연통된 검출 유로;를 포함하는 검출부;를 포함하고,
상기 진단부는 하부 케이스 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부가 체결된 주입부는 하부 케이스 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부와 하부 유로 형성부는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트를 제공한다.
또한 본 발명은
상기의 검출 키트의 주입부를 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 상태로 두고, 상기 검출 키트의 시료용액 주입구 및 시약용액 주입구에 각각 시료용액 및 시약용액을 주입하는 단계(단계 1);
상기 주입부를 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두는 단계(단계 2); 및
상기 검출 키트의 검출창의 변화를 확인하는 단계(단계 3);를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출 키트는 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능한 장점이 있고, 신호 증폭으로 검출 민감도가 향상된 효과가 있다.
도 1a, 1b, 및 1c는 본 발명에 따른 검출 키트의 일례를 나타낸 모식도이고,
도 2 내지 도 9는 본 발명에 따른 검출 키트의 상부 유로 형성부, 검출부 및 하부 유로 형성부의 일례를 나타낸 모식도이고,
도 10은 본 발명에 따른 실시예 1에 노란색, 빨간색 염료를 주입한 뒤 확산 상태를 나타낸 사진이고,
도 11은 본 발명에 따른 실시예 2에 증류수를 주입한 뒤 확산 상태를 나타낸 사진이고,
도 12는 본 발명에 따른 실시예 3a 및 실시예 3b의 mouse IgG 병원균 농도 및 신호 강화제 유무에 따른 검출 결과를 나타낸 사진이고,
도 13은 본 발명에 따른 실시예 3a 및 실시예 3b의 mouse IgG 병원균 농도 및 신호 강화제 유무에 따른 검출 강도를 나타낸 그래프이고,
도 14a는 본 발명에 따른 실시예 3a의 신호 강화 메커니즘의 일례를 나타낸 개략도이고,
도 14b는 본 발명에 따른 실시예 3a 및 실시예 3b에서, 500 ng/mL 농도의 mouse IgG를 포함하는 시료용액의 신호 강화제 유무에 따른 검출 결과를 나타낸 사진이고,
도 15는 본 발명에 따른 실시예 4a 및 실시예 4b의 노로바이러스 GII.4 복제 수 및 신호 강화제 유무에 따른 검출 결과를 나타낸 사진이고,
도 16은 본 발명에 따른 실시예 4a 및 실시예 4b의 노로바이러스 GII.4 복제 수 및 신호 강화제 유무에 따른 검출 강도를 나타낸 그래프이고,
도 17은 본 발명에 따른 실시예 4a의 노로바이러스 GII.4 복제 수 로그값 및 강도 로그값에 따른 검출 결과를 나타낸 그래프이고,
도 18은 본 발명에 따른 실시예 4a의 실시예 4b 대비 시간에 따른 신호 강화 비율을 나타낸 그래프이고,
도 19는 본 발명에 따른 실시예 4a 및 실시예 4b의 2 개의 상부 유로 형성층, 제1 하부 유로 형성층, 2 개의 제2 하부 유로 형성층의 일례를 나타낸 개략도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 다음과 같이 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면 상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다. 덧붙여, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은
시료용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시료용액 주입구(53); 및 시약용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시약용액 주입구(54);가 구비된 주입부(51); 및 검출창(55)이 구비된 진단부(52);를 포함하는 상부 케이스(50);
상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스(60);
상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부(11); 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부(12);를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 적어도 1 층 이상 적층된 상부 유로 형성부(70);
상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21); 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22);를 포함하는 유로 형성층(20);을 포함하는 하부 유로 형성부(80); 및
상기 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42);를 포함하는 검출부(40);를 포함하고,
상기 진단부(52)는 하부 케이스(60) 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트(100)를 제공한다.
이때, 도 1a 내지 도 9에 본 발명에 따른 검출 키트의 일례를 모식도를 통해 개략적으로 나타내었으며,
이하, 본 발명에 따른 검출 키트에 대하여 상세히 설명한다.
종이 기반의 측방유동 분석(Lateral Flow Assay, LFA)은 가장 상업적으로 POC(Point Of Care) 장치에 이용 가능하고, 임신, 약물 남용, 임상 분석, 음식과 환경 등 다양한 분야에 범용적으로 사용된다. 상기 LFA는 저비용의 분석, 신속한 분석 시간, 간단한 조작, 외부 장비 불필요 및 대량 생산 등의 장점을 제공한다. 다만, 비록 LFA가 POC에 가장 적합한 형태 일지라도, 감도 및 유체 유동의 제어에 한계가 존재한다.
상기 한계점을 극복하기 위하여, 현재 POC 장치에 대한 연구는 감지 신호의 향상 및 종이의 기하학적 구조를 변경하는 데 집중되고 있다. 예를 들어, 다양한 감지 신호(나노 입자, 탄소 나노튜브, 양자점, 형광 염료 등) 및 증폭 수단(효소 반응 및 금속 석출)들이 감지 신호와 감도를 향상시키는 데 사용되고 있다. 하지만, 이들은 감도의 증가가 충분하지 못할 수 있고, 시각적 또는 전기화학적 검출을 위한 복수의 증폭 단계(연속적인 시약 첨가 또는 세척)가 필요하다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)는 POC 장치에 있어 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능하여 신호를 증폭하는 장치에 부응하며, 소수성의 왁스-패턴화된 층으로 적층되어 형성된 3D 액체 경로를 갖는 검출 키트이다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 하부 유로 형성층(20)은 제1 하부 유로 형성층(20)일 수 있으며, 상기 하부 유로 형성부(80)는 상기 제1 하부 유로 형성층(20) 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부(22)에서 유입되어 수렴부(21)로 수렴하는 하부 유로(31);가 형성되는 적어도 1 층 이상 적층된 제2 하부 유로 형성층(30, 30a);을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 검출부(40)는 상기 검출 유로(42) 일단에 구비되는 흡수부(43)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 주입부(51)는 적어도 1 개 이상의 시료용액을 주입하기 위한 적어도 1 개 이상의 시료용액 주입구(53)가 구비될 수 있다.
