KR20180123681A - 항원 어레이 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 샘플에서 어레이의 항원 중 어느 하나에 특이적인 면역글로불린을 검출하기 위한 항원 어레이 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 고체 지지체 상에 고정된 항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 항원 어레이에 관한 것이다. 항원 어레이를 포함하는 카트리지, 키트 및 장치, 및 이를 사용하는 방법이 본원에 추가로 포함된다.
Description
본 발명은 생물학적 샘플에서 어레이(array)의 항원 중 어느 하나에 특이적인 면역글로불린을 검출하기 위한 항원 어레이 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 고체 지지체 상에 고정된 항원-코팅된 비드(antigen-coated bead)의 군을 포함하는 항원 어레이에 관한 것이다. 항원 어레이를 포함하는 카트리지, 키트 및 장치, 및 이를 사용하는 방법이 본원에 추가로 포함된다.
알레르기 및 밀접하게 관련된 질환 예컨대 기관지 천식은 산업 국가에서 인구의 사분의 일에 영향을 미친다. WHO는 알레르기를 21 세기의 주요 건강 문제로 지명한다. 현재, 1형 알레르기는 산업 국가에서 인구의 거의 삼분의 일에 영향을 미친다. 종종 무해하긴 하지만, 알레르기의 발생률 및 중증도는 증가하고 있으며, 사회에 대한 직접 및 간접 비용도 증가하고 있다. 이론상으로는 알레르기 진단은 간단한 과제이나, 이는 진단 산업 및 의료인에게 여전히 도전 과제를 제시한다. 상당한 비율의 환자들이 적절한 진단 및 치료를 받지 않는다. 결과는 삶의 질 감소, 피할 수 없는 사망, 및 일반적으로 더 높은 질환 관리 비용이다. 각각의 개개 환자에 대한 치료를 최적화하기 위해, 진단은 알레르기항원(allergen) 원천(source) (예를 들어 꽃가루, 동물, 식품)의 확인에서 중단할 수 없으나, 분자 민감화 프로파일(molecular sensitization profile)로 더 심도 있게 진전되어야 한다. 질환 유발 단일 알레르기항원 분자는, 이들이 알레르기항원 원천 사이의 교차 반응성(cross-reactivity), 위험 분류 (심한 반응 또는 더 경미한 형태), 증상 유형 (재채기, 천식 등), 요법의 선택; 및 질환 진행에 대한 예후의 원인이 되기 때문에 올바르게 확인되어야 한다. 증가된 진단 분해능(diagnostic resolution)에 대한 이러한 필요성은 일상적으로 검사될 다수의 파라미터에 대한 멀티플라이어(multiplier)를 창출하며, 이는 지원 시스템(reimbursement system)에 의해서도 또는 일상적인 알레르기 진단 계측(instrumentation)의 현재 기술 능력에 의해서도 일치되지 않는다.
따라서 특정 생물학적 또는 비생물학적 항원 표적에 대한 특이적 항체 생산의 형태로 특이적 면역 반응을 검출하는 것은 제I형 알레르기의 진단뿐만 아니라 다른 면역학적 병태 예컨대 자가면역 질환 및 감염성 질환의 핵심이다.
이들 영역 모두에서, 기저 병태는 질환을 위한 마커로서 작용할 수 있는, 여러 가지의 질환 유발 항원, 또는 자가면역 질환의 경우에서와 같이 결과의 예측 또는 병태를 위한 대리 마커(surrogate marker)의 역할을 하는 항원에 의해 야기될 수 있다.
용어 항원은 일반적으로 면역계가 그에 대한 항체 반응을 초래할 수 있게 하고, 가능하게는, 항체가 적절한 생체내 조건 하에 그에 결합하는 경우 생물학적 반응을 촉발할 수 있는 물질을 지칭한다.
이론적으로, 제1 단계에서 병력(anamnesis)을 철저히 검토하면 시험관내 시험의 제2 단계를 위한 시험 파라미터의 수를 합리적으로 낮은 수로 줄일 수 있게 될 것이다. 그러나, 다수의 실제적인 한계 때문에, 이것이 항상 쉽게 달성 가능한 것은 아니며, 이는 몇몇 질환에 대한 다중 파라미터(multi-parameter) 진단 시험의 적용을 매력적인 것으로 만든다. 이것은, 특히 동일한 항체 클래스가 다수의 항원 (예를 들어 IgE, IgG, IgA)에 대한 면역 반응의 원인이 되는 경우에 진실이어서, 다중 항원에 기초한 항체 반응 모니터링이 각각의 개개 환자를 위한 더 양호한 건강 관리를 용이하게 할 수 있도록 한다. 항원 프로파일 또는 패턴 또는 예측 알고리즘을 확인하기 위해 생물 정보학을 사용하면 진단 및 치료 선택을 크게 용이하게 할 수 있으며, 의사가 치료 및 치료의 모니터링에서 보다 환자 맞춤형(patient-tailored) 접근법을 제공할 수 있게 할 수 있다.
항원 특이적 면역글로불린 검출에 대한 시험관내 시험은 ELISA 원리에 대부분 기초하고, 여기서 항원이 고체상(solid phase)에 고정화된 다음에, 이를 샘플로 인큐베이션하고, 비결합 샘플 및 비특이적 항체를 세척 제거한 후, 특이적으로 결합된 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 검출 가능한 신호 (색상, 광자 등)를 발생시키는 종류의 2차 항체 또는 친화도 결합제(affinity binder)로 검출된다.
이 맥락에서의 고정화는 고체상 (예를 들어 플라스틱 표면 또는 항원을 보유하기에 적합한 물리적 및 화학적 특성을 가진 임의의 다른 고체 담체(carrier))에, 화학적 커플링이거나 다른 비공유적 부착 방식에 의해 항원을 결합하는 것을 지칭한다.
다중 파라미터 면역학적 시험관내 시험을 개발하는 경우 흔한 곤란한 문제는 항원의 이질적 성질이며, 한편 시험 형식은 통상적으로 고정화 및 검정 절차 동안에 각각의 항원에 대해 동일하거나 적어도 유사한 조건을 단지 적용할 수 있다. 결과적으로, 이는 숙련된 전문가에게 공지된 차원에 따라 시험의 기술적 성능에 비해 시험에 포함될 항원의 수 사이의 트레이드오프(tradeoff)를 결과한다.
관련된 항원의 대다수는 식품, 식물, 박테리아 또는 바이러스와 같은 생물학적 원천으로부터의 단백질이거나, 자가면역의 경우에서와 같이, 인간 유기체 자체에 의해 생산되는 단백질이다. 단백질은 - 유전자 검사에서 예를 들어 DNA와 비교하여 - 지극히 다용도이나 또한 지극히 이질적 (전하, 구조, 안정성, 표면 성질 등)이며, 취급 및 시험 제조 동안에 각각의 단백질의 물리 화학적 성질을 수용하는 것만 필요한 것이 아니다. 훨씬 더 중요한 것은, 예를 들어 실제 에피토프 및 항체 결합 부위를 창출하는 생체 분자의 2차 및 3차 구조를 무손상으로 유지함으로써 생물학적 활성을 보존하는 것이 필요하다. 그렇지 않으면 임상적으로 관련된 민감도 및 특이성을 가진 기능적 검정이 달성될 수 없다.
알레르기, 감염성 또는 자가면역 질환에서 몇몇 관련된 항원은 자유(free) 또는 가용성 단백질이 아니며 용액에 머무르기 위해 상대적으로 엄격한(harsh) 화학 용매를 필요로 하며, 이는 시험관내 시험의 제조 공정에서 통상적인 단백질 커플링 또는 취급을 장황하게 만든다. 이들의 예는 다음과 같다: 견과류 또는 종자로부터의 저장 단백질, 또는 세포막에 또는 조직 내에 (여기서 이들은 국부적으로 생산된다)에 존재하는 세포 항원.
알레르기 시험관내 진단의 분야에서, 추가로 복잡한 것은 질환 유발 항원을 함유하는 생물학적 원천이 상기 원천 사이에 그러나 또한 원천 내에서 매우 이질적이라는 점이다. 전형적으로, 소위 알레르기항원 추출물은 생체내 및 시험관내 진단 둘 다에 사용된다. 알레르기항원 추출물은 식품, 동물, 식물, 식물 꽃가루 등과 같은 각각의 원천으로부터의 단백질 함량의 수성 발췌물(excerpt)이다. 알레르기항원 추출물에서, 알레르기항원성 및 비알레르기항원성 구성성분의 복잡하고 표준화하기 어려운 혼합물이 특이적 IgE 항체를 함유할 수 있는, 환자의 혈액 샘플에 대해 시험되거나 환자의 피부에 제시된다.
단백질, 지질, 탄수화물 및 다른 화학적 화합물의 이러한 복잡한 혼합물 중에서, 각각의 알레르기항원 원천에서 단지 상대적으로 적은 수의 단백질 또는 단백질 패밀리가 면역계가 항체 반응을 초래할 수 있게 할 수 있는 방식으로 실제로 알레르기항원인 것으로 공지되어 있다.
관련성이 없는 물질에 대한 대다수에서의 실제로 관련된 항원의 이 분획은 고체 지지체 물질의 결합 능력에 대한 높은 요구를 제기하며, 전형적으로, 알레르기항원 분획의 추가 농축(enrichment) 및 비알레르기항원성 물질의 제거 없이, ELISA 플레이트와 같은 단순한 평평한 표면 상에서 알레르기 진단을 위한 민감하고 특이적인 IgE 검정을 하는 것이 가능하지 않다.
지난 30년에 걸쳐, 알레르기의 진단에 관련 있는 많은 소위 분자 항원이 확인되었으며, 천연 원천으로부터 정제되거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조되었다. 분자 항원의 사용은 표준화로부터 분자 교차 반응성의 더 양호한 이해 및 예측, 환자의 위험 분류 및 적응 치료에 이르기까지 많은 이점을 갖는다. 그러나, 임의의 일상적인 시험에 대한 큰 단점은 첫째, 시험을 위해 파라미터 선택에서 훨씬 많은 의사의 전문 지식이 필요하다는 점이다. 둘째, 이는 상업적 시장의 99% 초과를 여전히 차지하는, 단일 파라미터 시험의 통상적인 수단에 의해 시험될 경우 환자당 상당히 더 높은 비용을 창출한다. 더 나아가, 환자로부터 채취되어야 하는 혈액의 양은, 수행된 각각의 통상적인 단일 파라미터 시험으로 선형 방식으로, 전형적으로 파라미터당 50 내지 100 마이크로리터의 범위로 상승할 것이다.
결과적으로, 다양한 시행으로 통상적인 소형화된 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) (MTP) 기반 ELISA 시스템으로부터 서스펜션 비드 어레이(suspension bead array) 또는 마이크로어레이(microarray)에 이르는 다양한 기본 기술을 이용하여, 몇몇 군에 의해 다중 파라미터 (다중화(multiplexed)로도 언급됨) 검정 시스템이 개발 및 공개되어 있다.
예를 들어, WO2004/104586A1은 반응성 표면을 가진 바이오칩에 부착된, 포획 시약에 대한 알레르기항원-특이적 항체 (예를 들어, 단백질 A, 단백질 G 또는 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 항체)의 결합에 기초하여 상기 항체를 검출하기 위한 방법 및 장치를 기재한다. 그 다음에, 결합된 알레르기항원-특이적 항체를 표지된 알레르기항원-특이적 항체에 의해 검출되는, 그 각각의 알레르기항원과 접촉시킨다.
US2005/079592A1은 그의 표면 상에 고정된 단백질과 같은 생물학적 물질을 가진 비드가 고체상 기재(base) 상의 특정 위치 상에 분출되는(ejected) 다중화 비드 어레이를 제조하기 위한 장치를 개시한다.
샘플에서 복수개의 분석물의 분석을 위한 검정은 US6268222B1에 추가로 기재되어 있다. 검정은 그의 표면 상에 복수개의 더 작은 형광 표지된 중합체 입자 또는 나노입자(nanoparticle)를 갖는 코어 또는 담체 입자에 기초한다.
US2002/0015666A1은 대용량 저장 설비(mass storage arrangement)로부터 수많은 선택된 시약을 저장 및 분배(dispensing)하기 위한 시스템 및 공정을 제공하고 문헌 [Tai et al. ((Analytical Biochemistry, vol. 391, no. 2, August 2009, p. 98-105)]은 다중화 면역검정을 위한 마이크로유체성 카트리지(microfluidic cartridge) 및 시스템을 기재한다.
서스펜션 비드 어레이는 이론적으로 작은 부피에서 높은 정도의 다중화(multiplexing)를 가질 수 있지만, 실제 적용은 전형적으로 20개 미만의 파라미터로 제한된다. 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 기질의 고유 가변성으로 인해 종종 용혈성, 지방혈성 또는 황달성 샘플이 시험을 위해 도착하는 모든 일상적인 실험실에서의 사용이 어렵게 된다. 더 나아가, 결합 능력은 순수 항원만으로 작업할 수 있게 하고, 예를 들어 IgE 검출과 같은 민감도가 요구되는 적용에서 조(crude) 알레르기항원 추출물로는 아니다. 게다가, 계측은 FACS (형광 활성 세포 분류(fluorescent activated cell sorting)) 또는 몇몇 레이저 채널 및 공초점 레이저 스캐닝 정밀도를 필요로 하는, 다른 고가의 기술에 기초한다.
유리 슬라이드 상에 또는 마이크로타이터 플레이트 내부의 통상적인 마이크로어레이는 각각의 환자 샘플에 대해 필요에 따라 요구시 즉시(on-demand) 시약을 혼합하는 유연성 및 각각의 파라미터를 근본적으로 최적화하는 가능성을 희생함으로써 서스펜션 비드의 일부 한계를 극복할 수 있다. 사실상, 단백질 항원의 결합을 위해 평평하고 동질적으로 활성인 표면을 사용하여야 하는 것은 고급의 성능을 달성하는 중요한 억제제이다. 게다가, 제조는 고가일 뿐만 아니라 재현성 있는 방식으로 분배되거나 침착될 필요가 있는 피코-리터 양으로 인해 매우 복잡하다. 현재 시장에 나와 있는 기술 제공자로는, 연간 수백만개의 고품질 진단용 마이크로어레이를 제조하기 위한 어떠한 실제 대량 신속 처리가 가능한 계측기도 없다. 배치(batch) 크기는 전형적으로 작고 (수백 이하), 가변성 계수 (CV)는 최첨단의 자동화 면역 분석기에 비해 높다. 서스펜션 비드 기술과 유사하게, 마이크로어레이는 대부분 형광 또는 발광 판독과 함께 작동하며, 이와 관련하여 또한 고가의 계측기를 필요로 한다. 소형화된 검정 형식으로 인해, 자동화는 간단하지 않으며 정교한 장비 및/또는 마이크포유체성 설계를 필요로 하며, 이는 다시 일상적인 실험실 샘플로는 문제가 될 수 있다.
측방 유동형(lateral flow type) 시험과 같은 다른 다중 파라미터 시험은 파라미터당 비용이 상대적으로 낮은 이점을 가지나, 민감도, 재현성의 부족으로 손상 받고 있으며, 거의 자동화되어 있지 않으며 시험 스트립당 5-20개 초과의 파라미터를 가질 수 없다.
따라서, 임상 화학 시장의 이 분야에는 현재, 모든 필요성, 특히: 시험당 저렴한 비용, 높은 정도의 다중화 (> 200), 재현성, 및 우수한 기술적 성능 특성 (CV, 민감도, 특이성, 측정 범위, 정량화 등)을 제공할 수 있는 어떠한 이용 가능한 기술도 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 재현성 및 우수한 기술적 성능 특성이 현저하게 개선되지만 많은 파라미터를 포함하고 매우 비용 효율적으로 시험을 초래할 가능성을 보존하는 항원 어레이를 제공하는 것이다.
발명의 개요
상기 목적은 청구된 주제에 의해 구체적으로 해결된다.
분자 연구 및 다중의 면역-검정 기술의 진보가 본원에서 조합되어 시험관내 시험을 위한 원스톱숍(one-stop-shop) 제품, 즉 고체 지지체 상에 고정화된 항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 항원 어레이를 형성한다. 이 신규한 어레이 형식 및 그의 제조 및 사용 방법은 단일 파라미터 검정으로부터 최첨단의 방법의 이점, 주로 각각의 개개 항원에 대한 커플링을 최적화하면서, 그러나 특히 시험당 비용, 제조의 확장성, 또는 파라미터당 혈청 요구량과 관련하여, 대안적인 방법과 비교하여 상당한 트레이드-오프를 도입함이 없이, 상당한 다중화의 가능성을 지닌 기술적 검정 성능을 기초로 하여 개발되었다. 마이크로어레이 시험에서와 같은 소형화된 형식은 비용 효과적이지만 고성능의 시험 형식에 부적합하므로, 아래에 상세히 기재된 항원 어레이는 각각의 항원-커플링된 비드 집단에 대한 구별되는(discrete) 실체(entities)를 형성하나, 통상적인 마이크로어레이보다 상당히 큰 차원을 갖는, 고정화된 나노입자 또는 마이크로입자(microparticle)로 이루어진 시험관내 마크로 어레이(macro array) 시험으로 간주될 수 있다.
이 신규한 기술은 알레르기항원과 같은 임의의 항원 (예를 들어, 검출 항원)을 고체상에 개별적으로 최적화되게 커플링할 수 있게 하여, 민감하지만 견고한 검정 설계를 가능하게 하며, 비용 효과와 개개의 시험 파라미터 성능 사이의 트레이드-오프를 제외시킨다. 본원에 제공된 항원-어레이 및 방법은 일반적인 민감도를 개선시키나, 특히 2상의 커플링 접근법(two phased coupling approach) (먼저 입자에 그리고 두 번째로 고체상 또는 다공성 및 3D 구조화된 고체상에)이 검정 인큐베이션 단계 동안에, 항체가 결합할 수 있는 항원 제시 표면의 다중 증폭을 창출하는 한에 있어서, 이질적 원천 물질로 작업시 민감도를 개선시킨다. 최첨단의 자동화 및 소프트웨어 솔루션은 시약을 보완한다.
검정의 견고성, 민감도 및 특이성뿐만 아니라 그의 용이한 사용과 조합된 지능적으로 설계된 항원 패널을 사용하는 것은 결과의 더 양호한 임상적 해석 및 교차 반응성의 예측, 및 따라서 효과적인 치료 방법의 선택을 제공한다.
따라서, 본원에 개시된 어레이 및 방법은 알레르기 진단의 일상뿐만 아니라 감염성 또는 자가면역 질환과 같은 특이적이고 신뢰할 만한 항체 검출에 기초한 다른 면역학적 조건을 변화시킬 잠재력을 갖는 처음 시험을 제공한다. 구체적으로 알레르기 진단과 관련하여, 현재 시험관내 검사는 진단 과정에서 두 번째 또는 세 번째 단계로서 수행되나, 본원에 기재된 바와 같은 포괄적인, 고해상도이지만 민감한 선별 검사는 확증적인 병력, 피부 검사 또는 도발(provocation)에 의해 단지 추적될, 첫 번째 수준의 도구가 될 수 있다. 상기 이점은 전체 가치 사슬에 적용될 것이나, 가장 중요한 것은 면역학적 병태를 앓고 있는 환자에게 적용될 것이다.
한 측면에서 고체 담체 상에 고정된 항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 항원 어레이로서, 여기서 각각의 군이
(i) 하나의 검출 항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii) 검출 항원의 세트로 코팅된 비드를 포함하고, 바람직하게는 여기서 고체 담체가 시트 또는 플레이트이고, 검출 항원이 알레르기항원, 감염 마커 또는 자가항원인 것인 항원 어레이가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 검출 항원이 핵산 및/또는 아미노산, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 항체 또는 DNA 분자, 또는 유기 또는 비유기 화학적 화합물로 구성된 생체 분자이다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 알레르기항원이다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 감염 마커이다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 자가항원이다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항원 또는 생물학적 물질로부터 단리되고 정제된 항원이다.
비드가 검출 항원의 세트로 코팅되는 일부 실시양태에서, 검출 항원의 상기 세트는 하나 초과의 항원을 함유하는 생물학적 원천 물질로부터의 추출물 또는 용해물로부터 수득되거나, 이러한 추출물 또는 용해물의 정제된 분획 또는 세포 배양 유래 물질의 정제된 분획으로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 단일 에피토프, 몇몇 항체 결합 에피토프를 가진 단일 거대 분자 또는 여러 가지의 에피토프를 함유하는 상이한 항원과 다양한 단백질의 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비드는 마이크로비드(microbead) 또는 나노비드(nanobead)이다. 구체적으로, 비드는 직경이 5 내지 500 nm, 바람직하게는 직경이 200 내지 500 nm인 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 비드는 라텍스 비드, 중합체 플라스틱 비드, 바람직하게는 폴리스티렌 비드, 생체 적합성 중합체로 구성된 비드, 또는 유리 비드, 바람직하게는 실리카 비드이다. 구체적으로, 비드의 표면은 다공성 또는 비다공성이다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 비드에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링된다. 구체적으로, 검출 항원은 비드에 비공유적으로 수동 흡착에 의해, 바람직하게는 소수성 및/또는 정전기적 부착(electrostatic attachment)에 의해 커플링된다.
일부 실시양태에서, 검출 항원은 항원 스페이서를 통해 커플링된다. 구체적으로, 검출 항원은 결합된 항원 상에 제시된 에피토프의 제시를 위한 바람직한 배향을 창출하는 방식으로 커플링된다.
일부 실시양태에서, 고체 담체는 다공성 또는 비다공성 물질의 시트 또는 플레이트, 바람직하게는 니트로셀룰로스 시트, 더 바람직하게는 적층(laminated) 니트로셀룰로스 시트이다.
일부 실시양태에서, 어레이는 적어도 25개의 상이한 군을 포함한다. 구체적으로, 어레이 내에 또는 하나의 군 내에 비드는 동일하거나 상이한 유형이다. 일부 실시양태에서, 항원-코팅된 비드의 군은 접촉 방법 또는 비접촉 방법을 사용하여, 바람직하게는 솔레노이드(solenoid) 분배 시스템을 사용하여 고체 담체 상에 고정된다. 구체적으로, 각각의 군은 직사각형 어레이 또는 오렌지-패킹된 어레이(orange-packed array)에서, 바람직하게는 mm2당 1개의 어드레스 가능한 요소(addressable element)의 밀도로 어드레스 가능한 요소로서 고정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 어레이의 비드는 동일하거나 상이한 유형이다. 구체적으로, 비드의 상이한 군의 비드는 동일한 유형일 수 있거나 (예를 들어, 항원 어레이의 비드의 모든 군은 200-500 nm 사이의 직경을 가진 폴리스티렌 비드를 포함한다), 비드의 상이한 군의 비드는 상이한 유형일 수 있다 (예를 들어 군 1은 폴리스티렌 비드를 포함하고, 군 2는 유리 비드를 포함한다). 또한 하나의 군 내의 비드는 동일하거나 상이한 유형일 수 있다.
한 측면에서, 고체 담체 상에 고정된 알레르기항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 알레르기항원 어레이로서, 여기서 각각의 군이
(i)
하나의 알레르기항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii)
알레르기항원의 세트, 바람직하게는 알레르기항원 추출물로 코팅된 비드를 포함하고, 바람직하게는 여기서 고체 담체가 시트 또는 플레이트인 것인, 알레르기항원 어레이가 본원에 제공된다.
추가 측면에서 검출 항원 또는 검출 항원의 세트에 특이적인 면역글로불린을 검출하는 방법으로서, 바람직하게는 여기서 검출 항원 또는 검출 항원의 세트가 알레르기항원, 감염 마커 또는 자가항원이며,
(i)
본원에 기재된 항원 어레이 중 어느 하나에 따른 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약으로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로 어레이를 신호 발생 시약(signal generation reagent)으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린은 알레르기와 연관된 IgE 항체이다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린은 감염 또는 자가면역 질환과 연관된 IgG 항체이다.
(i)
본원에 기재된 바와 같은 알레르기항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약, 바람직하게는 IgE-특이적 항체 또는 IgE-특이적 앱타머(aptamer)로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계.
를 포함하는, 알레르기와 연관된 IgE 항체를 검출하는 방법이 본원에 추가로제공된다.
일부 실시양태에서, 샘플은 대상체 또는 대상체의 풀(pool)로부터의 생물학적 유체, 바람직하게는 혈청, 전혈 또는 가공 혈액, 비강 유체(nasal fluid) 또는 소변, 세포 용해물 또는 조직 균질액(homogenate)이다.
