CN109196361A - 抗原阵列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗原阵列以及检测生物样品中对阵列的任何一种抗原特异性的免疫球蛋白的方法。具体地,本发明涉及抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组。本文还包括盒、试剂盒和装置及其使用方法,所述盒、试剂盒和装置包括抗原阵列。
Description
技术领域
本发明涉及抗原阵列以及在生物样品中检测对阵列的任何一种抗原有特异性的免疫球蛋白的方法。具体地,本发明涉及抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组。本发明还公开了包括抗原阵列的盒(cartridge)、试剂盒和装置及其使用方法。
背景技术
过敏以及与其紧密相关的疾病(如支气管哮喘)影响了工业国家四分之一的人口。WHO将过敏列为21世纪主要的健康问题。目前,1型过敏影响了工业国家近三分之一的人口。虽然通常无害,但过敏的发生率和严重程度正在增加,对社会的直接和间接成本也在增加。理论上,过敏诊断是一项简单的任务,但仍然对诊断行业和医疗保健提供者提出了挑战。很大比例的患者没有接受适当的诊断和治疗。后果是生活质量降低、原可避免的死亡以及疾病管理成本通常增加。为了优化对每个个体患者的治疗,诊断不能止于识别过敏源(例如花粉、动物、食物),而且必须深入到分子致敏谱。必须正确识别引起疾病的各个单一过敏原分子,因为过敏原分子负责:过敏源之间的交叉反应、风险分类(严重反应或轻度形式)、症状类型(打喷嚏、哮喘等)、治疗选择以及疾病进展的预后。对提高诊断分辨率的需求使得常规测试的多个参数产生了倍增,即,既不与报销系统匹配,也不与常规过敏诊断仪器的现有技术能力相匹配。
因此,检测针对某些生物或非生物抗原靶标的特异性抗体产生型特异性免疫响应,对于I型过敏的诊断很关键,对于其他免疫病症如自身免疫疾病和感染性疾病也是如此。
在所有这些领域中,潜在的病症可以由各种引起疾病的抗原造成,所述抗原可以作为疾病的标志物,或抗原作为病症或预测结果的替代标志物,如在自身免疫疾病中。
术语抗原通常是指这样的物质,其可以使免疫系统产生针对其的抗体响应,并且在适当的体内条件下当抗体与其结合时可能触发生物反应。
从理论上讲,在第一步中彻底确认既往病史允许将用于体外测试的第二步的测试参数的数量缩小到相当低的数量。然而,由于许多实际限制,这并不总是容易实现的,使得某些疾病的多参数诊断测试应用具有吸引力。这尤其适用于这样的情况,其中相同的抗体类别负责针对多种抗原(例如IgE、IgG、IgA)的免疫响应,使得基于多抗原的抗体响应监测能够促进对每个个体患者进行更好的健康护理。使用生物信息学来识别抗原谱或模式或预测算法能够极大地促进诊断和治疗选择,使医生在治疗和监测治疗中能够提供更适应于患者的方法。
用于抗原特异性免疫球蛋白检测的体外测试主要基于ELISA原理,其中将抗原固定在固相上,然后将其与样品一起孵育,洗去未结合的样品和非特异性抗体后,用第二抗体或各种各样的亲和结合剂检测特异性结合的抗体,产生本领域技术人员已知的可检测的信号(颜色、光子等)。
在本文中,固定是指通过化学偶联或其他非共价附着方式使抗原与固相(例如塑料表面或具有合适的物理和化学性质的任何其他固体载体)结合以保持抗原。
当开发多参数免疫体外测试时,常见的问题是抗原的异质性,而在固定和分析过程中,测试形式通常对每种抗原仅可应用相同或至少相似的条件。因此,这导致根据技术人员已知的尺度,在测试所包括的抗原数量与测试的技术性能之间进行权衡。
绝大多数相关的抗原是生物源(例如食物、植物、细菌或病毒)的蛋白质,或在自身免疫的情况下由人体组织自身产生的蛋白质。例如与基因检测中的DNA相比,蛋白质有非常多的功能(versitle)但也非常异质(电荷、结构、稳定性、表面性质等),并且还需要在处理以及测试生产过程中适应每种蛋白质的物理-化学性质。更重要的是,必须保持生物活性,例如,保持生物分子的二级和三级结构完整,所述生物分子的二级和三级结构产生实际的表位和抗体结合位点。否则,不能实现具有临床相关的灵敏度和特异性的功能分析。
过敏、感染或自身免疫疾病中的几种相关抗原并非游离或可溶性的蛋白质,而是需要相对苛刻的化学溶剂以保持在溶液中,使得在体外测试的制造过程中常规的蛋白质偶联或处理变得繁琐。这些相关蛋白的实例是:来自坚果或种子的储存蛋白,或位于细胞膜的细胞抗原或在组织内并在组织中产生的细胞抗原。
在体外诊断过敏领域,其他问题是含有引发疾病的抗原的生物源之间是非常异质的,而且源内也是异质的。通常,所谓的过敏原提取物用于体内和体外诊断。过敏原提取物是相应来源(如食物、动物、植物、植物花粉等)的蛋白质的水性提取物。在过敏原提取物中,将复杂且难以标准化的过敏性和非过敏性成分的混合物用于患者的皮肤,或针对患者血液样本进行测试,血液样本中含有特异性IgE抗体。
在这类由蛋白质、脂类、碳水化合物和其他化合物组成的复杂的混合物中,在每个过敏源中只有相对少数的蛋白质或蛋白质家族已知实际上是过敏性的,它们可以导致免疫系统产生抗体响应。
在占绝大多数的无关材料中的实际上相关的抗原部分对固体支持材料的结合能力提出了很高的要求,并且在简单的平面表面上(例如ELISA板),如果不进一步富集过敏原部分和去除非过敏性物质,则通常不可能进行灵敏的和特异性的IgE分析用于过敏诊断。
在过去的三十年中,已经鉴定了许多与过敏诊断相关的所谓的分子抗原,其可以从天然来源纯化或通过重组DNA技术产生。使用分子抗原具有许多优点,从标准化到更好地理解和预测分子交叉反应性,到患者的风险分类和适应性治疗。然而,对于任何常规测试来说,很大的缺点是,首先,需要医生在参数选择中提供更多的专业知识以进行测试。其次,如果通过传统的单参数测试方法进行测试,则每位患者的成本显著提高,而单参数测试仍然占据市场的99%以上。更重要的是,随着每个常规单参数测试的进行,从患者抽取的血液量将以线性方式上升,通常在每个参数50-100微升的范围。
因此,几个小组已经开发并公开了多参数(也称为多重)分析系统,其采用各种基本技术,从基于ELISA系统的常规小型化微量滴定板(MTP)到各种实施方式中的悬浮珠阵列或微阵列。
例如,WO2004/104586A1描述了一种检测过敏原特异性抗体的方法和装置,基于此类抗体与捕获试剂(例如蛋白A、蛋白G或特异性结合免疫球蛋白的抗体)的结合,捕获试剂附着于具有反应性表面的生物芯片上。然后使结合的过敏原特异性抗体与其对应的过敏原接触,通过标记的过敏原特异性抗体检测过敏原。
US2005/079592A1公开了一种用于制造多重珠粒分析的装置,其中将珠粒喷射到固相基质上的特定位置,珠粒具有固定在其表面上的生物物质,例如蛋白质。
在US6268222B1中进一步描述了一种用于分析样品中的多种分析物的分析方法。该分析方法基于核或载体颗粒,在核或载体颗粒表面上具有多个较小的荧光标记的聚合物颗粒或纳米颗粒。
US2002/0015666A1提供了一种系统和方法,用于储存和分配许多来自大容量储存装置的选定试剂,Tai等人((Analytical Biochemistry,第391卷,第2期,2009年8月,98-105页)描述了一种用于多重免疫分析的微流体盒和系统。
虽然悬浮珠粒阵列理论上可以在小体积中具有高度的倍增性(multiplexing),但实际应用通常限于少于20个参数。生物基质(例如血清或血浆)固有的变化性使得其难以在所有的常规实验室中使用,在常规实验室中通常测试溶血、脂血或黄疸样品。更重要的是,在要求灵敏度的应用中,如检测IgE,结合能力仅允许与纯抗原一起使用,而不与例如粗过敏原提取物一起使用。此外,仪器基于FACS(荧光激活细胞分选)或其他昂贵的技术,需要几个激光通道以及共焦激光扫描精度。
通过牺牲每个患者样品所需的按需混合试剂的灵活性以及从根本上优化每个参数的可能性,在玻璃载玻片上或微量滴定板内的传统微阵列能够克服悬浮珠粒的一些限制。事实上,必须使用平坦且均匀活性表面来结合蛋白质抗原严重抑制了实现高端性能。此外,由于皮升的量需要以重现的方式分配或沉积,因此制造不仅昂贵而且高度复杂。对于目前市场上的技术提供商,并没有真正的高通量能力仪器用于每年生产数百万个高质量的诊断微阵列。与现有的自动免疫学分析仪相比,批量通常较小(几百或更少)并且变异系数(Coefficients of Variability(CV))很高。与悬浮珠粒技术类似,微阵列主要与荧光或发光读数一起使用,并且在这方面也需要昂贵的仪器。由于分析形式小型化,自动化不是容易实现的并且需要复杂的设备和/或微流体设计,这也会对常规实验室样品造成问题。
其他多参数测试,例如横向流动型测试,具有每个参数成本相对较低的优点,但是灵敏度、重现性不足,很少自动化并且每个测试条不能超过5-20个参数。
因此,在临床化学这个细分市场,目前并没有可用于满足所有需求的技术,特别是这些需求:每次测试的低成本、高度的倍增性(>200)、重现性以及优异的技术性能特征(CV、灵敏度、特异性、测量范围、定量等)。
因此,本发明的目的是提供抗原阵列,其显著提高重现性以及具有优异的技术性能特征,同时保留了纳入许多参数的可能性并且非常经济地进行测试。
发明内容
本发明的目的尤其是通过要求保护的主题解决。
本文将分子研究和多重免疫分析技术的进展结合起来,以形成用于体外测试的一站式(one-stop-shop)产品,即抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组。这种新颖的阵列形式及其制备和使用方法的开发基于单参数分析的现有方法的优点,主要是技术分析性能以及明显的倍增的可能性,同时优化对每个单独抗原的偶联,但与替代方法相比,没有引入明显的权衡,特别是在每次测试的成本、生产规模或每个参数需要的血清方面。小型化形式(例如在微阵列测试中)不适于成本有效且高性能的测试形式,因此可以认为下文详细描述的抗原阵列是体外宏观的阵列测试,其由固定的纳米颗粒或微米颗粒组成,所述纳米颗粒或微米颗粒形成用于每个抗原偶联的珠粒群的离散实体,所述抗原阵列具有比常规的微阵列明显更大的尺寸。
这种新技术允许单独优化任何抗原(例如检测抗原)(例如过敏原)与固相的偶联,从而实现灵敏且稳健的分析设计,并消除成本效益与每个测试参数性能之间的权衡。本文提供的抗原阵列和方法提高了通常的灵敏度,特别是使用异源材料时的灵敏度,只要两个阶段的偶联方法(首先是与颗粒偶联,然后是与固相或多孔的3D结构固相偶联)产生抗原呈递表面的多重扩增(在分析孵育步骤中,抗体可以与该表面结合)。自动化和软件方案的现有技术是对试剂的补充。
使用智能设计的抗原组并结合分析的稳健性、灵敏度和特异性及其易于使用的特点,提供了对结果更好的临床解释以及对交叉反应性的预测,进而选择有效的治疗方法。
因此,本文公开的阵列和方法首次提供了一种测试,基于特异性和可靠的抗体检测(例如感染性或自身免疫性疾病),该测试有潜力改变过敏诊断以及其他免疫学病症的常规(routine)。特别是对于过敏诊断,目前,体外测试在诊断过程中作为第二或第三步进行,而本文所述的全面的、高分辨率的且灵敏的筛选测试可以成为第一级工具,仅由确认既往病历、皮肤测试或刺激跟进。这些益处将适用于整个价值链,但最重要的是适用于患有免疫病症的患者。
一方面,本文提供了一种抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组(group),其中每组包括:
(i)由一种检测抗原包覆的珠粒,或
(ii)由一组(a set of)检测抗原包覆的珠粒,优选地,其中固体载体是片或板并且检测抗原是过敏原、感染标志物或自身抗原。
在一些实施例中,检测抗原是由核酸和/或氨基酸形成的生物分子,优选蛋白质、肽、抗体或DNA分子,或有机或无机化合物。
在一些实施例中,检测抗原是过敏原。
在一些实施例中,检测抗原是感染标志物。
在一些实施例中,检测抗原是自身抗原。
在一些实施例中,检测抗原是通过重组DNA技术产生的抗原或从生物材料分离和纯化的抗原。
在一些实施例中,其中珠粒由一组检测抗原包覆,所述的一组检测抗原获得自包含一种以上的抗原的生物源材料的提取物或裂解物,或获得自这种提取物或裂解物的纯化部分或细胞培养衍生材料的纯化部分。
在一些实施例中,检测抗原包括单个表位、具有几个抗体结合表位的单个大分子,或多种蛋白与包含多个表位的不同的抗原的混合物。
在一些实施例中,珠粒是微米珠粒或纳米珠粒。具体地,珠粒的直径为5-500nm,优选地,直径为200-500nm。
在一些实施例中,珠粒是乳胶珠粒、聚合物塑料珠粒(优选聚苯乙烯珠粒)、由生物相容性聚合物制成的珠粒或玻璃珠粒(优选二氧化硅珠粒)。具体地,珠粒的表面是多孔的或无孔的。
在一些实施例中,检测抗原与珠粒共价或非共价地偶联。具体地,检测抗原通过被动吸附(优选通过疏水和/或静电吸附)与珠粒非共价偶联。
在一些实施例中,检测抗原通过抗原隔离物偶联。具体地,检测抗原以产生优选的方向的方式偶联,以呈现结合的抗原上的表位。
在一些实施例中,固体载体是多孔或无孔材料的片或板,优选的是硝化纤维片,更优选的是层压的硝化纤维片。
在一些实施例中,阵列包括至少25个不同的组。具体地,阵列内或一组内的珠粒是相同或不同的类型。在一些实施例中,使用接触方法或非接触方法,优选使用电磁分配系统(solenoid dispensing system),将抗原包覆的珠粒组固定在固体载体上。具体地,将每组固定为矩形阵列或橙色阵列(orange-packed array)中的可寻址元件,优选地,以1个可寻址元件/mm2的密度。