또한, 상기 상부 케이스(60)는 적어도 1 개 이상의 시약용액을 주입하기 위한 적어도 1 개 이상의 시약용액 주입구(54)가 구비될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 진단부(52)는 하기 기술한 검출 결과를 확인하기 위해 적어도 1 개 이상이 구비될 수 있다.
이때, 상기 상부 케이스(50)는 상기 주입부(51) 및 진단부(52)를 포함하고, 상기 검출 키트(100)의 상부를 마감할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 하부 케이스(60)는 상기 상부 케이스(50)와 대응되어 체결될 수 있으며, 상기 상부 케이스 및 하부 케이스 사이에 3차원 유로를 형성하는 적층된 층 및 검출 결과를 나타내는 층들이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 상부 유로 형성부(70)는 상기 주입부(51) 하부에 체결되고, 상기 시료용액 주입구(53)에 대응되는 시료용액 흡수부(11) 및 상기 시약용액 주입구(54)에 대응되는 시약용액 흡수부(12)를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 적어도 1 층 이상 적층될 수 있다.
이때, 상기 상부 유로 형성층(10)이 한 층만 적층된 상부 유로 형성부의 일례를 도 2 내지 도 5에 도시하였고, 상기 상부 유로 형성층이 2 층 적층된 상부 유로 형성부의 일례를 도 6 내지 도 9에 도시하였다.
또한, 상기 상부 유로 형성부(70) 내 시료용액 흡수부(11) 및 시약용액 흡수부(12)를 연장 또는 더 추가하거나, 기하학적 구조를 변경하는 상부 유로 형성층(10a)이 추가적으로 더 포함될 수 있으며, 이를 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 하부 유로 형성부(80)는 상기 상부 유로 형성부 하부에 위치하고, 상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21) 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22)를 포함하는 제1 하부 유로 형성층(20)을 포함한다.
또한, 상기 하부 유로 형성부(80)는 상기 제1 하부 유로 형성층(20) 하부에 위치하는 제2 하부 유로 형성층(30)를 포함하고, 상기 하부 유로 형성층이 적어도 1 층 이상이 적층되며 시약용액이 상기 시약용액 확산부(22)에서 유입되어 상기 수렴부(21)로 수렴하는 하부 유로(31)를 형성할 수 있다.
이때, 상기 제2 하부 유로 형성층(30)이 한 층만 적층된 하부 유로 형성부(80)의 일례를 도 2 내지 도 5에 도시하였고, 상기 제2 하부 유로 형성층이 2 층 적층된 하부 유로 형성부의 일례를 도 6 내지 도 9에 도시하였다.
나아가, 상기 하부 유로 형성부(80) 내 하부 유로(31)를 연장 또는 더 추가하거나, 기하학적 구조를 변경하는 제2 하부 유로 형성층(30a)이 추가적으로 더 포함될 수 있으며, 이를 제한하지 않는다.
더욱 나아가, 상기 시약용액 주입구(54)는 시약용액 갯수 만큼 시약용액 주입구를 구비할 수 있고, 상기 하부 유로 형성부(80)는 또 다른 하부 유로(미도시)가 형성되며 적층되는 제3 하부 유로 형성층(미도시)을 시약용액 갯수 만큼 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 검출부(40)는 상기 진단부(52)의 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42)및 상기 검출 유로 일단에 검출 유로를 통과하는 용액을 흡수하는 흡수부(43)를 포함한다. 상기 검출 유로는 제1 반응물질을 저장하는 저장부(41), 제2 반응물질이 고정된 반응부(44) 및 검출 결과를 비교하기 위한 대조부(미도시)를 더 포함할 수 있다.
즉, 도 2에서는 1 개의 시료용액 주입구(53)와 1 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 1 개의 층이 적층되며 1 개의 시료용액 흡수부(11) 및 1 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 1 개의 수렴부(21) 및 1 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 1 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 1 개의 층이 적층되며 1 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 3에서는 2 개의 시료용액 주입구(53)와 1 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 1 개의 층이 적층되며 2 개의 시료용액 흡수부(11) 및 1 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 2 개의 수렴부(21) 및 1 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 2 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 1 개의 층이 적층되며 일부가 분기된 1 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 4에서는 1 개의 시료용액 주입구(53)와 2 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 1 개의 층이 적층되며 1 개의 시료용액 흡수부(11) 및 2 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 1 개의 수렴부(21) 및 2 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 1 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 1 개의 층이 적층되며 일부가 수렴된 2 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 5에서는 2 개의 시료용액 주입구(53)와 2 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 1 개의 층이 적층되며 2 개의 시료용액 흡수부(11) 및 2 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 2 개의 수렴부(21) 및 2 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 2 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 1 개의 층이 적층되며 2 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 6에서는 1 개의 시료용액 주입구(53)와 1 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 2 개의 층이 적층되며 1 개의 시료용액 흡수부(11) 및 1 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 1 개의 수렴부(21) 및 1 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 1 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 2 개의 층이 적층되며 1 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 7에서는 2 개의 시료용액 주입구(53)와 1 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 2 개의 층이 적층되며 2 개의 시료용액 흡수부(11) 및 1 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 2 개의 수렴부(21) 및 1 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 2 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 2 개의 층이 적층되며 일부가 분기된 1 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 8에서는 1 개의 시료용액 주입구(53)와 2 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 2 개의 층이 적층되며 1 개의 시료용액 흡수부(11) 및 2 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 1 개의 수렴부(21) 및 1 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 1 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 2 개의 층이 적층되며 일부가 수렴된 2 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
도 9에서는 2 개의 시료용액 주입구(53)와 2 개의 시약용액 주입구(54)에 대응되는 상부 유로 형성부(70), 하부 유로 형성부(80) 및 검출부(40)의 일례를 나타내었으며, 2 개의 층이 적층되며 2 개의 시료용액 흡수부(11) 및 2 개의 시약용액 흡수부(12)가 형성되는 상부 유로 형성층(10), 2 개의 수렴부(21) 및 2 개의 시약용액 확산부(22)가 구비된 제1 하부 유로 형성층(20), 2 개의 검출 유로(42)가 구비된 흡수부, 2 개의 층이 적층되며 2 개의 하부 유로(31)를 갖는 제2 하부 유로 형성층(30)의 일례를 나타낸다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 상기 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는다.