일부 실시양태에서, 검출 시약은 면역글로불린에 특이적인 친화도 결합제, 바람직하게는 항체 (예를 들어, 항-IgE 또는 항-IgG 항체), 앱타머 (예를 들어, IgE-특이적 앱타머 또는 IgG-특이적 앱타머) 또는 애피바디(affibody)이다. 구체적으로, 검출 시약은 (i) 바람직하게는 착색 또는 형광 화합물로 또는 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자로 직접 표지되거나; (ii) 효소에 접합된다 (예를 들어, 직접 검출 가능한 표지를 갖거나 효소에 접합된 항-IgE 또는 항-IgG 항체).
일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 방법의 단계 (iv)에 따라 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약이 효소에 접합되고 신호 발생 시약이 상기 효소에 대한 기질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 방법의 단계 (iv) 후에 본원에 기재된 항원 어레이를 정지 용액으로 인큐베이션하는 단계, 즉 항원 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션한 후 정지 용액을 첨가하여 신호 발생을 종결시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 또 다른 측면은 본원에 기재된 항원 어레이 중 임의의 것을 위한 시험 챔버(test chamber), 액체 폐기물 저장소(reservoir), 및 임의로 바코드를 포함하는 카트리지(cartridge)이다. 카트리지는 검출 시약, 신호 발생 시약, 정지 용액, 1종 이상의 완충제 및 1종 이상의 대조군 샘플 중 어느 하나 이상을 위한 저장소 또는 통합 바이알(integrated vial)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항원 어레이 중 임의의 것, 검출 시약, 1종 이상의 완충제, 1종 이상의 대조군 샘플, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서 키트를 사용하기 위한 사용 설명서, 및 임의로 신호 발생 시약을 포함하는 키트가 본원에 추가로 제공된다. 키트는 정지 용액을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 카트리지용 챔버, 피펫터(pipettor) 및 신호 검출용 기기를 포함하는 장치가 본원에 제공된다.
도 1A 및 도 1B : 알레르기 개인 (1A) 또는 음성 대조군 (1B)으로부터의 인간 혈청 풀로 표준 검정을 수행하고 평판형(flatbed) 스캐너로 영상을 스캔한 후, 245개의 알레르기항원, 특이적 IgE 측정 및 증가하는 농도의 5개의 IgE 표준 (우측 상단 구석)의 B/W 표시의 표시. 원래 영상은 16-비트 그레이스케일(grayscale) TIFF 형식이었다.
도 1C: 도 1A 및 도 1B에 상응하는 알레르기항원 위치의 개략적 레이아웃(layout). 각각의 알레르기항원 특징 형상(allergen feature)은 직경이 대략 600 미크론이고, 상기 형상 사이의 거리는 각각의 방향으로 1 mm였다.
도 2: 참조 방법과 비교한 시험 평가.
도 3: 고체 지지체 상에 직접 고정화된 분자상 알레르기항원을 가진 어레이와 동일한 유형의 고체 지지체 상에 고정화되고 동일한 분자상 알레르기항원과 커플링된 나노입자를 가진 어레이의 비교. 표 4로부터의 결과의 그래픽 표시.
도 4: 복숭아로부터의 주요 알레르기항원인 Pru p 3에 대해 8개의 상이한 샘플이 양성이고 하나가 음성인 특이적 IgE 측정.
도 5 : 특이적 IgE 측정에 이용 가능한 다중 파라미터 검정의 기술 사양 및 비교. (*) 정의에 의한 특이적 IgE 측정은 개개 알레르기항원에 대한 어떠한 국제 참조 표준 제제가 이용 가능하지 않으므로 반정량적(semi-quantitative)이다. (**) >100개 샘플을 시험하고 알레르기항원 성분과 알레르기항원 추출물을 ImmunoCAP 및 ImmunoCAP ISAC로 비교한 평균 선형 상관 관계.
도 6 : 알레르기항원 코팅된 비드의 동일한 제제를 사용하여 0일 및 330일째 시험된 샘플의 IgE 측정의 비교.
도 1C: 도 1A 및 도 1B에 상응하는 알레르기항원 위치의 개략적 레이아웃(layout). 각각의 알레르기항원 특징 형상(allergen feature)은 직경이 대략 600 미크론이고, 상기 형상 사이의 거리는 각각의 방향으로 1 mm였다.
도 2: 참조 방법과 비교한 시험 평가.
도 3: 고체 지지체 상에 직접 고정화된 분자상 알레르기항원을 가진 어레이와 동일한 유형의 고체 지지체 상에 고정화되고 동일한 분자상 알레르기항원과 커플링된 나노입자를 가진 어레이의 비교. 표 4로부터의 결과의 그래픽 표시.
도 4: 복숭아로부터의 주요 알레르기항원인 Pru p 3에 대해 8개의 상이한 샘플이 양성이고 하나가 음성인 특이적 IgE 측정.
도 5 : 특이적 IgE 측정에 이용 가능한 다중 파라미터 검정의 기술 사양 및 비교. (*) 정의에 의한 특이적 IgE 측정은 개개 알레르기항원에 대한 어떠한 국제 참조 표준 제제가 이용 가능하지 않으므로 반정량적(semi-quantitative)이다. (**) >100개 샘플을 시험하고 알레르기항원 성분과 알레르기항원 추출물을 ImmunoCAP 및 ImmunoCAP ISAC로 비교한 평균 선형 상관 관계.
도 6 : 알레르기항원 코팅된 비드의 동일한 제제를 사용하여 0일 및 330일째 시험된 샘플의 IgE 측정의 비교.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 구체적 용어는 하기 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 면역계가 그에 대한 항체 반응을 초래할 수 있고, 가능하게는 항체가 적절한 생체내 조건 하에 그에 결합하는 경우 생물학적 반응을 촉발할 수 있는 물질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 항원은 전체 표적 분자 또는 항원 결합 부위에 의해 인식되는 이러한 분자의 단편을 지칭하여야 한다. 구체적으로, 항원의 하부 구조, 예를 들어 면역학적으로 관련이 있는, 일반적으로 "에피토프"로 지칭되는 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는, 이러한 항원 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.
용어 "검출 항원", "검출될 항원"또는 "검출 가능한 항원"은 항원 특이적 반응, 예컨대 항체-항원 반응을 결정하는 항원을 지칭한다. 용어 "항원", "검출 항원", "검출될 항원" 및 "검출 가능한 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "검출 항원의 세트"는 병태에 특이적인 반응을 결정하는 하나 이상의 항원을 지칭한다. 병태는 질환 또는 장애 또는 그에 대한 소질, 예컨대 알레르기 또는 자가면역 질환일 수 있으며; 상기 용어는 임의의 신체적 및/또는 임상적 증상을 나타내지 않는 병태를 포함한다. 상기 병태에 특이적인 반응은 상기 병태에 특징적이고 상기 병태와 연관되는 적어도 하나의 항체 (예를 들어, 병태가 알레르기인 경우 알레르기항원에 특이적인 IgE 항체)와의 항체-항원 반응일 수 있으며, 상기 병태는 이러한 반응에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항원의 세트"는 동일한 생물학적 원천 물질로부터 수득된, 예를 들어 세포 용해물, 세포 또는 조직 균질액 또는 그의 정제된 분획으로부터 수득된 하나 이상의 항원을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 그의 면역학적 특이성을 결정하는 항원의 부분을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 에피토프는 특히 특이적 결합 파트너를 완전히 구성하거나 항체의 결합 부위에 대한 특이적 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭하여야 한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드성 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 그의 유도체 및 그의 임의의 조합물로 구성될 수 있다.
에피토프는 선형 에피토프이거나 입체형태적(conformational) 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 1차 서열(primary sequence)의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 인접하거나 중복될 수 있다. 입체형태적 에피토프는 3차 구조를 형성하기 위해 폴리펩티드를 폴딩함으로써 합쳐진 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며 아미노산은 선형 서열에서 서로 반드시 인접할 필요는 없다. 구체적으로, 그리고 폴리펩티드 항원과 관련하여, 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 1차 서열에서 분리된 2개 이상의 구별되는 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 하나, 폴리펩티드가 천연(native) 단백질/항원에 폴딩되는 경우 분자의 표면 상에 일관된 구조로 어셈블리된다.
흔히, 에피토프는 자연 발생 항원에서 폴리펩티드 또는 폴리사카라이드이다. 통상적으로, B-세포 에피토프는 적어도 약 5개의 아미노산을 포함할 것이나 3-4 개의 아미노산만큼 작을 수 있다. 에피토프는 면역 B 및 T 세포에 의해 인식되는 형태를 나타내며, 비항원(non-antigen) 유래 펩티드 및 천연 항원 내에 존재하는 동일한 에피토프 형태를 보유하는 다른 분자에 의해 또한 표시될 수 있다. 에피토프 형태를 가진 요소의 예는 앱타머이다. 앱타머는 면역학적 에피토프를 모방할 수 있는 형태를 제공하는 분자이다. 번역 후 변형을 나타내는 펩티드 또는 분자와 같은 분자의 부분이 개개 에피토프를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
용어 "어레이"는 각각의 군이 공간적으로 분리된 어드레스 가능한 요소를 나타내는 항원-코팅된 비드의 군의 집합을 말한다. 이러한 요소 또는 분자 실체는 각각의 요소가 구별되는 X 및 Y 좌표에 존재하는 평면 표면 상에 고정화되거나, 마이크로타이터 플레이트 내에 함유된 어레이와 같이 공간적으로 어드레스 가능할 수 있다. 코딩으로도 공지된 이러한 공간적 어드레스 가능도(addressability)에 대해, 분자의 위치는 고정되어 있고, 그 위치는 동일성과 상관 관계가 있으며, 이로 인해, 어레이에서 시험될 샘플 내에 함유된 항체의 특이성을 확인할 수 있게 한다. 이러한 유형의 공간적 어레이는 일반적으로 평면 기판 상에 합성되거나 스폿팅되어, 작은 영역에 조밀하게 레이 아웃된 다수의 상이한 요소를 초래한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "입자", "나노입자", "구", "미세구", 및 "비드"는 상호교환 가능하며 원형, 타원형 또는 구형 형상의 작은 불활성 지지체를 지칭하며, 이들은 항원 (검출 항원) 또는 항원의 세트 (검출 항원의 세트)로 코팅하기 쉽다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비드의 군"은 항체-항원 반응에서 상기 항원에 특이적인 항체로 확인될 수 있는 특이적 검출 항원으로 커플링되거나 코팅된 (본원에서 상호교환적으로 사용됨) 비드의 집단 또는 세트의 검출 항원 중 하나에 특이적인 적어도 하나의 항체로 확인될 수 있는 검출 항원의 세트로 코팅된 비드의 집단을 지칭한다.
용어 "비드의 유형"은 그의 크기, 물질, 표면 코팅의 분자 특성, 소수성, 전하, 표면 특성 (다공성 또는 비다공성 표면), 커플링 화학 또는 화학적 링커/스페이서 화학에 의해 정의되는 비드의 특성을 지칭한다. 동일한 유형의 비드는 동일한 크기, 물질, 표면 특성을 갖고 항원 커플링에 동일한 화학이 사용된다. 상이한 유형의 비드는 이들 특성 중 적어도 하나가 상이한 비드를 고려한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지지체", "고체 지지체", "담체", "고체 담체" 또는 "고체상"은 어드레스 가능한 어드레스 가능한 요소/분자 실체 (항원 코팅된 비드)가 침착될 수 있고, 검정 및 반응을 수행하기 위해 고정화될 수 있는 임의의 고체 표면을 지칭한다.
용어 "고정화된" 또는 "고정된"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 물질 또는 입자, 구체적으로 항원-코팅된 비드가 고체 지지체에 공유적으로나 비공유적으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 용어는 물질 또는 입자가 상대적으로 고정되어 있어 고체 지지체로 수행되는 인큐베이션 및 또는 세척 단계 동안에 방출되지 않는 것을 지칭한다.
용어 "면역글로불린 (Ig)"은 혈청의 글로불린 단백질의 면역-부여 부분, 및 동일한 기능적 특성을 갖는 다른 당단백질을 지칭한다. 그들은 전형적으로, 이황화 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 폴리펩티드 쇄 - 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 포함한다.
용어 "IgG"는 혈청에서 발견되는 Ig 이소형 중 하나를 지칭하며, 이는 항원에 반응하여 생성되는 주요 항체이며 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 네 가지 주요 아형을 갖는다.
용어 "IgE"는 혈청에서 발견되는 Ig 이소형 중 하나를 지칭하며, 이는 비만 세포 및 호염구에 단단히 결합하며, 항원에 추가로 결합하는 경우, 히스타민 및 즉각적인 과민증의 다른 매개체의 방출을 야기한다. Ig의 이러한 이소형은 고초열, 천식 및 아나필락시스와 같은 우세한 제I형 알레르기 반응(predominant type I allergic reaction)에서 주요 역할을 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 링커 서열을 갖거나 갖지 않는, 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로서 이해되는, 항체 도메인으로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩티드는 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어진 베타-배럴(barrel) 구조를 포함한다면 항체 도메인으로서 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조일 수 있거나 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형되어, 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예컨대 안정성 또는 기능적 특성, 예컨대 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에 대한 결합을 변형시킬 수 있다. 용어 "항체"는 인간 종, 예컨대 인간, 뮤린, 토끼, 래트, 염소, 라마, 암소 및 말 등을 포함한 포유 동물, 또는 암탉과 같은 조류를 포함한 동물 기원의 항체에 적용되며, 이 용어는 특히 동물 기원의 서열에 기초한 재조합 항체를 포함하여야 한다.
항체는 무손상 면역글로불린으로서, 또는 예를 들어 경쇄 및 중쇄 가변 영역만을 함유하는 Fv 단편, 가변 영역을 함유하는 Fab 또는 (Fab)'2 단편 및 불변 영역의 부분, 단쇄 항체 등을 포함한, 여러 가지의 형태의 변형으로서 존재할 수 있다. 항체는 동물 (특히 마우스, 염소, 토끼 또는 래트) 또는 인간 기원일 수 있거나 키메라일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이들 다양한 형태를 포함하며, 이들은 전체 항체의 변형에 의해 생성되고/거나 재조합 DNA 방법론을 사용하여 신규로(de novo) 합성될 수 있다. "모노클로날" 항체는 차위의 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 특이성 및 친화도가 동일한, 개개 항체 또는 개개 항체의 집단을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표지"는 "표지된" 항체/항체 단편 또는 "검출 항체"를 생성하기 위해 항체 또는 항체 단편에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그것만으로 검출 가능할 수 있으며, 예를 들어 방사성 동위 원소 표지, 색소 또는 형광 표지, 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자, 또는 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "추출물"은 추출물이 단리되는 생물학적 물질과 같은 물질을 용매로 처리하고, 그 후 용매가 제거됨으로써 수득된, 전형적으로 농축된 형태의 하나 이상의 물질을 지칭한다. 용어 "추출물"은 또한 일차 추출물을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 후속 정제 공정에 적용함으로써 수득된 하나 이상의 물질을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 추출물은 단백질과 다른 분자의 혼합물을 포함한다.
알레르기항원 추출물은 전형적으로 생물학적 원천 물질로부터 알레르기항원(들)을 추출하여 제조된다. 생물학적 원천 물질은 전형적으로 진균, 식물계 또는 동물계의 다세포 생물, 또는 일부 경우에 박테리아 기원의 다세포 생물로부터의 다세포 또는 비세포 물질이다. 이러한 알레르기항원 추출물은 기계적 균질화 절차 (예를 들어 격렬한 혼합 및 교반)를 사용한 수용성 물질의 수성 추출에 뒤이어 여과 또는 분획화(fractioning)와 같은 정제 단계에 의해 용액, 즉 추출물을 수득함으로써 수득될 수 있다. 그 다음에 추출물은 추가 정제 및/또는 가공 예컨대 동결-건조에 적용하여 실질적으로 모든 물을 제거할 수 있다. 일반적으로, 알레르기항원 추출물은 단백질과 다른 분자의 혼합물을 포함한다.
본 맥락에서 용어 "알레르기항원"은 알레르기 반응, 즉 개체에게 그의 반복적 노출 직후 IgE 매개된 반응을 유도할 수 있는, 임의의 자연 발생 단백질, 그의 이소형, 변형 단백질, 재조합 단백질, 재조합 변이체 단백질, 또는 그의 임의의 단백질 단편 또는 단백질의 혼합물을 말한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알레르기항원의 세트"는 동일한 생물학적 알레르기항원 원천 물질로부터 수득된, 예를 들어 생물학적 알레르기항원 원천 물질의 알레르기항원 추출물로부터 수득된 하나 이상의 알레르기항원을 지칭한다.
용어 "생물학적 원천 물질" 또는 "생물학적 물질"은 임의의 생명체로부터 기원하는 임의의 물질을 지칭한다. 그것은 특히 많은 이전의 원천 (하나 이상의 항원을 포함)의 분리된 세포, 조직의 단편(piece), 박테리아, 바이러스, 효모, 및 하위 분획(sub-fraction) (예컨대 분리된 핵 또는 세포질)을 고려한다.
본원에서 사용된 바와 같은 표현 "생물학적 알레르기항원 원천 물질"은 하나 이상의 알레르기항원을 포함하는 임의의 생물학적 물질을 지칭한다. 이러한 물질의 예는 진드기(acarids) PMB (순수 진드기 몸체(Pure Mite Body)) 또는 WMC (전체 진드기 배양물(Whole Mite Culture)), 예를 들어 풀(grass), 초본, 잡초 및 나무로부터의 지방 제거된(defatted) 또는 지방 제거되지 않은(non-defatted) 꽃가루, 동물 털 및 비듬, 생가죽(pelt), 진균 균사체 및 포자, 곤충 몸체, 독 또는 타액 및 식품이다.
용어 "자가면역 질환"은 병원성 자가항체와 연관된 임의의 질환, 아마 십중팔구 T 세포 매개되는 질환 및 병원성 과정에 대한 증거가 단지 직접적인 질환을 포함한다. 상기 장애는 급성 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 호중구 감소증, 자가면역 적혈모구 감소증, 중증 근무력증, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 다발성 경화증, 항-mag 활성을 가진 모노클로날 감마병증, 부신백질이영양증, 그레이브스병(Grave's disease), 전신 홍반성 루프스, 항-카르디올리핀 항체 및 반복 유산(recurrent abortion), 난치성 다발성 근염, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 펠티 증후군(Felty's syndrome), 궤양성 대장염, 크론병(Crohn's disease), 특정 사구체 신염, ANCA 양성 전신 혈관염, 가와사키병(Kawasaki's disease), 항-인자 VIII 자가면역 질환 및 버드샷 망막증(birdshot retinopathy)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "공유 결합" 또는 "공유 상호 작용"은 원자 사이에 전자 쌍을 공유함으로써 생성된 결합 또는 상호 작용을 지칭한다. 공유 결합/상호 작용은 원자 결합, 동극 결합, σ-σ 상호 작용, σ-π-상호 작용, 2-전자-대-중심 결합, 단일 결합, 이중 결합, 삼중 결합, 뿐만 아니라 이들 상호 작용/결합의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 언급된 상호 작용/결합은 극성이거나 분극(polarized)될 수 있거나, 비극성 또는 비분극될 수 있다.
"비공유 결합"은 원자와 분자 간의 회합, 예컨대 이온 상호 작용 (예를 들어, 쌍극자-쌍극자 상호 작용, 이온 쌍형성(pairing), 및 염 형성), 수소 결합, 비극성 상호 작용, 포접 복합체(inclusion complex), 포접화(Clathration), 반 데르 발스 상호 작용 (예를 들어 pi-pi 스태킹(stacking)) 및 그의 조합을 지칭한다.
용어 "수동 흡착", "흡착" 또는 "흡수"는 기체, 액체 또는 용해된 고체로부터 표면으로 원자, 이온 또는 분자를 부착시키는 것을 지칭한다. 흡착 메커니즘은 소수성 부분의 흡착된 분자와 표면 사이의 소수성 (반 데르 발스, 런던 타입 (London Type)) 인력에 주로 기초한다. 대부분의 소수성 분자는 수동 흡착에 의해 표면에 부착한다. 소수성이 덜한 분자 (또는 보다 친수성인 표면, 예컨대 -COOH 또는 NH2 변형된 표면)의 경우에, 이온 상호 작용 및 소수성 상호 작용 둘 다를 통한 부착이 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "정전기적 상호 작용" 또는 "정전기적 부착"은 반대 전하의 성분이 서로 끌어 당기는 경우 인력으로 인해, 대전된 성분, 분자 또는 이온 사이에서 발생하는 임의의 상호 작용을 지칭한다. 예는 이온 상호 작용, 공유 상호 작용, 이온과 쌍극자 (이온과 극성 분자) 사이의 상호 작용, 두 쌍극자 사이의 상호 작용 (극성 분자의 부분 전하), 수소 결합 및 런던 분산 결합 (분극 가능한 분자의 유도된 쌍극자)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"검출 가능한 신호"는 육안 또는 기구적 방법에 의해 측정될 수 있는 물리적 또는 화학적 신호를 지칭하며, 비색계, 형광성, 전기 및 화학 발광 신호를 포함한다.
"대조군 값" 또는 "대조군 신호"는 대상체 또는 대상체의 풀의 샘플로 수득된 신호가 비교될 수 있는 참조 값을 지칭한다. 음성 대조군 신호는, 예를 들어, (i) 어떠한 면역글로불린(들)도 함유하지 않는 샘플로, (ii) 임의의 항원으로 코팅되지 않은 비드, 즉 고체 지지체 상에 고정화된 코팅되지 않은 비드로, iii) 그 위에 어떠한 비드도 고정되어 있지 않은 고체 지지체 물질 그것 만으로, 또는 (iv) 건강한 개체 또는 건강한 개체의 풀 또는 군으로부터의 샘플로 수득될 수 있다. "양성 대조군 신호"는, 예를 들어, 특정된 양의 분석물 (즉, 특정 항원/알레르기항원에 특이성을 가진 총 면역글로불린 또는 한정된 면역글로불린)을 가진 상업용 참조 샘플, 표준 검정에서 양성으로 입증되거나 양성 반응을 보인 샘플, 또는 검출될 특정된 양의 면역글로불린으로 커플링되고 고체 지지체 상에 고정된 비드로 수득될 수 있다.
용어 "샘플"은 사실상 임의의 액체 샘플을 지칭한다. 샘플은 임의의 원하는 원천, 예컨대 생리적 유체, 예를 들어, 혈액, 타액, 안구 수정체의 액(ocular lens fluid), 대뇌 척수액, 땀, 소변, 우유, 복수 액, 점액, 활액, 복강 액, 양수 등으로부터 유래될 수 있다. 액체 시험 샘플은 예컨대 혈청 또는 혈장을 혈액으로부터 준비하거나, 점성 액체를 희석하는 등, 사용 전에 사전 처리될 수 있으며; 처리 방법은 또한 분리, 여과, 증류, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 및 시약의 첨가를 수반할 수 있다. 게다가, 일단 액체 배지를 형성하도록 변형되면 고체를 사용할 수 있다. 상기 용어는 시험관내 검정에 사용될 수 있는 임의의 체액에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 또는 "환자"는 온혈 포유동물, 특히 인간 또는 비인간 동물을 지칭하여야 한다.
용어 "생체 분자"는 생명체의 부분인 임의의 유기 분자를 지칭한다. 생체 분자는, 그 중에서도, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 글리코실화된 분자, 지질 등을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어는 또한 생체 분자의 구조 및 결합 특이성을 모방한 유기 분자, 예를 들어, 앱타머에 적용되므로, 생체 분자와 동일한 항체에 의해 인식된다.
"재조합 DNA 기술"은, 예를 들어, 실험실 매뉴얼 [Laboratory Manuals edited by Weigel and Glazebrook, 2002 Cold Spring Harbor Lab Press; and Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 바와 같은 재조합 핵산 서열을 제조하기 위한 분자 생물학 절차를 지칭한다.
용어 "항원 스페이서"는 고체 표면과 커플링된 항원 사이의 한정된 거리를 창출하는 중간 층을 도입하는 데 사용될 수 있는 화학적 링커를 지칭할 뿐만 아니라, 예를 들어, 문헌 [Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 25.07.2013]에서 상기 중간 층의 화학적 특성을 정의한다,
본 발명의 목적은 고체 담체 상에 고정된 항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 항원 어레이를 제공하는 것이다. 일부 실시양태에서, 항원-코팅된 비드는 하나의 검출 항원 (예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항원 또는 생물학적 원천으로부터 단리되고 정제된 항원)으로 코팅된 비드이다. 일부 실시양태에서, 항원-코팅된 비드는 검출 항원의 세트 (예를 들어 알레르기항원 추출물과 같은 추출물로부터 수득된 항원, 박테리아 세포 용해물과 같은 용해물로부터 수득된 항원, 세포 또는 조직 균질액 또는 그의 정제된 분획으로부터 수득된 항원)로 코팅된 비드이다.