在一些实施例中,本文所述的抗原阵列的珠粒是相同或不同的类型。具体地,不同珠粒组的珠粒可以是相同的类型(例如,抗原阵列的所有组的珠粒包括直径为200-500nm的聚苯乙烯珠粒),或者不同珠粒组的珠粒可以是不同的类型(例如,第1组包括聚苯乙烯珠粒,而第2组包括玻璃珠粒)。此外,一组中的珠粒也可以是相同或不同的类型。
一方面,本文提供了一种过敏原阵列,其包括固定在固体载体上的多组过敏原包覆的珠粒,其中每组包括:
(i)由一种过敏原包覆的珠粒,或
(ii)由一组过敏原(优选过敏原提取物)包覆的珠粒,优选地,其中固体载体是片或板。
另一方面,本文提供了检测对检测抗原或一组检测抗原特异性的免疫球蛋白的方法,优选地,其中检测抗原或一组检测抗原是过敏原、感染标志物或自身抗原,所述方法包括:
(i)提供根据本文所述的任何一种抗原阵列的抗原阵列,
(ii)将阵列与样品一起孵育,
(iii)将阵列与检测试剂一起孵育,
(iv)任选地将阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
在一些实施例中,免疫球蛋白是与过敏相关的IgE抗体。
在一些实施例中,免疫球蛋白是与感染或自身免疫疾病相关的IgG抗体。
本文还提供了检测与过敏相关的IgE抗体的方法,包括
(i)提供本文所述的过敏原阵列,
(ii)将阵列与样品一起孵育,
(iii)将阵列与检测试剂(优选IgE特异性抗体或IgE特异性适配体)一起孵育,,
(iv)任选地将阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
在一些实施例中,样品是生物流体,优选来自受试者(subject)或受试者库的血清、全血或处理的血液、鼻液或尿液、细胞裂解物或组织匀浆。
在一些实施例中,检测试剂是对免疫球蛋白特异性的亲和结合剂,优选抗体(例如抗IgE或抗IgG抗体)、适配体(例如IgE特异性适配体或IgG特异性适配体)或亲和体。具体地,检测试剂(i)直接标记有优选地有色或荧光化合物或金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒;或(ii)与酶结合(例如抗IgE或抗IgG抗体,其具有可直接检测的标记物或与酶结合)。
在一些实施例中,根据本文所述的方法的步骤(iv),该方法还包括将阵列与信号产生试剂一起孵育,其中检测试剂与酶结合,并且信号产生试剂包括所述酶的底物。
在一些实施例中,该方法还包括在本文所述的方法的步骤(iv)后,将本文所述的抗原阵列与终止溶液一起孵育,即,将抗原阵列与信号产生试剂一起孵育后,加入终止溶液以终止信号产生。
另一方面,本文提供了一种盒,其包括用于本文所述的任何抗原阵列的测试室、用于液体废物的储液器、以及任选地条形码。该盒还可以包括储液器或集成的小瓶,用于检测试剂、信号产生试剂、终止溶液、一种或多种缓冲液和一种或多种对照样品中的一种或多种。
本文还提供了一种试剂盒,其包括本文所述的任何抗原阵列、检测试剂、一种或多种缓冲液、一种或多种对照样品、在本文所述的任何方法中使用试剂盒的说明书,以及任选地信号产生试剂。试剂盒还可以包括终止溶液。
另一方面,本文提供了一种装置,其包括用于一个或多个本文所述的盒的腔室、移液器和用于信号检测的设备。
附图说明
图1A和B:用来自过敏个体(1A)或阴性对照(1B)的人血清库进行标准分析并用台式扫描仪扫描图像后,245种过敏原、特异性IgE测试和浓度不断升高的5个IgE标准(右上角)的B/W表示。原始图像采用16位灰度TIFF格式。
图1C:过敏原位置的示意性布局,对应于图1A和B。每个过敏原特征直径约为600微米,每个方向上的特征之间的距离为1毫米。
图2:通过与参比方法比较进行测试评估。
图3:将分子过敏原直接固定在固体载体上的阵列与相同的分子过敏原与纳米颗粒偶联并固定在相同类型的固体载体上的阵列进行比较。图形表示表4的结果。
图4:特异性IgE测试,其中8种不同的样品对水蜜桃3(Pru p 3)呈现阳性,而一种样品对水蜜桃3呈现阴性,水蜜桃3是一种来自桃的主要过敏原。
图5:用于特异性IgE测试的可用的多参数分析的技术规格和比较。(*)定义的特异性IgE测试是半定量的,因为没有针对单独过敏原的国际参考标准制剂。(**)测试>100个样品的平均线性相关性,并将过敏原组分和过敏原提取物与ImmunoCAP和ImmunoCAP ISAC比较。
图6:使用过敏原包覆的珠粒的相同制剂,比较在第0天和第330天测试的样品的IgE的测量值。
具体实施方式
在整个说明书中使用的具体术语具有以下含义。
本文所用的术语“抗原”是指这样的物质,其能够使免疫系统产生针对其的抗体响应,并且在适当的体内条件下当抗体与其结合时可能引发生物反应。本文所用的术语抗原应指整个靶分子或由抗原结合位点识别的此类分子的片段。具体而言,抗原的亚结构,例如多肽或碳水化合物结构,通常称为“表位”,其是免疫相关的,可以被这种抗原结合位点识别。
术语“检测抗原”、“待检测的抗原”或“可检测的抗原”是指决定抗原特异性反应(例如抗体-抗原反应)的抗原。术语“抗原”、“检测抗原”、“待检测的抗原”和“可检测的抗原”在本文中可互换使用。
术语“检测抗原组”是指决定对病症特异性反应的一种或多种抗原。该病症可以是疾病或紊乱或其倾向,例如过敏或自身免疫疾病;该术语包括不显示任何身体和/或临床症状的病症。对该病症特异性的反应可以是抗体-抗原反应,其中至少一种抗体是所述病症的特征/或与所述病症相关,并且所述病症可以通过这种反应来确定;例如,如果病症是过敏,则是对过敏原特异性的IgE抗体。本文所用的术语“抗原组”是指获得自相同的生物源材料的一种或多种抗原,例如,获得自细胞裂解物、细胞或组织匀浆或其纯化部分。
术语“表位”是指决定抗原的免疫特异性的抗原部分。本文所用的术语表位特别是指这样的分子结构,其可以完全构成特异性结合配体或者是抗体结合位点的特异性结合配体的一部分。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机的生物化学物或无机物或其衍生物及其任何组合组成。
表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个区段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由氨基酸或碳水化合物组成,所述氨基酸或碳水化合物通过折叠多肽形成三级结构而聚集在一起,并且在线性序列中氨基酸不一定彼此相邻。具体地,就多肽抗原而言,构象或不连续表位的特征在于存在两个或多个离散的氨基酸残基,其在一级序列中分开,但是当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时,在分子表面组装成连续的结构。
通常,在天然存在的抗原中表位是多肽或多糖。通常,B细胞表位包括至少约5个氨基酸,但可以小至3-4个氨基酸。表位表示免疫B和T细胞识别的形状,并且还可以由非抗原来源的肽和其他分子来表示,所述非抗原来源的肽和其他分子具有与天然抗原中存在的表位形状相同的表位形状。具有表位形状的元件的实例是适配体。适配体是一种分子,其提供了能够模拟免疫表位的形状。分子(例如肽)的部分或代表翻译后修饰的分子、碳水化合物、脂质和其他分子可用于表示各个表位。
术语“阵列”是指抗原包覆的珠粒组的集合,其中每组表示空间上间隔的可寻址元件。此类元件或分子实体可以是空间上可寻址的,例如容纳在微量滴定板内或固定在平面上的阵列,其中每个元件以不同的X和Y坐标存在。对于这种空间可寻址性(也称为编码),分子的位置是固定的,并且该位置与身份(identity)相关,从而允许在阵列中鉴定待测试的样品中包含的抗体的特异性。这种类型的空间阵列通常被合成或定点在平面基板上,在小区域中产生密集布置的大量的不同元件。
除非另有说明,否则本文所用的术语“颗粒”、“纳米颗粒”、“球”、“微球”和“珠粒”可互换,并且是指圆形、椭圆形或球形的小的惰性载体,其易于由抗原(检测抗原)或一组抗原(检测抗原组)包覆。
本文所用的术语“珠粒组”是指与特异性检测抗原偶联或由特异性检测抗原包覆(在本文中偶联和包覆可互换使用)的珠粒群(在抗体-抗原反应中其可以由对所述抗原特异性的抗体鉴定),或者是由一组检测抗原包覆的珠粒群(其可以由对该组中的检测抗原之一具有特异性的至少一种抗体进行鉴定)。
术语“珠粒类型”是指珠粒的特征,由它们的尺寸、材质、表面包覆的分子性质、疏水性、电荷、表面性质(多孔或无孔的表面)、偶联化学或化学连接剂/隔离物化学来限定。相同类型的珠粒具有相同的尺寸、材质、表面性质,并且使用相同的化学物质来偶联抗原。不同类型的珠粒是指珠粒的这些特征中至少有一个不同。
本文所用的“支撑物”、“固体支持物”、“载体”、“固体载体”或“固相”是指任何固体表面,可寻址的元件/分子实体(抗原包覆的珠粒)沉积并固定在固体表面上,用于进行分析和反应。
术语“固定(immobilized)”或“固定(fixed)”在本文中可互换使用,并且是指材料或颗粒(尤其是抗原包覆的珠粒)与固体载体共价或非共价结合。该术语是指材料或颗粒是相对静止的并且在用固体载体进行的孵育和/或洗涤步骤期间不会释放。
术语“免疫球蛋白(Ig)”是指血清球蛋白的赋予免疫力的部分,以及指具有相同的功能特征的其他糖蛋白。它们通常包括四条多肽链,两条相同的轻链和两条相同的重链通过二硫键连接在一起。
术语“IgG”是指在血清中发现的Ig同种型之一,其是响应抗原而产生的主要抗体,有四种主要的亚型,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“IgE”是指在血清中发现的Ig同种型之一,其与肥大细胞和嗜碱性粒细胞紧密结合,而当与抗原另外结合时,引起组胺和速发型过敏反应的其他介质的释放。Ig的这种同种型在主要的I型过敏反应(如花粉热、哮喘和过敏性反应)中起主要作用。
本文所用的术语“抗体”是指由抗体结构域组成或包括抗体结构域的多肽或蛋白质,所述结构域理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域,具有或不具有连接子序列。如果包括β-桶结构,多肽理解为抗体结构域,所述β-桶结构由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两个β-条带组成。抗体结构域可以是天然的结构或通过诱变或衍生化修饰,例如,修饰抗原结合特性或任何其他特性,例如稳定性或功能特性,例如与Fc受体FcRn和/或Fcγ受体的结合。术语“抗体”适用于动物来源(包括人类物种)的抗体,例如哺乳动物,包括人、鼠、兔、大鼠、山羊、羊驼、牛和马,或禽类,例如母鸡,该术语应特别包括重组抗体,所述重组抗体基于动物来源的序列。
抗体可以以完整的免疫球蛋白存在,或以多种形式的修饰存在,包括,例如仅包含轻链和重链可变区的Fv片段、包含可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)’2片段、单链抗体等。抗体可以是动物(特别是小鼠、山羊、兔或大鼠)或人来源的,或者可以是嵌合的。本文所用的术语“抗体”包括这些多种形式,其可以通过修饰完整抗体和/或使用重组DNA方法重新合成来产生。“单克隆”抗体是指单个抗体或单个抗体的群,其中除了少量存在的可能的天然发生的突变,抗体在特异性和亲和力方面相同。
本文所用的术语“标记”是指可检测的化合物或组合物,其直接或间接地与抗体或抗体片段结合,以产生“标记的”抗体/抗体片段或“检测抗体”。标记可以是自身可检测性的,例如,放射性同位素标记、颜色或荧光标记、金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒,或者在酶标记的情况下,可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本文所用的术语“提取物”是指一种或多种物质,通常为浓缩形式,通过用溶剂处理材料(如生物材料)并从生物材料中分离提取物来获得,然后除去溶剂。术语“提取物”还应理解为包括通过本领域技术人员已知的后续纯化方法来处理初级提取物所获得的一种或多种物质。通常,提取物包括蛋白质和其他分子的混合物。
通常,通过从生物源材料中提取过敏原来制备过敏原提取物。生物源材料通常是来自真菌界、植物界或动物界的多细胞生物的多细胞或非细胞材料,或在某些情况下是细菌来源。此类过敏原提取物可以这样获得,利用机械均质化步骤(例如,剧烈混合和搅拌)对水溶性材料进行水性提取,然后进行纯化步骤(如过滤或分馏)以获得溶液,即提取物。然后可以对提取物进行进一步的纯化和/或处理,如冷冻干燥以基本上除去所有的水。通常,过敏原提取物包括蛋白质和其他分子的混合物。
在本文中,术语“过敏原”是指任何天然存在的蛋白质、其同种型、修饰的蛋白、重组蛋白、重组突变蛋白或其任何蛋白片段或蛋白混合物,其能够诱导过敏(即IgE在它们反复接触个体时介导反应)。本文所用的术语“过敏原组”是指从相同的生物过敏原源材料获得的一种或多种过敏原,例如,从生物过敏原源材料的过敏原提取物获得。
术语“生物源材料”或“生物材料”是指源自任何活的生物体的任何材料。该术语特别考虑许多先前来源(包括一种或多种抗原)的分离细胞、组织片、细菌、病毒、酵母和亚组分(例如分离的细胞核或细胞质)。
本文所用的表述“生物过敏原源材料”是指包括一种或多种过敏原的任何生物材料。这种材料的实例是螨虫PMB(纯螨体(Pure Mite Body))或WMC(全螨培养物(Whole MiteCulture)),来自例如草、草药、杂草和树的脱脂或非脱脂花粉、动物毛发和皮屑、毛皮、真菌菌丝体和孢子、昆虫体、毒液或唾液以及食物。