구체적으로, 상기 검출 키트(100)가 닫힘 상태일 경우, 상기 시료용액 주입구(53), 시료용액 흡수부(11) 및 수렴부(21)는 연통된 상태가 될 수 있고, 상기 시약용액 주입구(54), 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22), 하부 유로(31) 및 수렴부(21)는 연통된 상태가 될 수 있다.
또한, 상기 검출 키트(100)가 열림 상태일 경우, 상기 시료용액 주입구(53) 및 시료용액 흡수부(11)는 연통되어 있고, 상기 시약용액 주입구(54) 및 시약용액 흡수부(12)는 연통되어 있지만, 상기 시료용액 흡수부(11) 및 수렴부(21)는 이격된 상태가 될 수 있고, 상기 시약용액 흡수부(12) 및 시약용액 확산부(22)는 이격된 상태가 될 수 있다.
따라서, 상기 검출 키트(100)가 열림 상태일 시, 상기 시료용액 주입구(53) 및 시약용액 주입구(54)로 각각 시료용액과 시약용액을 주입하면, 상기 수렴부를 향해 각각의 용액이 흐르지 않으며, 상기 시료용액은 시료용액 흡수부(11)에 저장된 상태로 있을 수 있고, 상기 시약용액은 시약용액 흡수부(12)에 저장된 상태로 있을 수 있다. 이때 상기 검출 키트를 조작하여 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두면, 상기 시료용액 흡수부에 저장되어 있던 시료용액은 상기 수렴부를 향해 흐르게 될 수 있고, 상기 시약용액 흡수부에 저장되어 있던 시약용액은 상기 시약용액 확산부를 통과하여 수렴부를 향해 흐를 수 있으며 또는 하부 유로를 추가로 통과하여 수렴부를 향해 흐르게 될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)는 각기 다른 시료용액이 저장되거나 흐르는 또 다른 시료용액 주입구, 시료용액 흡수부 및 수렴부가 더 구비될 수 있고, 각기 다른 시약용액이 저장되거나 흐르는 또 다른 시약용액 주입구, 시약용액 흡수부, 시약용액 확산부 및 하부 유로가 더 구비될 수 있다. 이때, 상기 검출유로 또한 상기 시료용액과 마찬가지로 더 추가될 수 있다.
또한, 각기 다른 시료용액 주입구 및 수렴부가 구비된 경우, 각각의 시료용액을 각각의 시료용액 주입구에 주입한 뒤 상기 검출 키트가 닫힘 상태로 됨과 동시에 용액의 흐름이 시작되며, 각기 다른 수렴부 및 검출 유로로 향하여 검출 결과가 나타날 수 있다.
나아가, 각기 다른 시약용액 주입구, 시약용액 확산부 및 하부 유로가 구비된 경우, 각각의 시약용액을 각각의 시약용액 주입구에 주입한 뒤 상기 검출 키트가 닫힘 상태로 됨과 동시에 용액의 흐름이 시작되며, 각기 다른 수렴부 및 검출유로로 향할 수 있고, 같은 수렴부 및 검출 유로로 향할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 상부 유로 형성부(70) 및 하부 유로 형성부(80) 내 상기 시약용액 흡수부(11), 시료용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)를 제외한 영역은 액체의 침투가 불가능한 영역일 수 있다.
구체적으로, 상기 상부 유로 형성부(70) 및 하부 유로 형성부(80)를 구성하는 적어도 1 개 이상의 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20) 및 적어도 1 개 이상의 제2 하부 유로 형성층(30)은 액체의 침투가 가능한 재질로 구성될 수 있고, 이때 상기 적어도 1 개 이상의 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20) 및 적어도 1 개 이상의 제2 하부 유로 형성층(30) 내 시약용액 흡수부(11), 시료용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)를 제외한 영역을 소수성의 왁스를 도포하여, 액체의 침투가 불가능하도록 할 수 있다.
상기 적어도 1 개 이상의 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20) 및 적어도 1 개 이상의 제2 하부 유로 형성층(30)의 재질은 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로오스 에스테르(cellulose ester), 셀룰로오스/폴리에스테르(cellulose/polyester), 나일론, 유리 섬유, 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌(PP), 폴리카보네이트(PC), 폴리에스테르(PE), 폴라아미드(PA) 및 폴리설폰(PS)일 수 있으나, 액체의 흐름이 용이하게 이루어지는 재질이라면 이에 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 검출 유로(42)의 재질은 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로오스 에스테르(cellulose ester), 셀룰로오스/폴리에스테르(cellulose/polyester), 나일론, 유리 섬유, 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌(PP), 폴리카보네이트(PC), 폴리에스테르(PE), 폴라아미드(PA) 및 폴리설폰(PS)일 수 있으나, 액체의 흐름이 용이하게 이루어지는 재질이라면 이에 제한하는 것은 아니다.