예를 들어, 비드의 제1군는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 특정 (제1) 검출 항원과 커플링되고, 비드의 제2군는 생물학적 물질로부터 정제된 상이한 (제2) 검출 항원과 커플링되고, 제3 군은 제1 및 제2 검출 항원과 다시 상이한 검출 항원의 세트과 커플링되고, 검출 항원의 이러한 세트는 세포 용해물로부터 수득되며, 비드의 제4 군은 추출물 등으로부터 수득된, 검출 항원의 또 다른 세트와 커플링된다. 따라서, 항원 어레이의 상이한 군의 항원-코팅된 비드 (비드의 집단)는 그에 커플링된 항원 (예를 들어, 검출 항원 또는 검출 항원의 세트)이 상이하다.
상이한 검출 항원 또는 검출 항원의 세트를 보유하는 비드의 이러한 군을 검출 항원의 상이한 원천 (예를 들어, 용해물, 추출물, 재조합 생성), 상이한 유형의 비드 (상이한 크기 및/또는 물질의 비드) 및/또는 상이한 커플링 화학 (비공유 또는 공유적으로 커플링된 항원)을 사용하여 제조할 수 있다.
본원에 기재된 항원 어레이는 비드의 적어도 25개의 상이한 군을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 어레이는 비드의 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250 개의 군 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 어레이는 비드의 300, 400, 500 또는 1000 개의 군 중 어느 하나까지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 어레이는 비드의 200 내지 500 개의 군, 바람직하게는 비드의 250 내지 350 개의 군을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 어레이 내의 비드의 군은 단지 하나의 유형의 비드 (예를 들어, 단지 폴리스티렌 비드, 단지 200-500 nm 직경의 비드 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 어레이 내의 비드의 군은 상이한 유형의 비드 (예를 들어 350 nm 직경의 폴리스티렌 비드, 300-500 nm 직경의 라텍스 비드 및 5-500 nm 직경의 유리 비드)를 가진 군을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 어레이 내의 비드의 군은 동일한 커플링 화학을 사용하여 생성된다 (예를 들어, 상이한 검출 항원/검출 항원의 세트는 수동 흡착을 통해 비드의 상이한 군에 커플링된다). 일부 실시양태에서, 커플링 화학은 비드의 상이한 군 사이에서 상이하다 (예를 들어, 제1 검출 항원/검출 항원의 세트가 수동 흡착을 사용하여 비드의 제1군에 커플링되고, 제2 검출 항원/검출 항원의 세트가 공유 링커를 사용하여 비드의 제2군에 커플링된다). 구체적으로, 항원 어레이는 제1 검출 항원이 수동 흡착을 통해 표면에 커플링되는 약 200 nm의 직경을 가진 폴리스티렌 마이크로비드를 포함하는 비드의 제1군, 제2 검출 항원이 12 원자 스페이서를 도입하는 EGS (에틸렌 글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트)) 가교 결합제를 통해 표면에 커플링되는 약 500 nm의 직경을 가진 폴리스티렌 마이크로비드 및 NH2 표면 코팅을 포함하는 비드의 제2 군, 제3 검출 항원이 제로 길이의 EDC 카르보디이미드 커플링 화학을 통해 표면에 커플링되는 약 200 nm의 직경을 갖는 폴리스티렌 마이크로비드 및 COOH 표면 코팅을 포함하는 비드의 제3 군을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비드의 한 군 내에 비드 (즉, 동일한 검출 항원으로 코팅된 비드의 집단 또는 검출 항원의 동일한 세트로 코팅된 비드의 집단)는 동일한 유형의 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드의 한 군 내에 비드 (즉, 동일한 검출 항원으로 코팅된 비드의 집단 또는 검출 항원의 동일한 세트로 코팅된 비드의 집단)는 상이한 유형의 비드를 포함한다. 예를 들어, 비드의 한 군 내에서, 일부 비드 (제1 하위 집단/비드 유형)는 약 200 nm의 직경을 가진 비드이며, 한편 일부 다른 비드 (제2 하위 집단/비드 유형)는 약 350 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 200 nm 직경의 비드는 추출물 또는 용해물 (즉, 단백질과 다른 분자의 혼합물)을 200 nm의 상기 비드와 혼합함으로써 제1 검출 항원과 우선적으로 커플링되며, 350 nm 직경의 비드는 이들을 동일한 추출물과 혼합함으로써 제2 검출 항원에 우선적으로 커플링된 다음에, 동일한 추출물 또는 용해물로부터 수득된 2개의 상이한 검출 항원과 커플링된 두 가지 유형의 비드를 풀링하여, 검출 항원의 세트로 코팅된 상이한 유형의 비드의 군을 창출한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 어레이는 검출 알레르기항원 (예를 들어 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 알레르기 항원 또는 정제된 천연 알레르기 항원) 또는 검출 알레르기항원의 세트 (예를 들어 알레르기항원 추출물과 커플링된 비드)로 커플링된 비드의 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 250 개의 군 중 적어도 어느 하나를 포함하는 알레르기항원이다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원 어레이는 비드의 300, 400, 500 또는 1000 개의 군 중 어느 하나까지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원 어레이는 비드의 200 내지 500 개의 군, 바람직하게는 비드의 250 내지 350 개의 군을 포함한다.
일부 실시양태에서, 알레르기항원 어레이는 분자/재조합적으로 제조된 알레르기항원으로 코팅된 비드의 하나 이상의 군, 알레르기항원 추출물로 코팅된 비드의 하나 이상의 군, 및/또는 생물학적 원천으로부터 단리되고 정제된 하나 이상의 알레르기항원으로 코팅된 비드의 하나 이상의 군을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 또는 알레르기항원 어레이는 고체 플레이트 또는 시트 (예를 들어 니트로셀룰로스 막) 상에 고정된 비드의 적어도 200개의 군 (예를 들어, 비드의 200 내지 300 개의 군)를 포함하며, 여기서 어레이는 (i) 비드의 군 (군 A 비드), 상이한 검출 항원/알레르기항원으로 코팅된 (군 A 비드의) 각각의 군 (예를 들어, 재조합적으로 제조된 제1 항원/알레르기항원으로 코팅된 군 1, 추출물 또는 용해물로부터 정제된 제2 항원/알레르기항원으로 코팅된 군 2, 재조합적으로 제조된 제3 항원/알레르기항원 등으로 코팅된 군 3) 및 (ii) 비드의 군 (군 B 비드), 상이한 검출 항원의 세트/알레르기항원의 세트로 코팅된 (군 B 비드의) 각각의 군 (예를 들어 제1 생물학적 물질로부터 수득된 제1 항원/알레르기항원 추출물로 코팅된 군 I, 제2 생물학적 물질로부터 수득된 제2 항원/알레르기항원 추출물로 코팅된 군 II)을 포함하고, 여기서 비드의 군 (군 A 및 군 B의 비드 둘 다)은 약 200 내지 500 nm의 직경 (예를 들어 약 350 nm의 직경)으로 제조된 비드 (예를 들어 폴리스티렌 비드)이고 검출 항원/알레르기항원 또는 검출 항원의 세트/알레르기항원의 세트는 비드에 공유적으로 또는 비공유적으로 동일하거나 상이한 커플링 화학을 통해 커플링된다. 일부 실시양태에서, 상이한 검출 항원/알레르기항원 또는 그의 세트는 수동 흡착을 통해 비드에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 검출 항원/알레르기항원 또는 그의 세트의 부분은 수동 흡착을 통해 커플링되며, 한편 다른 검출 항원/알레르기항원은 공유적으로 예를 들어 EGS 링커 또는 EDC 화학을 통해 커플링된다.
일부 실시양태에서, 비드의 군은 본원에 기재된 항원 또는 알레르기항원 어레이 상에 직사각형 패턴의 행 및 열 또는 오렌지 패킹된 패턴으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 또는 알레르기항원 어레이는 어레이의 항원-코팅된 비드를 위치시키고 식별하는데 사용될 수 있는 어레이의 한정된 위치에 양성 및/또는 음성 대조군 스폿 (예를 들어, 마커 스폿)을 추가로 포함한다.
항원
항원은 면역계가 그에 대해 항체 반응을 초래하게 할 수 있는 물질이다. 항원은 전형적으로, 숙주에 이물질인 거대 분자 또는 분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 항체 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드, RNA, DNA, 지질, 글리코실화 분자, 탄수화물, 유기 또는 비유기 화학적 화합물, 이러한 분자의 자연 발생 변형체, 앱타머)이다. 항원은 하나 이상의 면역학적 에피토프를 포함한다.
본원에 기재된 항원은 검출 항원, 즉 항원-특이적 반응을 결정하는 항원이다. 일부 실시양태에서, 검출 항원은 알레르기항원, 감염 마커 및/또는 자가항원이다.
알레르기항원은 면역글로불린 E (IgE) 반응을 통해 아토피 개체에서 I형 과민증 반응을 자극할 수 있는 항원이다. 알레르기항원은 식품 품목, 예를 들어, 유제품 (예를 들어, 암소의 우유), 에그(egg), 샐러리, 참깨, 밀, 대두, 어류, 조개류, 당류 (예를 들어 육류에 존재하는 당류 예컨대 알파-갈락토스), 땅콩, 다른 콩류(legume) (예를 들어, 콩, 완두콩, 대두 등), 및 각과류(tree nuts) 내에 함유되거나 이로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 비식품 항목 예컨대 동물 제품, 예를 들어, 먼지 진드기 배설물(dust mite excretion), 털 및 비듬, 양모; 꽃가루, 예를 들어 나무 꽃가루 (예컨대 자작나무 꽃가루, 삼나무 꽃가루, 참나무 꽃가루, 오리나무 꽃가루, 서어나무 꽃가루, 칠엽수(aesculus) 꽃가루, 버드나무 꽃가루, 포플러 꽃가루, 플라타너스 꽃가루, 피나무(tilia) 꽃가루, 올리브(olea) 꽃가루, 애쉬 주니퍼(Ashe juniper) 꽃가루, 및 알스토니아 스콜라리스(Alstonia scholaris) 꽃가루) 잡초 (돼지풀, 질경이, 쐐기풀, 아르테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 및 체노포디움 알범(Chenopodium album), 수영(sorrel)), 풀 (라이그라스류(rye grass), 큰조아재비(timothy grass)); 곤충 독 (예를 들어, 꿀벌, 말벌, 모기, 불 개미의 독 등), 곰팡이, 라텍스, 금속 (예를 들어, 니켈), 가정용 클리너, 세제, 의약, 화장품 (예를 들어, 향수 등), 약물 (예를 들어, 페니실린, 술폰아미드, 살리실레이트 등), 치료용 모노클로날 항체 (예를 들어 세툭시맙)에 함유되거나 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 알레르기항원은 교차 반응성 알레르기항원이다. 교차 반응성 알레르기항원은 상이한 원천 (예를 들어 사과)의 알레르기항원과 구조적 유사성을 공유하는 하나의 원천 (예를 들어 자작나무)의 알레르기항원이다. 일단 환자가 제1 원천에 알레르기가 있으면, 그/그녀는 제2 원천에 알레르기가 또한 생길 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원은 마커 알레르기항원이다. 마커 알레르기항원은 한 특이적 원천에서 주로 발견된다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원은 pan-알레르기항원이다. Pan-알레르기항원 (예를 들어 프로필린)은 다양한 상이한 원천에 존재한다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원은 주된 알레르기항원이며, 이는 알레르기 집단에서 우세한 Ig 반응을 유도하며, 한편 또 다른 실시양태에서 알레르기항원은 단지 소수의 알레르기 환자가 반응하는 차위의 알레르기항원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 알레르기항원은 임의의 다른 알레르기항원과 교차 반응하지 않는 알레르기항원이다.
| 코드 | 명칭 | 종 | 일반명 | 원천 | 계 |
| 2405 | Act c [열매] | 악티니디아 키넨시스(Actinidia chinensis) | 골드 키위 | 열매 | 식물 |
| 8234 | Act c 11 | 악티니디아 키넨시스 | 골드 키위 | 열매 | 식물 |
| 10879 | Act c 키티나제_IV | 악티니디아 키넨시스 | 골드 키위 | 열매 | 식물 |
| 1697 | Act d [열매] | 악티니디아 델리시오사(Actinidia deliciosa) | 그린 키위 | 열매 | 식물 |
| 1 | Act d 1 | 악티니디아 델리시오사 | 그린 키위 | 열매 | 식물 |
| 5737 | Act d 10 | 악티니디아 델리시오사 | 그린 키위 | 열매 | 식물 |
| 747 | Act d 2 | 악티니디아 델리시오사 | 그린 키위 | 열매 | 식물 |
| 2821 | Act d 5 | 악티니디아 델리시오사 | 그린 키위 | 열매 | 식물 |
| 1279 | Aed c | 아에데스 코뮤니스(Aedes communis) | 흡혈 곤충 | 몸체 | 동물 |
| 1704 | All c | 알리움 세파(Allium cepa) | 양파 | 괴경 | 식물 |
| 1705 | All p | 알리움 포룸(Allium porrum) | 리크 | 괴경 | 식물 |
| 1706 | All s | 알리움 사티붐(Allium sativum) | 마늘 | 괴경 | 식물 |
| 722 | Alt a 1 | 알테르나리아 알테르나타(Alternaria alternata) | 알테르나리아 알테르나타 | 포자 | 진균 |
| 3063 | Alt a 6.0101 | 알테르나리아 알테르나타 | 알테르나리아 알테르나타 | 포자 | 진균 |
| 6459 | Ama cr | 아마란투스 크루엔투스(Amaranthus cruentus) | 블러드 아마란스(Blood Amaranth) | 종자 | 식물 |
| 1710 | Amb a | 암브로시아 아르테미시이폴리아(Ambrosia artemisiifolia) | 쑥/돼지풀-관련 종 | 꽃가루 | 식물 |
| 24 | Amb a 1 | 암브로시아 아르테미시이폴리아 | 쑥/돼지풀-관련 종 | 식물 | |
| 694 | Ana c 2 | 아나나스 코모수스(Ananas comosus) | 파인애플 | 열매 | 식물 |
| 1714 | Ana o [종자] | 아나카르듐 옥시덴탈레(Anacardium occidentale) | 캐슈 | 종자 | 식물 |
| 1077 | Ana o 3 | 아나카르듐 옥시덴탈레 | 캐슈 | 종자 | 동물 |
| 1033 | Ana p [난백] | 아나스 플라티린초스(Anas platyrhynchos) | 피스타치오 | 에그 | 식물 |
| 10853 | Ana p [난황] | 아나스 플라티린초스 | 복숭아 | 에그 | 식물 |
| 2918 | Ani pe | 아니사키스 페그레피이(Anisakis pegreffii) | 아니사키스(Anisakis) | 유충 | 동물 |
| 1716 | Ani s | 아니사키스 심플렉스(Anisakis simplex) | 아니사키스 | 유충 | 동물 |
| 35 | Ani s 1 | 아니사키스 심플렉스 | 아니사키스 | 유충 | 동물 |
| 37 | Ani s 3 | 아니사키스 심플렉스 | 아니사키스 | 유충 | 동물 |
| 8793 | Api g [줄기] | 아피움 그라베올렌즈(Apium graveolens) | 셀러리 | 줄기 | 식물 |
| 41 | Api g 1.0101 | 아피움 그라베올렌즈 | 셀러리 | 뿌리 | 식물 |
| 1722 | Api m [독] | 아피스 멜리페라(Apis mellifera) | 꿀벌 | 독 | 동물 |
| 45 | Api m 1 | 아피스 멜리페라 | 꿀벌 | 독 | 동물 |
| 48 | Api m 4 | 아피스 멜리페라 | 꿀벌 | 독 | 동물 |
| 11401 | Ara h | 아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea) | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 11402 | Ara h 1-NT | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 51 | Ara h 2 | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 52 | Ara h 3 | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 55 | Ara h 6 | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 3100 | Ara h 8.0101 | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 1050 | Ara h 응집소(aggultinin) | 아라키스 히포가에아 | 땅콩 | 종자 | 식물 |
| 862 | Arm r HRP | 아르모라시아 루스티카나(Armoracia rusticana) | 서양고추냉이 | 잎 | 식물 |
| 1728 | Art v | 아르테미시아 불가리스 | 쑥 | 꽃가루 | 식물 |
| 753 | Art v 1 | 아르테미시아 불가리스 | 쑥 | 꽃가루 | 식물 |
| 1730 | Asp f | 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) | 아스페르길루스 | 포자 | 진균 |
| 1732 | Asp n | 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) | 아스페르길루스 | 포자 | 진균 |
| 3050 | Asp r 1 | 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus) | 아스페르길루스 | 포자 | 진균 |
| 1734 | Aspa o | 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis) | 아스파라거스 | 줄기 | 식물 |
| 1738 | Ber e | 베르톨레티아 엑셀사(Bertholletia excelsa) | 브라질 넛(Brazil Nut) | 종자 | 식물 |
| 1741 | Bet v [꽃가루] | 베툴라 베루코사(Betula verrucosa) | 자작나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 90 | Bet v 1.0101 | 베툴라 베루코사 | 자작나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 3136 | Bet v 2.0101 | 베툴라 베루코사 | 자작나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 2200 | 베타 v [잎] | 베타 불가리스(Beta vulgaris) | 일반 비트(Common Beet) | 잎 | 식물 |
| 1742 | Bla g | 블라텔라 게르마니카(Blattella germanica) | 독일산 바퀴벌레(독일산 바퀴벌레) | 몸체 | 동물 |
| 136 | Bla g 1 | 블라텔라 게르마니카 | 독일산 바퀴벌레 | 몸체 | 동물 |
| 141 | Bla g 2 | 블라텔라 게르마니카 | 독일산 바퀴벌레 | 몸체 | 동물 |
| 143 | Bla g 4 | 블라텔라 게르마니카 | 독일산 바퀴벌레 | 몸체 | 동물 |
| 144 | Bla g 5 | 블라텔라 게르마니카 | 독일산 바퀴벌레 | 몸체 | 동물 |
| 1744 | Blo t | 블로미아 트로피칼리스(Blomia tropicalis) | 블로미아 | 몸체 | 동물 |
| 2019 | Bos d [육류] | 보스 도메스티쿠스(Bos domesticus) | 암소 | 근육 | 동물 |
| 10999 | Bos d [우유] | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 163 | Bos d 4 | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 164 | Bos d 5 | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 165 | Bos d 6 | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 167 | Bos d 8 | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 10878 | Bos d CA | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 근육 | 동물 |
| 7669 | Bos d 젤라틴 | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 피부 | 동물 |
| 1065 | Bos d LF | 보스 도메스티쿠스 | 암소 | 우유 | 동물 |
| 1755 | Bub b [우유] | 부발루스 부발리스(Bubalus bubalis) | 아시아물소 | 우유 | 동물 |
| 4043 | Cam d [우유] | 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius) | 단봉낙타 | 우유 | 동물 |
| 1756 | Can f [상피] | 캐니스 패밀리아리스(Canis familiaris) | 개 | 상피 | 동물 |
| 174 | Can f 1 | 캐니스 패밀리아리스 | 개 | 상피 | 동물 |
| 175 | Can f 2 | 캐니스 패밀리아리스 | 개 | 상피 | 동물 |
| 176 | Can f 3 | 캐니스 패밀리아리스 | 개 | 혈청 | 동물 |
| 5762 | Can f 5 | 캐니스 패밀리아리스 | 진드기 | 상피 | 동물 |
| 1757 | Cand a | 칸디다 알비칸즈(Candida albicans) | 칸디다 | 포자 | 진균 |
| 1760 | Cap h [우유] | 카프라 히르쿠스(Capra hircus) | 염소 | 우유 | 동물 |
| 709 | Car p 1 | 카리카 파파야(Carica papaya) | 파파야 | 열매 | 식물 |
| 1540 | Car p 키모파파인 | 카리카 파파야 | 파파야 | 열매 | 식물 |
| 2025 | Cas s [종자] | 카스타네아 사티바(Castanea sativa) | 자작나무/Hazel/Oak-관련 종 | 종자 | 식물 |
| 1765 | Cav p [상피] | 캐비아 포르셀루스(Cavia porcellus) | 기니 피그 | 상피 | 동물 |
| 10907 | Cer si [종자] | 세라토니아 실리쿠아(Ceratonia siliqua) | 캐럽(Carob) | 종자 | 식물 |
| 2223 | Che qu | 체노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) | 퀴노아 | 종자 | 식물 |
| 1771 | Cic a | 시세르 아리에티넘(Cicer arietinum) | 병아이콩 | 종자 | 식물 |
| 2229 | Cit r [열매] | 시트루스 레티쿨라타(Citrus reticulata) | 만다린 오렌지 | 열매 | 식물 |
| 1775 | Cla h | 클라도스포륨 헤르바룸(Cladosporium herbarum) | 진균 | 포자 | 진균 |
| 1778 | Cor a [꽃가루] | 코릴루스 아벨라나(Corylus avellana) | 헤이즐넛 | 꽃가루 | 식물 |
| 2028 | Cor a [종자] | 코릴루스 아벨라나 | 헤이즐넛 | 종자 | 식물 |
| 235 | Cor a 1.0103 | 코릴루스 아벨라나 | 헤이즐넛 | 꽃가루 | 식물 |
| 5886 | Cor a 14 | 코릴루스 아벨라나 | 진드기 | 종자 | 동물 |
| 245 | Cor a 8 | 코릴루스 아벨라나 | 헤이즐넛 | 종자 | 식물 |
| 246 | Cor a 9 | 코릴루스 아벨라나 | 헤이즐넛 | 종자 | 식물 |
| 2429 | Cot c [난백] | 코투르닉스 코투르닉스(Coturnix coturnix) | 골드 키위 | 에그 | 식물 |
| 2430 | Cot c [난황] | 코투르닉스 코투르닉스 | 골드 키위 | 에그 | 식물 |
| 1782 | Cri c | 크리세투스 크리세투스(Cricetus cricetus) | 햄스터 | 상피 | 동물 |
| 1784 | Cry j | 크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica) | 삼나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 1786 | Cuc m [Pulp] | 쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo) | 머스크멜론 | 열매 | 식물 |
| 1789 | Cuc s | 쿠쿠미스 사티버스(Cucumis sativus) | 오이 | 열매 | 식물 |
| 256 | Cup a 1 | 쿠프레서스 아리조니카(Cupressus arizonica) | 아리조나 사이프러스(Arizona Cypress) | 꽃가루 | 식물 |
| 1799 | Dau c | 다우쿠스 캐로타(Daucus carota) | 당근 | 뿌리 | 식물 |
| 295 | Der f 1 | 더마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae) | 아리조나 시프레스 | 몸체 | 식물 |
| 302 | Der f 2 | 더마토파고이데스 파리나에 | 아리조나 시프레스 | 몸체 | 식물 |
| 310 | Der p 1 | 더마토파고이데스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus) | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 311 | Der p 10 | 더마토파고이데스 프테로니시누스 | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 316 | Der p 2 | 더마토파고이데스 프테로니시누스 | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 5748 | Der p 23.0101 | 더마토파고이데스 프테로니시누스 | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 321 | Der p 7 | 더마토파고이데스 프테로니시누스 | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 323 | Der p 9 | 더마토파고이데스 프테로니시누스 | 진드기 | 몸체 | 동물 |
| 3995 | Equ as [우유] | 에쿠우스 아시누스(Equus asinus) | 당나귀 | 우유 | 동물 |
| 1813 | Equ c [상피] | 에쿠우스 카발루스(Equus caballus) | 말 | 상피 | 동물 |
| 2032 | Equ c [우유] | 에쿠우스 카발루스 | 말 | 우유 | 동물 |
| 335 | Equ c 3 | 에쿠우스 카발루스 | 말 | 혈청 | 동물 |
| 10877 | Equ c 미오글로빈 | 에쿠우스 카발루스 | 말 | 근육 | 동물 |
| 340 | Eur m 2 | 유로글리푸스 메이네이(Euroglyphus maynei) | 말 | 몸체 | 동물 |
| 1816 | Fag e | 파고피룸 에스쿨렌툼(Fagopyrum esculentum) | 말 | 종자 | 동물 |