术语“自身免疫疾病”包括与致病性自身抗体相关的任何疾病、最可能由T细胞介导的疾病以及致病过程的证据仅直接相关的疾病。所述疾病可以是但不限于,急性特发性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性白细胞减少症、自身免疫性红细胞减少症、重症肌无力、吉兰—巴雷综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多发性硬化症、具有抗mag活性的单克隆免疫球蛋白病、肾上腺脑白质营养不良、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、抗心磷脂抗体与反复流产、难治性多发性肌炎、幼年型类风湿关节炎、类风湿关节炎,费尔蒂综合症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、某些肾小球性肾炎、ANCA阳性系统性血管炎、川崎病、抗因子VIII自身免疫性疾病和鸟枪弹样视网膜病变。
术语“共价键”或“共价相互作用”是指原子之间共用一对电子而产生的键或相互作用。共价键/相互作用包括但不限于原子键、同极键、σ-σ-相互作用、σ-π-相互作用、双电子-中心键、单键、双键、三键,以及这些相互作用/键的组合。所提及的相互作用/键可以是极性的或极化的,或者可以是非极性的或非极化的。
“非共价”是指原子和分子之间的关联,例如离子相互作用(例如,偶极-偶极相互作用、离子对和成盐)、氢键、非极性相互作用、包合配合、包合作用、范德华相互作用(例如,π-π堆叠)及其组合。
术语“被动吸附”、“吸附”或“吸收”是指气体、液体或溶解的固体中的原子、离子或分子附着到表面上。吸附的机理主要基于吸附的分子的疏水部分和表面之间的疏水性(范德华、伦敦型)吸引力。大多数疏水性分子通过被动吸附附着在表面上。在疏水性较低的分子(或更亲水的表面,例如-COOH或NH2改性的表面)的情况下,附着可以通过离子相互作用和疏水相互作用发生。
本文所用的术语“静电相互作用”或“静电附着”是指相反电荷的组分彼此吸引时由于吸引力而在带电组分、分子或离子之间发生的任何相互作用。实例包括但不限于:离子相互作用、共价相互作用、离子与偶极子(离子和极性分子)之间的相互作用、两个偶极子(极性分子的部分电荷)之间的相互作用、氢键和伦敦色散键(可极化分子的诱导偶极子)。
“可检测的信号”是指物理或化学信号,其可以通过视觉或仪器方法测量,包括比色、荧光、电和化学发光信号。
“对照值”或“对照信号”是指参比值,用受试者或受试者库的样品获得的信号与参比值进行比较。可以获得阴性对照信号,例如,(i)用不含任何免疫球蛋白的样品,(ii)用未被任何抗原包覆的珠粒,即固定在固体载体上的未包覆的珠粒,(iii)没有任何珠粒固定在其上的固体载体材料本身,或(iv)用来自健康个体或健康个体库或健康个体组的样品。例如,可以获得“阳性对照信号”,例如用具有特定量的分析物(即,对特定抗原/过敏原特异性的总免疫球蛋白或限定的免疫球蛋白)的商业参比样品、在标准分析中已经验证或测试为阳性的样品、或用与特定量的待检测的免疫球蛋白偶联的珠粒,且珠粒固定在固体载体上。
术语“样品”基本上是指任何液体样品。样品可以来自任何所需的来源,例如生理液体,例如血液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水等。在使用前可以预处理液体测试样品,例如从血液中制备血清或血浆、稀释粘稠液体等;处理方法还可包括分离、过滤、蒸馏、浓缩、使干扰组分失活以及加入试剂。另外,一旦将固体改性形成液体介质,就可以使用固体。该术语适用于可用于体外分析的任何体液。
本文所用的术语“受试者”或“患者”是指温血哺乳动物,特别是人或非人动物。
术语“生物分子”是指任何有机分子,其是活的生物体的一部分。生物分子包括核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽、蛋白质、碳水化合物、糖基化分子、脂质等。本文所用的术语也适用于模拟生物分子的结构和结合特异性的有机分子(例如适配体),从而由与识别生物分子的抗体相同的抗体识别。
“重组DNA技术”是指制备重组核酸序列的分子生物学方法,例如,描述于Weigel和Glazebrook编辑的《实验室手册》(Laboratory Manuals),2002,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Lab Press);和Sambrook等人,1989,冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约:冷泉港实验室出版社。
术语“抗原隔离物”是指化学连接剂,其可用于引入中间层,在固体表面和偶联的抗原之间产生限定的距离,以及限定所述中间层的化学性质,例如描述于BioconjugateTechniques,Greg T.Hermanson,学术出版社(Academic Press),2013年7月25日。
本发明的一个目的是提供一种抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组。在一些实施例中,抗原包覆的珠粒是由一种检测抗原(例如,通过重组DNA技术产生的抗原或从生物源分离和纯化的抗原)包覆的珠粒。在一些实施例中,抗原包覆的珠粒是由一组检测抗原(例如,获得自提取物(例如过敏原提取物)的抗原、获得自裂解物(例如细菌细胞裂解物)的抗原、获得自细胞或组织匀浆或其纯化部分的抗原)包覆的珠粒。
例如,第一组珠粒与通过重组DNA技术产生的某种(第一种)检测抗原偶联;第二组珠粒与从生物材料纯化的不同(第二种)检测抗原偶联;第三组与一组检测抗原偶联,所述一组检测抗原再次不同于第一种和第二种检测抗原,该组检测抗原获得自细胞裂解物;第四组珠粒具有另一组检测抗原,该组检测抗原获得自提取物,等等。因此,抗原阵列的不同抗原包覆的珠粒组(珠粒群)在与其偶联的抗原(例如检测抗原或检测抗原组)方面不同。
可以使用不同来源(例如裂解物、提取物、重组产生)的检测抗原、不同类型的珠粒(不同大小和/或材质的珠粒)和/或不同的偶联化学(非共价或共价偶联的抗原)来生产这些具有不同检测抗原或检测抗原组的珠粒组。
本文所述的抗原阵列包括至少25组不同的珠粒组。在一些实施例中,本文所述的抗原阵列包括25、50、75、100、125、150、175、200或250组珠粒中的至少任一种。在一些实施例中,抗原阵列包括多达300、400、500或1000组珠粒中的任一种。在一些实施例中,抗原阵列包括200-500组珠粒,优选250-350组珠粒。
在一些实施例中,抗原阵列内的珠粒组仅包括一种类型的珠粒(例如,仅聚苯乙烯珠粒,仅200-500nm直径的珠粒等)。在一些实施例中,抗原阵列内的珠粒组包括具有不同类型的珠粒的组(例如直径为350nm的聚苯乙烯珠粒、直径为300-500nm的乳胶珠粒和直径为5-500nm的玻璃珠粒)。在一些实施例中,使用相同的偶联化学(例如,不同的检测抗原/检测抗原组通过被动吸附与不同的珠粒组偶联)来制备抗原阵列内的珠粒组。在一些实施例中,不同珠粒组之间的偶联化学不同(例如,使用被动吸附使第一检测抗原/检测抗原组与第一组珠粒偶联,而使用共价连接剂使第二检测抗原/检测抗原组与第二组珠粒偶联)。特别地,抗原阵列可以包括第一组珠粒,其包括直径约200nm的聚苯乙烯微珠,其中第一检测抗原通过被动吸附与表面偶联;第二组珠粒,其包括直径为约500nm的聚苯乙烯微珠,该微珠具有NH2表面包层,其中第二检测抗原通过EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))交联剂与该表面偶联,所述交联剂引入12个原子隔离物;第三组珠粒,其包括直径约200nm的聚苯乙烯微珠,该微珠具有COOH表面包层,其中第三检测抗原通过零长度的EDC碳二亚胺偶联化学与该表面偶联。
在一些实施例中,一组珠粒内的珠粒(即,由相同的检测抗原包覆的珠粒群或由相同的检测抗原组包覆的珠粒群)包括相同类型的珠粒。在一些实施例中,一组珠粒内的珠粒(即,由相同的检测抗原包覆的珠粒群或由相同的检测抗原组包覆的珠粒群)包括不同类型的珠粒。例如,在一组珠粒内,一些珠粒(第一珠粒亚群/类型)是直径约200nm的珠粒,而一些其他珠粒(第二珠粒亚群/类型)的直径为约350nm。在一些实施例中,将提取物或裂解物(即蛋白质和其他分子的混合物)与所述200nm的珠粒混合,直径为约200nm的珠粒优先地与第一检测抗原偶联,通过将直径为350nm的珠粒与相同的提取物混合,直径为350nm的珠粒优先地与第二检测抗原偶联,然后将与两种不同的检测抗原偶联的两种类型的珠粒集中在一起,所述两种不同的检测抗原获得自相同的提取物或裂解物,从而产生由一组检测抗原包覆的一组不同类型的珠粒。
在一些实施例中,本文所述的抗原阵列是过敏原阵列,其包括25、50、75、100、125、150、175、200或250组珠粒中的至少任一种,珠粒组与检测过敏原(例如由重组DNA技术产生的过敏原或纯化的天然过敏原)或一组检测过敏原(例如与过敏原提取物偶联的珠粒)偶联。在一些实施例中,过敏原阵列包括多达300、400、500或1000组珠粒中的任一种。在一些实施例中,过敏原阵列包括200-500组珠粒,优选250-350组珠粒。
在一些实施例中,过敏原阵列包括由分子/重组产生的过敏原包覆的一组或多组珠粒、由过敏原提取物包覆的一组或多组珠粒,和/或由从生物源分离纯化的一组或多组过敏原包覆的一组或多组珠粒。
在一些实施例中,本文所述的抗原或过敏原阵列包括固定在固体板或片(例如硝化纤维膜)上的至少200组珠粒(例如,200-300组珠粒),其中所述阵列包括(i)珠粒组(A组珠粒),每组(A组珠粒)由不同的检测抗原/过敏原包覆(例如,1组由重组产生的第一抗原/过敏原包覆,2组由从提取物或裂解物纯化的第二抗原/过敏原包覆,3组由重组产生的第三抗原/过敏原包覆等)和(ii)珠粒组(B组珠粒),每组(B组珠粒)由不同的检测抗原组/过敏原组包覆(例如,I组由获得自第一种生物材料的第一抗原/过敏原提取物包覆,II组由获得自第二种生物材料的第二抗原/过敏原提取物包覆),其中珠粒组(A组珠粒和B组珠粒两者)由直径约200-500nm(例如直径约350nm)(例如聚苯乙烯珠粒)的珠粒制成,并且检测抗原/过敏原或检测抗原组/过敏原组通过相同或不同的偶联化学与珠粒共价或非共价地偶联。在一些实施例中,不同的检测抗原/过敏原或检测抗原组/过敏原组通过被动吸附与珠粒偶联。在一些实施例中,部分检测抗原/过敏原或检测抗原组/过敏原组通过被动吸附偶联,而其他的检测抗原/过敏原共价地偶联,例如通过EGS连接剂或EDC化学品。
在一些实施例中,珠粒组以行和列的矩形图案或橙色包装图案(orange packedpattern)布置在本文所述的抗原或过敏原阵列上。在一些实施例中,本文所述的抗原或过敏原阵列还包括在阵列限定位置处的阳性和/或阴性对照点(例如标记点),其可以用于定位以及鉴定阵列的抗原包覆的珠粒。
抗原
抗原是可以使免疫系统产生针对其的抗体响应的物质。抗原通常是大分子或分子,例如蛋白质、肽、抗体多糖、多核苷酸、RNA、DNA、脂质、糖基化分子、碳水化合物、有机或无机化合物、这些分子天然发生的修饰、适配体,其对宿主来说是外来的。抗原包括一个或多个免疫表位。
本文所述的抗原是检测抗原,即决定抗原特异性反应的抗原。在一些实施例中,检测抗原是过敏原、感染标志物和/或自身抗原。
过敏原是能够在特应性个体中通过免疫球蛋白E(IgE)响应刺激I型超敏反应的抗原。过敏原可以包含在食品中或来自食品,例如乳制品(例如,牛奶)、蛋、芹菜、芝麻、小麦、大豆、鱼、贝类、糖(例如,肉类中存在的糖,例如α-半乳糖)、花生、其他豆类(如黄豆、豌豆、大豆等)和树坚果。或者,过敏原可以包含在非食品中或来自非食品,例如动物产品(例如尘螨排泄物、皮毛和皮屑、羊毛)、花粉,例如树花粉(如桦树花粉、雪松花粉、橡树花粉、赤桦树花粉、角树花粉、七叶树花粉、柳树花粉、杨树花粉、悬铃木(plantanus)花粉、椴树花粉、油橄榄树花粉、阿什桧柏花粉和糖胶树花粉)、杂草(豚草、车前草、荨麻草、北艾、藜草、酢浆草)、草(黑麦草、猫尾草)、昆虫毒液(如蜜蜂、黄蜂、蚊子、火蚁等的毒液)、霉菌、乳胶、金属(如镍)、家用清洁剂、洗涤剂、药剂、化妆品(如香水等)、药物(例如,青霉素、磺胺药、水杨酸盐等)、治疗性单克隆抗体(例如,西妥昔单抗)。
在一些实施例中,过敏原是交叉反应性过敏原。交叉反应性过敏原是一种来源(例如桦树)的过敏原与不同来源(例如苹果树)的过敏原具有结构相似性。一旦患者对第一个来源过敏,他/她可能也会对第二个来源产生过敏。在一些实施例中,过敏原是标志物过敏原。标志物过敏原主要在一个特定的来源中发现。在一些实施例中,过敏原是泛过敏原。泛过敏原(例如,前纤维蛋白)存在于多种不同来源中。在一些实施例中,过敏原是主要过敏原,其在过敏群体中诱导主要的Ig响应,而在另一个实施例中,过敏原可以是次要过敏原,仅有少数过敏患者对其起反应。在一些实施例中,过敏原是不与任何其他过敏原交叉反应的过敏原。
表1:过敏原列表
感染标志物是指示存在感染因子(如病毒、寄生虫、细菌、朊病毒和真菌)的物质、组合物或颗粒。
感染标志物包括但不限于蛋白质、糖蛋白(例如细菌或病毒的表面或外壳蛋白)、蛋白质的混合物(例如细菌细胞裂解物)、与感染因子或颗粒相关的其他可检测的化合物(例如,类病毒颗粒或病毒外壳蛋白、细菌表面抗原等)。
