CN114167050A - C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法 - Google Patents

C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法，属于过敏体外检测装置技术领域，本发明的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，包括抗原和聚苯乙烯酶标板以及连接抗原和酶标板的桥接分子，所述桥接分子为大分子聚氨基酸，所述聚苯乙烯酶标板为带有羧基的改性酶标板，所述抗原为青霉素类或头孢菌素类抗生素，大分子聚氨基酸通过其氨基与改性酶标板的羧基化学连接，青霉素类或头孢菌素类抗生素通过其氨基与大分子聚氨基酸的羧基相连。本发明提供的检测板在抗原抗体结合后，通过强力洗涤，能将吸附在酶标板上的其他蛋白质洗脱，进而避免其他蛋白质对检测结果造成干扰。

Description

C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其 制备方法
技术领域
本发明属于过敏原体外检测装置技术领域，具体涉及一种C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法。
背景技术
青霉素类和与头孢菌素类抗生素在临床使用中应用广泛，但是其过敏反应时常发生，容易发生休克，甚至危及生命。
皮试是现行青霉素类和与头孢菌素类抗生素过敏测试的“金标准”。大量临床验证显示，青霉素过敏与皮试阳性呈高度的相关性，然而是非常复杂的关系——部分皮试阳性病史的人，在未来并不对青霉素和类与头孢菌素类抗生素过敏；皮试阴性的人，也不能完全排除因位置原因出现过敏的可能。根据用药指南，皮试测试3天后，应当进行一次复测，从而提高过敏检测的准确率，然而反复皮试也存在风险，导致更严重的过敏反应，影响病人的健康；所以临床实践中为保护病人，不会冒着过敏风险再次皮试；现行做法通常是只要皮试呈阳性，即认为病人对青霉素和类与头孢菌素类抗生素过敏，从而无法进行精准判断。另一方面，临床工作复杂繁忙，而皮试主要依赖于临床工作人员手工劳动，每例皮试需20-30分钟且要严格控制观察时间，费时耗力。第三，皮肤神经末梢敏感，且皮试药物注射到皮肤内，容易到导致患者的不适感。
青霉素和头孢菌素过敏多数是因为体内存在抗青霉素和抗头孢菌素的抗体；为此，体外检测青霉素和头孢菌素抗体是一种比较好的选择。乔海林在《青霉素过敏病人特异性IgE和IgG抗体、相关细胞因子及其基因多态性》一文中，采用RAST法(放射过敏原吸附试验)对650例过敏病人血清中的8种抗原对应的特异性IgE抗体，8种抗原的特异性IgE抗体阳性检出率总计为55.69％，且皮试反应程度越高，阳性检出率越高；采用ELISA法(酶联免疫吸附剂测定法)检测249例过敏病人的8种特异性IgG，阳性检出率总计为58.63％。血液特异性IgE和IgG抗体同时检测，阳性检出率84.74％。证明特异性IgE抗体与特异性抗体IgG均参与了过敏反应，只要能同时检测出特异性IgE抗体与特异性抗体IgG，即可提高过敏诊断阳性率，因此，体外血液特异性抗体检测是切实可行的方案，也是避免再次皮试检测的唯一方案。
现行体外血检测方法通常为RAST法或ELISA法，其中ELISA法是能实现一次性检测多种抗原过敏的方法，乔海林在《青霉素过敏病人特异性IgE和IgG抗体、相关细胞因子及其基因多态性》一文中采用的ELISA法，先将抗原与人血清白蛋白(HSA)结合，然后利用酶标板对蛋白的吸附作用，将连接人血清白蛋白的抗原附着于酶标板上，制成抗原-HSA-酶标板，随后在抗原-HSA-酶标板上加入抗体反应，使得抗体与抗原通过氢键和空间构象结合在一起，洗板后加入显色剂湿敷，然后利用酶标仪测OD值，即可完成检测。