| 1819 | Fel d | 펠리스 도메스티쿠스(Felis domesticus) | 고양이 | 상피 | 동물 |
| 345 | Fel d 1 | 펠리스 도메스티쿠스 | 고양이 | 상피 | 동물 |
| 346 | Fel d 2 | 펠리스 도메스티쿠스 | 고양이 | 혈청 | 동물 |
| 2034 | Foe v [구근] | 포에니쿨룸 불가레(Foeniculum vulgare) | 펜넬(Fennel) | 구근 | 식물 |
| 1826 | Fra a [열매] | 프라가리아 아나나사(Fragaria ananassa) | 딸기 | 열매 | 식물 |
| 1831 | Gad m [육류] | 가두스 모르후아(Gadus morhua) | 대서양 대구 | 근육 | 동물 |
| 1832 | Gal d [난백] | 갈루스 도메스티쿠스(Gallus domesticus) | 닭 | 에그 | 동물 |
| 2036 | Gal d [난황] | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 2037 | Gal d [육류] | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 근육 | 동물 |
| 359 | Gal d 1 | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 360 | Gal d 2 | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 361 | Gal d 3 | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 362 | Gal d 4 | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 363 | Gal d 5 | 갈루스 도메스티쿠스 | 닭 | 에그 | 동물 |
| 1834 | Gly m | 글리신 맥스(Glycine max) | 대두 | 종자 | 식물 |
| 368 | Gly m 1 | 글리신 맥스 | 대두 | 종자 | 식물 |
| 1429 | Gly m 응집소 | 글리신 맥스 | 대두 | 종자 | 식물 |
| 1144 | Gly m TI | 글리신 맥스 | 대두 | 종자 | 식물 |
| 1840 | Hel as | 헬릭스 아스페르사(Helix aspersa) | 갈색 정원 달팽이 (Brown Garden Snail) | 근육 | 동물 |
| 378 | Hel as 1 | 헬릭스 아스페르사 | 갈색 정원 달팽이 | 근육 | 동물 |
| 1841 | Hev b | 헤베아 브라질리엔시스(Hevea brasiliensis) | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 379 | Hev b 1 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 380 | Hev b 10 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 384 | Hev b 11 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 3314 | Hev b 3.0101 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 3316 | Hev b 5.0101 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 392 | Hev b 6.02 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 396 | Hev b 7.02 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 397 | Hev b 8 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 404 | Hev b 9 | 헤베아 브라질리엔시스 | 라텍스 | 라텍스 | 식물 |
| 763 | Hom s HSA | 호모 사피엔스(Homo sapiens) | 인간 | 혈청 | 동물 |
| 1384 | Hom s LF | 호모 사피엔스 | 인간 | 우유 | 동물 |
| 2040 | Hor v [종자] | 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) | 보리 | 종자 | 식물 |
| 1850 | Jug r [종자] | 저글란즈 레지아(Juglans regia) | 호두 | 종자 | 식물 |
| 425 | Jug r 2 | 저글란즈 레지아 | 라텍스 | 종자 | 식물 |
| 426 | Jug r 3 | 저글란즈 레지아 | 호두 | 종자 | 식물 |
| 1856 | Lac s | 락투카 사티바(Lactuca sativa) | 쑥/돼지풀-관련 종 | 잎 | 식물 |
| 1857 | Len c | 렌즈 쿨리나리스(Lens culinaris) | 렌틸 | 종자 | 식물 |
| 905 | Lin us | 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum) | 리눔 우시타티시뭄 | 종자 | 식물 |
| 1868 | Lol p [꽃가루] | 로리움 페렌(Lolium perenne) | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 450 | Lol p 1 | 로리움 페렌 | Gr | 꽃가루 | 식물 |
| 940 | Lup a [종자] | 루피누스 알부스(Lupinus albus) | 루피루스 알부스 | 종자 | 식물 |
| 1871 | Mal d [열매] | 말루스 도메스티카(Malus domestica) | 말루스 도메스티카 | 열매 | 식물 |
| 1454 | Mal d 1.0108 | 말루스 도메스티카 | 말루스 도메스티카 | 열매 | 식물 |
| 1035 | Mel g [난백] | 멜레아그리스 갈로파보(Meleagris gallopavo) | 일반 칠면조 | 에그 | 동물 |
| 10909 | Mel g [난황] | 멜레아그리스 갈로파보 | 일반 칠면조 | 에그 | 동물 |
| 2049 | Mel g [육류] | 멜레아그리스 갈로파보 | 일반 칠면조 | 근육 | 동물 |
| 476 | Mer a 1 | 머큐리알리스 아누아(Mercurialis annua) | 머큐리알리스 아누아 | 근육 | 식물 |
| 7643 | Mer mr 1 | 메를루시우스 메를루시우스(Merluccius merluccius) | 유럽산 헤이크(European Hake) | 근육 | 동물 |
| 2051 | Mus m [상피] | 머스 머스쿨루스(Mus musculus) | 마우스 | 상피 | 동물 |
| 478 | Mus m 1 | 머스 머스쿨루스 | 마우스 | 상피 | 동물 |
| 755 | Mus m 4 | 머스 머스쿨루스 | 쑥 | 혈청 | 식물 |
| 1413 | Myt e | 미틸루스 에둘리스(Mytilus edulis) | 진주 담치 | 근육 | 동물 |
| 2132 | Oct v | 옥토퍼스 불가리스(Octopus vulgaris) | 문어 | 근육 | 동물 |
| 1888 | Ole e [꽃가루] | 올레아 유로파에아(Olea europaea) | 올리브 나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 482 | Ole e 1 | 올레아 유로파에아 | 올리브 나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 490 | Ole e 2 | 올레아 유로파에아 | 올리브 나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 2054 | Ory c [상피] | 오릭톨라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus) | 마우스 | 상피 | 동물 |
| 2057 | Ory c [육류] | 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 | 토끼 | 근육 | 동물 |
| 759 | Ory c 6 | 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 | 토끼 | 혈청 | 동물 |
| 11394 | Ory s [종자] | 오리자에 사티바(Oryza sativa) | 벼 | 종자 | 식물 |
| 2061 | Ovi a [육류] | 오비스 에어리즈 (Ovis aries) | 양 | 근육 | 동물 |
| 1892 | Ovi a [우유] | 오비스 에어리즈 | 양 | 우유 | 동물 |
| 758 | Ovi a 6 | 오비스 에어리즈 | 양 | 혈청 | 동물 |
| 1893 | Pan b | 판달루스 보레알리스(Pandalus borealis) | 갑각류 | 근육 | 동물 |
| 1904 | Par j | 파리에타리아 주다이카(Parietaria judaica) | 펠리트륨(Pellitory) | 꽃가루 | 식물 |
| 507 | Par j 2 | 파리에타리아 주다이카 | 펠리트륨 | 꽃가루 | 식물 |
| 1912 | Pen ch | 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) | 페니실리움 | 포자 | 진균 |
| 972 | Pen m 1 | 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon) | 홍다리얼룩새우(Black Tiger Prawn) | 근육 | 동물 |
| 1917 | Per a | 페리플라네타 아메리카나(Periplaneta americana) | 미국 바퀴벌레 | 몸체 | 동물 |
| 542 | Per a 7 | 페리플라네타 아메리카나 | 미국 바퀴벌레 | 근육 | 동물 |
| 1920 | Pers a | 페르세아 아메리카나(Persea americana) | 아보카도(Persea americana) | 열매 | 식물 |
| 1923 | Pha v [종자] | 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) | 콩류(Legumes) | 종자 | 식물 |
| 1924 | Phl p | 플레움 프라텐스(Phleum pratense) | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 551 | Phl p 1.0102 | 플레움 프라텐스 | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 3419 | Phl p 2.0101 | 플레움 프라텐스 | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 559 | Phl p 5.0101 | 플레움 프라텐스 | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 3420 | Phl p 6.0101 | 플레움 프라텐스 | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 3422 | Phl p 7.0101 | 플레움 프라텐스 | 풀 | 꽃가루 | 식물 |
| 714 | Pin p [종자] | 피누스 파니아(Pinus pinea) | 소나무 | 종자 | 식물 |
| 1008 | Pis v [종자] | 피스타치아 베라(Pistacia vera) | 피스타치오 | 종자 | 식물 |
| 1932 | Pla a | 플라타너스 아세리폴리아(Platanus acerifolia) | 시카모어 나무(Sycamore tree) | 꽃가루 | 식물 |
| 572 | Pla a 1 | 플라타너스 아세리폴리아 | 시카모어 나무 | 꽃가루 | 식물 |
| 10875 | Ple o [포자낭과] | 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus) | 버섯 | 포자낭과 | 진균 |
| 2322 | Pol spp | 폴리스테스 종(Polistes spp) | 벌목(Hymenoptera) | 독 | 동물 |
| 1945 | Pru ar [열매] | 프루누스 아르메니아카(Prunus armeniaca) | 체리 | 열매 | 식물 |
| 1948 | Pru du [종자] | 프루누스 둘시스(Prunus dulcis) | 아몬드 나무 | 종자 | 식물 |
| 2070 | Pru p [껍질] | 프루누스 페르시카(Prunus persica) | 복숭아 | 열매 | 식물 |
| 2069 | Pru p [펄프] | 프루누스 페르시카 | 복숭아 | 열매 | 식물 |
| 603 | Pru p 3 | 프루누스 페르시카 | 복숭아 | 열매 | 식물 |
| 9147 | Pru p 7 | 프루누스 페르시카 | 복숭아 | 열매 | 식물 |
| 1195 | Pun g | 푸니카 그라나툼(Punica granatum) | 석류 | 열매 | 식물 |
| 2834 | Pun g 1 | 푸니카 그라나툼 | 석류 | 열매 | 식물 |
| 11786 | Pun g 14 | 푸니카 그라나툼 | 석류 | 열매 | 식물 |
| 11787 | Pun g 5 | 푸니카 그라나툼 | 석류 | 열매 | 식물 |
| 11614 | Pun g 7 | 푸니카 그라나툼 | 석류 | 열매 | 식물 |
| 1955 | Que a [꽃가루] | 퀘르쿠스 알바(Quercus alba) | 식물 | 꽃가루 | 식물 |
| 2072 | Rat n [상피] | 래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) | 래트 | 상피 | 동물 |
| 611 | Rat n 1 | 래투스 노르베기쿠스 | 래트 | 상피 | 동물 |
| 756 | Rat n 4 | 래투스 노르베기쿠스 | 래트 | 혈청 | 동물 |
| 1960 | Sac c | 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) | 효모 | 포자 | 진균 |
| 3348 | Sal k 1 | 살솔라 칼리(Salsola kali) | 러시아 엉겅퀴(Russian-thistle) | 꽃가루 | 식물 |
| 1962 | Sal s [육류] | 살모 살라르(Salmo salar) | 대서양 연어 | 근육 | 동물 |
| 2363 | Sar m | 사르디놉스 멜라노스틱투스(Sardinops melanostictus) | 어류 | 근육 | 동물 |
| 1971 | Ses i | 세사뭄 인디쿰(Sesamum indicum) | 참깨 | 종자 | 식물 |
| 1972 | Sin a [종자] | 시나피스 알바(Sinapis alba) | 백겨자(Sinapis alba) | 종자 | 식물 |
| 2368 | Sol so | 솔레아 솔레아(Solea solea) | 일반 서대기(Common Sole) | 근육 | 동물 |
| 1870 | Sola l [열매] | 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) | 토마토 | 열매 | 식물 |
| 6131 | Sola l [종자] | 솔라눔 리코페르시쿰 | 토마토 | 종자 | 식물 |
| 8215 | Sola l 6 | 솔라눔 리코페르시쿰 | 토마토 | 열매 | 식물 |
| 875 | Sola m | 솔라눔 멜론게나(Solanum Melongena) | 가지(Aubergine) | 열매 | 식물 |
| 1977 | Sola t | 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) | 감자 | 괴경 | 식물 |
| 639 | Sola t 1 | 솔라눔 투베로숨 | 감자 | 괴경 | 식물 |
| 1980 | Spi o | 스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea) | 시금치 | 잎 | 식물 |
| 2088 | Sus s [육류] | 수스 스크로파 도메스티카(Sus scrofa domestica) | 돼지 | 근육 | 동물 |
| 757 | Sus s 1 | 수스 스크로파 도메스티카 | 돼지 | 혈청 | 동물 |
| 2375 | Thu a [육류] | 썬누스 알바카레스(Thunnus albacares) | 어류 | 근육 | 동물 |
| 11396 | Tri a [종자] | 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum) | 밀 | 종자 | 식물 |
| 8724 | Tri a 7k-LTP | 트리티쿰 아에스티붐 | 밀 | 종자 | 식물 |
| 650 | Tri a 18 | 트리티쿰 아에스티붐 | 밀 | 종자 | 식물 |
| 8186 | Tri a 28 | 트리티쿰 아에스티붐 | 밀 | 종자 | 식물 |
| 651 | Tri a 글리아딘 | 트리티쿰 아에스티붐 | 밀 | 종자 | 식물 |
| 2653 | Tri me | 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes) | 진균 | 전신 | 진균 |
| 921 | Tri tp | 트리티쿰 폴로니쿰(Triticum polonicum) | 풀 | 종자 | 식물 |
| 8169 | Uro du | 우로테우티스 두바우셀리(Uroteuthis duvauceli) | 인디언 스퀴드(Indian Squid) | 근육 | 동물 |
| 11791 | Uro du 1 | 우로테우티스 두바우셀리 | 인디언 스퀴드 | 근육 | 동물 |
| 6340 | Ven ga | 베누스 갈리나(Venus gallina) | 조개(Clam) | 근육 | 동물 |
| 11788 | Ven ga 1 | 베누스 갈리나 | 조개 | 근육 | 동물 |
| 2400 | Ves spp | 베스풀라 종(Vespula spp) | 벌목 | 독 | 동물 |
| 2012 | Vit v [열매] | 비티스 비니페라(Vitis vinifera) | 포도 | 열매 | 식물 |
| 11392 | Zea m [종자] | 제아 메이즈(Zea mays) | 옥수수 | 종자 | 식물 |
| 684 | Zea m 14 | 제아 메이즈 | 옥수수 | 종자 | 식물 |
감염 마커는 감염원 예컨대 바이러스, 기생충, 박테리아, 프리온 및 진균의 존재를 나타내는 물질, 조성물 또는 입자이다.
감염 마커는 단백질, 당 단백질 (예를 들어 박테리아 또는 바이러스의 표면 또는 외피(coat) 단백질), 단백질의 혼합물 (예를 들어 박테리아 세포 용해물), 감염원 또는 입자와 연관된 다른 검출 가능한 화합물 (예를 들어, 바이러스-유사 입자 또는 바이러스 코트 단백질, 박테리아 표면 항원 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
자가항원은 인간과 같은 유기체에 의해 생성된 분자이며, 이 때문에 그 유기체에 의한 면역 반응 예컨대 자가항원에 대한 항체의 생성, 즉 자가항체의 생성이 존재한다. 자가항체의 생산은 일반적으로 자가면역 질환과 연관이 있다. 자가항원의 예는 기관-특이적 항원 예컨대 티로글로불린 및 유비쿼터스 세포 항원 예컨대 DNA, 히스톤 및 리보핵단백질 입자를 포함한다. 본원에 기재된 항원 어레이에 포함될 수 있는 예시적인 자가항원을 표 2에 열거하였다.
| 단백질 | 질환 | 단백질 | 질환 |
| SmB/SmB' | SLE | RuvB-like 1 | PM, Der, AH |
| Sm-D1 | SLE | CHD-3 | Der |
| Sm-D2 | SLE | CHD-4 | Der |
| Sm-D3 | SLE | RCC1 | Ray |
| U1 snRNP A | SLE | PM/Scl-100, PM/Scl-2 | PM,SScl |
| U1 snRNP 70K | SLE | PM/Scl-75, PM/Scl-1 | PM,SScl |
| U1 snRNP C | SLE | RRP42 | PM,SScl |
| U2 snRNP A' | SLE | RRP4 | PM,SScl |
| U2 snRNP B" | SLE | 피브릴라린 | SScl, 8% 환자 중 |
| Ro52K SS-A1 | SLE,SS | UBF-1 | SScl, 자기항원 NOR-90 |
| Ro60K SS-A2 | SLE,SS | PA28g | SLE |
| La SS-B | SLE,SS | SSNA1 | SS |
| 히스톤 H1b | SLE | hnRNP A/B | SLE, RA, MCTD |
| 히스톤 H2A.1b | SLE | hnRNP A2 | SLE, RA, MCTD |
| 히스톤 H2B.1a | SLE | ZNF330 | RA, 핵소체 자기항원 36 |
| 히스톤 H3.1 | SLE | ASF-1 SRp30a | SLE |
| 히스톤 H4 | SLE | SC35 SRp30b | SLE |
| DNA 토포이소머라제 I | SScl (레트로바이러스 p30gag) | SRp20 | SLE |
| CENP-A | Ray, Crest(SScl sub) | SRp75 | SLE |
| CENP-B | Ray, Crest(SScl sub) | SRp40 | SLE |
| CENP-C | SS, SScl, 자기항원 | SRp55 | SLE |
| Ku86 | SLE | DBP1 | SScl,SLE |
| Ku70 | SLE, Cterm 190 잔기 | NUMA1 | SS |
| 아넥신 A11 | SLE,SS,RA | Eg5키네신-유사NUMA-2 | SS, SLE |
| RNaseP p38 | SScl, 4/4 혈청 | PCNA (cyclin) | SLE 혈청은 PCNA를 함유 |
| RNaseP p30 | SScl, 2/4 혈청 | CCP | RA |
| 피브리노겐 | RA | 류마티스 인자 | RA, SLE |
| Ro52 | RA | 콜라겐 | RA |
| 질환 약어: | |||
| SLE = 전신 홍반성 루푸스 | |||
| SS = 쇼그렌 증후군(Sjogren Syndrome) | |||
| SScl = 피부경화증 (전신 경화증) | |||
| PM = 다발성 근염 | |||
| Der = 피부근염 | |||
| Ray = 레이노병(Raynaud disease), | |||
| RA = 류마티스 관절염 | |||
| MCTD = 혼합 결합 조직병 | |||
본원에 기재된 항원 어레이의 항원, 즉 검출 항원은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항원일 수 있거나, 생물학적 원천 물질로부터 정제되고 단리된 항원일 수 있다 (예를 들어, 임의의 다른 항원을 실질적으로 함유하지 않는 생물학적 물질로부터의 항원이며, 이는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 동일한 생물학적 물질로부터 단리될 수 있다 (문헌 [Ian R. Mackay & Noel R. Rose, The Autoimmune Diseases, Fifth Edition, Academic Press 2014] 비교). 일부 실시양태에서, 비드는 재조합적으로 제조된 항원과 커플링된다. 일부 실시양태에서, 비드는 생물학적 원천으로부터 단리되고 정제된 검출 항원과 커플링된다.
일부 실시양태에서, 항원 어레이는 검출 항원의 세트 (예를 들어, 적어도 하나, 둘 이상의 검출 항원)를 가진 비드의 군을 포함한다. 예를 들어, 검출 항원의 세트는 생물학적 원천의 추출물 (예를 들어 알레르기항원 추출물) 또는 용해물 (예를 들어 박테리아 용해물 또는 다른 세포 용해물)로부터 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 생물학적 원천의 추출물 또는 용해물과 커플링되어, 검출 항원의 세트로 항원-코팅된 비드를 생성시킨다.
일부 실시양태에서, 비드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 분자상 알레르기항원으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 비드는 생물학적 원천으로부터 단리되거나 정제된 알레르기항원으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 비드는 알레르기항원 추출물 (예를 들어, 생물학적 물질로부터의 적어도 하나, 둘 이상의 알레르기항원과 같은 알레르기항원의 세트)로 코팅된다. 알레르기항원 추출물은 미가공(raw) 알레르기항원 추출물; 농축 알레르기항원 추출물; 또는 알레르기항원 추출물로부터 정제된 몇몇 알레르기항원을 포함할 수 있다. 알레르기항원은 자연 발생 알레르기항원이다. 알레르기항원 추출물은 동일한 알레르기항원의 하나 이상의 이소형을 자연적으로 함유할 수 있다. 알레르기항원 추출물은 또한 상이한 생물학적 원천, 예를 들어 유사한 기본 기원의 2종의 상이하나 밀접하게 관련된 종 (일반적으로 spp로 언급됨)의 적어도 2종의 알레르기항원 추출물의 혼합물로 이루어질 수 있다.
마이크로입자 또는 나노입자를 사용한 항원 커플링
본원에 기재된 항원 어레이는 이질적 및 복합체 생물학적 항원 (즉, 검출 항원)의 개별화된 최적화된 커플링 전략의 원리를 이용한다. 다중화 면역학적 항체 검출 검정에서, 이는 각각의 단일 파라미터에 대해 최적의 시험 성능을 달성하기 위한 전제 조건이다.
항원 커플링은 두 가지 구별되는 단계로 진행된다. 제1 단계에서, 각각의 항원은 마이크로미터 또는 나노미터 규모의 현탁된 입자, 예를 들어 마이크로비드 또는 나노비드에 커플링된다.
구체적 실시양태에서, 그러한 입자는 단백질 또는 더 일반적으로는 생체 분자 저장에 전형적으로 사용되는 것들과 같은 수성 완충제 중의 용액 상태로 유지될 수 있는 구형 입자이다. 입자는 라텍스 또는 폴리스티렌 입자, 플라스틱 중합체 입자 또는 유리 (실리카)로 제조된 입자, 다공성 또는 비다공성 표면 입자, 또는 심지어 다른 생체 적합성 중합체로 제조된 입자일 수 있다. 입자의 크기는 수 나노미터 최대 미크론까지의 사이일 수 있으며, 이로 인해 입자의 바람직한 크기는 직경이 5 내지 500 nm, 더 바람직하게는 200 내지 500 nm, 훨씬 더 바람직하게는 직경이 200 내지 350 nm (예를 들어, 약 350 nm)이다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리스티렌 나노입자이다.
항원 (단백질, 펩티드, 항체, DNA, 및 항원의 역할을 할 수 있는, 핵산, 아미노산 또는 유기 또는 비유기 화학적 화합물로 구성된 다른 생체 분자)의 부착은 다양한 부착 전략을 통해 진행될 수 있다.
가장 간단한 실시양태에서, 항원성 분자 또는 거대 분자는 수동 흡착, 예를 들어 소수성 및/또는 정전기 부착에 의해 입자 (비드)에 부착될 것이다. 부착은, 예를 들어 항원의 등전점에 가까운 pH 값을 갖는 완충제 시스템을 선택하여 평균 표면 전하를 중화시킴으로써, 최대 부착을 위한 환경을 창출하는 적절한 완충제 시스템을 선택함으로써 용이하게 할 수 있다.
더 복잡한 설정에서, 커플링될 항원은 다양한 단일 항원 보유 분자 또는 몇몇 항체 결합 에피토프를 가진 단일 거대 분자 또는 심지어 여러 가지의 에피토프를 함유하는 개별적으로 상이한 항원과 다양한 단백질의 복합체 혼합물 (예를 들어 검출 항원의 세트를 포함하는 생물학적 원천 물질의 추출물 또는 용해물)로 이루어지며, 이는 최적의 생물학적 결합 능력 (결합능)을 달성하기 위해 상이한 흡착 조건을 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에, 항원 또는 항원 혼합물은 수개의 분취액으로 나눠질 수 있고, 각각의 분취액은 상이한 조건, 예를 들어 상이한 pH 값 또는 상이한 이온 완충제 강도 또는 상이한 완충제 첨가제 예컨대 염, 세제, 완충제 물질 등 하에 커플링될 수 있다. 각각의 조건 하에, 각각의 항원은 생물학적 활성에바람직할 수 있는 특정 입체형상(configuration)으로 커플링되거나, 특정 항원의 분획은 또 다른 하위 집단보다 더 쉽게 커플링될 수 있거나, 선택된 조건 하에 전혀 커플링되지 않을 수 있다. 후속 단계에서, 다양한 구조적 입체형상의 단일 항원, 또는 초기 복합체 혼합물로부터 상이한 항원을 운반하는 마이크로입자 또는 나노입자의 집단을 창출하기 위해 상이한 분취액을 재결합할 수 있다. 이를 달성함으로써, 생물학적 샘플의 원래의 에피토프 레퍼토리는 단지 선택된 에피토프가 보존되는 방식으로, 또는 복합체 혼합물로부터의 단지 선택된 항원 담체가 실제로 커플링되는 방식으로 바이어스(bias)를 창출하지 않으면서 입자에 커플링될 수 있다.