나아가, 상기 흡수부(43)의 재질은 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로오스 에스테르(cellulose ester), 셀룰로오스/폴리에스테르(cellulose/polyester), 나일론, 유리 섬유, 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌(PP), 폴리카보네이트(PC), 폴리에스테르(PE), 폴라아미드(PA) 및 폴리설폰(PS)일 수 있으나, 액체의 흐름이 용이하게 이루어지는 재질이라면 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 검출 유로(42)의 저장부(41)는 제1 반응물질을 포함하고, 상기 제1 반응물질은 검출 타겟과 결합할 수 있는 항체, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 흡광물질, 형광물질, 발광물질, 전기화학적 신호 발생물질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 결합된 것을 포함할 수 있고, 바람직하게는 항체와 발광물질이 결합된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 저장부(41)의 재질은 유리 섬유, 폴리에스테르, 레이온 기반 멤브레인 등일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
이때, 상기 발광물질은 금속 나노입자(콜로이드), 색소, 효소, 양자점, 형광염료 및 마이크로비드 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 전기화학적 신호 발생물질은 효소, 금속 나노입자, 양자점, Ferrocene, Ferrocene 파생물, Ferrocyanide((Fe(CN)6)4-), 루테튬 착물((Ru(bpy)3)2+) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 검출 유로(42)의 반응부(44)에 고정된 상기 제2 반응물질은 검출 타겟과 결합할 수 있는 항체, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids), 압타머(aptamer)등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 항체를 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 시료용액은 검출하고자 하는 검출 타겟을 포함할 수 있고, 포함하지 않을 수 있다. 이때 상기 검출 타겟은 분리된 단백질, 바이러스, 박테리아 및 분리된 DNA일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 시약용액은 포스페이트(phosphate), PBS(Phosphate-buffered saline), Trisodium citrate, acetate, MES, HEPES, glycine 버퍼 용액 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)는 시료용액 및 시약용액이 흐르는 각각의 경로가 이격되고, 시약용액이 흐르는 경로가 비교적 우회함으로써 긴 경로를 갖게 될 수 있다. 따라서, 상기 시료용액 흡수부(11)를 거쳐 수렴부(21)로 수렴하는 시료용액이 먼저 상기 검출부의 검출 유로(42)로 도달하고, 이후 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)를 거쳐 수렴부(21)로 수렴하는 시약용액이 상기 검출부의 검출 유로(42)로 도달할 수 있다.
이때, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)는 상기 제1 반응물질의 가시성을 증가시키는 신호 강화제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트(100)에 있어서, 상기 검출 유로(42)에 유입되는 시약용액에 포함된 검출 타겟은 상기 저장부(41)의 제1 반응물질과 함께 상기 반응부(44)에 고정된 제2 반응물질에 의해 포획되며 고정되어 샌드위치(sandwitch) 구조를 형성할 수 있다. 이때, 검출 타겟을 포함하는 시료용액 다음으로 순차적으로 유입되는 시약용액은 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)를 거치며, 시약용액 흡수부, 시약용액 확산부 및 하부 유로에 포함된 신호 강화제가 상기 시약용액에 의해 용해되고, 이후 신호 강화제가 용해된 시약용액이 상기 검출 유로의 반응부에 유입되면서 샌드위치 구조가 형성된 제1 반응물질의 가시성을 증폭할 수 있다.
구체적인 일례로써, 바이러스를 포함하는 시료용액이 상기 검출 유로(42)로 유입될 경우, 저장부(41)에서 상기 바이러스를 포획하는 금 나노입자가 결합된 항체가 바이러스를 포획하며 흐르고, 이후 반응부(44)에 유입되며 반응부에 고정된 또 다른 항체에 의해, 상기 금 나노입자가 결합된 항체로 포획된 바이러스가 다시 포획되어 상기 반응부 내 고정되며, 샌드위치 구조를 형성한다. 그 다음, 순차적으로 상기 검출 유로로 유입되는 상기 신호 강화제가 용해된 시약용액이 상기 샌드위치 구조가 형성된 반응부 내로 유입되고, 샌드위치 구조의 항체에 결합된 금 나노입자를 상기 신호 강화제에 포함된 금 이온으로 인하여 환원되며 더 큰 크기를 갖는 입자가 형성됨으로써, 가시성이 증폭될 수 있다.
상기 신호 강화제는 금속 이온, 양자점, 마그네틱 나노입자, 효소기질, 트리프로필아민(TPA), 과산화수소(H202), 글루코스(Glucose) 및 Ferrocyanide 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 금속 이온을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 신호 강화제는 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22), 및 하부 유로(31)에 포함되어 시약용액이 확산될 시 용해되며 흐를 수 있고, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22), 및 하부 유로(31)에 신호 강화제가 미 포함될 수도 있으며, 이때 시약용액에 미리 신호 강화제를 용해시켜 상기 검출 키트로 주입할 수 있다.
다만, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22), 및 하부 유로(31)에 미리 신호 강화제를 함침시킬 경우, 검출 키트의 구성이 단순해지고, 이에 따라 보관 및 수송이 용이해질 뿐만 아니라, 사용자가 직접 각각의 신호 강화제를 혼합하여 주입하는 번거로움이 해소되어, 더욱 사용자 친화적인 검출 키트로 활용될 수 있다.
다른 일례로써, ELISA를 이용한 분석법을 사용할 수 있다. 항체-효소 결합반응에 의한 면역분석법인 ELISA는 그 미세한 방법의 차이 및 용도에 따라 indirect ELISA, sandwich ELISA, competitive ELISA로 나뉘는데, sandwich ELISA를 적용하는 것이 바람직하다.
혈액이나 혈청 샘플에 존재하는 표적물질인 특이 항원을 고감도로 감지하기 위하여 항원에 결합하는 항체가 고정화되어 있는 부분 표면에 분석하고자 하는 샘플을 반응시키면 항원-항체 반응에 의하여 고정되어 있는 항체의 특이 항원만 결합하게 된다. 이러한 항원에 특이 결합을 하는 또 다른 항체(이차항체)를 반응 시키면 항원과 상기 이차항체가 특이 결합을 하게 되는데, 이러한 이차 항체에 효소가 부착되어 있어서 효소의 기작을 하게 하는 물질을 주입하게 되면 여러 가지 광학에너지가 발생하게 된다. 이러한 광학 에너지를 상기와 같은 샌드위치 방법으로 발광, 발색을 유도하고, 자외선 탐지기 등으로 감지하여 항원의 존재 유무를 알게 할 수 있다. 또한, 이차 항체의 효소 대신에 형광물질을 부착하여 형광 감지법을 적용할 수 있다. 나아가, 센서의 민감도를 증진시키기 위하여 나노입자 혹은 양자점(quantum dot)을 상기 이차항체에 부착하여 사용할 수 있다.
또 다른 일례로써, 전기화학적 방법을 사용할 수 있다. 검출 타겟을 검출하고자 하는 부분에 전극을 형성 및 Electrical mediator를 사용하여 전하를 유도하고, 반응부 표면에서 일어나는 생화학적 산화 환원 반응에 의하여 전자의 이동이 발생하며, 이러한 전자의 이동에 의하여 전위 차이, 전류 변화 혹은 전도도 변화가 발생하여 생화학 반응을 전기적 신호 변화로 측정 할 수 있다.