自身抗原是由生物体(例如人)产生的分子,生物体对其产生免疫响应,例如产生抗自身抗原的抗体,即产生自身抗体。自身抗体的产生通常与自身免疫疾病有关。自身抗原的实例包括器官特异性抗原,例如甲状腺球蛋白和普遍存在的细胞抗原,例如DNA、组蛋白和核糖核蛋白颗粒。在本文所述的抗原阵列中可以包括的示例性自身抗原列于表2中。
表2:自身抗原
疾病缩写:
SLE=系统性红斑狼疮
SS=干燥综合症
SScl=硬皮病(全身性硬皮病)
PM=多发性肌炎
Der=皮肌炎
Ray=雷诺病
RA=类风湿性关节炎
MCTD=混合性结缔组织病
本文所述的抗原阵列的抗原,即检测抗原,可以是通过重组DNA技术产生的抗原,或者是从生物源材料纯化和分离的抗原(例如,来自基本上不含任何其他抗原的生物材料的抗原,所述其他抗原可以通过本领域已知的方法从相同的生物材料分离(对照IanR.Mackay和Noel R.Rose,The Autoimmune Diseases,第5版,学术出版社,2014)。在一些实施例中,珠粒与重组产生的抗原偶联。在一些实施例中,珠粒与从生物源分离和纯化的检测抗原偶联。
在一些实施例中,抗原阵列包括具有一组检测抗原(例如,至少一种、两种或更多种检测抗原)的珠粒组。例如,该组检测抗原可以从生物源的提取物(例如过敏原提取物)或裂解物(例如细菌裂解物或其他细胞裂解物)获得。在一些实施例中,珠粒与生物源的提取物或裂解物偶联,从而产生抗原包覆的珠粒,其具有一组检测抗原。
在一些实施例中,珠粒由重组DNA技术产生的分子过敏原包覆。在一些实施例中,珠粒由从生物源分离或纯化的过敏原包覆。在一些实施例中,珠粒由过敏原提取物(例如一组过敏原,例如来自生物材料的至少一种、两种或更多种过敏原)包覆。过敏原提取物可以包括原始的(raw)过敏原提取物、浓缩的过敏原提取物或从过敏原提取物中纯化的几种过敏原。过敏原是天然存在的过敏原。过敏原提取物可以天然地含有相同过敏原的一种或多种同种型。过敏原提取物也可以由至少两种过敏原提取物的混合物组成,所述至少两种过敏原提取物是不同生物源的,例如,相似基本来源的两种不同但密切相关的物种,通常称为spp。
用微米或纳米颗粒偶联抗原
本文所述的抗原阵列利用了异质的和复杂的生物抗原(即检测抗原)的个体化优化偶联策略的原理。在多重免疫抗体检测分析中,这是实现每个单参数的最佳测试性能的先决条件。
抗原偶联以两个不同的步骤进行。在第一步中,将每种抗原与微米或纳米级悬浮颗粒偶联,例如微米珠粒或纳米珠粒。
在一个具体实施例中,那些颗粒是球形颗粒,其可以保持在水性缓冲液的溶液中,例如通常用于蛋白质或更通常用于生物分子储存的那些水性缓冲液。颗粒可以是胶乳或聚苯乙烯颗粒、塑料聚合物颗粒或由玻璃(二氧化硅)制成的颗粒、多孔或无孔表面颗粒,或者甚至由其他生物相容性聚合物制成的颗粒。颗粒的尺寸可以在几纳米到1微米之间,其中颗粒优选的尺寸是直径为5-500nm,更优选为200-500nm,甚至更优选地为200-350nm(例如,约350nm)。在一些实施例中,珠粒是聚苯乙烯纳米颗粒。
抗原(蛋白质、肽、抗体、DNA以及由核酸、氨基酸或有机或无机化合物形成的其他生物分子可用作抗原)的附着可以通过各种附着策略进行。
在最简单的实施例中,抗原分子或大分子将通过被动吸附附着于颗粒(珠粒)上,例如疏水和/或静电附着。通过选择合适的缓冲体系可以促进附着,所述缓冲体系产生用于最大附着的环境,例如通过选择pH值接近抗原的等电点的缓冲体系,从而平均地中和表面电荷。
在更复杂的设置中,待偶联的抗原由多种含单一抗原的分子或者具有几个抗体结合表位的大分子或者甚至多种蛋白与单独地不同的抗原的复杂混合物组成(例如包括一组检测抗原的生物源材料的提取物或裂解物),所述单独地不同的抗原含有多个表位,可能需要不同的吸附条件来实现最佳的生物结合能力(亲合力)。在这种情况下,可以将抗原或抗原混合物分成几个等分试样,每个等分试样在不同条件下偶联,例如不同的pH值或不同的离子缓冲强度或不同的缓冲添加剂,例如盐、洗涤剂、缓冲物质等。在每种条件下,每种抗原以一定的构造偶联,该构造对于生物活性可能是优选的,或者某些抗原的部分可能比另一种亚群更容易偶联,或者在所选择的条件下根本不偶联。在随后的步骤中,可以将不同的等分试样重新组合以产生微米颗粒或纳米颗粒群,所述微米颗粒或纳米颗粒群携带来自初始的复杂混合物的不同抗原或多种结构构型的单一抗原。通过实现这一点,可以将生物样品的原始表位谱与颗粒偶联而不产生偏差,所述偏差以这样的方式产生,即仅保留选择的表位,或实际仅与从复杂混合物选择的抗原载体偶联。
通过选择足够数量的不同偶联条件并优化差异性偶联的颗粒-抗原组合的混合物,带有抗原的最终颗粒溶液将紧密地集合原始混合物的表位谱,或者可以以那种方式在颗粒溶液中富集优选的抗原载体同时仍然在整体上保持完整的表位复杂性。
在甚至更复杂的设置中,可以通过使用本领域技术人员已知的过量的组合有机偶联化学来偶联抗原。通过这种策略,抗原可以与颗粒共价偶联,并且可以选择性地与抗原表面上存在的某些化学基团偶联,例如氨基或羧基、巯基、芳香残基等。
当使用小抗原如肽或化合物时,还可以使用合适的抗原隔离物以优化抗原呈现。
通过颗粒表面的化学表面工程化,还可以优化珠粒与固体载体表面的偶联,抑制非特异性结合或增强抗体结合。
在一些实施例中,检测抗原或检测抗原组与珠粒共价结合(例如,通过EGS连接剂与NH2表面珠粒结合,通过EDC连接剂与COOH表面珠粒结合)。在一些实施例中,检测抗原或检测抗原组与珠粒非共价结合。例如,抗原或检测抗原组可以通过被动吸附包覆珠粒。
还可以优化粒径以适应制备过程的要求。颗粒应当易于处理并保持在溶液中,同时,一旦沉积到最终的固体载体上,颗粒应当特异性或非特异性地附着。在颗粒携带抗原后,可以将携带抗原的颗粒与剩余的抗原溶液分离,例如通过离心、磁分离、电荷或尺寸排异等。通过这种分离,可以仅保留优选偶联的抗原部分并除去剩余部分(可能是原始抗原混合物的非抗原性部分)。
可以对抗原偶联的颗粒进行功能测试,并将结果与可利用的参比测试、临床参比数据或可利用的标准制剂进行比较,所述参比测试用参比体外诊断方法进行。对于极少数的抗原特异性IgE抗体,由于没有国际公认的实验室标准,一个可利用的参比系统是Biorad质量控制样品,已经在三种最广泛使用的自动免疫分析仪器上测试了其对主要过敏原的IgE抗性(www.bio-rad.com)。
可以通过本领域已知的多种方法检查抗原偶联的程度。例如,偶联反应的上清液可以用于ELISA分析,可以测量蛋白质含量,或可以在1D或2D蛋白质凝胶上测试,由此不仅可以估计未偶联的抗原的总含量,还可以通过观察蛋白质峰或斑点的大小/位置来记录未结合的以及结合的抗原载体(凝胶上不再存在的那些)的性质。如果需要,还可以通过质谱分析上清液。
可以应用类似的方法来测试偶联的稳定性。例如,通过偶联颗粒然后在限定的时间间隔后测试上清液(不含颗粒的溶液),可以确定抗原蛋白是否永久地附着在颗粒上,或在一定时间后或在使用了某些储存缓冲液或洗涤剂的特定储存条件下,抗原蛋白是否扩散回溶液中。
抗原偶联的珠粒的储存及其制备期间的处理
偶联的珠粒储存在可以使与颗粒结合的蛋白稳定至少几个月的条件下,优选储存在初始偶联后稳定几年的条件下,其中的两个主要目标是,首先保持蛋白质附着于颗粒上,其次且更重要的是保持蛋白质的生物活性并防止其降解,例如通过蛋白水解消化。此外,珠粒必须保持在溶液中并且必须避免任何沉淀,因为这可能导致聚集体形成,聚集体形成后不能溶解,在不使用较苛刻的和潜在的抗原损伤方法(加热、剪切、超声处理、涡旋等)的情况下会封闭或破坏原始抗原溶液中存在的部分表位谱。
上述方法为任何免疫分析制备过程提供了显著的改进,因为当在例如-80℃储存时,试剂可以充分稳定更长的时间或甚至无限期地稳定。对于后续制备过程,稳定的原始试剂组的优点主要在于,一旦生产出良好的试剂,假设其长时间稳定,则在质量控制程序中需要进行相对较少的努力。反之,如果必须在较短的时间间隔内新鲜地完成偶联,则每次偶联完成时,必须提交一整套质量控制措施和文件(documentation)。,变化是源于偶联过程还是先前劣化的抗原溶液,仍然会存在不确定性,而抗原溶液可能比实际吸附在颗粒表面上的抗原更难以储存更长时间。本领域技术人员知晓,即使在低温下,蛋白质也不能无限期地储存在简单的溶液中,主要是因为反复的冷冻和解冻会使质量劣化并且蛋白质具有沉淀或彼此附着的倾向。然而,即使在不太有利的储存条件下,表面附着的蛋白质的稳定性可以明显更长。
可以储存更长时间的条件还包括选择最佳的温度范围,通常为-20℃或2-8℃,优选地为2-4℃。
适于储存本文所述的抗原包覆的珠粒的缓冲液包括但不限于:简单的NaCl溶液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等。
用于储存的pH条件优选在生理范围内,即pH 7-8,但也可以为pH 6-9甚至pH 2-14。
允许储存更长的时间的添加剂包括但不限于:非离子型洗涤剂,例如吐温-20、SDS、Triton等。
在储存期间,可以使用叠氮化钠、卡松或其他防腐剂来避免制剂中细菌或真菌生长。
可以使用多元醇来稳定溶液中的颗粒以及颗粒上的蛋白,如甘油、聚乙烯醇等。
多糖,如海藻糖、蔗糖等,可以进一步稳定蛋白质,特别是防止结构降解。
糖可以进一步用于蛋白质稳定化,即使在颗粒与最终分析的固相偶联后。
以阵列形式表面沉积携带抗原的珠粒
通过本领域技术人员已知的几种方法可以实现珠粒从溶液转移到固相。目的是将一系列包含独立的抗原的颗粒溶液(珠粒组)转移到可寻址元件的有序阵列(间隔的分子实体在阵列上具有确定的位置)上,以便与包含抗原的生物样品(例如患者的血清)孵育并对结合进行适当的检测后,检测到的信号可以与相应的抗原性源材料关联起来。
将液体从溶液沉积到固体载体上的主要方法是接触或非接触驱动。对于接触方法,通常将某种类型的印模(stamp)或销钉(pin)反复浸入源液(source liquid)中,在浸入源液之间,吸收到印模或销钉的聚集材料沉积在固体载体上。然而,作为较简单的替代方案,这种方法在可扩展性和重现性方面有明显的缺点,因为大部分工艺性能将取决于印模和源液的性质,以及固相的润湿性、液体的粘度和成分等。
因此,在大多数现代应用中,非接触方法是优选的。对于本文所述的阵列,可以使用电磁分配系统,由此,注射器在液体通道中产生压力,通道中含有抗原性源溶液,电磁阀精确地定时打开允许在陶瓷尖端形成精确均匀的液滴。然后从陶瓷尖端喷出液滴,并在短暂的飞行后着陆并附着在固相上。当以有序的方式沉积一个又一个不同的源液时,固相在陶瓷尖端下方运动(或者相反地,通过电动轴移动尖端)允许产生不同的阵列。或者,液滴的沉积可以通过压电驱动的液滴形成来进行,与前述方法的主要区别在于压力不是通过注射器建立的,而是由压电晶体的电脉冲建立,并且分配的体积通常小得多,在皮升范围内,而液滴在纳升范围时电磁分配的效果最好。
所形成的液滴的优选的尺寸为直径1mm,从而在固相上产生直径接近1mm的圆形特征(间隔的分子实体作为可寻址元素)。使用这样的尺寸,可以产生这样的阵列,即每平方厘米有大约10×10(总共100)个不同抗原偶联的区域。以这种方式分配到固相的液体量为每滴约30nl,但也可以在1nl-200nl之间,甚至更大。包含特定抗原包覆的珠粒组的圆形特征或单元可以通过其定位/位置(空间上可寻址的)来识别,并且可以以规则的矩形阵列或橙色阵列排列。本文所述的阵列具有1-9个可寻址元件/mm2,例如,具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个可寻址元件/mm2。
就最终测量的变异系数而言,沉积点的质量(均匀性、形状、位置公差等)以及定量重现性的重要变量是:距离目标的距离、通道中的压力;阀门打开次数;液滴体积;轴的移动速度;分配的间隔时间;过程和过程间隔中陶瓷尖端的清洁和调节;实际的点沉积过程之前的预先定点程序;吸气量和吸气速度;以及微量滴定板的几何形状。在沉积过程中,当在液体处理设备内时,需要将抗原偶联的颗粒保持在溶液中,并且在抽吸和分配周期之间,通过充分清洁液体通道来避免沉积不同的抗原包覆的珠粒之间的任何交叉污染。
为了实现零缺陷沉积过程,检测每个单独的分配缺陷事件是重要的,例如,通过在颗粒溶液中加入非永久性颜料,非永久性颜料允许检测液体成功地沉积到固相上,但在实际测试过程中会洗掉。以这种方式,可以检测到缺失的液滴并且在初始分配轮次后回顾性地加入,从而在100%的时间内形成100%完整的批次。
固体载体
通常在较大的固体载体材料片或板上进行沉积过程,由此,每批通常由数百至数千个相同的阵列组成。通过对准所需数量的分配通道并移动板上的基底或甚至在分配尖端下方的卷对卷系统,并对定位和分配事件进行定时,从而在固体载体上产生有序的颗粒点阵列,实现连续过程。
在分配步骤后,将固体载体切割成尺寸合适的块,用于进一步装配或储存。或者,甚至可以在沉积抗原包覆的珠粒之前将固体载体切割成合适的尺寸,其中块的尺寸对应于沉积的颗粒组的数量以及每个组的密度。在一个优选的实施例中,每个固体载体块是矩形的并且为5×5mm至200×200mm或更大,甚至更优选地为10×10至20×30mm。
固体载体可以由硝化纤维、层压的硝化纤维或重氮纸或有机聚合物组成,有机聚合物为例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、异质同晶聚合物、聚乙烯化合物、尼龙及其共聚物及其接枝物或其他功能化塑料。固体载体也可以是无机物,例如玻璃、二氧化硅、孔径可控的玻璃(CPG)或反相二氧化硅。固体载体的构造可以是膜或表面形式,并且可以是平面的、基本上平面的或非平面的。固体载体可以是多孔的或无孔的,并且可以具有溶胀或非溶胀特性。