충분한 수의 상이한 커플링 조건을 선택하고 상이하게 커플링된 입자-항원 조합의 혼합물을 최적화함으로써, 항원으로 충전된 최종 입자 용액은 원래 혼합물의 에피토프 레퍼토리를 밀접하게 어셈블리할 것이거나, 전체 완전한 에피토프 복합성을 여전히 유지하면서 그 방식으로 입자 용액에서 바람직한 항원 담체를 농축하게 하는 것이 가능하다.
훨씬 더 정교한 설정에서, 항원은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 과다한 조합적 유기 커플링 화학을 이용함으로써 커플링될 수 있다. 이 전략에 의해, 항원은 입자에 공유적으로 커플링될 수 있고, 항원의 표면에 존재하는 특정 화학적 기, 예를 들어 아미노 또는 카르복실 기, 술프히드릴 기, 방향족 잔기 등에 선택적으로 커플링되는 것이 가능하다.
작은 항원 예컨대 펩티드 또는 화학적 화합물로 작업하는 경우 항원 제시를 최적화하기 위해 적합한 항원 스페이서를 사용하는 것이 추가로 가능하다.
입자 표면의 화학적 표면 공학에 의해, 고체 담체 표면에 대한 비드의 커플링을 최적화하거나, 비특이적 결합을 억제하거나 항체 결합을 증진시키는 것이 추가로 가능하다.
일부 실시양태에서, 검출 항원 또는 검출 항원의 세트는 비드에 (예를 들어, EGS 링커를 통해 NH2 표면 비드에, EDC 링커를 통해 COOH 표면 비드에) 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 검출 항원 또는 검출 항원의 세트는 비드에 비공유적으로 결합된다. 예를 들어, 비드는 수동 흡착에 의해 항원 또는 검출 항원의 세트로 코팅될 수 있다.
제조 공정의 요구 사항에 맞도록 입자 크기를 최적화하는 것이 추가로 가능하다. 입자는 취급하기 쉽고 용액 상태로 유지되어야 하며, 동시에 이들은 최종 고체 지지체에 일단 침착되면 특이적으로 또는 비특이적으로 부착되어야 한다. 입자를 항원으로 충전한 후에, 충전된 입자는, 그 중에서도, 예를 들어 원심분리, 자기 분리, 전하 또는 크기 배제에 의해, 잔류 항원 용액으로부터 분리될 수 있다. 이러한 분리에 의해, 바람직하게 커플링된 항원의 분획만을 유지하고 원래의 항원 혼합물의 잔류하는, 아마도 비항원성 분획을 제거하는 것이 가능하다.
항원-커플링된 입자의 기능 시험을 수행할 수 있고 결과를 참조 시험관내 진단 방법으로 수행된 이용 가능한 참조 시험에 대하여, 임상 참조 데이터에 대하여, 또는 이용 가능한 표준 제제에 대하여 비교하였다. 불과 극소수에 지나지 않는 항원 특이적 IgE 항체에 대한 국제적으로 인정된 실험실 표준이 없기 때문에, 한 이용 가능한 참조 시스템은 세 가지의 가장 널리 사용되는 자동 면역검정 장비 상에서 주요 알레르기항원에 대한 IgE에 대해 시험된 바이오래드 리포체크(Biorad Lyphocheck)® 품질 관리 샘플이다 (www.bio-rad.com).
항원 커플링의 정도는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 점검될 수 있다. 예를 들어, 커플링 반응으로부터의 상청액은 ELISA 검정에 사용될 수 있고, 단백질 함량에 대해 측정될 수 있거나, 1D 또는 2D 단백질 겔 상에서 시험될 수 있으며, 이로 인해 커플링되지 않은 항원의 총 함량이 평가될 수 있을 뿐만 아니라, 결합되지 않은 것뿐만 아니라 결합된 항원 담체 (더 이상 겔 상에 존재하지 않는 것들)의 성질도 단백질 피크 또는 점의 크기/위치를 관찰함으로써 문서화될 수 있다.
유사한 접근법이 커플링의 안정성 시험에 적용될 수 있다. 예를 들어, 입자를 커플링시킨 다음에 한정된 시간 간격 후에 상청액 (비입자 함유 용액)을 시험함으로써, 항원성 단백질이 입자에 영구적으로 부착되어 머무는지 또는 이들이 일정시간 후에 또는 특정 저장 조건 하에, 특정 저장 완충제 또는 세제를 사용하여, 용액으로 다시 확산되는지를 결정할 수 있다.
항원 커플링된 비드의 저장 및 제조 동안에 그의 취급
커플링된 비드의 저장은 입자에 결합된 단백질을 초기 커플링 후 적어도 수개월, 바람직하게는 수년 동안 안정화시키는 조건 하에, 첫째, 입자에 부착된 단백질을 유지하고, 둘째 그리고 더 중요하게는 단백질을 생물학적으로 활성 상태로 유지하고, 예를 들어 단백질분해 소화에 의해 분해로부터 단백질을 보호하는 두 가지 주요 목표로, 진행될 수 있다. 또한, 비드는 용액 상태로 유지되어야 하고, 어떠한 침전도 피해져야 하는데, 그 이유는 이것이 나중에 용해될 수 없는 응집체 형성을 야기할 수 있고, 이로 인해 더 가혹하고 잠재적으로 항원을 손상시키는 방법 (열, 전단, 초음파, 볼텍싱 등)을 사용하지 않고, 원래의 항원 용액에 존재하는 에피토프 레퍼토리의 일부를 차단 또는 파괴하기 때문이다.
상기 접근법은 시약이 예를 들어 -80℃에서 저장되는 경우 더 오랜 기간 동안 또는 심지어 무기한으로 충분히 안정화될 수 있다는 점을 고려하면 임의의 면역 검정 제조 공정에 대해 상당한 개선을 제공한다. 후속 제조 공정을 위한 안정적인 1차 시약 세트를 갖는 이점은 주로, 일단 양호한 시약이 제조되면, 그것이 오랜 기간 동안 안정적인 것으로 가정하면, 품질 관리 절차에 비교적 거의 노력을 기울일 필요가 없다는 점이다. 한편 커플링을 더 짧은 간격으로 신선한 상태로 행해야 하는 경우, 커플링이 완료될 때마다 전체 품질 관리 조치 및 증거 서류를 제출하여야 한다. 그 변이가 커플링 공정 또는 항원 용액의 이전 열화에 기인한 것인지 여부는 여전히 불확실성이 남아 있을 것인데, 이는 이들이 입자의 표면 상에 항원을 실제로 흡착하는 것보다 더 오랜 시간 동안 저장하기가 더 어려울 수 있다. 주로 동결 및 해빙의 반복은 품질을 열화시킬 수 있고 단백질은 침전되거나 서로 부착되는 경향이 있기 때문에, 심지어 저온에서도 단순 용액 중에 단백질을 무기한 저장할 수 없다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 그러나 표면 부착된 단백질의 안정성은 심지어 덜 바람직한 저장 조건 하에서도 상당히 더 길 수 있다.
더 오랜 기간 동안 저장이 가능한 조건은 또한 통상적으로 -20℃ 또는 2-8 ℃, 바람직하게는 2-4 ℃의 최상의 온도 범위를 선택하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 항원-코팅된 비드를 위한 저장에 적용 가능한 완충제는 단순 NaCl 용액, 포스페이트 완충제, 트리스(Tris) 완충제, MES 완충제, 시트레이트 완충제, HEPES 완충제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
저장을 위한 pH 조건은 pH 7 - 8 사이의 생리학적 범위에서 바람직하나, 또한 pH 6 - 9 또는 심지어 pH 2- 14 사이의 범위일 수 있다.
더 오랜 저장을 가능하게 하기 위한 첨가제는 비이온성 세제, 예컨대 트윈(Tween)-20, SDS, 트리톤(Triton) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
소듐 아지드, 카톤(kathon) 또는 다른 방부제를 사용하여 저장 동안에 제제에서 박테리아 또는 진균 성장을 피할 수 있다.
다가 알콜 예컨대 글리세롤, 폴리비닐 알콜 등을 사용하여 용액 중의 입자 및 입자 상의 단백질 둘 다를 안정화시킬 수 있다.
폴리사카라이드 예컨대 트레할로스, 사카로스 등은 특히 구조적 분해로부터 단백질을 추가로 안정화시킬 수 있다.
당류는 입자가 최종 검정의 고체상에 커플링된 후에도 단백질 안정화를 위해 추가로 사용될 수 있다.
어레이 형식으로 항원 충전된 비드의 표면 침착
용액으로부터 고체상으로의 비드의 전달은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 목표는 입자 용액 (비드의 군)을 함유하는 다양한 개개 항원을 어드레스 가능한 요소의 정연한 어레이 (어레이 상의 한정된 장소를 가진 분리된 분자 실체)로 전달하여, 생물학적 샘플, 예를 들어 환자 혈청을 함유하는 항원으로 인큐베이션하고, 결합 사건을 적절히 검출한 후, 검출된 신호가 각각의 항원성 원천 물질에 연관될 수 있도록 하는 것이다.
용액으로부터 고체 지지체 상에 액체를 침착시키는 주요 방법은 접촉 또는 비접촉 구동형이다. 접촉 방법의 경우, 전형적으로 일부 종류의 스탬프 또는 핀이 원료액(source liquid)에 반복적으로 침지되고, 원액에 침지되는 중간에 스탬프 또는 핀에 흡수되는 모아진 물질은 고체 지지체 상에 침착된다. 그러나 더 간단한 대안인 이 방법은, 공정 성능의 대부분이 스탬프 및 원료액의 성질, 뿐만 아니라 고체상의 습윤성, 점도, 액체의 조성 등에 따라 달라질 것이므로, 확장성(scalability) 및 재현성에 관한 한 상당한 단점을 갖는다.
따라서, 대부분의 현대 적용에서 비접촉 방법이 선호된다. 본원에 기재된 어레이의 경우, 솔레노이드 분배 시스템이 사용될 수 있으며, 이로 인해 시린지는 항원성 원천 용액을 함유하는 액체 채널에서 압력을 창출하고 솔레노이드 밸브의 정밀하게 시기 선택된 개방은 세라믹 팁으로부터 정밀하게 균일한 소적(droplet)의 형성을 허용한다. 그 다음에 방울은 세라믹 팁으로부터 분출되며 짧은 비행 단계(flight phase) 후 내려 앉아 고체상에 부착된다. 세라믹 팁 아래에서의 고체상의 이동 (또는 전동 축에 의한 팁의 역방향 이동)은 차례로 상이한 원료액이 정연한 방식으로 침착되는 경우 구별되는 어레이를 생성할 수 있게 한다. 대안적으로, 방울의 침착은 피에조(piezo) 유래 방울 형성을 통해 진행될 수 있으며, 이로 인해 이전에 기재된 방법과의 주된 차이점은 압력이 시린지에 의해서가 아니라 피에조 결정(piezo crystal)에 대한 전기적 임펄스에 의해서 구축되며, 분배된 부피가 피코리터 범위로 전형적으로 훨씬 더 작으며, 한편 솔레노이드 분배는 나노리터 범위의 방울에서 가장 효과가 좋다는 점이다.
형성된 소적의 바람직한 크기는 직경이 1 mm이며, 직경이 1 mm에 가까운 고체상의 원형 특징 형상(circular feature) (어드레스 가능한 요소로서 분리된 분자 실체)을 결과한다. 이러한 차원을 사용하면, 제곱 센티미터당 대략 10x10 (총 100)의 상이한 항원 커플링된 영역의 어레이를 창출하는 것이 가능하다. 고체상에 이러한 방식으로 분배되는 액체의 양은 방울당 약 30 nl이나, 1 나노리터 내지 200 나노리터, 또는 심지어 그 이상일 수 있다. 항원-코팅된 비드의 특이적 군을 포함하는 원형 특징 형상 또는 유닛은 그들의 장소/위치 (공간적으로 어드레스 가능한)에 의해 식별될 수 있고, 규칙적인 직사각형 어레이 또는 오렌지-패킹된 어레이로 배열될 수 있다. 본원에 기재된 어레이는 mm2당 1 내지 9 개의 어드레스 가능한 요소, 예를 들어 mm2당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 어드레스 가능한 요소 중 어느 하나를 갖는다.
최종 측정의 변이 계수의 면에서 침착된 스폿의 품질 (동질성, 형태, 위치 공차(position tolerance) 등) 및 양적 재현성에 대한 중요한 변수는 다음과 같다: 표적으로부터의 거리, 채널의 압력; 베일의 오픈 타임(open times of the vales), 방울 부피; 축의 이동 속도; 분배 사이의 시간; 공정 중 세라믹 팁 및 중간의 세정 공정 및 컨디셔닝; 실제 스폿 침착 공정 전에 사전-스폿팅 관례(pre-spotting rountine); 흡인 부피 및 흡인 속도; 및 마이크로타이터 플레이트의 기하학적 구조. 침착 공정 동안에, 액체 취급 장비 내부에 있을 때 항원 커플링된 입자를 용액 상태로 유지하고, 흡인 주기와 분배 주기 중간에 액체 채널을 충분히 세정함으로써 상이한 항원-코팅된 비드의 침착 중간에 임의의 교차 오염을 피할 것이 요구된다.
제로-결함 침착 공정을 달성하기 위해, 예를 들어, 입자 용액에 영구적이지 않은 색소를 첨가함으로써, 모든 단일 분배 결함 사건을 검출하는 것이 중요하며, 이는 액체의 고체상으로 성공적인 침착을 검출할 수 있게 하나, 실제 시험 절차 동안에 씻겨 없어질 것이다. 그 방식으로, 분실된 방울을 검출할 수 있으며 초기 분배 라운드 후에 소급적으로 부가하여, 이로 인해 100%의 시간 내에 100%의 완전한 배치(complete batch)를 야기할 수 있다.
고체 지지체
침착 공정은 통상적으로 고체 지지체 물질의 더 큰 시트 또는 플레이트 상에서 행해지며, 이로 인해 각각의 배치는 전형적으로 수백 내지 수천 개의 동일한 어레이로 이루어진다. 필요한 수의 분배 채널을 정렬하고 플레이트 상에 기판 또는 심지어 릴을 분배 팁 아래에 릴 시스템으로 이동시키고, 위치 선정 및 분배 사건을 시기 선택하여 입자 스폿의 정연한 어레이가 고체 지지체 상에 창출되도록 함으로써 연속 공정을 실현할 수 있다.
분배 단계 후에, 고체 지지체는 추가 어셈블리 또는 저장을 위해, 적절한 크기의 단편으로 커팅된다. 대안적으로, 고체 지지체는 심지어 항원-코팅된 비드의 침착 전에 적합한 크기로 커팅될 수 있으며, 여기서 단편의 크기는 침착된 입자의 군의 수 및 개개 군의 밀도에 상응한다. 바람직한 실시양태에서, 고체 지지체의 개개의 단편은 직사각형이고 5x5 mm 내지 200x200 mm 또는 그 초과, 훨씬 더 바람직하게는 10x10 내지 20x30 mm이다.
고체 지지체는 니트로셀룰로스, 적층 니트로셀룰로스 또는 디아조 종이 또는 유기 중합체 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 폴리아크릴아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알로머(polyallomer), 폴리비닐, 나일론, 뿐만 아니라 공중합체 및 그의 그래프트 또는 다른 관능화된 플라스틱으로 구성될 수 있다. 고체 지지체는 또한 무기, 예컨대 유리, 실리카, 제어된-세공-유리(controlled-pore-glass) (CPG), 또는 역상 실리카(reverse-phase silica)일 수 있다. 고체 지지체의 입체형상(configuration)은 막 또는 표면의 형태일 수 있으며, 평면, 실질적으로 평면, 또는 비평면일 수 있다. 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성일 수 있고, 팽창(swelling) 또는 비팽창 특성을 가질 수 있다.
고체 지지체의 성질은 단백질 항원으로 충전된 입자를 보유하는 능력을 가진, 다공성 또는 비다공성 물질일 수 있다. 예를 들어, 니트로셀룰로스 시트 또는 적층 니트로셀룰로스 시트가 고체상으로서 사용될 수 있으며, 이로 인해 니트로셀룰로스의 세공 크기 및 정확한 조성이 시험 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 생체 분자를 공유 결합시킬 수 있도록 하는 니트로셀룰로스의 화학적 활성화조차도 시험 결과에 유익한 영향을 미칠 수 있다. 상이한 유형의 니트로셀룰로스 막이 고체 지지체로서 이용 가능하며, 이러한 니트로셀룰로스 막은 세공 크기, 유량 또는 기재 물질(base material)과 관련하여 상이하다. 바람직하게는, 세공 크기는 입자 크기의 범위 내에 있어야 하고, 따라서 입자가 표면 상의 세공에 의해 보유될 수 있으나, 동시에 고체 지지체의 구조 내에서 사라지지 않도록 하여, 항체가 입자의 표면에 결합하는 것을 더 어렵게 할 것이다.
고체상은 수시간의 인큐베이션 및 수용액 중에서의 세척을 필요로 하는 전형적인 ELISA 절차와 적합성이고 내구성이 있어야 한다. 표면에 대한 비특이적 결합은 본질적으로 낮아야 하거나, 고체상에 대한 임의의 비특이적 결합을 차단하는 것이 가능하여 필요한 신호 대 잡음비 (잡음 표준 편차에 의해 나눠진 신호)를 수득하도록 하여야 한다.
시험 및 어셈블리의 카트리지에의 저장
고체 지지체에 침착시킨 후에 입자를 안정화시키기 위해, 고체 지지체는 적절한 온도, 바람직하게는 2-8 ℃에서 저장할 수 있다. 게다가, 당 또는 다른 안정화 물질을 입자 침착 후에 분무 코팅에 의해 첨가할 수 있다. 안정성 요구 사항은 제조 후 적어도 1년, 제조 후 적어도 30개월이며, 이는 제조 후 최종 사용자에게로의 선적을 위해 6개월 및 최종 사용자에서 24개월의 남은 저장 수명을 남길 것이다.
실용적인 취급, 저장 및 선적뿐만 아니라 키트 포장 목적을 위해, 고체 지지체의 커팅된 스트립을 아래에서 더 상세하게 기재되는 카트리지로 어셈블리할 것이다. 카트리지는 고체 지지체 마크로 어레이(macro array)에 대한 물리적 보호를 제공할 뿐만 아니라, 시험의 자동 처리, 잠재적으로 오염된 물질의 액체 취급 및 폐기를 매우 용이하게 하는 고도로 정교하고 기능적인 용기를 제공한다.
검정 절차
본원에 기재된 항원 어레이를 사용하여 검출 항원 또는 검출 항원의 세트에 특이적인 면역글로불린을 검출하는 시험관내 방법이 본원에 추가로 기재되어 있다. 구체적으로, 상기 방법은
(i)
본원에 기재된 바와 같은 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약으로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로, 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함한다.
음성 대조군 신호와 비교하여 증가된 검출 가능한 신호는 샘플 중에 면역글로불린의 존재를 나타내며, 한편 어떠한 신호 증가도 샘플 중에 면역글로불린의 부재를 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 비색계, 형광성, 전기 또는 화학발광성 신호이다.
본원에 기재된 바와 같은 생물학적 검정은 ELISA 원리에 기초한 단일 분석 절차에서 복수개의 항원에 대한 특이적 면역글로불린을 검출하는 목적을 가지며, 대개 하기 기본 단계로 이루어진다:
1) 사전 세척
2) 차단
3) 샘플로 인큐베이션
4) 세척
5) 검출 시약으로 인큐베이션
6) 세척
7) 임의적: 신호 발생 시약으로 인큐베이션
8) 임의적: 신호 발생 정지
9) 결과의 검출 및 측정
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항원 어레이를 사용하여 검출 항원 또는 검출 항원의 세트 (예를 들어, 알레르기항원 또는 알레르기항원의 세트)에 특이적인 면역글로불린을 검출하는 방법은
(i))
본원에 기재된 바와 같은 항원 어레이 (예를 들어, 알레르기항원 어레이)를 제공하는 단계,
(ii))
어레이를 샘플 (예를 들어 혈청 또는 전혈 또는 가공 혈액)로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약 (예를 들어 항-IgE 또는 항-IgG 항체 또는 IgE-특이적 또는 IgG-특이적 앱타머 (검출 가능한 신호로 직접 표지됨), 항-IgE 또는 IgG 항체 또는 IgE-특이적 또는 IgG-특이적 앱타머 (효소에 접합됨))으로 인큐베이션하는 단계,
(iv) 임의로, 신호 발생 시약 (예를 들어, 효소 반응을 위한 기질)으로 어레이를 인큐베이션하는 단계,
(v) 임의로, 정지 용액을 첨가하여 신호 발생을 종료시키는 단계, 및
(vi) 검출 가능한 신호를 측정하는 단게를 포함한다.
그러한 관점에서의 샘플은 환자 혈청, 전체 또는 가공 혈액, 비강 유체, 소변, 다른 체액 또는 조직으로부터의 세포 용해물 또는 균질액일 수 있다. 샘플은 단일 대상체 또는 대상체의 풀 (예를 들어 많은 집단의 대상체를 스크리닝하는 경우 10, 20, 30 명의 대상체의 혈청의 풀)로부터 일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 (예를 들어, 혈청 샘플)이다. 일부 실시양태에서, 샘플 크기는 1 μl 내지 2000 μl 중 어느 하나, 예를 들어 1 μl 내지 10 μl, 10 μl 내지 50 μl, 50 μl 내지 100 μl, 100 μl 내지 500 μl, 500 μl 내지 2000 μl 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 샘플 크기는 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl, 100 μl, 250 μl, 500 μl 또는 1000 μl 또는 2000 μl 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 희석되지 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 희석된다. 일부 실시양태에서, 샘플 희석은 1:1 내지 1:10, 1:10 내지 1:100, 1:100 내지 1:1000 또는 1:1000 내지 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 샘플 희석은 1:10, 1: 100, 1:1000 또는 1:10000 중 어느 하나이다. 필요한 샘플의 실제 양은 인큐베이션 반응에 사용된 샘플 희석에 따라 달라질 수 있다.
일상적인 혈액 채취 중에 빈번하게 발생하는, 샘플이 완벽한 상태가 아니어도 시험의 수행은 생물학적 샘플에 의해 크게 영향을 받지 않아야 한다. 전형적인 문제는 지방혈성, 용혈성 또는 황달 샘플 유체, 높은 단백질 함량 또는 심지어 높은 항체 함량 (IgG, IgE, 기타)을 가진 샘플일 수 있다.
검출 시약은 생물학적 기원의 친화도 결합제, 바람직하게는 무작위 라이브러리를 통한 면역화나 인공 선택으로부터의 항체 (예를 들어 검출 항체)이다. 다른 친화도 결합제는 단백질 또는 핵산 인위적으로 선택된 결합제, 예컨대 앱타머 또는 아피바디일 수 있다.
초기 세척 단계는 샘플 인큐베이션 단계에서 고체상 결합 항원 및 유리 가용성(free soluble) 항원의 결합과 달리 경쟁하지 않을 고체상으로부터 임의의 비영구적으로 결합된 입자를 제거하는 목적을 갖는다.
일반적인 표현으로, 세척 단계는 단일 단계는 아니지만 대개 반복적으로 수행하여, 검출 한계 미만의 임의의 원치 않는 시약의 최종 제거를 달성하도록 한다. 구체적으로, 세척 단계의 사용은 3-5 회 반복될 수 있으며, 이로 인해 카트리지를 기울임으로써 부피의 희석이 가정되고, 새로운 세척 용액을 첨가하는 것이 적어도 30배가 되므로, 3 라운드의 세척 후 희석 정도는 대략 27.000 중 1이고, 임의의 추가 세척 단계는 희석을 30배 만큼 훨씬 더 증가시킬 것이다.
차단 단계는 검출될 것이나 고정화된 항원에 특이적이지 않은 항체와 같은 샘플의 어느 구성 성분이든지의 비특이적 결합의 임의의 가능성뿐만 아니라, 검출 시약의 비특이적 결합을 차단하고자 하는 것이다.
차단은 샘플로 인큐베이션하기 전에 1회 행하거나, 검정의 매 단계 전에 반복적으로 행할 수 있거나, 차단제를 첨가하여 측정될 샘플을 희석하거나 심지어 검출 시약 (예를 들어 검출 항체, 앱타머 또는 애피바디)이 차단 시약에 함유될 수 있다.