또한, 본 발명은
상기의 검출 키트의 주입부(51)를 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 상태로 두고, 상기 검출 키트(100)의 시료용액 주입구(53) 및 시약용액 주입구(54)에 각각 시료용액 및 시약용액을 주입하는 단계(단계 1);
상기 주입부(51)를 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두는 단계(단계 2); 및
상기 검출 키트의 검출창(55)의 변화를 확인하는 단계(단계 3);를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
이때, 도 1a에 본 발명에 따른 검출 방법의 일례를 모식도를 통해 개략적으로 나타내었으며,
이하, 본 발명에 따른 검출 방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 검출 방법에 있어서, 단계 1은 상기의 검출 키트(100)의 주입부(51)를 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 상태로 두고, 상기 검출 키트의 시료용액 주입구(53) 및 시약용액 주입구(54)에 각각 시료용액 및 시약용액을 주입하는 단계이다.
이때 상기 단계 1의 시료용액은 검출 타겟을 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 상기 검출 타겟은 분리된 단백질, 바이러스, 박테리아 및 분리된 DNA일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 1의 시약용액은 버퍼 용액일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
나아가, 상기 단계 1에서는 상기 검출 키트(100)의 시료용액 주입구(53) 및 시료용액 흡수부(11)는 연통되어 있고, 상기 시약용액 주입구(54) 및 시약용액 흡수부(12)는 연통되어 있지만, 상기 시료용액 흡수부(11) 및 수렴부(21)는 이격된 상태가 될 수 있고, 상기 시약용액 흡수부(12) 및 시약용액 확산부(22)는 이격된 상태가 될 수 있다. 따라서, 상기 검출 키트(100)가 열림 상태인 단계 1에서는, 상기 검출 키트(100)의 시료용액 주입구(53) 및 시약용액 주입구(54)로 각각 시료용액과 시약용액을 주입하면, 상기 수렴부를 향해 각각의 용액이 흐르지 않으며, 상기 시료용액은 시료용액 흡수부(11)에 저장된 상태로 있을 수 있고, 상기 시약용액은 시약용액 흡수부(12)에 저장된 상태로 있을 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 검출 방법에 있어서, 단계 2는 상기 주입부(51)를 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두는 단계이다.
즉, 상기 검출 키트(100)를 조작하여 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두면, 상기 시료용액 흡수부(11)에 저장되어 있던 시료용액은 상기 수렴부를 향해 흐르게 될 수 있고, 상기 시약용액 흡수부(12)에 저장되어 있던 시약용액은 상기 시약용액 확산부, 하부 유로를 통과하여 수렴부를 향해 흐르게 될 수 있다. 다만, 상기 하부 유로는 제외될 수 있으며, 이 경우 상기 시약용액은 상기 확산부에서 상기 수렴부를 향해 바로 흐를 수 있다.
이때, 상기 시료용액 및 시약용액은 동시에 상기 검출 키트(100)의 검출 유로(42)를 향해 액체 흐름이 시작될 수 있다.
다만, 상기 시료용액은 시료용액 흡수부(11) 및 수렴부(21)에 이르는 비교적 짧은 경로로 인해 먼저 수렴부(21)에 도달할 수 있고, 상기 시약용액은 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)에 이르는 비교적 긴 경로로 인해 상기 시료용액보다 늦게 수렴부에 도달할 수 있다. 다만, 상기 하부 유로는 제외될 수 있다.
또한, 상기 시약용액은 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)를 통과하면서, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)에 포함된 신호 강화제를 용해시킬 수 있고, 상기 용해된 신호 강화제를 포함하며 수렴부에 도달할 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 검출 방법에 있어서, 단계 3은 상기 검출 키트(100)의 검출창(55)의 변화를 확인하는 단계이다.
상기 단계 2에서 수렴부에 도달한 시료용액은 검출 타겟을 포함한다면 상기 저장부(41)의 제1 반응물질에 포획되며 흐를 수 있고, 상기 시료용액이 검출 타겟을 포함하지 않는다면 제1 반응물질과의 반응 없이 흐를 수 있다. 만약, 상기 시료용액이 검출 타겟을 포함하면, 상기 저장부의 제1 반응물질에 포획되며 흐르고, 이후 상기 반응부(44)의 제2 반응물질에 포획되어 고정된 후, 순차적으로 유입되는 신호 강화제가 용해된 시약용액에 의해 반응부에 고정된 검출 타겟의 가시성이 향상될 수 있다.
따라서, 검출 타겟이 일정 농도 이상 존재 시, 상기 검출창(55) 내부 검출유로의 반응부 색이 변화하며 이로 인해 시료용액 내 검출 타겟에 대해 진단할 수 있다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시에 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 3차원 복수의 액체 경로가 구비된 검출 키트
1 개의 시료용액 주입구(53); 및 1 개의 시약용액 주입구(54);가 구비된 주입부(51); 및 검출창(55)이 구비된 진단부(52);를 포함하는 상부 케이스(50);를 준비하였다.
그 다음, 상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스(60);를 준비하였다.
그 다음, 상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부(11); 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부(12);를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 2 층으로 적층된 상부 유로 형성부(70);를 준비하였다.
그 다음, 상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21); 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22);를 포함하는 제1 하부 유로 형성층(20); 상기 제1 하부 유로 형성층 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부에서 유입되어 수렴부로 수렴하는 하부 유로(31);가 형성되는 제2 하부 유로 형성층(30);이 2 층으로 적층된 하부 유로 형성부(80);를 준비하였다.
그 다음, 상기 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42); 및 상기 검출 유로 일단에 구비되는 흡수부(43);를 포함하는 검출부(40);를 준비하되,
상기 진단부(52)는 하부 케이스(60) 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트(100)를 구비하였다.
상기 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20), 제2 하부 유로 형성층(30) 및 흡수부(43)는 셀룰로오스 재질을 사용하였고, 검출 유로(42)는 니트로셀룰로오스 재질을 사용하였다.
이때, 상기 검출 키트(100)의 각 층의 시료용액 흡수부(11), 시약용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22), 하부 유로(31), 검출 유로(42) 및 흡수부(43)를 제외한 영역은 소수성의 왁스를 코팅하여 액체의 침투가 불가능하게 하였다.