固体载体的性质可以是多孔或无孔的材料,具有保留携带蛋白质抗原的颗粒的能力。例如,硝化纤维片或层压的硝化纤维片可以用作固相,从而硝化纤维的孔径和精确的组成可以对测试性能具有明显的影响。甚至硝化纤维的化学活化可以对测试结果产生有益的影响,硝化纤维的化学活化是为了能够共价结合生物分子。不同类型的硝化纤维膜可用作固体载体,此类硝化纤维膜在孔径、流速或基质材料方面不同。优选地,孔径应该在颗粒尺寸的范围内,使得颗粒可以被表面上的孔保留,但同时不会在固体载体的结构中消失,否则抗体难以结合到颗粒表面。
固相应该是耐用的并且与通常的ELISA程序相容,固相需要数小时的孵育并在水溶液中洗涤。与表面的非特异性结合应该本质上很低,或者必须够阻止与固相的任何非特异性结合,以实现所需的信噪比(信号除以噪声标准偏差)。
存储测试以及装配在盒中
在沉积到固体载体上后,为了稳定颗粒,可以将固体载体储存在合适的温度,优选2-8℃。另外,在颗粒沉积后,可以通过喷涂加入糖或其他稳定性物质。对稳定性的要求是制备后稳定至少一年,优选地制备后稳定至少30个月,这将为制备后运输至最终用户留下6个月时间并且最终用户的剩余保质期为24个月。
对于实际处理、储存和运输以及试剂盒包装,将固体载体的切割条装配到以下更详细描述的盒中。盒不仅为固体载体宏阵列提供了物理保护,而且还提供了高度复杂的以及功能性的容器,极大地促进了测试、液体操作以及处理可能受污染的材料的自动化处理。
分析程序
本文还描述了使用本文所述的抗原阵列来检测对检测抗原或一组检测抗原特异性的免疫球蛋白的体外方法。特别地,该方法包括:
(i)提供如本文所述的抗原阵列,
(ii)将阵列与样品一起孵育,
(iii)将阵列与检测试剂一起孵育,
(iv)任选地,将阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
与阴性对照信号相比,可检测的信号增加表明样品中存在免疫球蛋白,而信号没有增加表明样品中不存在免疫球蛋白。
在一些实施例中,可检测的信号是比色、荧光、电或化学发光信号。
本文所述的生物分析的目的是在单次分析程序中检测针对多种抗原的特异性免疫球蛋白,所述分析程序基于ELISA原理并且通常包括以下基本步骤:
1)预洗涤
2)阻断
3)与样品一起孵育
4)洗涤
5)与检测试剂一起孵育
6)洗涤
7)任选的:与信号产生试剂一起孵育
8)任选的:停止信号产生
9)检测和测量结果。
在一些实施例中,使用本文所述的抗原阵列来检测对检测抗原或一组检测抗原(例如过敏原或一组过敏原)特异性的免疫球蛋白的方法包括:
(i)提供本文所述的抗原阵列(例如过敏原阵列),
(ii)将阵列与样品(例如血清或全血或处理的血液)一起孵育,
(iii)将检测试剂(例如,用可检测的信号直接标记的抗IgE或抗IgG抗体或IgE特异性或IgG特异性适配体、与酶结合的抗IgE或IgG抗体或IgE特异性或IgG特异性适配体)与阵列一起孵育,
(iv)任选地,将阵列与信号产生试剂(例如,酶促反应的底物)一起孵育,
(v)任选地加入终止溶液以结束信号产生,和
(vi)测量可检测的信号。
在那方面,样品可以是患者血清、全血或处理的血液、鼻液、尿液、其他体液或细胞裂解物或来自组织的匀浆等。样品可以来自单个受试者或来自受试者库(例如,当筛选大量受试者时,来自10、20、30名受试者的血清库)。在一些实施例中,样品是血液样品(例如血清样品)。在一些实施例中,样品的量为1μl-2000μl中的任一种,例如1μl-10μl、10μl-50μl、50μl-100μl、100μl-500μl、500μl-2000μl中的任一种。在一些实施例中,样品的量为1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、250μl、500μl或1000μl或2000μl中的任一种。在一些实施例中,未稀释样品。在一些实施例中,稀释了样品。在一些实施例中,按1∶1-1∶10、1∶10-1∶100、1∶100-1∶1000或1∶1000-1∶10000稀释样品。在一些实施例中,按1∶10、1∶100、1∶1000或1∶10000中的任一种稀释样品。所需的实际样品量取决于用于孵育反应的样品稀释。
生物样品不会明显地影响测试性能,即使样品不是完美的状态,这在常规抽血过程中经常发生。通常出现问题的是脂血、溶血或黄疸样品液、具有高蛋白质含量或甚至高抗体含量(IgG、IgE、其他)的样品。
检测试剂是生物源的亲和结合剂,优选来自免疫或在随机文库中人工选择的抗体(例如检测抗体)。其他亲和结合剂可以是蛋白质或核酸这些人工选择的结合剂,例如适配体或亲和体。
初始的洗涤步骤的目的是从固相中除去任何非永久结合的颗粒,否则在样品孵育步骤中,非永久结合的颗粒会与固相结合的抗原以及游离的可溶性抗原的结合进行竞争。
一般来说,洗涤步骤不是单次步骤而通常重复进行,以最终除去任何不需要的试剂并使其低于检出限。具体地,洗涤步骤可以重复3-5次,通过倾斜盒并加入至少30倍的新鲜洗涤溶液来稀释体积,使得在3轮洗涤之后稀释度大约为1/27000,任何额外的洗涤步骤甚至会进一步使稀释度增加30倍。
阻断步骤旨在阻断样品成分的非特异性结合的任何可能性,例如待检测的抗体对固定的抗原不具有特异性,以及检测试剂的非特异性结合。
在与样品一起孵育前可以进行一次阻断,或者可以在分析的每个步骤之前重复进行,或者可以加入阻断试剂来稀释待测样品或者甚至阻断试剂可以包含检测试剂(例如检测抗体、适配体或亲和体)。
在那方面,阻断试剂是指生物来源或其他来源的任何物质,其可以减少复杂的生物样品(如血液或血清)和固相上的多种抗原之间通常发生的非预期的或非特异性的结合反应。阻断剂优选不含潜在的抗原性蛋白,否则可能导致甚至更多的非特异性结合以及减少的信噪比产生。
例如,当涉及检测人IgE或IgG时,在简单的ELISA程序中经常用作稳定剂或阻断剂的牛血清白蛋白(BSA)通常是不合适的,因为BSA既是潜在的食物过敏原,又在经常消费来自奶牛的乳制品或肉制品的人中是非相关IgG普遍的诱导物。因此,如果样品含有检测亚类相应的抗BSA抗体,则由BSA阻断的任何结合位点可以造成比其它情况甚至更多的非特异性背景问题。类似的情况使得使用许多廉价且容易获得的阻断试剂变得不切实际,这些阻断试剂在其他领域中经常使用。
因此,如果使用蛋白质阻断剂,则它们对人不应该是免疫原性的,例如人血清白蛋白,其通常不与任何人抗体结合。
其他的阻断方法包括洗涤剂、糖、多元醇或其他化合物,其可以使相互作用的伴侣(partner)之间的弱结合不稳定,相互作用的伴侣之间的弱结合不像抗原-抗体结合物(通常具有10-9M或更低的亲和常数)那样强烈和特异。
与样品或检测试剂(例如检测抗体)一起孵育的孵育步骤通常成比例地占整个过程的最长时间,孵育时间为数分钟至数小时。优选地,与样品一起孵育的耗时少于2小时,而与检测试剂一起孵育的耗时少于30分钟。在检测试剂已经带有可检测的标记的情况下,可以省略信号产生孵育步骤。否则,尤其是当使用酶促信号产生时,与信号产生试剂一起孵育的通常孵育时间优选少于5分钟。
在孵育期间,本盒设计允许搅动液体,从而混合样品并增加亲和结合剂与相应抗原的质量传递。优选地,搅动沿着盒的长边移动,搅动足够温和而不会使液体从容器边界溢出,并且搅动足够强烈,与没有混合的孵育相比,充分地增加反应动力学。
或者,可以通过温度或电磁波来增加或控制分析动力学,温度或电磁波旨在更有效地混合流体。
检测和测量
本领域技术人员已知的几种可能的方法能产生可检测的信号。在最简单的形式中,直接用颜料或激发型(excitable)化合物(例如荧光染料或金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒等)标记检测试剂,所述检测试剂与载有特异性免疫球蛋白的抗原位点结合。在这种情况下,检测不需要任何额外的信号产生步骤,并且在清洗掉未结合的检测试剂后可以直接读取信号。
在一个优选的实施例中,通过使用与酶结合的检测试剂来产生酶促信号,酶将信号产生试剂中包含的底物转化为可检测的信号。
与检测试剂结合的酶包括但不限于碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或β-半乳糖苷酶(GAL)。这些酶可以分别使底物(如NCIB/NBT)产生有色沉淀物,或者可以使发光体转化(例如Lumingen APS-5)产生光子,或者可以转化底物以改变某一波长处的消光系数,例如邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷酶。
如果需要,通过加入强烈干扰酶转化底物的物质可以立即停止酶促反应,即所谓的终止溶液(例如蒸馏水、EDTA、NaOH、HCl等)。
在一些实施例中,检测试剂是直接标记有色化合物、金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒或激发型化合物的抗人IgE抗体。在一些实施例中,检测试剂是直接标记有颜料、金纳米颗粒、有色乳胶纳米颗粒或激发型化合物的抗人IgG抗体。在一些实施例中,检测试剂是特异性识别人IgE或IgG抗体的适配体或亲和体,其中适配体或亲和体直接标记有颜料、金纳米颗粒、有色乳胶纳米颗粒或激发型化合物。在一些实施例中,检测试剂是与酶(例如,AP、HRP或GAL)结合的抗人IgE或IgG抗体,并且根据本文所述的方法的步骤(iv),该方法包括将阵列与信号产生试剂(例如,用于酶促反应的底物)一起孵育,并且任选地在步骤(iv)后加入终止溶液(例如,ddH2O、EDTA、NaOH、盐酸、硫酸或任何可以干扰酶促反应的试剂,无论是由于催化反应的pH值要求而使反应不能进行、化学地破坏或改变底物、阻断酶的活性中心,还是将反应减慢到不明显的水平等)。
在一些实施例中,检测试剂包括两种组分:(i)第一组分,其包括抗IgE或抗IgG抗体;和(ii)第二组分,其包括识别抗IgE或抗IgG抗体的试剂,第二试剂直接标记有颜料或激发型化合物或与酶结合,并且根据本文所述的方法的步骤(iii),其中将抗原阵列与(i)一起孵育,然后与(ii)一起孵育(其间有洗涤步骤)。例如,第一组分可以是特定类型的抗IgE或抗IgG抗体,例如从生物体(例如大鼠、小鼠、兔等)获得的抗体,而第二组分可以是与所述的抗体类型结合的抗体,例如,抗大鼠、抗小鼠、抗兔抗体等。
本文特别提供了用于检测与过敏相关的IgE抗体的体外方法,包括,
(i)提供本文所述的过敏原阵列,
(ii)将阵列与样品(例如血清或全血或处理的血液)一起孵育,
(iii)将阵列与直接标记有可检测的信号的抗IgE抗体或抗IgE适配体或与酶结合(例如,与AP、HRP或GAL结合)的抗IgE或抗IgE适配体一起孵育,
(iv)任选地,将阵列与信号产生试剂(例如,用于酶促反应的底物)一起孵育,
(v)任选地加入终止溶液(例如ddH2O、EDTA、NaOH、盐酸、硫酸或任何能干扰酶促反应的试剂)以终止信号产生,和
(vi)测量可检测的信号。可以通过简单的CCD照相机、CMOS照相机、激光扫描仪(例如传统的台式扫描器)或任何其他设备来检测有色信号,所述其他设备能够测量通常的白色或固体载体的透明背景与有色反应位点之间的强度差异,在有色反应位点处检测结合反应。在光子测量的情况下,需要使用具有足够灵敏度的照相机或光电倍增器设备以单独测量信号。
对于定量,首先需要鉴定固定独立抗原的区域。这可以通过阳性对照点的图案来实现,阳性对照点总是给出可检测的强烈的信号,称为标记点。例如,阳性对照点可以是与纯化的人IgE抗体偶联的一组珠粒。从标记点的位置和方向,所有其他位点的相对位置以及它们的尺寸都可以知道,并且可以位于所获取的图像或数据点阵列内。
对于固定的携带抗原的颗粒的每个典型圆形区域,可以通过将位于预期信号内的每个像素加入到总信号来计算信号积分,并且可以将外部的每个像素加入到背景中。另外,对于信号和背景,也可以计算平均值、中值和标准偏差。所有计算将由本领域技术人员已知的图像分析软件工具处理,例如来自NIH的ImageJ。
在本文所述的方法中,优选局部背景计算,这通过总结所有像素来完成,所述所有像素在点区域的直径的三倍之内但不在任何抗原位点内。
另外,可以使用统计对照措施(statistical control measures)来判断信号的质量或可靠性,例如平均值到中值变化(mean to median variation)、信号变化、噪声变化和异常值检测。
就总的可测量的信号-背景或信噪比而言,应用阈值来过滤原始的测量数据。优选地,仅将比背景噪声变化高至少2倍的信号视为阳性信号(例如,可检测的信号)。
结果的归一化和校准
在获取原始的测量数据后,需要两个步骤来实现原始的分析数据到临床相关的响应单位。
在本文描述的方法中,采用两种不同的方法来实现结果的首先归一化和其次校准。
在那方面,归一化是将测量、天数、批次或操作员之间的总信号水平的变化归一化到平均相同的水平的过程。以这种方式,可以将精确的孵育时间的变化、由于环境温度变化引起的差异、由样品基质引起的变化等补偿到相同程度。
对于本申请,使用分析中待测量的特定抗体亚类的标准曲线来实现归一化。纯化的抗体,例如人IgE,以增加的浓度固定在宏观阵列形式的不同位点。根据该方法,认为标准曲线上的最高浓度为100%信号,而标准曲线的每个已知稀释度指定为相应浓度值的减少。由曲线的所有点,计算曲线拟合并通过将曲线方程应用于每个原始测量值而将任意强度单位变换为相对信号单位。