그러한 관점에서 차단 시약은 혈액 또는 혈청과 같은 복잡한 생물학적 샘플과 고체상의 복수개의 항원 사이에서 대개 발생하는 의도하지 않거나 비특이적인 결합 반응을 완화할 수 있는, 생물학적 또는 다른 기원의 임의의 물질을 지칭한다. 차단은 잠재적으로 항원성 단백질이 존재하지 않는 것이 바람직하며, 그렇지 않으면 훨씬 더 많은 비특이적 결합 및 감소된 신호 대 잡음 발생을 야기할 것이다.
예를 들어, 안정화제 또는 차단제로서 간단한 ELISA 절차에 빈번하게 사용되는 소 혈청 알부민 (BSA)은 인간 IgE 또는 IgG의 검출이 수반되는 경우 전형적으로 부적합한데, 그 이유는 BSA가 잠재적인 식품 알레르기항원이고 암소로부터 육류 제품이나 유제품을 빈번하게 섭취하는 인간에서 관련되지 않은 IgG의 빈번한 유도인자 둘 다이다. 따라서 BSA에 의해 차단된 임의의 결합 부위는 그렇지 않으면 검출된 하위 클래스의 각각의 항 BSA 항체를 샘플이 함유하는 경우보다 비특이적 배경으로 더 많은 문제를 제공할 수 있다. 유사한 상황으로 인해 다른 영역에서 빈번하게 사용되는 많은 싸고 쉽게 이용 가능한 차단 시약을 사용하는 것이 실용적이지 못하게 된다.
따라서, 단백질 차단제가 사용된다면, 이들은 어떠한 인간 항체에도 통상적으로 결합하지 않는 인간 혈청 알부민과 같이 인간에게 면역원성이 아니어야 한다.
대안적인 차단 방법은 세제, 당류, 다가 알콜 또는 항원-항체 결합 복합체 (전형적으로 10 -9 M 이하의 친화도 상수를 가짐)만큼 강력하고 특이적이지 않은 상호 작용 파트너 사이에 약한 결합을 불안정하게 만들 수 있는 다른 화합물을 수반한다.
샘플 또는 검출 시약 (예를 들어 검출 항체)으로의 인큐베이션 단계는 대개 총 절차의 가장 긴시간이 비례하여 걸리며, 인큐베이션 시간은 수분에서 수시간범위이다. 바람직하게는, 샘플의 인큐베이션은 2시간 미만 걸리며, 검출 시약으로의 인큐베이션은 30분 미만이 걸린다. 검출 시약이 이미 검출 가능한 표지를 보유하고 있는 경우에, 신호 발생 인큐베이션 단계는 생략될 수 있다. 그렇지 않으면, 특히 효소적 신호 발생을 사용할 때, 신호 발생 시약으로의 전형적인 인큐베이션 시간은 바람직하게는 5분 미만이다.
인큐베이션 동안에, 카트리지의 현재 설계는 액체의 교반을 가능하게 하여, 샘플을 혼합하고 각각의 항원에 대한 친화도 결합제의 대량 수송을 증가시킨다. 바람직하게는, 교반은 카트리지의 긴 면을 따라 이동하여 액체가 리셉터클(receptacle) 경계를 넘치지 않도록 충분히 온화하지만, 혼합 없이 인큐베이션과 비교하여 반응 속도(reaction kinetic)를 충분히 증가시킬 만큼 강하다.
유체를 보다 효율적으로 혼합하도록 의도된 온도 또는 전자기파에 의해 대안적인 검정 반응속도론(assay kinetics)을 증가시키거나 제어할 수 있다.
검출 및 측정
검출 가능한 신호의 생성을 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 몇 가지 가능성이 있다. 가장 간단한 형태로, 특이적 면역글로불린이 로딩된 항원 부위에 결합하는 검출 시약은 색소 화합물이나 흥분성 화합물로, 예컨대 형광 염료 또는 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자 등으로 직접 표지된다. 이러한 경우에, 검출은 신호 생성을 위한 어떠한 추가 단계도 필요로 하지 않으며, 신호는 결합되지 않은 검출 시약을 세척 제거한 후 직접 판독될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 효소적 신호 발생은 효소에 접합되는 검출 시약을 사용함으로써 이용되며, 이는 신호 발생 시약에 함유된 기질을 검출 가능한 신호로 전환시킨다.
검출 시약에 접합되는 효소는 알칼리성 포스파타제 (AP), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 또는 베타-갈락토시다제 (GAL)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 효소는 기질 (예컨대 NCIB/NBT)로부터 착색 침전물을 창출할 수 있거나, 발광단 전환(luminophore conversion) (예를 들어 루민겐(Lumingen) APS-5)으로부터 광자를 창출할 수 있거나, 특정 파장에서 흡광 계수를 변화시키기 위해 기질을 전환시킬 수 있으며, 예를 들어 각각 o-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시다제이다.
필요한 경우, 효소에 의해 기질의 전환을 강하게 방해하는 물질, 소위 정지 용액 (예를 들어 증류수, EDTA, NaOH, HCl 등)을 첨가함으로써 효소 반응을 즉시 정지시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 시약은 색소 화합물, 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자로 또는 흥분성 화합물로 직접 표지된 항-인간 IgE 항체이다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 색소, 금 나노입자, 착색 라텍스 나노입자로 또는 흥분성 화합물로 직접 표지된 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 앱타머 또는 애피바디가 색소, 금 나노입자, 착색 라텍스 나노입자 또는 흥분성 화합물로 직접 표지된 인간 IgE 또는 IgG 항체를 특이적으로 인식하는 앱타머 또는 애피바디이다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 효소 (예를 들어, AP, HRP 또는 GAL)와 접합된 항-인간 IgE 또는 IgG 항체이고, 상기 방법은 어레이를 신호 발생 시약 (예를 들어, 효소 반응을 위한 기질)으로 본원에 기재된 단계 (iv)에 따라 인큐베이션하는 단계, 그리고 임의로, 단계 (iv) 후에 정지 용액 (ddH2O, EDTA, NaOH, 염산, 황산 또는 임의의 시약 (이는 촉매 반응에 필요한 pH 값 때문에 반응을 불가능하게하거나, 화학적으로 기질을 파괴 또는 변경하거나, 효소의 활성 중심을 차단하거나, 반응을 중요하지 않은 수준으로 둔화시키는 등에 의해 효소 반응을 방해할 수 있다)을 추가로 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 검출 시약은 두 성분, 즉 (i) 항-IgE 또는 항-IgG 항체를 포함하는 제1 성분; 및 (ii) 항-IgE 또는 항-IgG 항체를 인식하는 시약을 포함하는 제2 성분 (이러한 제2 시약은 색소 또는 흥분성 화합물로 직접 표지되거나 효소와 접합되어 있다)을 포함하며 여기서 항원 어레이는 상기 (i) 그리고 그 다음에 본원에 기재된 방법의 단계 (iii) (중간에 세척 단계를 가짐)에 따라 (ii)로 인큐베이션된다. 예를 들어, 제1 성분은 래트, 마우스, 토끼 등과 같은 생물로부터 수득한 항체와 같은 특정 유형의 항-IgE 또는 항-IgG- 항체일 수 있고, 제2 성분은 상기 유형의 항체, 예를 들어 항-래트, 항-마우스, 항-토끼 항체 등에 대한 항체 결합일 수 있다.
(i)
본원에 기재된 바와 같은 알레르기항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플 (예를 들어 혈청 또는 전혈 또는 가공 혈액)로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 가능한 신호로 직접 표지된 항-IgE 항체 또는 항-IgE 앱타머로 또는 효소 (예를 들어, AP, HRP 또는 GAL에 접합된)에 접합된 항-IgE 또는 항-IgE 앱타머로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로, 어레이를 신호 발생 시약 (예를 들어, 효소 반응을 위한 기질)으로 인큐베이션하는 단계,
(v)
임의로, 정지 용액을 첨가하여 신호 발생을 정지시키는 단계 (예를 들어 ddH2O, EDTA, NaOH, 염산, 황산, 또는 효소 반응을 방해할 수 있는 임의의 시약), 및
(vi)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 알레르기와 연관된 IgE 항체를 검출하기 위한 시험관내 방법이 본원에 구체적으로 제공된다. 착색된 신호의 검출은 간단한 CCD 카메라, CMOS 카메라, 레이저 스캐너 예컨대 통상적인 평판형 스캐너, 또는 고체 지지체의 통상 백색 또는 투명한 배경과 결합 반응이 검출되는 착색된 반응 부위 사이의 강도 차이를 측정할 수 있는 임의의 다른 기기를 통해 진행될 수 있다. 광자 측정의 경우에, 신호를 개별적으로 측정하기 위해서 충분한 민감도를 가진 카메라 또는 광전자 증배관 장치(photomultiplier device)를 사용할 필요가 있다.
정량화를 위해, 먼저 개개의 항원이 고정화되어 있는 영역을 확인할 필요가 있다. 이것은 소위 마커 스폿(marker spots)인 검출 가능하고 강한 신호를 항상 제공하는 양성 제어 스폿(positive control spot)의 패턴에 의해 용이하게 될 수 있다. 예를 들어, 양성 제어 스폿은 정제된 인간 IgE 항체와 커플링된 비드의 군일 수 있다. 마커 스폿의 위치 및 배향으로부터, 모든 다른 부위의 상대적 위치뿐만 아니라 그의 크기가 공지되어 있고 데이터 포인트의 획득된 영상 또는 어레이 내에 위치될 수 있다.
고정화된 항원으로 충전된 입자의 각각의 전형적으로 둥근 영역의 경우, 예상된 신호 내에 있는 각각의 픽셀을 총 신호에 첨가함으로써 신호 집적을 계산할 수 있고, 외부에 있는 각각의 픽셀을 배경에 첨가할 수 있다. 게다가, 평균, 중앙값 및 표준 편차는 배경의 경우와 마찬가지로 신호에 대해 계산할 수 있다. 모든 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것과 같은 영상 분석 소프트웨어 도구, 예를 들어 NIH로부터의 ImageJ에 의해 취급될 것이다.
본원에 기재된 방법에서, 국부적 배경 계산이 바람직하며 이는 스폿 영역의 직경의 3배 이내이나 함께 항원 부위 중 임의의 것 이내는 아닌 모든 픽셀을 요약함으로써 행해진다.
게다가, 통계적 제어 조치를 사용하여 신호, 예컨대 평균 내지 중앙값 변동, 신호 변동, 잡음 변동, 및 이상치 검출의 품질 또는 신뢰성을 판단할 수 있다.
전체 측정 가능한 신호 - 배경의 면에서든, 또는 신호 대 잡음 비의 면에서든 임계 값을 필터 미가공 측정 데이터에 적용한다. 바람직하게는 배경 잡음 변동보다 적어도 2배 더 높은 유일한 신호는 양성 신호 (예를 들어, 검출 가능한 신호)로 간주된다.
결과의 표준화 및 교정
미가공 측정 데이터의 획득 후, 미가공 분석 데이터로부터 임상적으로 관련된 응답 단위로 전환하는 데 필요한 두 단계가 있다.
본원에 기재된 방법에서, 결과의 제1 정규화(normalization) 및 제2 교정을 달성하기 위한 두 가지의 구별되는 방법이 이용된다.
그 점에 있어서 정규화는 측정, 일수, 로트(lot) 또는 오퍼레이터(operator) 간의 전반적인 신호 수준의 변동을 평균적으로 동일한 수준으로 정규화하는 과정이다. 이러한 방식으로, 인큐베이션의 정확한 시기 선택의 변동, 주위 온도 변동으로 인한 차이, 샘플 매트릭스에 의한 변동 등이 어느 정도 보상될 수 있다.
본 출원의 경우, 검정에서 측정될 특이적 항체 하위 클래스의 표준 곡선을 사용하여 이러한 정규화를 달성한다. 정제된 항체, 예를 들어 인간 IgE는 증가하는 농도로 마크로어레이 형식의 구별되는 부위에 고정화된다. 이 접근법에 따르면, 표준 곡선 상의 가장 높은 농도는 100% 신호로 간주될 것이며, 한편 표준 곡선의 각각의 공지된 희석은 농도 값에 상응하는 감소가 할당된다. 곡선의 모든 점으로부터, 곡선 적합성이 계산되어 각각의 미가공 측정 값에 곡선 방정식을 적용함으로써 임의의 강도 단위를 상대 신호 단위로 변환하는 데 사용된다.
이 방법을 사용하면 측정 간의 평균 신호 강도를 정규화할 수 있지만, 각각의 배치에 대한 각각의 개개 파라미터에 대한 개개 요동(fluctuation)을 보상할 수는 없다. 전형적으로, 각각의 생산된 로트에서 특정 정도의 제조 변동이 존재하며, 종종 이들 변동은, 예를 들어, 파라미터 1이 장시간 평균보다 10% 더 높을 수 있고, 파라미터 2가 장시간 평균보다 5%보다 더 낮을 수 있고 파라미터 3이 사양(specifications) 내에 있을 수 있는 방식으로 체계적이다. 이들 차이를 필요한 최소한으로 근절하기 위해, 제조업자의 품질 관리 사이트에서 이미 명확한 대조군 샘플을 사용하여 장기간 평균으로부터 임의의 체계적 변동을 탐지하는 것이 실현 가능하다. 일단 이러한 체계적 변동이 확인되면, 이들 차이점을 최종 사용자에게 데이터 시트의 형태로, 또는 바람직하게는 각각의 배치 상에 인쇄된 2D 바코드와 같은 자동 코딩 형식으로 전달하는 것이 실현 가능한다. 이 바코드를 읽고 해석함으로써, 최종 사용자는 - 소프트웨어 도구에 의해 용이하게 됨 - 제조업자 사이트의 QC 절차 중에 식별된 변동에 따라 측정 값을 자동으로 조정할 수 있을 것이며, 그 다음에 상기 예에서 파라미터 1을 10% 감소시킴으로 조정하고, 파라미터 2를 5% 증가시킴으로써 조정하고 파라미터 3을 변경하지 않은 상태로 둘 수 있을 것이다. 결과적으로, 면역검정의 전체 변동을 이와 같이 구성 가능하고 통계적으로 정당화된 데이터 조정이 없는 것보다 더 낮은 수준으로 감소시키는 것이 가능하여야 한다.
최종 단계에서, 결과의 실제 교정이 달성되어야 한다. 이 점에서 교정은 조정된 상대 응답 단위를 일부 형태의 절대 단위에서 전환하는 과정이다. 절대 단위는, 심지어 시스템에 대한 상당한 변화이 이루어진 경우라도, 실험실 간 또는 시점 간, 결과를 다른 제조업자의 시스템과 결과를 비교하게 할 수 있는 값의 역할을 하여야 한다.
국제적으로 인정되는 참조 제제에 대한 교정이 가능하다면 이루어질 수 있다. 많은 질환 영역에서, 정량적 참조 표준은 구매품일 수 있으며 교정에 사용될 수 있다. 그러나 순전히 실제 측정을 수행하는 것보다 시스템을 교정하는데 상당히 더 많은 노력 및 비용이 필요할 것이기 때문에, 정상적인 교정 과정은 다중 파라미터 검정 형식에서 사용하기에 실용적이지 않다.
단일 파라미터 검정에서 교정을 위한 표준 접근법은 동종 교정(homologous calibration)이며, 이로 인해 후자의 농도가 알려지지 않은 샘플로부터 측정하여야 하는 특정 항원 - 항체 상호 작용에 대한 측정 결과가 측정되어 각각의 항원에 대한 면역글로불린의 한정된 농도를 가진 한정된 샘플의 측정 결과에 대하여 미가공 측정을 절대적으로 정량화된 측정 결과로 변환시키기 위한 이 참조 곡선을 사용하여 비교된다.
이는 상대적으로 많은 수의 알려지지 않은 샘플과 비교하여 교정 목적으로 상대적으로 적은 표준 제제를 측정할 때 쉽게 달성된다.
그러나 각각의 반응에서 측정된 수백개의 개개의 파라미터를 사용하며, 각각의 파라미터가 동일한 항체 하위 클래스의 결합을 나타내지만 상이한 항원에 대항하는 것을 나타내는 것인 적용에서, 각각의 개개 파라미터에 대한 동종 교정 곡선은 실현 가능하지 않으며 유의한 추가 변동을 도입할 가능성이 매우 클 것이다. 따라서 소위 이종 교정 접근법이 이용된다. 따라서, 구별되는 샘플에서 측정된 각각의 항체의 상이한 농도를 가진 단일 항원-항체 측정에 대해 교정 곡선이 생성되지 않으나, 다양한 상이한 고정화된 항원에 대해 다양한 특이적 항체 농도를 나타내는 단일 샘플로는 생성된다. 상기 방법은 동일한 면역글로불린이 상이한 항원에 대한 결합에 대해 검출될 때, 각각의 표적 항원에 대한 항체 반응을 개별적으로 교정하는 것이 절대적인 요구 사항은 아니나, 검출되는 면역글로불린의 각각의 부류에 대해서만 동일한 교정 곡선을 유지하는 것이 상기 요구 사항이라는 사실에 의존한다.
소프트웨어 도구에 의해 지원되는 결과의 해석
다중 파라미터 면역학적 측정의 기재된 적용은 환자의 민감화 프로파일의 통상적인 단일 파라미터에 기초한 임상적 일련의 정밀 검사(clinical workup)보다 상당히 더 많은 시험 결과를 초래할 것이다.
결과적으로, 생물 정보학 도구의 적용은 의사가 데이터를 보다 쉽게 검토하고 가능한 한 최상의 진단 결론을 얻게 할 수 있는 형식으로 결과의 해석 및 시각화를 용이하게 하여야 한다. 하기 인자들은 소프트웨어가 프리젠테이션 또는 지침을 용이하게 하기 위해 적절하다고 간주되어야 한다:
1)
예를 들어, 프로파일에 기초하여 건강 상태의 일반적인 분류, 환자가 검사가 지시된 주장된 질환을 앓고 있을 가능성이 있는지.
2)
질환의 세부 분류, 예를 들어 질환의 상태 또는 질환의 원인을 나타내는 파라미터의 패턴 또는 관련 파라미터.
3)
예를 들어 상이한 항원 표적에 대한 상이한 항체 서브클래스의 비, 또는 특정 표적에 대한 보호 항체의 부재, 또는 표적의 조합에 대한 항체 반응의 패턴, 또는 특정 표적에 대한 항체 반응의 수준으로 환자를 구별함으로써, 환자의 위험 분류.
4)
예를 들어 적절한 약물 투여를 선택하거나, 회피에 대한 올바른 권장 사항 사항을 제시하거나, 심지어 효과가 없을 가능성이 매우 큰 약물 투여를 피하는 것에 의한, 환자 치료에 대한 결과.
임상 해석을 위한 완전한 패널
고도로 다중화된 면역검정의 주된 이점은 모든 관련 임상 파라미터를 단일 검사에 포함시킬 수 있다는 점이며, 이는 의사가 각각의 단일 환자에 대한 검사를 미리 선택하는 부담을 감소시키며, 단일 분석 단계에서 항상 완전한 임상적 일련의 정밀 검사를 얻는다.
자동화와 관련된 카트리지 설계 및 이점
본원에 기재된 항원 어레이 중 임의의 것을 위한 시험 챔버, 액체 폐기물 저장소, 및 임의로 식별 및 교정을 위한 바코드를 포함하는 카트리지가 본원에 추가로 제공된다. 카트리지는 검출 시약 (예를 들어, 표지된 항체, 표지된 앱타머 또는 표지된 애피바디), 신호 발생 시약 (예를 들어 효소 기질), 및 정지 용액 (예를 들어 증류수, EDTA, NaOH, HCl 등) 중 어느 하나 이상을 위한 저장소 또는 통합 바이알을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 1종 이상의 대조군 샘플 (예를 들어 양성 및/또는 음성 대조군) 및/또는 검정 절차 동안에 사용되는 1종 이상의 완충제 (예를 들어 세척 완충제, 차단 완충제, 희석 완충제) 중 어느 하나 이상을 위한 저장소 또는 통합 바이알을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양성 대조군 샘플은 한정된 양의 면역글로불린 (예를 들어 총 IgG 또는 IgE 및/또는 특정한 항원/알레르기항원에 대해 특이적인 한정된 IgG 또는 IgE)을 가진 상업적으로 입수 가능한 표준화된 샘플이다. 일부 실시양태에서, 양성 대조군 샘플은 각각의 면역글로불린에 대한 표준 검정에서 양성으로 입증되거나 양성 반응을 보인 샘플이다. 일부 실시양태에서, 음성 대조군 샘플은 어떠한 면역글로불린도 함유하지 않는 상업적으로 입수 가능한 샘플 또는 각각의 면역글로불린에 대한 표준 검정에서 음성으로 입증되거나 음성 반응을 보인 샘플이다. 카트리지는 인큐베이션 기간 동안뿐만 아니라 어레이의 철저한 세척을 통해 어레이 상의 샘플 및 완충제의 균등한 분배를 보장하기 위해 항원 어레이가 그 안에 배치된 전체적으로 시험 챔버 또는 시험 챔버 내에서 항원 어레이를 부드럽게 이동시키는 수단을 추가로 제공할 수 있다. 카트리지의 차원은 어레이의 크기 및 사용된 시약의 유형 및 수에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는 크기는 1 cm x 1 cm x 5 cm 내지 2 cm x 5 cm x 15 cm의 범위일 것이다.
항원 어레이를 카트리지에 고정하는 것은 주변의 정확한 치수로 커팅함으로써 기계적 고정을 하거나, 스트립의 에지에서 기계적 고정을 사용하거나, ELISA 절차 동안에 세척 및 인큐베이션 단계를 또한 견디는, 생체 적합성 접착제를 사용하는 것을 포함한, 몇몇 방식 중 하나에 의해 행할 수 있다. 고정의 중요한 측면은 카트리지에서 또는 카트리지와 고체상 시험 스트립 사이에 갭(gap), 영역 또는 구멍(hole)을 창출하는 것이 아니며 여기서 인큐베이션 단계 동안에 비특이적 결합이 발생할 수 있으며, 이는 효율적인 세척에 따르지 않을 수 있으며, 그 이유는 이것이 검출 단계에서 전반적인 비특이적 신호 발생을 크게 증가시키므로 검정의 피크 신호 대 잡음 및 전반적인 검정 성능을 감소시킬 것이기 때문이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 바와 같이 인큐베이션 및 신호 검출의 위치 효과를 갖지 않는 인자가 유사하게 중요하다. 전형적인 바이어스는 소위 에지 효과(edge effect)이며, 이는 어레이의 중간에서의 것들보다 현저하게 그리고 재현 가능하게 더 높거나 더 낮은 벽 또는 바이알을 둘러싸는 인접한 카트리지 및 어레이의 경계에 가까운 반응 부위 (스폿)를 결과한다. 그 차이는 교반 또는 혼합 동안에 액체의 거동에 의해, 선택된 장소에서 결합제의 축적에 의해, 또는 표면 장력에 의해, 또는 보다 고정된 경계에 둘러싸인 반응 부위의 반응속도 차이(kinetic difference) 그리고 따라서 더 중심적이고 에지 또는 벽에 의해 덜 억제되는 이들보다 더 제한된 자유 확산에 의해 야기될 수 있다. 심지어 공간 온도 차이도 관측된 차이에서, 뿐만 아니라 용기의 기하학적 구조에 의한 검출 사건에서의 바이어스에서 역할을 할 수 있다. 예는 마이크로어레이를 원형 마이크로웰 플레이트에 침착시킨 경우, 중앙의 스폿은 전형적으로 플레이트의 경계에 더 가까운 스폿과 훨씬 상이하게 거동한다는 점이다. 일부 제조업자는 "원형 어레이" 또는 패턴을 인쇄하여 이러한 한계를 극복할 수 있긴 하지만, 이 과정은 사용 가능한 영역 및 영역당 특징 형상의 수를 대폭 감소시키는데, 이는 반응에서 수백개의 구별되는 어레이를 사용하는 실제 다중 파라미터 검정에는 적합하지 않을 것이다.
제시된 발명에서의 카트리지 설계는 추가적인 이점을 제공한다. 카트리지는 키트 자체로 거의 간주될 수 있으며, 이는 따라서 설계된 리셉터클에서 시험 절차에 필요한 모든 액체 및 시약을 함유할 수 있다. 카트리지는 로트 식별을 위한 바코드를 포함할 수 있고, 교정을 위한 심지어 정정 인자 등이 이러한 바코드에 저장될 수 있을 것이다.