<실시예 2> 3차원 복수의 액체 경로가 구비되고, 염료가 함침된 검출 키트
1 개의 시료용액 주입구(53); 및 1 개의 시약용액 주입구(54);가 구비된 주입부(51); 및 검출창(55)이 구비된 진단부(52);를 포함하는 상부 케이스(50);를 준비하였다.
그 다음, 상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스(60);를 준비하였다.
그 다음, 상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부(11); 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부(12);를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 2 층으로 적층된 상부 유로 형성부(70);를 준비하였다.
그 다음, 상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21); 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22);를 포함하는 제1 하부 유로 형성층(20); 상기 제1 하부 유로 형성층 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부에서 유입되어 수렴부로 수렴하는 하부 유로(31);가 형성되는 제2 하부 유로 형성층(30);이 2 층으로 적층된 하부 유로 형성부(80);를 준비하였다.
그 다음, 상기 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42); 및 상기 검출 유로 일단에 구비되는 흡수부(43);를 포함하는 검출부(40);를 준비하되,
상기 시약용액 흡수부(12)의 일부 층 및 하부 유로(22)의 일부 층은 각각 파란색, 노란색의 염료를 포함하고, 상기 진단부(52)는 하부 케이스(60) 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트(100)를 구비하였다.
상기 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20), 제2 하부 유로 형성층(30) 및 흡수부(43)는 셀룰로오스 재질을 사용하였고, 검출 유로(42)는 니트로셀룰로오스 재질을 사용하였다.
이때, 상기 검출 키트(100)의 각 층의 시료용액 흡수부(11), 시약용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22), 하부 유로(31), 검출 유로(42) 및 흡수부(43)를 제외한 영역은 소수성의 왁스를 코팅하여 액체의 침투가 불가능하게 하였다.
<실시예 3a> mouse IgG 검출 키트 1
1 개의 시료용액 주입구(53); 및 1 개의 시약용액 주입구(54);가 구비된 주입부(51); 및 검출창(55)이 구비된 진단부(52);를 포함하는 상부 케이스(50);를 준비하였다.
그 다음, 상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스(60);를 준비하였다.
그 다음, 상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부(11); 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부(12);를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 2 층으로 적층된 상부 유로 형성부(70);를 준비하였다.
그 다음, 상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21); 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22);를 포함하는 제1 하부 유로 형성층(20); 상기 제1 하부 유로 형성층 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부에서 유입되어 수렴부로 수렴하는 하부 유로(31);가 형성되는 제2 하부 유로 형성층(30);이 2 층으로 적층된 하부 유로 형성부(80);를 준비하였다.
그 다음, 상기 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42); 및 상기 검출 유로 일단에 구비되는 흡수부(43);를 포함하는 검출부(40);를 준비하되, 상기 검출 유로는 금 나노입자가 결합된 mouse IgG 항체(염소)를 저장하는 저장부(41), mouse IgG 항체(염소)가 고정된 반응부(44) 및 항-염소 항체(토끼)가 고정된 대조부(미도시)를 준비하였다.
그 다음, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)는 금 이온을를 포함하는 신호 강화제를 포함하고, 상기 진단부(52)는 하부 케이스(60) 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트(100)를 구비하였다.
상기 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20), 제2 하부 유로 형성층(30) 및 흡수부(43)는 셀룰로오스 재질을 사용하였고, 검출 유로(42)는 니트로셀룰로오스 재질을 사용하였다.
이때, 상기 검출 키트(100)의 각 층의 시료용액 흡수부(11), 시약용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22), 하부 유로(31), 검출 유로(42) 및 흡수부(43)를 제외한 영역은 소수성의 왁스를 코팅하여 액체의 침투가 불가능하게 하였다.
<실시예 3b> mouse IgG 검출 키트 2
상기 실시예 3a의 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)에 신호 강화제가 포함되지 않는 것을 제외하고, 상기 실시예 3a와 동일하게 구성된 검출 키트(100)를 구비하였다.
<실시예 4a> 노로바이러스 검출 키트 1
1 개의 시료용액 주입구(53); 및 1 개의 시약용액 주입구(54);가 구비된 주입부(51); 및 검출창(55)이 구비된 진단부(52);를 포함하는 상부 케이스(50);를 준비하였다.
그 다음, 상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스(60);를 준비하였다.
그 다음, 상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부(11); 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부(12);를 형성하는 상부 유로 형성층(10)이 2 층으로 적층된 상부 유로 형성부(70);를 준비하였다.
그 다음, 상기 시료용액 흡수부(11)와 일부가 접하며 연통된 수렴부(21); 및 상기 시약용액 흡수부(12)와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부(22);를 포함하는 제1 하부 유로 형성층(20); 상기 제1 하부 유로 형성층 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부에서 유입되어 수렴부로 수렴하는 하부 유로(31);가 형성되는 제2 하부 유로 형성층(30);이 2 층으로 적층된 하부 유로 형성부(80);를 준비하였다.
그 다음, 상기 검출창(55)과 대응되어 위치하며 상기 수렴부(21)와 연통된 검출 유로(42); 및 상기 검출 유로 일단에 구비되는 흡수부(43);를 포함하는 검출부(40);를 준비하되, 상기 검출 유로는 금 나노입자가 결합된 노로바이러스 GII.4 항체인 capsid protein VP1 항체(토끼)를 저장하는 저장부(41), 노로바이러스 GII.4 항체(쥐)가 고정된 반응부(44) 및 항-토끼 항체(염소)가 고정된 대조부(미도시)를 준비하였다.
그 다음, 상기 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)의 일부는 금 이온을 포함하는 신호 강화제를 포함하고, 상기 진단부(52)는 하부 케이스(60) 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부(70)가 체결된 주입부(51)는 하부 케이스(60) 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부(70)와 하부 유로 형성부(80)는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트(100)를 구비하였다.
상기 상부 유로 형성층(10), 제1 하부 유로 형성층(20), 제2 하부 유로 형성층(30) 및 흡수부(43)는 셀룰로오스 재질을 사용하였고, 검출 유로(42)는 니트로셀룰로오스 재질을 사용하였다.