该方法允许使测量之间的平均信号强度归一化,但是不能补偿相应批次上的每个单独参数的个体波动。通常,每个生产批次中存在一定程度的生产变化,并且这些变化通常以某种方式是系统性的,例如,参数1可能比长时间的平均值高10%,参数2可能比长时间的平均值低5%,而参数3可能在规格范围内。为了将这些差异消除到必要的最小值,可行的方案是,使用已经在制造商的质量控制站点处明确限定的对照样品来检测长时间的平均值的任何系统性变化。一旦识别出该系统性变化,就可以以数据表的形式,或者优选地以自动编码格式,例如在每批上打印的2D条形码,将这些差异传达给最终用户。通过阅读和理解该条形码,在制造商站点处的质量控制(QC)程序期间,通过软件工具的帮助,最终用户可以根据识别的变化自动调整测量值,并在上述示例中,通过将其减少10%来调整参数1测量值,通过将其增加5%来调整参数2而保持参数3不变。因此,与没有这种可配置的和统计上合理的数据调整相比,可以将免疫分析的总变化降低至较低的水平。
在最后一步中,必须实现结果的实际校准。在这方面,校准是将调整的相对响应单位转换成某种形式的绝对单位的过程。绝对单位应作为一个值,其允许将结果与其他制造商的系统、实验室之间或时间点之间进行比较,即使系统发生了重大变化。
如果可利用国际公认的参比制剂,则可以针对其进行校准。对于许多疾病领域,可以购买定量参比标准并用于校准。然而,在多参数分析形式中使用标准的校准过程是不实际的,简单来说是因为校准一个系统比实际的测量需要更多的精力和成本。
在单参数分析中,校准的标准方法是同源校准,由此,对特定的抗原-抗体相互作用的测量结果(测量结果测量自后者浓度未知的样品)进行测量并与确定的样品(确定的样品具有针对对应抗原的确定的免疫球蛋白浓度)的测量结果进行比较,并使用该参比曲线将原始测量结果转化为绝对的定量测量结果。
与相对大量的未知样品相比,当测量相对较少的标准制剂用于校准目的时,这很容易实现。
然而,在一应用中,即在每个反应中测量数百个独立的参数,并且每个参数代表相同的抗体亚类与不同的抗原的结合,这时,对于每个独立的参数,同源校准曲线是不可行的并且很可能引入明显的其他变化。因此,采用所谓的异源校准方法。产生的校准曲线不是用于在不同样品中具有不同浓度的相应抗体的单一的抗原-抗体测量,而是使用单个样品,其呈现出针对一系列不同的固定化抗原的一系列特异性抗体浓度。该方法基于这样的事实,即当检测到结合不同抗原的相同免疫球蛋白时,不是绝对要单独校准针对每种靶抗原的抗体响应,而是保持校准曲线相同,所述校准曲线仅仅用于检测到的每类免疫球蛋白。
软件工具支持的结果的解释
所述多参数免疫测量的应用将比基于正常的单参数的患者致敏谱的临床检查产生明显更多的测试结果。
因此,应用生物信息学工具将有助于解释并将结果可视化为一种格式,该格式允许医生更容易地查看数据并尽可能地获得最佳的诊断结论。对于软件辅助的演示或指导,必须将以下因素认为是相关的:
1)医学病症的一般分类,例如,基于概况,患者是否可能患有测试所检查的声称的疾病。
2)疾病的详细分类,例如指示疾病的状况或病因的相关参数或参数模式。
3)患者的风险分类,例如通过针对某些靶标的抗体响应水平,或针对靶标组合的抗体响应模式,或不存在针对某些靶标的保护性抗体,或针对不同的抗原靶标的不同抗体亚类的比例来区分患者。
4)患者治疗的结果,例如通过选择适当的药物、给予正确的建议来避免或甚至避免给予最有可能无效的药物。
用于临床解释的完整的组
高度多重免疫分析的主要优点是可以将所有相关的临床参数纳入单个测试中,这减轻了医生对每个单独患者预先选择测试的负担,并且在单个分析步骤中总是获得完整的临床检查。
盒设计以及与自动化相关的优点
本文还提供了盒,其包括用于本文所述的任何抗原阵列的测试室、用于液体废物的储液器以及任选地用于鉴定和校准的条形码。盒还可以包括储液器或集成的小瓶,其用于检测试剂(例如标记的抗体、标记的适配体或标记的亲和体)、信号产生试剂(例如酶底物)和终止溶液(例如蒸馏水、EDTA、NaOH、HCl等)中的任何一种或多种。在一些实施例中,盒还包括储液器或集成的小瓶,用于分析过程中使用的一种或多种对照样品(例如阳性和/或阴性对照)和/或一种或多种缓冲液(例如洗涤缓冲液、阻断缓冲液、稀释缓冲液)。在一些实施例中,阳性对照样品是商购获得的标准化样品,其具有确定量的免疫球蛋白(例如总IgG或IgE和/或对特定的抗原/过敏原特异性的确定的IgG或IgE)。在一些实施例中,阳性对照样品是这样的样品,其在相应的免疫球蛋白的标准分析中已经验证或测试为阳性。在一些实施例中,阴性对照样品是商购获得的不含任何免疫球蛋白的样品,或是在相应的免疫球蛋白的标准分析中已经验证或测试为阴性的样品。盒还可以提供这样的工具,用于轻轻移动测试室中的抗原阵列,或轻轻移动作为整体的测试室及放入其中的抗原阵列,以确保在孵育期间样品和缓冲液在阵列上均等分布以及彻底地清洗阵列。盒的尺寸取决于阵列的大小以及所用的试剂的类型和数量。优选地,尺寸为1cm×1cm×5cm至2cm×5cm×15cm。
可以通过几种方法之一将抗原阵列固定到盒中,包括通过切割至周围的精确尺寸进行的机械固定、在条带边缘处使用机械固定,或使用生物相容性的粘合剂,其在ELISA过程中也经历洗涤和孵育步骤。固定的重要方面是在盒中或盒与固相测试条带之间不产生间隙、区域或孔,否则孵育步骤期间在这些地方会发生非特异性结合,这可能无法通过有效的洗涤修正,因为在检测步骤中这将大大增加总体非特异性信号的产生,并因此降低了分析的峰值信噪比以及整体的分析性能。
同样重要的是对孵育和信号检测无位置影响的因素,例如本领域技术人员已知的。典型的偏差是所谓的边缘效应,其导致靠近阵列边界以及邻近盒周围的壁或小瓶的反应位点(点)明显地且再现地高于或低于阵列中间的那些。这种差异可由搅动或混合过程中液体的行为、选定位置处粘合剂的积聚或表面张力造成,或由更固定的边界包围的反应位点的动力学差异造成,因此与更中心且受边缘或壁抑制更少的那些位点相比,自由扩散更加受限。甚至空间的温度差异以及在检测中由容器几何形状引起的偏差也可以对观察到的差异起作用。一个实例是,使微阵列沉积在圆形微孔板中,中心的点与靠近板边界的点通常表现得大不相同。虽然一些制造商通过印刷“圆形阵列”或图案来克服这一限制,但是这当然会大大减少每个区域的可用面积和特征数量,不适用于在反应中进行数百个不同分析的真正的多参数分析。
本发明的盒设计提供了其他优点。几乎可以将盒当作试剂盒,盒可以容纳所需的所有液体和试剂,用于设计的容器中的测试程序。盒可以包括用于批次鉴定的条形码,甚至用于校准的校正因子等也可以储存在这种条形码中。
类似地,一组一次性塑料尖端可以装在盒中,移液器可以从盒中抓取方法所用的一次性塑料尖端并且在使用后将其重新注入盒中。以这种方式,不会引起周围的系统部件(例如液体处理部件)与潜在的传染性生物有害性液体接触,因为所有液体都通过设计的废物容器收集在盒本身中。因此,仪器无需任何特殊的清洁或消毒步骤。
由于盒可以捕获或甚至容纳测试程序所需的所有液体,因此基于这样的设计,设计分析自动化是可行的,以这样的方法,仅液体处理部件可以是排气移液器,其在仪器的正常预期使用寿命期间使用无需维护或更换任何阀门或管道的一次性尖端。这种几乎无需维护的仪器的总体开发成本及拥有成本远低于通常的自动免疫分析仪,自动免疫分析仪包括许多需要反复更换的可移动部件、阀门和管道。
在洗涤步骤期间,将盒简单地向一侧倾斜,使得所容纳的液体流入盒内的储液器,在储液器中收集液体并最终处理。
本文还提供了试剂盒,其包括本文所述的抗原阵列或盒、检测试剂、对照样品(例如阳性或阴性对照)、在分析期间使用的缓冲液以及使用说明书。试剂盒还可以包括信号产生试剂(例如用于酶的底物)以及任选地终止溶液(例如蒸馏水、EDTA、NaOH、HCl等)。在一些实施例中,试剂盒包括抗原阵列(例如过敏原阵列)、对IgE或IgG特异性的检测试剂(例如抗IgE或抗IgG抗体、对IgE或IgG特异性的适配体或亲和体,无论是直接标记还是与酶结合)、缓冲溶液(例如洗涤缓冲液、阻断缓冲液、稀释缓冲液)以及任选地信号产生试剂(例如酶底物)。在一些实施例中,试剂盒还包括终止溶液(例如蒸馏水、EDTA、NaOH、HCl等)。
本文还提供了一种装置,其包括用于一个或多个本文所述的盒的腔室、移液器和用于信号检测的设备(例如CCD照相机、CMOS照相机、激光扫描仪)。
本发明还包括以下项目:
1.一种抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组,其中每组包括:
(i)由一种检测抗原包覆的珠粒,或
(ii)由一组检测抗原包覆的珠粒,优选地,其中固体载体是片或板,并且其中检测抗原是过敏原、感染标志物或自身抗原。
2.根据项目1所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是由核酸和/或氨基酸形成的生物分子,优选地是蛋白质、肽、抗体或DNA分子,或有机或无机化合物。
3.根据项目1或2中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是过敏原。
4.根据项目1-3中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是感染标志物。
5.根据项目1-4中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是自身抗原。
6.根据项目1-5中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是通过重组DNA技术产生的抗原或从生物材料分离和纯化的抗原。
7.根据项目1-6中任一项所述的抗原阵列,其中所述一组检测抗原获得自含有一种以上抗原的生物源材料的提取物或裂解物。
8.根据项目1-7中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原包括单个表位、具有几个抗体结合表位的单个大分子,或多种蛋白质与包括多个表位的不同抗原的混合物。
9.根据项目1-8中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒是微米或纳米珠粒。
10.根据项目1-9中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒的直径为5-500nm,优选地为200-500nm。
11.根据项目1-10中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒是乳胶珠粒、聚合物塑料珠粒(优选聚苯乙烯珠粒)、由生物相容性聚合物制成的珠粒,或玻璃珠粒优选二氧化硅珠粒。
12.根据项目1-11中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒的表面是多孔或无孔的。
13.根据项目1-12中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原共价或非共价地偶联。
14.根据项目1或13中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原通过被动吸附与珠粒非共价偶联,优选通过疏水和/或静电附着。
15.根据项目1-14中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原通过抗原隔离物偶联。
16.根据项目1-15中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原以产生优选的方向的方式偶联,以呈现结合的抗原上的表位。
17.根据项目1-16中任一项所述的抗原阵列,其中所述固体载体是多孔或无孔材料的片或板,优选地为硝化纤维片,更优选地为层压的硝化纤维片。
18.根据项目1-17中任一项所述的抗原阵列,其包括相同或不同类型的珠粒。
19.根据项目1-18中任一项所述的抗原阵列,其中所述阵列包括至少25个不同的组。
20.根据项目1-19中任一项所述的抗原阵列,其中使用接触方法或非接触方法将抗原包覆的珠粒组固定在固体载体上,优选使用电磁分配系统。
21.根据项目1-20中任一项所述的抗原阵列,其中每组固定为矩形阵列或橙色阵列中的可寻址元件,优选地以1个可寻址元件/mm2的密度。
22.根据项目1-3以及6-21中任一项所述的抗原阵列,其中所述抗原包覆的珠粒是固定在固体载体上的过敏原包覆的珠粒,优选地,固体载体是片或板,其中每组包括:
(i)由一种过敏原包覆的珠粒,或
(ii)由一组过敏原(优选过敏原提取物)包覆的珠粒。
23.检测对检测抗原或一组检测抗原特异性的免疫球蛋白的方法,包括:
(i)提供根据项目1-22中任一项所述的抗原阵列,
(ii)将阵列与样品一起孵育,
(iii)将阵列与检测试剂一起孵育,
(iv)任选地将阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
24.根据项目23所述的方法,其中所述免疫球蛋白是与过敏相关的IgE抗体。
25.根据项目23所述的方法,其中所述免疫球蛋白是与感染或自身免疫反应相关的IgG抗体。
26.根据项目23-25中任一项所述的方法,其中所述样品是生物流体,优选来自受试者或受试者库的血清、全血或处理的血液、鼻液或尿液、细胞裂解物或组织匀浆。
27.根据项目23-26中任一项所述的方法,其中所述检测试剂是对免疫球蛋白特异性的亲和结合剂,优选抗体、适配体或亲和体。