유사한, 일회용 플라스틱 팁의 세트가 카트리지에 내장되어 있어, 그로부터 피펫터는 프로세스를 위해 이들을 잡아서 사용 후 카트리지 내로 이들을 재주입할 수 있다. 그러한 방식으로, 모든 액체가 설계된 폐기물 리셉터클에 의해 카트리지 자체에 수집되기 때문에, 주변 시스템 부품 (예를 들어 액체 취급)이 잠재적으로 전염성이 있는 생물학적으로 위험한 액체와 접촉하는 일이 발생하지 않는다. 따라서, 기기에 대한 어떠한 특수 세척 또는 소독 절차가 필요하지 않다.
카트리지는 시험 절차에 모든 필요한 액체를 포획하거나 심지어 함유할 수도 있기 때문에, 이러한 설계를 기초로, 단지 액체 취급 부품이 공기 치환 피펫터일 수 있으며, 이는 일회용 팁을 사용하면 유지할 필요가 없거나 어떠한 밸브 또는 튜빙도 기기의 정상적인 예상 수명 동안 교체할 필요가 없는 방식으로 검정 자동화를 설계하는 것이 실현 가능하다. 이러한 거의 유지 보수가 필요 없는 기기의 전체 개발 비용뿐만 아니라 소유 비용은 반복적으로 교체하여야 하는 많은 가동 부품, 밸브 및 튜브를 함유하는 전형적인 자동 면역 분석기의 것들 보다 훨씬 낮다.
세척 단계 동안에, 카트리지는 단지 한쪽으로 기울어짐으로써, 함유된 액체가 카트리지 내의 저장소 내로 유입되어 거기서 포획되어 마지막으로 처리된다.
본원에 기재된 바와 같은 항원 어레이 또는 카트리지, 검출 시약, 대조군 샘플 (예를 들어 양성 또는 음성 대조군), 검정 동안에 사용되는 완충제 및 사용을 위한 사용 설명서를 포함하는 키트가 본원에 추가로 제공된다. 키트는 신호 발생 시약 (예를 들어 효소의 기질) 및 임의로 정지 용액 (예를 들어 증류수, EDTA, NaOH, HCl 등)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 항원 어레이 (예를 들어, 알레르기항원 어레이), IgE 또는 IgG에 특이적인 검출 시약 (예를 들어, 직접 표지되거나 효소와 접합된, 항-IgE 또는 항 IgG 항체, IgE 또는 IgG에 특이적인 앱타머 또는 애피바디), 완충제 용액 (예를 들어 완충제를 차단하는 세척 완충제, 희석 완충제) 및 임의로 신호 발생 시약 (예를 들어 효소 기질)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 정지 용액 (예를 들어 증류수, EDTA, NaOH, HCl 등)을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 카트리지용 챔버, 피펫터 및 신호 검출용 기기 (예를 들어, CCD 카메라, CMOS 카메라, 레이저 스캐너)를 포함하는 장치가 추가로 제공된다.
본 발명은 더욱이 하기 항목을 포함한다:
1.
고체 담체 상에 고정된 항원-코팅된 비드의 군을 포함하는 항원 어레이로서, 여기서 각각의 군이
(i)
하나의 검출 항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii)
검출 항원의 세트로 코팅된 비드를 포함하고, 바람직하게는 여기서 고체 담체가 시트 또는 플레이트이고 여기서 검출 항원이 알레르기항원, 감염 마커 또는 자가항원인 것인 항원 어레이.
2.
제1항에 있어서, 검출 항원이 핵산 및/또는 아미노산, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 항체 또는 DNA 분자, 또는 유기 또는 비유기 화학적 화합물로 구성된 생체 분자인 것인 항원 어레이.
3.
제1항 또는 제2항에 있어서, 검출 항원이 알레르기항원인 것인 항원 어레이.
4.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 감염 마커인 것인 항원 어레이.
5.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원인 자가항원인 것인 항원 어레이.
6.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항원 또는 생물학적 물질로부터 단리되고 정제된 항원인 것인 항원 어레이.
7.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원의 세트가 하나 초과의 항원을 함유하는 생물학적 원천 물질로부터의 추출물 또는 용해물로부터 수득되는 것인 항원 어레이.
8.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 단일 에피토프, 몇몇 항체 결합 에피토프를 가진 단일 거대 분자 또는 여러 가지의 에피토프를 함유하는 상이한 항원과 다양한 단백질의 혼합물을 포함하는 것인 항원 어레이.
9.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 마이크로비드 또는 나노비드인 것인 항원 어레이.
10.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 직경이 5 내지 500 nm, 바람직하게는 직경이 200 내지 500 nm인 크기를 갖는 것인 항원 어레이.
11.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 라텍스 비드, 중합체 플라스틱 비드, 바람직하게는 폴리스티렌 비드, 생체 적합성 중합체로 구성된 비드, 또는 유리 비드, 바람직하게는 실리카 비드인 것인 항원 어레이.
12.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비드의 표면이 다공성 또는 비다공성인 것인 항원 어레이.
13.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 비드에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링되는 것인 항원 어레이.
14.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 비드에 비공유적으로 수동 흡착에 의해, 바람직하게는 소수성 및/또는 정전기적 부착에 의해 커플링되는 것인 항원 어레이.
15.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 항원 스페이서를 통해 커플링되는 것인 항원 어레이.
16.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 결합된 항원 상에 제시된 에피토프의 제시를 위한 바람직한 배향을 창출하는 방식으로 커플링되는 것인 항원 어레이.
17.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 담체가 다공성 또는 비다공성 물질의 시트 또는 플레이트, 바람직하게는 니트로셀룰로스 시트, 더 바람직하게는 적층 니트로셀룰로스 시트인 것인 항원 어레이.
18.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동일하거나 상이한 유형의 비드를 포함하는 항원 어레이.
19.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 25개의 상이한 군을 포함하는 항원 어레이.
20.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-코팅된 비드의 군이 접촉 방법 또는 비접촉 방법을 사용하여, 바람직하게는 솔레노이드 분배 시스템을 사용하여 고체 담체 상에 고정되는 것인 항원 어레이.
21.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 군이 직사각형 어레이 또는 오렌지-패킹된 어레이에서, 바람직하게는 mm2당 1개의 어드레스 가능한 요소의 밀도로 어드레스 가능한 요소로서 고정되는 것인 항원 어레이.
22.
제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-코팅된 비드가 고체 담체 상에 고정된 알레르기항원-코팅된 비드이고, 바람직하게는 고체 담체가 시트 또는 플레이트이고, 여기서 각각의 군이
(i)
하나의 알레르기항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii)
알레르기항원의 세트, 바람직하게는 알레르기항원 추출물로 코팅된 비드를 포함하는 것인 항원 어레이.
23.
(i)
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약으로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 검출 항원 또는 검출 항원의 세트에 특이적인 면역글로불린을 검출하는 방법.
24.
제23항에 있어서, 면역글로불린이 알레르기와 연관된 IgE 항체인 것인 방법.
25.
제23항에 있어서, 면역글로불린이 감염 또는 자가면역 질환과 연관된 IgG 항체인 것인 방법.
26.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 대상체 또는 대상체의 풀로부터의 생물학적 유체, 바람직하게는 혈청, 전혈 또는 가공 혈액, 비강 유체 또는 소변, 세포 용해물 또는 조직 균질액인 것인 방법.
27.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약이 면역글로불린에 특이적인 친화도 결합제, 바람직하게는 항체, 앱타머 또는 애피바디인 것인 방법.
28.
제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약이 항-IgE 항체, IgE 특이적 앱타머, IgE 특이적 애피바디, 항-IgG 항체, IgG 특이적 앱타머, 또는 IgG 특이적 애피바디인 것인 방법. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약이 (i) 바람직하게는 착색 또는 형광 화합물로 또는 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자로 직접 표지되거나; (ii) 효소에 접합되는 것인 방법.
29.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제23항의 단계 (iv)에 따라 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약이 효소에 접합되고 신호 발생 시약이 상기 효소에 대한 기질을 포함하는 것인 방법.
30.
제30항에 있어서, 어레이를 단계 (iv) 후에 정지 용액으로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31.
제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
(i)
제22항에 따라 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii)
어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii)
어레이를 검출 시약 (예를 들어 항-IgE-항체 또는 IgE 특이적 앱타머 또는 IgE-특이적 애피바디)으로 인큐베이션하는 단계,
(iv)
임의로 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v)
검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 알레르기와 연관된 IgE 항체를 검출하는 방법.
32.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항원 어레이용 시험 챔버, 액체 폐기물 저장소, 및 임의로 바코드를 포함하는 카트리지.
33.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항원 어레이, 검출 시약, 1종 이상의 완충제, 1종 이상의 대조군 샘플, 및 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 키트를 사용하기 위한 사용 설명서, 및 임의로 신호 발생 시약을 포함하는 키트.
34.
제32항에 따른 하나 이상의 카트리지용 챔버, 피펫터 및 신호 검출용 기기를 포함하는 장치.
실시예
본원에 기재된 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 그에 대해 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 상이한 실시양태가 본 발명에 따라 기재되어 있다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재되고 도시된 기술에 대해 많은 수정 및 변형이 이루어질 수 있다.
실시예 1:
물질 및 방법
알레르기 원천 물질
알레르기항원은 다양한 외부 제공자로부터 구매하거나 사내에서 제조하였다. 알레르기항원은 알레르기성 추출물, 정제된 천연 알레르기항원 또는 재조합 알레르기항원이었다. 알레르기항원은 공급자의 권장 사항에 따라 또는 완충제 및 저장 조건에 관한 당사의 사내 경험에 따라 처리하였다. 반복된 동결/해동은 피하였다. 동결 건조된 형태로 전달된 알레르기항원에 대하여, 제조업자의 사용 설명서에 따라 재구성을 행하였다.
나노입자에 알레르기항원 커플링
폴리스티렌 나노입자는 폴리사이언시즈 유로페 게엠베하(Polysciences Europe GmbH)로부터 구매하였다. 입자에 알레르기항원 물질을 커플링하는 것은 제조업자가 제공한 권장 사항에 따라 행하였으나, 궁극적으로 각각의 알레르기항원 제제를 위해 최적화하여야 했다. 최적의 커플링 효율 및 생물학적 활성을 얻기 위해 여러 가지의 상이한 접근법이 적용되었다. 일부 알레르기항원은 만족할 만한 결과로 수동 흡착에 의해 커플링될 수 있었으며, 한편 많은 알레르기항원은 특별한 커플링 조건 또는 공유 커플링 전략을 필요로 하였다. 이 목적을 위해, NH2 또는 COOH 표면 개질을 가진 폴리스티렌 입자, 뿐만 아니라 호모- 또는 헤테로이관능성 가교결합제도 사용하였다. 수개의 알레르기항원 제제는 먼저 수개의 분취액으로 나눠진 다음에, 상이한 조건을 통해 커플링된 다음에 마지막으로 다시 풀링되어 기능적 시험 동안에 완전한 알레르기항원 에피토프 레퍼토리를 나타내도록 하는 방식으로 처리하여야 하였다.
수동 흡착 커플링 (표준 프로토콜)
나노입자는 제조업자로부터의 사용 설명서에 따라 제조하였다. 알레르기항원 또는 알레르기항원 추출물을 알레르기항원의 등전점과 일치하는 완충제에서 적용 가능한 커플링 농도, 전형적으로 0.5 mg/ml 미만으로 희석하였다. 입자 (1% 고형분) 및 알레르기항원을 일정한 양단간(end-to-end) 혼합 하에 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 2-8 ℃에서 밤새 혼합하지 않고 인큐베이션을 계속하였다. 마지막으로, 입자를 10.000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 수집하고, 비드를 장기간 저장을 위해 적절한 완충제 및 보존제에 현탁시켰다.
수동 흡착 커플링 (고급 프로토콜)
상기 표준 프로토콜과 유사하나, 적어도 3 가지 상이한 pH 범위를 전형적으로 중성, 산성 및 염기성 범위에서 개별적으로 사용되었다. 커플링 프로토콜을 실행한 후, 입자를 중성 pH에서 함께 다시 풀링하였다.
COOH 표면 입자에 의한 화학적 커플링
나노입자를 적절한 농도, 전형적으로 1% 고형분으로 희석한 다음에, 활성화 완충제 (예를 들어, pH가 5 내지 7.5인 MES 완충제)로 3회 세척하고, 세척 단계 중간에 펠렛화하고 현탁시켰다. 활성화를 위해, 표면 COOH 기를 함유하는 입자를 수용성 카르보디이미드, 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드로로 15 - 30 분 동안 활성화하였다. 활성화 후, 입자를 활성 완충제에서 2회 더 세척하였다. 단백질은 임의의 유리 NH2 기를 함유하지 않는 커플링 완충제에서 전형적으로 적정 실험에 의해 최적화된 농도로 희석하였다. 활성화된 입자 및 단백질 용액을 실온에서 적어도 3시간 동안 또는 밤새 2-8 ℃에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 상기한 바와 같이 원심분리에 의해 입자를 펠렛화하고, 추가 사용 때까지 보존제를 함유하는 저장 완충제 중에 현탁시켰다.
NH2 표면 입자에 의한 화학적 커플링
상기 기재한 바와 매우 유사한 프로토콜을 사용하였는데, 그 차이는 나노입자 상의 NH2 기를 활성화시키는데 아미노 반응성 시약, 예를 들어 글루타르알데히드, 또는 숙신이미드 화학 예컨대 EGS 가교결합제를 사용하였다. 따라서, 적용된 각각의 화학에 대한 커플링 효율을 최적화하기 위해 완충제 및 pH 값을 조정하여야 하였다. 이론적으로 최적의 pH 값이 원하는 최적의 커플링 효율을 모든 경우에 제공한 것은 아니며, 오히려 단백질의 이론적 특성을 고려하여 선택되지 않은 pH 값이 상기 커플링 효과를 제공하였다.
커플링 효율의 평가
커플링 효율은 직접 및 간접 방법 둘 다를 사용하여 측정하였다. 커플링 전후에, 용액 중의 단백질 농도를 측정하였다. 커플링 후 용액으로부터 단백질이 고갈되는 정도는 단백질 결합의 양호한 지표이나 생물학적 활성의 양호한 지표는 아니었다. 게다가, 커플링된 비드는 단백질을 비드로부터 분리 제거(get off)하기 위해 제공자에 의해 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 단백질로부터 박리하였다. 이러한 박리 제거된(stripped-off) 단백질 제제를 또한 농도 측정을 사용하여 특성화시킬 뿐만 아니라, SDS 겔 전기영동을 변성시키고 쿠마시 블루로 염색하였다.
커플링된 알레르기항원의 생물학적 활성을 마지막으로 평가하기 위해, 표준 검정 및 분석 절차 (아래 참조)를 사용하여 기능적 측정을 행하여, 각각의 알레르기항원 제제에 대한 특이적인 양성 혈청을 시험하였다. 시험에 사용된 파라미터는 다음과 같았다: 15분 차단, 1:5로 희석된 혈청 샘플을 이용한 2시간 혈청 인큐베이션, 30분 검출 항체 인큐베이션.
알레르기항원 입자의 고체상으로로 분배
니트로셀룰로스 막을 지이 헬쓰케어(GE Healthcare) 및 폴 유럽(Pall Europe)으로부터 구매하였다. 세공 크기, 유량 또는 기본 물질과 관련하여 상이한 특성을 가진, 여러 가지의 상이한 막 유형을 평가하였다.
이동, 흡입, 분배 및 세척 사이클에 최적화된 설정을 사용하여 바이오도트(Biodot) AD1520 기기로 분배를 행하였다. 각각의 알레르기항원 제제를 1 ㎜의 중심 대 중심 간격을 가진 적어도 20 나노리터의 부피로 고체상에 침착시켰다. 최종 어레이는 전형적으로 10열(column) 및 25행(row)의 기하학적 구조를 가졌다.
분배 후, NC 시트를 밀봉하고 추가 가공 때까지 2-8℃에서 저장하였다. 검정 전에, NC 시트를 적절한 크기로 커팅하여 작은 비네트(vignette) 함유 시험 어레이를 검정 카세트에 넣었다.
표준 검정 절차
어레이 컨테이너 카세트를 온화하게 로킹(rocking)하면서 고농도의 비알레르기항원 단백질을 함유하는 완충제에서 비특이적 결합으로부터 초기에 차단된 250 가지 상이한 특징 형상을 함유하는 시험 어레이를 생성시켰다.
공정 단계들 중간에 세척을 세제로서 pH 7.4 및 0.2% 트윈-20을 가진 트리스-완충 식염수 (TBS-T)를 사용하여 수행하였다.
차단 후, 어레이를 환자 혈청 또는 혈장으로, 적어도 15분 동안 온화한 로킹하에 인큐베이션하였다. 혈청을 폐기하고, 어레이를 온화한 교반 하에 TBS-T로 수회 세척하였다.
세척 사이클 후, 알칼리성 포스파타제 (AP)로 표지된 희석된 항-인간 IgE 항체로 어레이를 인큐베이션하였다. 그 다음에, 항체를 폐기하고 잔류하는 결합되지 않은 항체를 TBS-T로 수회 세척 제거하였다.
마지막으로, 충분한 민감도에 도달할 때까지 어레이를 BCIP/NBT 발색 기질 (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨)로 수분 동안 인큐베이션한 다음에, 반응을 정지시키고 잔류 기질을 세척 제거하였다.
어레이를 스캐닝 또는 영상화 전에 건조시켰다. 영상은 24-비트 컬러 영상으로 촬영되어 16-비트 그레이스케일 데이터로 전환되었다.
분석
각각의 원형 특징 형상을 중앙값 강도를 계산하고 특징 형상 값(feature value)으로부터 국부적 배경을 감함으로써 정량화하였다. > 2의 신호 잡음비는 양의 신호로 간주되었다.
어레이는 알레르기항원 제제와 함께 스폿팅된 고정화된 정제된 인간 IgE의 표준 곡선에 의해 정규화하였다. 게다가, 정규화된 값은 다중 양성 시험 결과를 가진 참조 샘플에 대한 이종 교정을 사용함으로써 교정하였다.
실시예 2:
항원-코팅된 비드의 245개의 군을 포함하는 항원 어레이를 실시예 1에 기재된 물질 및 방법을 사용하여 생성시켰다. 여기서 나타낸 데이터의 경우, 단지 수동적으로 흡착된 알레르기항원이 스폿팅되었다. 몇몇 알레르기 대상체로부터의 풀링된 인간 샘플을 사용하여 245개 알레르기항원 및 5개의 IgE 표준에 대한 특이적 IgE 측정을 도 1A에 나타냈다. 어떠한 유의한 수준의 특이적 IgE도 갖지 않는 각각의 음성 샘플을 도 1B에 나타냈다. 항원 군의 레이아웃을 도 1C에 나타냈다. 항원 군 사이의 간격은 x 및 y 방향으로 1 mm이었다.
실시예 3a:
참조 방법과 비교함으로써 시험 평가
총 최대 137개의 환자 샘플 (표 3에서 n으로서 열거된 환자의 수)을 실시예 1에 기재된 개시된 바와 같은 방법으로 시험하였다. 환자 샘플을 시험을 위해 1:5로 희석하고 표준 검정 절차를 적용하였다. 데이터 비교를 위해, 수득된 결과를 상이한 버전의 ImmunoCAP ISAC 시험 (써모 피셔(Thermo Fisher), 스웨덴 웁살라)을 사용하여 생성된 이용 가능한 참조 데이터와 비교하였다. 참조 검정 분석에서 양성 또는 음성 반응을 보인 환자 샘플을 각각 "양성(pos)" 또는 "음성(neg)"으로서 표 3에 나타냈다. 데이터 비교를 위해, Medcal 버전 16.1을 사용하여 ROC 통계 (응답 오퍼레이터 곡선(Response Operator Curve))를 작성하였다. 이 목적을 위해, ImmunoCAP ISAC 시험에서 제조업자 컷오프(cutoff)보다 높은 임의의 항원 특이적 결과를 진 양성(true positive) (=1), 그렇지 않으면 진 음성(true negative) (=0)으로 간주하였다. 통계 평가의 결과는 곡선 AUC 하 면적 (완전 상관 = 1, 상관 없음 = 0), 분석 민감도, 분석 특이성이었다. 총, 3619개의 측정 결과에서, 그것에 대해 692개의 양성 결과 및 2927개의 음성 결과를 고려하였다. 결과는 아래 표 3에 요약하였다. 평균 민감도 및 특이성이 또한 각각 99% 및 95%로 표시되고, 이로 인해 감소된 특이성은 신규 방법의 더 높은 민감도에 의해 설명될 수 있으며 이는 참조보다 더 양성인 측정 결과를 생성할 것이다.
| 파라미터 | 참조 시험 | n | 양성 | 음성 | AUC | 민감도 | 특이성 |
| Alt a 1 | Alt a 1 | 137 | 9 | 128 | 0,99 | 100 | 95 |
| Ani s 3 | Ani s 3 | 81 | 4 | 77 | 1,00 | 100 | 100 |
| Art v | Art v 1 | 81 | 4 | 77 | 0,96 | 100 | 94 |
| Art v 1 | Art v 1 | 137 | 8 | 129 | 1,00 | 100 | 99 |
| Bet v 1.0101 | Bet v 1 | 81 | 10 | 71 | 0,93 | 100 | 79 |
| Bet v 2.0101 | Bet v 2 | 81 | 10 | 71 | 0,99 | 100 | 99 |
| Bos d 4 | Bos d 4 | 81 | 4 | 77 | 1,00 | 100 | 100 |
| Bos d 5 | Bos d 5 (2x) | 81 | 4 | 77 | 0,99 | 100 | 99 |
| Bos d 8 | Bos d 8 | 81 | 5 | 76 | 1,00 | 100 | 99 |
| Bos d LF | Bos d LF | 81 | 2 | 79 | 0,90 | 100 | 84 |
| Can f 1 | Can f 1 | 81 | 6 | 75 | 1,00 | 100 | 99 |
| Can f 3 | Can f 3 | 81 | 3 | 78 | 1,00 | 100 | 100 |
| Cup a 1 | Cup a 1 | 56 | 26 | 30 | 0,98 | 100 | 97 |
| Der p 1 | Der p 1 | 137 | 47 | 90 | 0,99 | 97 | 98 |
| Der p 10 | Der p 10 | 81 | 3 | 78 | 1,00 | 100 | 100 |
| Fel d 1 | Fel d 1 | 81 | 29 | 52 | 0,98 | 97 | 94 |
| Gal d 1 | Gal d 1 | 81 | 4 | 77 | 1,00 | 100 | 100 |
| Gal d 난백 | Gal d 1,2,3,4 | 81 | 6 | 75 | 0,92 | 100 | 77 |
| Hel as | Hel as 1 | 81 | 3 | 78 | 0,75 | 100 | 63 |
| Hel as 1 | Hel as 1 | 81 | 3 | 78 | 1,00 | 100 | 99 |
| Hev b 6.02 | Hev b 6 | 81 | 5 | 76 | 1,00 | 100 | 100 |
| Hev b 8 | Hev b 8 | 81 | 12 | 69 | 0,95 | 92 | 96 |
| Lol p 1 | Lol p 1 | 137 | 74 | 63 | 0,99 | 98 | 93 |
| Mer a 1 | Mer a 1 | 81 | 13 | 68 | 0,98 | 92 | 93 |
| Ole e 1 | Ole e 1 | 137 | 42 | 95 | 0,98 | 96 | 94 |
| Ole e 2 | Ole e 2 | 137 | 25 | 112 | 1,00 | 100 | 100 |
| Par j 2 | Par j 2 | 137 | 44 | 93 | 0,99 | 97 | 94 |
| Pen m 1 | Pen m 1 | 81 | 4 | 77 | 1,00 | 100 | 100 |
| Per a 7 | Per a 7 | 81 | 4 | 77 | 0,98 | 100 | 92 |
| Phl p 1 | Phl p 1 | 137 | 87 | 50 | 1,00 | 100 | 100 |
| Phl p 2 | Phl p 2 | 137 | 44 | 93 | 0,95 | 100 | 91 |
| Phl p 5 | Phl p 5 | 137 | 61 | 76 | 1,00 | 100 | 100 |
| Phl p 6 | Phl p 6 | 137 | 40 | 97 | 0,99 | 100 | 98 |
| Phl p 7 | Phl p 7 | 81 | 3 | 78 | 1,00 | 100 | 100 |
| Phl p 꽃가루 | Phl p 1,2,5,6,7 | 56 | 31 | 25 | 0,98 | 97 | 92 |
| Pla a 1 | Pla a 1 | 81 | 2 | 79 | 1,00 | 100 | 100 |
| Pla a 꽃가루 | Pla a 1,2 | 81 | 6 | 75 | 0,94 | 100 | 91 |
| Pru p 3 | Pru p 3 | 56 | 5 | 51 | 0,98 | 100 | 90 |
| 합계 | 합계 | 합계 | 평균 | 평균 | |||
| 통계 | 3619 | 692 | 2927 | 99 | 95 |
실시예 3b:
참조 방법과 비교하여 시험 평가
220명의 환자 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같은 개시된 방법으로 시험하였다. 알레르기항원을 수동적으로 흡착시키거나 예를 들어 상이한 화학적 링커를 사용하여 화학적으로 커플링시켰다. 환자 샘플을 시험을 위해 1:5 희석하고, 표준 검정 절차를 적용하였다. 데이터 비교를 위해, 수득된 결과를 상이한 버전의 ImmunoCAP ISAC 시험 (써모 피셔, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 생성된 이용 가능한 참조 데이터와 비교하였다. 선택된 알러지항원에 대한 민감도, 특이성 및 r2 상관 관계를 도 2에 나타냈다. 민감도 및 특이성을 시험 및 컷-오프 0.3 ISU를 위한 제조업자 프로토콜을 사용하여 참조 데이터에 대해, MedCalc를 사용하여, 평가하였다. 측정 결과의 선형 회귀 분석을 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 수행하였다. 총, 779개의 양성 결과 및 2772개의 음성 결과가 고려되었다.