이때, 상기 검출 키트(100)의 각 층의 시료용액 흡수부(11), 시약용액 흡수부(12), 수렴부(21), 시약용액 확산부(22), 하부 유로(31), 검출 유로(42) 및 흡수부(43)를 제외한 영역은 소수성의 왁스를 코팅하여 액체의 침투가 불가능하게 하였다.
<실시예 4b> 노로바이러스 검출 키트 2
상기 실시예 4a의 시약용액 흡수부(12), 시약용액 확산부(22) 및 하부 유로(31)에 신호 강화제가 포함되지 않는 것을 제외하고, 상기 실시예 4a와 동일하게 구성된 검출 키트(100)를 구비하였다.
<실험예 1> 두 가지 염료의 확산 분석
본 발명에 따른 검출 키트의 용액 확산 및 혼합을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 구비된 검출 키트의 시료용액 주입구에 노란색 염료 110 μL, 시약용액 주입구에 빨간색 염료 200 μL를 주입하여 용액의 확산을 분석하였으며, 이를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 구비된 검출 키트를 열림 상태로 두고 두 가지 색의 염료를 각각 주입한 뒤, 상기 검출 키트를 닫음 상태로 둔 결과, 시료용액 주입구에 주입된 노란색 염료가 먼저 검출 유로로 도달하고, 이후 시약용액 주입구에 주입된 빨간색 염료가 도달하여 혼합되는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 시약용액 확산 분석
본 발명에 따른 검출 키트의 복수의 층을 통한 염료의 용해 및 용액 확산을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 구비된 검출 키트의 시료용액 주입구에 증류수 110 μL, 시약용액 주입구에 증류수 200 μL를 주입하여 용액의 확산을 분석하였으며, 이를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 구비된 검출 키트를 열림 상태로 두고 두 주입구에 증류수를 각각 주입한 뒤, 상기 검출 키트를 닫음 상태로 둔 결과, 시료용액 주입구에 주입된 증류수가 먼저 검출 유로로 도달하고, 이후 시약용액 주입구에 주입된 증류수가 시약용액 흡수부 및 하부 유로에 함침된 파란색 및 노란색 염료를 용해시키며 검출 유로로 도달하여 혼합되는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> mouse IgG 검출 분석
본 발명에 따른 검출 키트의 mouse IgG 병원균 검출을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3a 및 실시예 3b에서 구비된 각각의 검출 키트의 시료용액 주입구에 mouse IgG 병원균을 0.1 ng/mL 내지 50 μg/mL 를 포함하는 용액을 주입하고, 시약용액 주입구에 증류수 200 μL를 주입하여 검출 결과를 분석하였으며, 이를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3a 및 실시예 3b에서 구비된 검출 키트를 열림 상태로 시료용액 주입구에 mouse IgG 병원균을 포함하는 용액을 주입하고, 시약용액 주입구에 증류수를 주입한 다음, 각각의 검출 키트를 닫음 상태로 둔 결과를 확인하였다. 신호 강화제가 없는 실시예 3b보다, 신호 강화제가 함침된 실시예 3a는 크게 3배 정도 검출 신호 강도가 향상된 것을 확인할 수 있었고, 같은 신호 강도에서 최대 100배의 검출 감도가 향상된 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 노로바이러스 검출 분석
본 발명에 따른 검출 키트의 노로바이러스 검출을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4a 및 실시예 4b에서 구비된 검출 키트의 시료용액 주입구에 노로바이러스 GII.4 복제 수가 3.95105 mL-1 내지 7.90107 mL- 1 가량 포함하는 용액을 주입하고, 시약용액 주입구에 증류수 200 μL를 주입하여 검출 결과를 분석하였으며, 이를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 4a 및 실시예 4b에서 구비된 검출 키트를 열림 상태로 시료용액 주입구에 노로바이러스 GII.4를 포함하는 용액을 주입하고, 시약용액 주입구에 증류수를 주입한 다음, 각각의 상기 검출 키트를 닫음 상태로 둔 결과를 확인하였다. 신호 강화제가 포함되지 않은 실시예 4b보다, 신호 강화제를 포함한 실시예 4a가 크게는 5배 정도 검출 강도가 향상된 것을 확인할 수 있었고, 같은 강도에서 최대 100배의 검출 감도가 향상된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 4b의 검출 키트의 노로바이러스 최소 검출 한도(LOD)는 1.58107 복제 수/mL인 것을 확인하였고, 실시예 4a의 검출 키트의 노로바이러스 최소 검출 한도(LOD)는 9.5104 복제 수/mL이고, 최소 정량 한도(LOQ)는 6.3105 복제 수/mL인 것을 확인하였다.
이는 종래 검출 방법인 RT-PCR(1.6107 복제 수/mL), ELISA(4.2108 복제 수/mL), 일반적 LFA 키트(106 복제 수/mL 내지 107 복제 수/mL)에 비해 향상된 검출 한도를 갖는 것을 확인하였다.
나아가, 실시예 4a는 노로바이러스 복제 수의 로그값에 대하여 강도가 0.986의 기울기를 갖는 선형적인 비율로 증가하는 것을 도 17을 통해 확인하였다.
더욱 나아가, 실시예 4a는 시간에 따라 검출 신호 강화 비율(실시예 4a 강도/실시예 4b 강도)이 상승하는 것을 도 18을 통해 확인하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 검출 키트의 용액 확산, 혼합, mouse IgG 병원균 검출, 노로바이러스 검출 성능을 확인하였으며, 복수 개의 3D 액체 경로를 통해 시간차를 두고 시료용액과 신호 강화제가 포함된 시약용액을 검출 유로로 혼합함으로써, 효과적인 검출 강도 및 감도를 가질 수 있는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 검출 키트의 노로바이러스 GII.4 검출 한도는 9.5104 복제 수/mL로 나타났고, 이는 종래 LFA 검출 키트의 검출 한도인 107 복제수/mL보다 향상된 한도를 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 검출 키트는 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능한 장점이 있고, 신호 증폭으로 검출 민감도가 향상된 효과가 있다.