28.根据项目23-27中任一项的方法,其中所述检测试剂是抗IgE抗体、IgE特异性适配体、IgE特异性亲和体、抗IgG抗体、IgG特异性适配体或IgG特异性亲和体。根据项目23-27中任一项所述的方法,其中所述检测试剂(i)直接标记有优选地有色或荧光化合物或金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒;或(ii)与酶结合。
29.根据项目23-28中任一项所述的方法,还包括将阵列与根据项目23的步骤(iv)的信号产生试剂一起孵育,其中所述检测试剂与酶结合,并且所述信号产生试剂包括所述酶的底物。
30.根据项目30所述的方法,还包括在步骤(iv)后将阵列与终止溶液一起孵育。
31.根据项目23-30中任一项所述的方法,用于检测与过敏相关的IgE抗体,包括,
(i)提供根据项目22所述的抗原阵列,
(ii)将阵列与样品一起孵育,
(iii)将阵列与检测试剂(例如抗IgE抗体或IgE特异性适配体或IgE特异性亲和体)一起孵育,
(iv)任选地将阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
32.一种盒,其包括用于项目1-22中任一项所述的抗原阵列的测试室、用于液体废物的储液器以及任选地条形码。
33.一种试剂盒,其包括根据项目1-22中任一项所述的抗原阵列、检测试剂、一种或多种缓冲液、一种或多种对照样品和用于在根据项目23-31中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的说明书,以及任选地信号产生试剂。
34.一种装置,其包括用于一个或多个根据项目32所述的盒的腔室、移液器和用于信号检测的设备。
实例
本文描述的实例是为了说明本发明,而非对本发明进行限制。已经根据本发明描述了本发明的不同实施例。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对本文描述和说明的技术进行许多修改和变化。
实例1:
材料和方法
过敏性源材料
过敏原从各种外部供应方购买或由内部生产。过敏原是过敏原提取物、纯化的天然过敏原或重组过敏原。根据供应商的建议或根据我们关于缓冲液和储存条件方面的内部经验处理过敏原。避免重复冷冻/解冻。对于以冻干形式运送的过敏原,根据制造商的说明进行重建。
过敏原与纳米颗粒偶联
聚苯乙烯纳米颗粒购自Polysciences Europe GmbH。根据制造商提供的建议将过敏原材料与颗粒偶联,但最终必须针对每种过敏原制剂进行优化。已经应用了多种不同的方法以获得最佳的偶联效率和生物活性。一些过敏原可以通过被动吸附偶联,结果令人满意,而许多过敏原需要特殊的偶联条件或共价偶联策略。为此,使用NH2或COOH表面改性的聚苯乙烯颗粒,以及同型或异型双功能交联剂。几种过敏原制剂必须以这样的方式进行处理,即首先将它们分成几个等分试样,然后通过不同的条件偶联,最后再次汇集在一起,以在功能测试期间代表完整的过敏原表位库。
被动吸附偶联(标准方案)
根据制造商的说明准备纳米颗粒。在与过敏原的等电点匹配的缓冲液中,将过敏原或过敏原提取物稀释至适当的偶联浓度,通常小于0.5mg/ml。将颗粒(1%固体)和过敏原于室温下在恒定的端到端(end-to-end)混合条件下孵育3小时。继续孵育而不进行混合,在2-8℃过夜。最后,通过在4℃以10000rpm离心15分钟沉淀颗粒,收集上清液并将珠粒悬浮在适当的缓冲液和防腐剂中,以持久地储存。
被动吸附偶联(高级方案)
与上述标准方案类似,但是分别使用至少3种不同的pH范围,通常在中性、酸性和碱性范围。在执行偶联方案后,在中性pH将颗粒汇集在一起。
COOH表面颗粒的化学偶联
将纳米颗粒稀释至合适的浓度,通常为1%固体,然后在活化缓冲液(例如pH 5-7.5的MES缓冲液)中洗涤3x,在洗涤步骤之间沉淀以及悬浮。为了活化,用水溶性碳二亚胺(例如,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)活化含有表面COOH基团的颗粒15-30分钟。活化后,颗粒在活化缓冲液中再洗涤两次。将蛋白质在不含任何游离NH2基团的偶联缓冲液中稀释至一浓度,该浓度通常通过滴定实验优化。将活化的颗粒和蛋白质溶液在室温下孵育至少3小时或在2-8℃下孵育过夜。最后,如上所述通过离心沉淀颗粒,并悬浮在含有防腐剂的储存缓冲液中,以待使用。
NH2表面颗粒的化学偶联
使用与如上所述的方案非常类似的方案,区别在于使用氨基反应性试剂,例如戊二醛或琥珀酰亚胺化学品(例如EGS)交联剂来活化纳米颗粒上的NH2基团。因此,必须调整缓冲液和pH值以优化所应用的每种化学品的偶联效率。并非在所有情况下,理论上最佳的pH值都能得到所需的最佳偶联效率,相反,通过查看蛋白质的理论性质不会选择的pH值能得到所需的最佳偶联效率。
评估偶联效率
使用直接和间接方法测量偶联效率。在偶联前后,测量溶液中的蛋白质浓度。偶联后溶液中蛋白质消耗的程度是蛋白质结合的良好指标,但不是生物活性的良好指标。另外,使用供应商描述的方法将蛋白质从偶联的珠粒上剥离以获得从珠粒上剥离的蛋白质。还使用浓度测量以及变性SDS凝胶电泳和用考马斯蓝染色来表征那些剥离的蛋白质制剂。
为了最终评估偶联的过敏原的生物活性,使用标准分析和分析程序(见下文)进行功能测量,测试每种过敏原制剂的特异性阳性血清。用于测试的参数是:阻断15分钟,与1∶5稀释的血清样品一起孵育2小时,检测抗体孵育30分钟。
将过敏原颗粒分配到固相
硝化纤维膜购自GE Healthcare和Pall Europe。评估了多种不同的膜类型,这些膜在孔径、流速或基质材料方面有不同的性质。
使用优化的设置进行移动、抽吸、分配和洗涤周期,用Biodot AD1520仪器进行分配。每种过敏原制剂以至少20纳升的体积沉积在固相上,中心至中心间距为1mm。最终阵列的几何形状通常为10列和25行。
分配后,将硝化纤维(NC)片密封并储存在2-8℃,以待进一步处理。在分析之前,将NC片切割成合适的尺寸,并将含有测试阵列的小晕影(small vignette)放入分析盒中。
标准分析程序
产生包含250种不同特征的测试阵列,将其最初在含有高浓度的非过敏性蛋白的缓冲液中阻断非特异性结合,并同时轻轻摇动阵列容器盒。
在工艺步骤之间,使用pH 7.4的Tris缓冲盐水进行洗涤且0.2%吐温-20(TBS-T)作为洗涤剂。
阻断后,将阵列与患者的血清或血浆一起孵育,并恒定地轻轻摇动至少15分钟。弃去血清并在温和的搅拌下用TBS-T洗涤阵列数次。
洗涤周期后,将阵列与稀释的抗人IgE抗体一起孵育,该抗体标记有碱性磷酸酶(AP)。然后弃去抗体,并用TBS-T洗去剩余的未结合的抗体数次。
最后,将阵列与BCIP/NBT显色底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/硝基蓝四唑)一起孵育几分钟,直至达到足够的灵敏度,然后停止反应并洗去剩余的底物。
干燥阵列,然后扫描或成像。以24位彩色图像成像并转换为16位灰度数据。
分析
通过计算中值强度并从特征值中减去局部背景来量化每个圆形特征。信噪比>2认为是阳性信号。
通过固定的纯化人IgE的标准曲线对阵列进行归一化,所述纯化人IgE与过敏原制剂一起点样。此外,使用异源校准针对参比样品用多个阳性测试结果来校准归一化值。
实例2:
使用实例1所述的材料和方法,产生包括245组抗原包覆的珠粒的抗原阵列。对于此处所示的数据,仅发现被动吸附的过敏原。使用汇集的人样品(来自若干过敏受试者)对245种过敏原和5种IgE标准物的特异性IgE测试如图1A所示。没有显著水平的特异性IgE的对应阴性样品如图1B所示。抗原组的布局如图1C所示。抗原组之间的间隔在x和y方向上为1mm。
实例3a:
通过与参比方法比较进行测试评估
用实例1所公开方法对总共137个患者样品(患者数在表3中列为n)进行测试。按1∶5稀释患者样品用于测试,并应用标准分析程序。对于数据比较,将获得的结果与可利用的参比数据进行比较,参比数据使用不同版本的ImmunoCAP ISAC测试(Thermo Fisher,Uppsala,Sweden)产生。在参比分析中测试为阳性或阴性的患者样品在表3中分别表示为“阳性(pos)”或“阴性(neg)”。对于数据比较,使用Medcal Version 16.1创建ROC统计(响应运算符曲线(Response Operator Curve))。为此,在ImmunoCAP ISAC测试中,认为高于制造商截止值的任何抗原特异性结果是真阳性(=1),否则为真阴性(=0)。统计评估的输出为:曲线下的面积AUC(完全相关=1,不相关=0)、分析灵敏度、分析特异性。总共有3619个测量结果,其中692个阳性结果和2927个阴性结果考虑在内。结果总结于下表3中。还显示了平均灵敏度和特异性,分别为99%和95%,由此,可以通过新方法更高的灵敏度来解释降低的特异性,新方法比参比产生更多的阳性测量结果。
表3:用来自ImmunoCAP ISAC的参比数据进行ROC分析
实例3b:
通过与参比方法比较进行测试评估
用实例1所公开的方法对220个患者样品进行测试。过敏原被动吸附或化学偶联,例如,使用不同的化学连接剂。按1∶5稀释患者样品用于测试,并应用标准分析程序。对于数据比较,将获得的结果与可利用的参比数据进行比较,参比数据使用不同版本的ImmunoCAPISAC测试(Thermo Fisher,Uppsala,Sweden)产生。对于所选过敏原的灵敏度、特异性和r2相关性如图2所示。使用MedCalc评估灵敏度和特异性,与参比数据(使用制造商方案进行测试和截止值0.3ISU)对照。使用Microsoft Excel对测量结果进行线性回归分析。总共779个阳性结果和2772个阴性结果考虑在内。
实例4:
信号放大
在两种不同条件下,将来自乳液和蛋的12种过敏原提取物或分子过敏原固定在固相载体材料上(硝化纤维Protran,0.2μm,GE Healthcare)。第一种条件是将过敏原蛋白直接与固相偶联,如制造商对蛋白质印迹步骤所述的那样。第二种是在中性pH条件下,12种过敏原首先通过被动吸附与350nm大小的聚苯乙烯纳米颗粒偶联,而不进一步优化在实例1的材料和方法中所述的偶联条件。
然后,测试对乳液和蛋过敏的20个患者的血清对12种蛋白质的特异性IgE。从每种直接固定的蛋白质制剂或每种固定的颗粒偶联的抗原获得过敏原特异性信号(表5显示了所有20个血清的原始数据),将获得的所有20个血清的过敏原特异性信号求平均值,比较每种过敏原的两个总结值,并且计算这些值之间的因子。结果列于表4和图3中。
表4:直接固定或作为颗粒偶联的制剂固定的12种过敏原的总结结果。显示了原始强度测量数据,未校准。与未与颗粒偶联的过敏原相比,当过敏原与颗粒偶联时,平均信号放大将近8倍,因子(factor)为将近2-17。结果在图3中以图形表示。
过敏原 | 直接 | 与颗粒偶联 | 因子(x) |
黄牛[乳液] | 226308 | 685342 | 3,03 |
黄牛4 | 29706 | 98222 | 3,31 |
黄牛5 | 50009 | 278392 | 5,57 |
黄牛6 | 7291 | 127222 | 17,45 |
黄牛8 | 151474 | 606300 | 4,00 |
黄牛LF | 80338 | 342786 | 4,27 |
家鸡[蛋白] | 40472 | 77736 | 1,92 |
家鸡[蛋黄] | 29165 | 75288 | 2,58 |
家鸡1 | 14947 | 179650 | 12,02 |
家鸡2 | 2702 | 28958 | 10,72 |
家鸡3 | 5169 | 82668 | 15,99 |
家鸡4 | 5533 | 61884 | 11,18 |
表5:来自信号放大实例的详细的原始测量数据
实例5:
在功能分析中不同偶联条件对特异性IgE响应的影响
用对水蜜桃3(Pru p 3)阳性的8种不同样品进行了特异性IgE测试,水蜜桃3是来自桃子的主要过敏原(图4)。测试一个阴性样品作为对照。使用几种不同的方法偶联水蜜桃3,包括三种不同的共价偶联方法(条件1-3)。被动蛋白质吸附根本不起作用,仅通过被动吸附,蛋白质几乎没有与纳米颗粒结合(结果未显示)。根据偶联效率分析,在不同的共价偶联方法之间没有观察到太大的差异。然而,当测试一系列血清并将结果与来自Thermofisher,Uppsala,Sweden的参比方法ImmunoCAP 100进行比较时,功能分析揭示了偶联的过敏原的生物活性的主要差异。
根据测试的血清,可以在各种方法和偶联方法的结果之间观察到明显的差异。潜在的解释是,取决于血清具有针对哪种表位特异性IgE,某种偶联方法或分析方法使相应的表位呈现出更多或更少的活性构象。
这些值不能直接比较,因为每种方法产生的结果的单位不同,然而内部校准的结果相似。
实例6:
患者的案例研究揭示了其他致敏性
患者在一个有猫的朋友家过夜时,在夜间发生了两次哮喘后,去了一家当地的过敏诊所。之前已知患者对草和桦树过敏,但之前没有出现任何呼吸问题。在过敏诊所中,使用Immuno CAP方法获得的结果如下表6所示(参比IC),并与本文所述的方法(表6中称为“FABER”)进行比较。表6还显示了患者对所选过敏原的皮肤点刺试验(SPT)和观察到的症状的结果。