실시예 4:
신호 증폭
우유 및 에그로부터의 12개의 알레르기항원 추출물 또는 분자상 알레르기항원을 두 가지 상이한 조건 하에 고체상 담체 물질 (니트로셀룰로스 프로트란(Protran), 0.2 um, 지이 헬쓰케어)에 고정시켰다. 첫 번째 조건은 웨스턴 블로팅 절차에 대해 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 알레르기항원 단백질을 고체상에 직접 커플링시키는 것이었다. 둘째로, 12개의 알레르기항원을 실시예 1의 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 커플링 조건을 추가로 최적화하지 않고 중성 pH 조건 하에 수동 흡착에 의해 350 nm 크기의 폴리스티렌 나노입자에 먼저 커플링시켰다.
그 다음에, 20개의 우유 및 에그 알레르기 환자 혈청을 12개의 단백질에 대한 특이적 IgE에 대해 시험하였다. 각각의 직접 고정화된 단백질 제제 또는 각각의 고정화된 입자-커플링된 항원 (표 5에 나타낸 모든 20개 혈청에 대한 미가공 데이터)으로부터의 알레르기항원 특이적 신호를 모든 20개 혈청에 대해 평균화하고, 알레르기항원당 2개의 요약 값을 비교하고, 배수를 이들 값 사이에서 계산하였다. 결과는 표 4 및 도 3에 제시하였다.
| 알레르기항원 | 직접적 | 커플링된 입자 | 배수 (x) |
| Bos d [우유] | 226308 | 685342 | 3,03 |
| Bos d 4 | 29706 | 98222 | 3,31 |
| Bos d 5 | 50009 | 278392 | 5,57 |
| Bos d 6 | 7291 | 127222 | 17,45 |
| Bos d 8 | 151474 | 606300 | 4,00 |
| Bos d LF | 80338 | 342786 | 4,27 |
| Gal d [난백] | 40472 | 77736 | 1,92 |
| Gal d [난황] | 29165 | 75288 | 2,58 |
| Gal d 1 | 14947 | 179650 | 12,02 |
| Gal d 2 | 2702 | 28958 | 10,72 |
| Gal d 3 | 5169 | 82668 | 15,99 |
| Gal d 4 | 5533 | 61884 | 11,18 |
실시예 5:
기능적 검정에서 특이적 IgE 반응에 미치는 상이한 커플링 조건의 영향
복숭아로부터의 주요 알레르기항원인 Pru p 3에 대해 양성인 8개의 상이한 샘플을 사용한 특이적 IgE 측정을 수행하였다 (도 4). 하나의 음성 샘플을 대조군으로서 시험하였다. Pru p 3은 세 가지 상이한 공유 커플링 방법 (조건 1-3)을 포함한, 몇몇 상이한 방법을 사용하여 커플링하였다. 수동적인 단백질 흡착은 전혀 효과가 없었고 수동 흡착에 의해서만 거의 어떠한 단백질도 나노입자에 결합될 수 없었다 (결과는 표시되지 않음). 커플링 효율의 분석에 따르면, 상이한 공유 커플링 접근법 사이에 많은 차이가 관찰되지 않을 수 있었다. 그러나, 기능적 검정은 다양한 혈청을 시험하고 그 결과를 참조 방법인 ImmunoCAP 100 (스웨텐 웁살라 소재의 써모피셔로부터)과 비교할 때 커플링된 알레르기항원의 생물학적 활성에서 중대한 차이를 나타냈다.
시험된 혈청에 따라, 다양한 방법과 커플링 접근법으로부터의 결과 간에 유의한 차이가 관찰될 수 있었다. 근본적인 설명은 혈청이 특이적 IgE를 갖는 에피토프에 따라, 특정 커플링 방법 또는 검정 방법이 활성 형태의 각각의 에피토프를 다소 제시한다는 점이다.
상기 값은 각각의 방법이 상이한 단위로 결과를 초래함에 따라 직접 비교할 수는 없으나, 이는 내부적으로 유사한 것으로 교정된다.
실시예 6:
추가 민감화를 드러내는 환자의 사례 연구
고양이가 있는 친구의 집에서 1박할 때 밤 동안에 2건의 천식 발작 후에 환자는 지역 알레르기 클리닉을 방문하였다. 풀 및 자작나무 알레르기는 전에 알려졌으나 이전에는 호흡 문제가 발생하지 않았었다. Immuno CAP 방법을 사용하여 알레르기 클리닉에서 수득된 결과를 아래 표 6 (참조 IC)에 나타냈고, 본원에 기재된 방법 (표 6에서 "FABER"로 언급함)과 비교하였다. 표 6은 선택된 알레르기항원에 대해 환자에서 피부 찌름 검사(skin prick test) (SPT) 및 관찰된 증상의 결과를 추가로 나타낸다.
본원에 기재된 방법과 참조 방법 ImmunoCAP 사이의 시험관내 결과의 정성적 상관 관계 (양성 또는 음성)는 일반적으로 높다. 수득된 값이 참조 방법보다 초기에 더 낮았기 때문에, 상업적으로 수득된 알레르기성 추출물의 일부 (예를 들어, Bet v, Amb a)는 충분한 양의 알레르기항원을 함유하지 않는다고 가정할 수 있다. 그러나 분자 시험 결과를 요약하면 우리의 방법 (Bet v 1.0101 + Bet v 2.0101)과 ImmunoCAP 사이에 매우 유사한 결과를 수득할 수 있었다.
환자에서 피부 찌름 검사 (SPT)는 고양이에 대해 음성이었다. ImmunoCAP 시스템에서의 피부 검사뿐만 아니라 IVD 검사는 고양이 알레르기항원 추출물을 사용하여 수행하였다. 두 검사 모두 제대로 수행되지 않았으며, SPT에서 음성 반응을 그리고 ImmunoCAP 검사에서 중등도 양성 반응을 제공하였다. 알레르기성 추출물을 사용한 일반적인 문제점은 추출물 또는 저장 동안에 발생할 수 있는 알레르기항원의 분해,뿐만 아니라 혼합물에 존재하는 알레르기항원의 정확한 성질이 불분명하다는 점이다. 우리의 시험 형식은 상업적으로 수득한 고양이 추출물에서 비교적 낮은 결과를 나타냈으나, 재조합 순수 고양이 알레르기항원 Fel d 1에서 매우 높은 양성 결과를 나타냈다. 이러한 높은 양성 시험관내 결과가 음성 SPT 검사 결과에 기초하여 임상의로부터 쉽게 논의되었을 가능성은 거의 없다.
추가적인 민감화가 밝혀졌는데, 그 중 일부는 알레르기항원 교차 반응성에 의해 설명될 수 없으므로, 예를 들어 새우 및 바퀴벌레에 대하여 잠재적으로 관련있는 것으로 간주될 수 있었다. 예를 들어, 고도도 관련된 PR10 유형의 알레르기항원 (Bet v 1 상동성)은 다음과 같은 양성이 포함되는 것으로 밝혀졌으며: Bet v 1.0101, Mal d 1.0108, Cor a 1.0103; 양성인 것으로 밝혀진 종 사이에 또한 고도로 보존적인 프로필린은 다음과 같았으며: Ara h 8.0101, Bet v 2.0101, Hev b 8, Mer a 1; 또한 많은 동물 상피 또는 동물 유래 우유 또는 육류 단백질은 동물 종간 교차 반응성에 의해 설명될 수 있다.
다른 한편으로, 알레르기항원 예컨대 바퀴벌레로부터의 Bla g 1 또는 새우로부터의 Pen m 1은 어떠한 참조 시험에 의해서도 발견되지 않았고 다른 양성 시험 결과에 대한 교차 반응성에 의해 설명될 수 없는 진정한 민감화로 간주될 수 있었다. 따라서, 이들 단백질은 임상적 관련성에 대해 추가로 조사되었을 수 있었다.
실시예 7:
참조 방법과 시험 비교
83개 샘플을 참조 방법으로서 ImmunoCAP ISAC 시험 (써모 피셔, 스웨덴 웁살라)을 사용하는 것뿐만 아니라 본원에 기재된 항원 어레이 (실시예 1 및 실시예 2 참조)를 사용하여 시험하였다. 두 시험의 기술 사양은 도 5에서 비교되었다.
총 245개의 알레르기항원을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 항원 어레이에서 시험하였고, 112개의 알레르기항원을 참조 방법에서 시험하였고, 70개의 알레르기항원은 두 시험 사이에서 중복되었다. 두 시험 사이에 직접 필적하는 (동일한) 이들 알레르기항원에 대한 결과는 상관 관계가 높았으며, 76% 피어슨(Pearson)의 상관 관계를 나타냈다. 1057개의 양성 결과를 참조 방법에서 이들 중복되는 알레르기항원에 대해 수득하였으며, 한편 1159개의 양성 결과를 본원에 기재된 방법으로 수득하였으며, 이는 약 10% (9,65%)의 증가에 상응하며 본 방법의 민감도가 증가함을 나타낸다.
더욱이, 참조 방법으로 총 2508개의 양성 시험 결과를 수득하였으며, 한편 본 방법으로 총 4740개의 양성 결과를 수득하였다. 따라서, 본원에 기재된 항원 어레이는 보다 많은 민감화, 즉 89%의 증가를 확인하였으며, 이는 참조 어레이/방법과 비교하여 본 발명의 항원 어레이/방법의 더 높은 민감도를 추가로 나타내는 것이다. 결과는 표 7에 요약하였다.
| 참조 방법 비교 요약 | |
| 시험 샘플의 수 | 83 |
| 참조 방법 | ImmunoCAP ISAC 112 sIgE |
| 참조 알레르기항원의 수 | 112 |
| 시험된 알레르기항원의 수 | 245 |
| 중복되는 (동일한) 알레르기항원의 수 | 70 |
| 직접적으로 필적하는 결과의 수 | 5810 |
| 참조 방법으로 수득된 양성 시험 결과의 수 | 2508 |
| 신규 방법으로 수득된 양성 시험 결과의 수 | 4740 |
| 참조, 중복되는 알레르기항원의 양성 결과의 수 | 1057 |
| 신규 방법의 중복되는 알레르기항원의 양성 결과의 수 | 1159 |
| 신규 방법으로 검출된 % 추가적 민감화 | 89,00% |
| 신규 방법, 중복되는 알레르기항원으로 검출된 % 추가적 민감화 | 9,65% |
| 평균 피어슨 상관 관계 신규 대 참조 방법 | 0,76 |
| 최대 피어슨 상관 관계 신규 대 참조 방법 | 0,99 |
실시예 8:
항원-커플링된 비드의 안정성
알레르기항원-커플링된 비드를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 알레르기항원 어레이를 0일째에 제조하였다. 알레르기항원 커플링된 비드의 동일한 제제를 사용하여 330일의 기간에 걸쳐 몇몇 추가 항원 어레이 (약 40개)를 제조하였다. 항원-커플링된 비드는 약 30분 동안 실온에서 유지된 알레르기항원 어레이를 제조하는 데 사용된 경우를 제외하고는 2-8 ℃에서 이 기간 동안 저장하였다.
동일한 샘플을 0일째에 제조된 알레르기항원 어레이에서 0일째에 시험한 다음에 330일째에 제조된 알레르기항원 어레이에서 330일째에 다시 시험하였다. 두 시험의 결과 및 변동 계수 (CV)를 표 8에 나타냈다. 도 5는 0일 및 330일째의 결과의 플롯을 도시한다.
이들 데이터는 알레르기항원-코팅된 비드의 안정성 및 방법의 재현성을 매우 높게 나타낸다.
| 알레르기항원 | 0일째 | 330일째 | CV (%) |
| Act d [열매] | 1,97 | 2,34 | 8,51 |
| All p | 5,05 | 5,54 | 4,63 |
| All s | 4,54 | 5,21 | 6,84 |
| Alt a 1 | 11,53 | 12,36 | 3,49 |
| Ana p [난황] | 1,32 | 1,32 | 0,34 |
| Ara h | 2,94 | 3,28 | 5,37 |
| Ara h 1-NT | 1,77 | 1,94 | 4,69 |
| Ara h 8.0101 | 1,20 | 1,43 | 8,62 |
| Art v | 2,21 | 2,60 | 8,12 |
| Blo t | 1,44 | 1,61 | 5,47 |
| Bos d [우유] | 10,61 | 11,14 | 2,45 |
| Bos d 8 | 9,60 | 10,01 | 2,08 |
| Bub b [우유] | 9,55 | 10,31 | 3,83 |
| Cam d [우유] | 2,28 | 2,47 | 4,12 |
| Can f [상피] | 11,78 | 12,00 | 0,93 |
| Can f 3 | 27,57 | 32,16 | 7,69 |
| Cap h [우유] | 7,16 | 6,58 | 4,18 |
| Cot c [난백] | 1,18 | 1,35 | 6,87 |
| Cot c [난황] | 2,11 | 2,57 | 9,76 |
| Cri c | 2,67 | 2,91 | 4,28 |
| Der f 2 | 1,89 | 2,21 | 7,92 |
| Der p 10 | 2,31 | 2,49 | 3,84 |
| Der p 23.0101 | 2,29 | 2,30 | 0,18 |
| Equ c 3 | 1,42 | 1,66 | 7,82 |
| Fag e | 1,50 | 1,66 | 4,88 |
| Fel d | 1,97 | 1,80 | 4,66 |
| Fel d 2 | 12,50 | 13,53 | 3,96 |
| Gal d [난황] | 1,34 | 1,22 | 4,82 |
| Gal d 5 | 2,05 | 1,91 | 3,46 |
| Hel as 1 | 1,27 | 1,49 | 8,18 |
| Jug r [종자] | 2,13 | 2,12 | 0,27 |
| Lup a [종자] | 1,24 | 1,28 | 1,49 |
| Mal d 1.0108 | 2,54 | 2,98 | 7,95 |
| Mel g [난황] | 1,43 | 1,35 | 2,81 |
| Ory c [상피] | 1,94 | 1,68 | 6,99 |
| Ory c 6 | 2,76 | 2,75 | 0,23 |
| Ovi a [우유] | 10,90 | 9,59 | 6,38 |
| Par j | 5,78 | 6,18 | 3,33 |
| Phl p 1.0102 | 5,06 | 6,23 | 10,38 |
| Phl p 7.0101 | 3,46 | 3,29 | 2,49 |
| Pis v [종자] | 3,81 | 4,00 | 2,51 |
| Pla a | 9,46 | 10,72 | 6,24 |
| Pru ar [열매] | 5,62 | 5,29 | 3,08 |
| Pru du [종자] | 2,05 | 1,77 | 7,30 |
| Pru p [Pulp] | 4,82 | 5,25 | 4,33 |
| Que a [꽃가루] | 4,59 | 4,41 | 2,00 |
| Sol so | 2,26 | 1,92 | 8,14 |
| Sola l [열매] | 2,86 | 2,95 | 1,43 |
| Sola l [종자] | 3,01 | 3,03 | 0,34 |
| Sola m | 2,55 | 2,91 | 6,46 |
| Tri a [종자] | 4,45 | 3,95 | 5,92 |
| Ven ga | 2,50 | 2,22 | 5,77 |
| Zea m [종자] | 1,33 | 1,57 | 8,22 |
실시예 9:
알레르기항원-코팅된 비드를 제조하기 위한 추출물 최적화
자작나무 꽃가루를 상업용 제공자로부터 구매하였고, 알레르기항원 추출물을 생리학적 완충제에서 한정된 조건 및 시기 선택 하에 기본적으로 교반하면서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 제조하였다. 자작나무 꽃가루 추출물을 4 가지 상이한 pH 및 염 조건을 사용한 수동 커플링에 의해 나노입자에 커플링시켰다. 데이터 (표 9)가 나타내는 바와 같이, 환자의 분자 프로파일 (예를 들어, 환자가 혈청 내 특이적 항체를 갖는 이러한 분자상 알레르기항원)에 기초하여, 상이한 pH 값은 sIgE의 상이한 정량화를 제공한다. 이것은 상이한 pH 조건을 조합하면 추출물의 분자상 에피토프 레퍼토리를 보존하고 더 정확하고 더 민감한 측정을 결과함을 나타낸다.
게다가, 자작나무 추출물을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 추가로 가공하였다. 원래 추출물의 한정된 분자량 범위를 나타내는 개개 분획을 수집하고 단일 조건을 사용하여 나노입자에 커플링시켰다. 예상된 바와 같이, 분자 인식 패턴에 따라, 환자의 분자 민감화 패턴에 따라 훨씬 더 두드러진 측정 결과를 수득하였다. 예를 들어, 샘플 1은 모든 분획에서 필적하는 수준의 특이적 IgE를 나타냈으며, 한편 샘플 2는 분획 1에 대하여 낮은 수준의 sIgE를 나타냈으나 분획 3에 대하여 높게 나타냈으며, 한편 샘플 3은 분획 1에 대하여 가장 높은 sIgE 수준을 가졌다. 개개 분획을 조합하고 각각의 분획에 대한 pH 커플링 조건을 추가로 최적화하면 참조 방법보다 더 높은 분석 민감도를 결과할 것이다.
| 단위: 특이적 IgE, kUA/L (= 2.4 ng / ml)로 | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 | 샘플 6 | 샘플 7 |
| 자작나무 추출물, pH 조건 1 | 24,15 | 29,06 | 9,22 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, pH 조건 2 | 21,3 | 22,28 | 9,51 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, pH 조건 3 | 26,25 | 28,68 | 18,79 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, pH 조건 4 | 20,24 | 22,95 | 10,46 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, pH 조건 1-4의 혼합 | 35,18 | 36,22 | 28,75 | 0 | 0,2 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, 분획 1 (SEC) | 39,21 | 1,1 | 37,41 | 0 | 0,29 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, 분획 2 (SEC) | 26,57 | 8 | 24,79 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 자작나무 추출물, 분획 3 (SEC) | 35,29 | 40,15 | 13,25 | 0 | 0,39 | 0 | 0 |
| SEC 분획 1-3의 합계 | 74,5 | 41,25 | 50,66 | 0 | 0,68 | 0 | 0 |
| 참조 방법(ImmunoCAP) | 29,6 | 77 | 6,04 | 0 | 0,34 | 0 | 0 |
| 분자상 알레르기항원 Bet v 1 | + | + | + | - | + | - | - |
| 분자상 알레르기항원 Bet v 2 | + | + | + | - | + | - | - |
| 분자상 알레르기항원 Bet v 4 | - | - | + | - | - | - | - |
Claims (21)
- 고체 담체 상에 고정된 항원-코팅된 비드(antigen-coated bead)의 군을 포함하는 항원 어레이(antigen arrary)로서, 여기서 각각의 군이
(i) 하나의 검출 항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii) 검출 항원의 세트로 코팅된 비드를 포함하고, 여기서 고체 담체가 시트 또는 플레이트이고, 검출 항원이 알레르기항원, 감염 마커 또는 자가항원인 것인 항원 어레이. - 제1항에 있어서, 검출 항원이 핵산 및/또는 아미노산, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 항체 또는 DNA 분자, 또는 유기 또는 비유기 화학적 화합물로 구성된 생체 분자인 것인 항원 어레이.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 검출 항원이 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 항원 또는 생물학적 물질로부터 단리되고 정제된 항원인 것인 항원 어레이.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 검출 항원의 세트가 하나 초과의 항원을 함유하는 생물학적 원천 물질로부터의 추출물 또는 용해물로부터 수득되는 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 마이크로비드 또는 나노비드이며, 바람직하게는 여기서 비드가 직경이 5 내지 500 nm, 바람직하게는 직경이 200 내지 500 nm인 크기를 갖는 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 라텍스 비드, 중합체 플라스틱 비드, 바람직하게는 폴리스티렌 비드, 생체 적합성 중합체로 구성된 비드, 또는 유리 비드, 바람직하게는 실리카 비드인 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항원이 공유적으로 또는 비공유적으로, 바람직하게는 수동 흡착에 의해 커플링되는 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 담체가 다공성 또는 비다공성 물질의 시트 또는 플레이트, 바람직하게는 니트로셀룰로스 시트, 더 바람직하게는 적층 니트로셀룰로스 시트인 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이가 적어도 25개의 상이한 군을 포함하고, 바람직하게는 여기서 각각의 군이 직사각형 어레이 또는 오렌지-패킹된 어레이에서, 임의로 mm2당 1개의 어드레스 가능한 요소의 밀도로 어드레스 가능한 요소로서 고정되는 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비드가 동일하거나 상이한 유형인 것인 항원 어레이.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-코팅된 비드가 알레르기항원-코팅된 비드이고, 알레르기항원-코팅된 비드의 각각의 군이
(i) 하나의 알레르기항원으로 코팅된 비드, 또는
(ii) 알레르기항원의 세트, 바람직하게는 알레르기항원 추출물로 코팅된 비드를 포함하는 것인 항원 어레이. - (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii) 어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii) 어레이를 검출 시약으로 인큐베이션하는 단계,
(iv) 임의로 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v) 검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 검출 항원 또는 검출 항원의 세트에 특이적인 면역글로불린을 검출하는 방법. - 제12항에 있어서, 면역글로불린이 알레르기와 연관된 IgE 항체 또는 감염 또는 자가면역 질환과 연관된 IgG 항체인 것인 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 샘플이 대상체 또는 대상체의 풀(pool)로부터의 생물학적 유체, 바람직하게는 혈청, 전혈 또는 가공 혈액, 비강 유체 또는 소변, 세포 용해물 또는 조직 균질액인 것인 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시약이 면역글로불린에 특이적인 친화도 결합제, 바람직하게는 항체, 앱타머 또는 애피바디이며, 임의로 여기서 검출 시약이 (i) 바람직하게는 착색 또는 형광 화합물로 또는 금 나노입자 또는 착색 라텍스 나노입자로 직접 표지되거나; (ii) 효소에 접합되는 것인 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제12항의 단계 (iv)에 따라 항원 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 검출 시약이 효소에 접합되고 신호 발생 시약이 상기 효소에 대한 기질을 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 어레이를 제12항의 단계 (iv) 후에 정지 용액으로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 알레르기와 연관된 IgE 항체이며,
(i) 제11항에 따르는 항원 어레이를 제공하는 단계,
(ii) 어레이를 샘플로 인큐베이션하는 단계,
(iii) 어레이를 검출 시약, 바람직하게는 IgE-특이적 항체 또는 IgE-특이적 앱타머로 인큐베이션하는 단계,
(iv) 임의로 어레이를 신호 발생 시약으로 인큐베이션하는 단계, 및
(v) 검출 가능한 신호를 측정하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항원 어레이용 시험 챔버(test chamber), 액체 폐기물 저장소, 및 임의로 바코드를 포함하는 카트리지(cartridge).
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항원 어레이, 검출 시약, 1종 이상의 완충제, 1종 이상의 대조군 샘플, 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 키트를 사용하기 위한 사용 설명서, 및 임의로 신호 발생 시약을 포함하는 키트.
- 제19항에 따른 하나 이상의 카트리지용 챔버, 피펫터(pipettor) 및 신호 검출용 기기를 포함하는 장치.
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