본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
본 발명에 따른 검출 키트는 신속하고, 저렴하며, 한 번의 조작으로 주변 장비 없이 복수의 용액이 순차적인 도달이 가능한 장점이 있고, 신호 증폭으로 검출 민감도가 향상된다.

Claims (24)

  1. 시료용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시료용액 주입구; 및 시약용액을 주입하는 적어도 1 개 이상의 시약용액 주입구;가 구비된 주입부; 및 검출창이 구비된 진단부;를 포함하는 상부 케이스;
    상기 상부 케이스에 체결되는 하부 케이스;
    상기 주입부 하부에 체결되며, 상기 시료용액 주입구와 대응되는 시료용액 흡수부; 상기 시약용액 주입구와 대응되는 시약용액 흡수부;를 형성하는 상부 유로 형성층이 적어도 1 층 이상 적층된 상부 유로 형성부;
    상기 시료용액 흡수부와 일부가 접하며 연통된 수렴부; 및 상기 시약용액 흡수부와 일부가 접하며 연통되고, 시약용액이 확산되는 시약용액 확산부;를 포함하는 하부 유로 형성층;을 포함하는 하부 유로 형성부; 및
    상기 검출창과 대응되어 위치하며 상기 수렴부와 연통된 검출 유로;를 포함하는 검출부;를 포함하고,
    상기 진단부는 하부 케이스 상에 체결되어 고정되어 있고, 상기 상부 유로 형성부가 체결된 주입부는 하부 케이스 상에서 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 또는 닫힘 상태가 되며, 열림 상태일 경우 상부 유로 형성부와 하부 유로 형성부는 연통되지 않는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하부 유로 형성층은 제1 하부 유로 형성층이고,
    상기 하부 유로 형성부는 상기 제1 하부 유로 형성층 하부에 위치하고, 시약용액이 상기 시약용액 확산부에서 유입되어 수렴부로 수렴하는 하부 유로;가 형성되는 적어도 1 층 이상 적층된 제2 하부 유로 형성층;을 추가로 포함하며,
    상기 검출부는 상기 검출 유로 일단에 구비되는 흡수부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 시약용액 주입구는 시약용액 갯수 만큼 시약용액 주입구를 구비하고, 상기 하부 유로 형성부는 또 다른 하부 유로가 형성되며 적층되는 제3 하부 유로 형성층;을 시약용액 갯수 만큼 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 상부 유로 형성부 및 하부 유로 형성부 내 시약용액 흡수부, 시료용액 흡수부, 수렴부, 시약용액 확산부 및 하부 유로를 제외한 영역은 액체의 침투가 불가능한 영역인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시료용액은 검출 타겟을 포함하는지 여부를 확인하고자 하는 대상이고, 상기 검출 타겟은 분리된 단백질, 바이러스, 박테리아 및 분리된 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시약용액은 버퍼 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 시료용액 흡수부를 거쳐 수렴부로 수렴하는 시료용액이 먼저 상기 검출부의 검출 유로로 도달하고, 이후 상기 시약용액 흡수부, 시약용액 확산부 및 하부 유로를 거쳐 수렴부로 수렴하는 시약용액이 상기 검출부의 검출 유로로 도달하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 검출부의 검출 유로는 제1 반응물질을 저장하는 저장부; 제2 반응물질이 고정된 반응부; 및 검출 결과를 비교하기 위한 대조부;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 검출부의 검출 유로로 유입되는 용액은 먼저 상기 저장부를 통과하고, 이후 상기 반응부를 통과하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 반응물질은 검출 타겟과 결합 가능한 항체, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids) 및 압타머(aptamer)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 흡광물질, 형광물질, 발광물질 및 전기화학적 신호 발생물질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 결합된 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 발광물질은 금속 나노입자, 색소, 효소, 양자점, 형광염료 및 마이크로비드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 신호 발생물질은 효소, 효소, 금속 나노입자, 양자점, Ferrocene, Ferrocene 파생물, Ferrocyanide((Fe(CN)6)4-) 및 루테튬 착물((Ru(bpy)3)2+)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 제2 반응물질은 검출 타겟과 결합 가능한 항체, 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acids) 및 압타머(aptamer)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 검출 유로에 유입되는 검출 타겟은 상기 저장부의 제1 반응물질과 함께 상기 반응부에 고정된 제2 반응물질에 의해 포획되며 고정되어 샌드위치(sandwitch) 형태의 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 시약용액 흡수부, 시약용액 확산부 및 하부 유로로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 상기 제1 반응물질의 가시성을 증가시키는 신호 강화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 시약용액은 상기 신호 강화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 신호 강화제는 금속 이온, 양자점, 마그네틱 나노입자, 효소기질, 트리프로필아민(TPA), 과산화수소(H202), 글루코스(Glucose) 및 Ferrocyanide로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 신호 강화제는 상기 시약 용액에 용해되어 흐르는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
  19. 제1항 또는 제2항의 검출 키트의 주입부를 슬라이딩(sliding)을 통해 열림 상태로 두고, 상기 검출 키트의 시료용액 주입구 및 시약용액 주입구에 각각 시료용액 및 시약용액을 주입하는 단계(단계 1);
    상기 주입부를 슬라이딩을 통해 닫힘 상태로 두는 단계(단계 2); 및
    상기 검출 키트의 검출창의 변화를 확인하는 단계(단계 3);를 포함하는 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 단계 1의 시료용액은 검출 타겟을 포함하는지 여부를 확인하고자 하는 대상이고, 상기 검출 타겟은 분리된 단백질, 바이러스, 박테리아 및 분리된 DNA로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 단계 1의 시약용액은 버퍼 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 단계 2에서, 상기 시료용액 및 시약용액은 동시에 상기 검출 키트의 검출 유로를 향해 액체 흐름이 시작되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 단계 2에서, 상기 시료용액이 먼저 상기 검출 키트의 검출 유로에 도달하고, 이후 상기 시약용액이 상기 검출 키트의 검출 유로에 도달하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  24. 제19항에 있어서,
    상기 단계 3에서, 검출 타겟 존재 시 검출창의 색이 변화하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
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