本文所述的方法和参比方法ImmunoCAP之间的体外结果的定性相关性(阳性或阴性)通常很高。可假设一些商购获得的过敏原提取物(例如疣皮桦(Bet v)、豚草(Amb a))含有的过敏原的量不足,因为获得的值最初低于参比方法。然而,在总结分子测试结果时,在我们的方法(疣皮桦1.0101+疣皮桦2.0101)和ImmunoCAP之间可以获得非常相似的结果。
患者的皮肤点刺试验(SPT)对猫是阴性的。用猫过敏原提取物进行皮肤试验以及ImmunoCAP系统的IVD测试。两项测试均表现不佳,在SPT中为阴性而在ImmunoCAP测试中为中等阳性。过敏原提取物的普遍问题是,混合物中存在的过敏原的确切性质不清楚,以及在提取或储存期间过敏原可能发生降解。我们的测试形式对商购获得的猫提取物显现出相对较低的结果,但是对重组纯猫过敏原家猫1(Fel d 1)显示出非常高的阳性结果。临床医生不太可能基于阴性SPT测试结果轻易地排除这样的高阳性体外结果。
已发现另外的致敏性,其中一些不能通过过敏原交叉反应性来解释,因此可以认为是潜在相关的,例如针对虾和小蠊。例如,发现高度相关的PR10型过敏原(疣皮桦1同源性)是阳性的,包括:疣皮桦1.0101(Bet v 1.0101)、苹果1.0108(Mal d 1.0108)、欧洲榛1.0103(Cor a 1.0103);发现肌动蛋白(在物种之间也是高度保守的)是阳性的:花生8.0101(Ara h 8.0101)、疣皮桦2.0101(Bet v 2.0101)、橡胶树8(Hev b 8)、法国山靛1(Mer a 1);许多动物上皮细胞或动物来源的乳液或肉蛋白也可以通过动物物种之间的交叉反应性来解释。
另一方面,通过任何参考测试都没有发现此类过敏原,例如来自小蠊的德国小蠊1(Bla g1)或来自虾的斑节对虾1(Pen m 1),并且可以认为是真正的致敏性,不能通过与其他阳性测试结果的交叉反应性来解释。因此,可以进一步研究这些蛋白质的临床相关性。
表6:“患者A”指FABER诊断系统
过敏原 | 名称 | 患者A | 参考IC | SpT | 症状 |
链格孢1 | 链格孢 | 6,66 | 1,97 | 阳性 | ? |
豚草[花粉] | 豚草 | 0 | 3,58 | 阴性 | |
凤梨2 | CCD标记物 | 1,32 | |||
花生8.0101 | 肌动蛋白,花生 | 2,9 | |||
辣根 | CCD标记物 | 1,08 | |||
艾草[花粉] | 艾草 | 0 | 4,03 | 阴性 | |
疣皮桦[花粉] | 桦树 | 1,04 | 60 | 阳性 | 阳性 |
疣皮桦1.0101 | 桦树 | 17,09 | |||
疣皮桦2.0101 | 桦树 | 18,85 | |||
德国小蠊1 | 小蠊 | 1,24 | ? | ||
黄牛[乳液] | 乳液,奶牛 | 1,64 | |||
家犬[上皮细胞] | 狗 | 3,37 | 0,38 | 阴性 | ? |
欧洲榛1.0103 | 榛树 | 10,06 | NA | + | ? |
原仓鼠 | 兔 | 2,96 | 阴性 | ||
日本柳杉 | 西洋杉 | 1,39 | |||
粉尘螨2 | 螨虫 | 108 | 0,02 | 阴性 | ? |
野驴[乳液] | 乳液,驴 | 3,23 | |||
家猫 | 猫 | 1,89 | 3,34 | 阴性 | 阳性 |
家猫1 | 猫 | 40,88 | |||
橡胶树8 | 肌动蛋白,乳胶 | 7,05 | |||
黑麦草[花粉] | 草 | 62,06 | |||
黑麦草1 | 草 | 46,21 | |||
苹果1.0108 | 苹果 | 7,32 | |||
法国山靛1 | 肌动蛋白,向日葵 | 9,52 | |||
小鼠[上皮细胞] | 小鼠 | 3,11 | |||
油橄榄2 | 橄榄树 | 5,3 | |||
家兔[上皮细胞] | 仓鼠 | 3,94 | |||
绵羊[肉] | 肉,绵羊 | 2,34 | |||
绵羊[乳液] | 乳液,绵羊 | 1,07 | |||
绵羊6 | 草 | 1,4 | |||
猫尾草 | 草 | 51,77 | 76,1 | 阳性 | 阳性 |
猫尾草1.0102 | 草 | 50,38 | |||
猫尾草5.0101 | 草 | 53,09 | |||
猫尾草6.0101 | 草 | 10,16 | |||
英国梧桐 | 英国梧桐 | 1,81 | |||
大白鼠[上皮细胞] | 大鼠 | 4,15 | |||
斑节对虾1 | 虾 | 0,38 |
实例7:
与参比方法进行测试比较
使用本文所述的抗原阵列(参见实例1和2)并使用ImmunoCAP ISAC测试(ThermoFisher Uppsala,Sweden)作为参比方法测试了83个样品。在图5中比较了两种测试的技术规格。
在实例1和2所述的抗原阵列中测试了总共245种过敏原,而在参比方法中测试了112种过敏原,两种测试之间有70种过敏原重叠。这些过敏原的结果在两种测试之间直接比较(相同的),相关性很好,显示出76%Pearson相关性。对于这些重叠的过敏原,在参比方法中获得了1057个阳性结果,而用本文所述的方法获得了1159个阳性结果,相当于增加了约10%(9.65%),表明本方法的灵敏度增加。
此外,用参比方法总共获得了2508个阳性测试结果,而用本方法总共获得了4740个阳性结果。因此,本文所述的抗原阵列鉴别了更多的致敏性,即增加了89%,进一步表明本发明的抗原阵列/方法与参比阵列/方法相比具有更高的灵敏度。结果总结在表7中。
表7:测试比较的总结
总结参比方法对比 | |
#测试的样品 | 83 |
参比方法 | ImmunoCAP ISAC 112slgE |
#参考过敏原 | 112 |
#测试的过敏原 | 245 |
#重叠的(相同的)过敏原 | 70 |
#直接比较的结果 | 5810 |
#用参比方法获得的阳性测试结果 | 2508 |
#用新方法获得的阳性测试结果 | 4740 |
#参比方法重叠的过敏原的阳性结果 | 1057 |
#新方法重叠的过敏原的阳性结果 | 1159 |
用新方法检测的额外的致敏性百分比 | 89,00% |
用新方法检测的额外致敏性百分比,重叠的过敏原 | 9,65% |
新方法vs参比方法的平均Pearsson相关性 | 0,76 |
新方法vs参比方法的最大Pearsson相关性 | 0,99 |
实例8:
过敏原偶联的珠粒的稳定性
如实例1所述制备过敏原偶联的珠粒,并在第0天生产过敏原阵列。使用相同的过敏原偶联的珠粒制剂,在330天的时间内产生几个其他抗原阵列(约40个)。在此期间将抗原偶联的珠粒储存于2-8℃,除了用于产生过敏原阵列时,此时将它们在室温下保持约30分钟。
在第0天时,用第0天生产的过敏原阵列测试相同的样品,然后在第330天时,用第330天生产的过敏原阵列再次测试相同的样品。两种测试的结果和变异系数(CV)如表8所示。图5显示了第0天和第330天的结果。
这些数据表明过敏原包覆的珠粒极高的稳定性以及方法的重现性。
表8:比较第0天和第330天的测试结果
实例9:
优化提取以制备过敏原包覆的珠粒
桦树花粉购买自供应商,并通过本领域技术人员已知的方法制备过敏原提取物,基本上为在生理缓冲液中于限定的条件和时间搅拌。使用4种不同的pH和盐条件,通过被动偶联使桦树花粉提取物与纳米颗粒偶联。如数据所示(表9),基于患者的分子谱(例如,患者的血清中具有对哪种分子过敏原特异性的抗体),不同的pH值给出不同的sIgE定量。这表明结合不同的pH条件保留了提取物的分子表位谱,并导致更准确和更灵敏的测量。
此外,通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步处理桦树提取物。收集代表原始提取物确定的分子量范围的各个级分(fraction),并使用单一条件与纳米颗粒偶联。如所预期的,根据分子识别模式,根据患者的分子致敏性模式获得了甚至更加显著的测量结果。例如,在所有级分中,样品1显示出相当水平的特异性IgE,而样品2对级分1显示出低sIgE水平,但对级分3显示出高sIgE水平,而样品3对级分1具有最高的sIgE水平。组合各个级分并进一步优化每个级分的pH偶联条件将导致比参比方法更高的分析灵敏度。
表9:
Claims (21)
1.一种抗原阵列,其包括固定在固体载体上的抗原包覆的珠粒组,其中每组包括:
(i)由一种检测抗原包覆的珠粒,或
(ii)由一组检测抗原包覆的珠粒,以及其中所述固体载体是片或板,并且所述检测抗原是过敏原、感染标志物或自身抗原。
2.根据权利要求1所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是由核酸和/或氨基酸形成的生物分子,优选蛋白质、肽、抗体或DNA分子,或有机或无机化合物。
3.根据权利要求1或2所述的抗原阵列,其中所述检测抗原是通过重组DNA技术产生的抗原或从生物材料分离和纯化的抗原。
4.根据权利要求1或2所述的抗原阵列,其中所述一组检测抗原获得自含有一种以上抗原的生物源材料的提取物或裂解物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒是微米珠粒或纳米珠粒,优选地其中所述珠粒的直径为5-500nm,优选地直径为200-500nm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒是乳胶珠粒;聚合物塑料珠粒,优选聚苯乙烯珠粒;由生物相容性聚合物制成的珠粒,或玻璃珠粒,优选二氧化硅珠粒。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗原阵列,其中所述检测抗原共价或非共价地偶联,优选通过被动吸附。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗原阵列,其中所述固体载体是多孔或无孔材料的片或板,优选地为硝化纤维片,更优选地为层压的硝化纤维片。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗原阵列,其中所述阵列包括至少25个不同的组,优选地,其中每个组被固定为矩形阵列或橙色阵列中的可寻址元件,任选地以1个可寻址元件/mm2的密度。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗原阵列,其中所述珠粒是相同或不同的类型。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗原阵列,其中所述抗原包覆的珠粒是过敏原包覆的珠粒,并且每组过敏原包覆的珠粒包括:
(i)由一种过敏原包覆的珠粒,或
(ii)由一组过敏原包覆的珠粒,优选用过敏原提取物包覆的珠粒。
12.检测对检测抗原或一组检测抗原特异性的免疫球蛋白的方法,包括:
(i)提供根据权利要求1-11中任一项所述的抗原阵列,
(ii)将所述阵列与样品一起孵育,
(iii)将所述阵列与检测试剂一起孵育,
(iv)任选地将所述阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述免疫球蛋白是与过敏相关的IgE抗体或与感染或自身免疫疾病相关的IgG抗体。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述样品是生物流体,优选来自受试者或受试者库的血清、全血或处理的血液、鼻液或尿液、细胞裂解物或组织匀浆。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法,其中所述检测试剂是对免疫球蛋白特异性的亲和结合剂,优选抗体、适配体或亲和体,任选地其中所述检测试剂(i)直接标记有优选地有色或荧光化合物或金纳米颗粒或有色乳胶纳米颗粒;或(ii)与酶结合。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法,还包括将所述抗原阵列与根据权利要求12的步骤(iv)的信号产生试剂一起孵育,其中所述检测试剂与酶结合,并且所述信号产生试剂包括所述酶的底物。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法,还包括在权利要求12的步骤(iv)之后将所述抗原阵列与终止溶液一起孵育。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法,其中所述免疫球蛋白是与过敏相关的IgE抗体,所述方法包括:
(i)提供根据权利要求11所述的抗原阵列,
(ii)将所述阵列与样品一起孵育,
(iii)将所述阵列与检测试剂一起孵育,检测试剂优选IgE特异性抗体或IgE特异性适配体,
(iv)任选地将所述阵列与信号产生试剂一起孵育,和
(v)测量可检测的信号。
19.一种盒,其包括用于权利要求1-11中任一项所述的抗原阵列的测试室、用于液体废物的储液器以及任选地条形码。
20.一种试剂盒,其包括根据权利要求1-11中任一项的抗原阵列、检测试剂、一种或多种缓冲液、一种或多种对照样品和用于在根据权利要求10-13中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的说明书,以及任选地信号产生试剂。
21.一种装置,其包括用于一个或多个根据权利要求19所述的盒的腔室、移液器和用于信号检测的设备。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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