该方法制备的抗原-HSA-酶标板，HSA与聚苯乙烯材质的酶标板之间是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与酶标板表面的疏水基团间的作用于，但是这种物理吸附是非特异性的，也就意味着检测物质中如果含有目标抗体以外的蛋白质，也会被酶标板吸附，而不仅仅是发生抗原和特异性抗体的结合，因此在特异性上，目标抗体以外的大分子蛋白质会对实验结果产生干扰，从而影响实验准确性；在极端条件下，比如强酸强碱，白蛋白容易变性，导致抗原脱落；此外HSA价格昂贵，每克单价在上千元，难以实现大规模推广使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法，以解决现有技术制备的检测板因目标抗体以外的大分子蛋白质会对实验结果产生干扰造成的实验准确性以及价格过于昂贵的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，包括抗原和聚苯乙烯酶标板以及连接抗原和酶标板的桥接分子，所述桥接分子为大分子聚氨基酸，所述聚苯乙烯酶标板为带有羧基的改性酶标板，所述抗原为青霉素类或头孢菌素类抗生素，大分子聚氨基酸通过其氨基与改性酶标板的羧基化学连接，青霉素类或头孢菌素类抗生素通过其氨基与大分子聚氨基酸的羧基相连。
作为优选地，所述大分子聚氨基酸为聚谷氨酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸以及8-氨基辛酸中的一种。
作为优选地，所述改性酶标板的改性方法为：以普通聚苯乙烯酶标板为反应基板，采用傅克酰基化反应，以邻苯二甲酸酐、苯均四酸二酐、偏苯三酸酐、四氢邻苯二甲酸酐中的一种酸酐为酰基化试剂，以体积比10∶1的无水二氯甲烷/硝基苯混溶液为溶剂，以三氯化铝为催化剂，反应前，将震荡箱做无水化干燥并放置干燥剂，干燥环境下将溶剂、酸酐、三氯化铝置于酶标板的孔洞中，贴膜封存后将酶标板放置在震荡箱内，室温反应10～15h，将酶标板取出，洗去多余物质并干燥即可得羧基型酶标板。
作为优选地，所述改性酶标板的改性方法为：以普通聚苯乙烯酶标板为反应基板，采用等离子发生器将含有羧基的物质喷涂在酶标板的孔洞表面。
C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，包括如下步骤：
(1)先将大分子聚氨基酸的羧基进行保护；
(2)然后将带羧基保护基团的大分子聚氨基酸投入带有羧基的改性酶标板板孔中，加入有机溶剂和缩合剂，使得大分子聚氨基酸的氨基与改性酶标板的羧基进行酰胺缩合反应；
(3)洗去反应残留物，脱去大分子聚氨基酸的羧基保护基团，将青霉素类或头孢菌素类抗生素投入改性酶标板板孔中，加入有机溶剂和缩合剂，使得青霉素类或头孢菌素类抗生素的氨基与大分子聚氨基酸的羧基进行酰胺缩合反应，洗去反应残留物。
更优地，步骤(1)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护过程为：将大分子聚氨基酸溶解于过量的乙醇水溶液中，加入磷酸、芳基磺酸、烷基硫酸酯和酸性离子交换树脂中的一种作为催化剂，并加入几滴稀硫酸使得溶液呈酸性，加热至100～150℃反应3h左右，反应结束后，分离得到带有羧基保护基团的大分子聚氨基酸。
进一步地，步骤(3)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护基团脱去操作：向酶标板板孔中加入加入5～10％的稀硫酸，于60～80℃温度下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板。
进一步地，步骤(3)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护基团脱去操作：向酶标板板孔中加入3～5ml水解酯键的GDSL脂肪酶溶液，于室温下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板。
进一步地，步骤(2)中的酰胺缩合反应，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温反应过夜，洗涤多余物质并干燥酶标板。
进一步地，步骤(3)中的酰胺缩合反应，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温反应过夜，洗涤多余物质并干燥酶标板。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过大分子聚氨基酸将抗原和酶标板键接在一起，相较于现有技术的吸附作用，连接更为稳固；抗体作为一种生物大分子，其与抗原的结合容易受到空间位阻的影响，大分子聚氨基酸的引入，增加了抗原与抗体结合的空间，有利于抗原和抗体的结合；
2、本发明提供的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，在抗原抗体结合后，通过强力洗涤，能将吸附在酶标板上的其他蛋白质洗脱，进而避免其他蛋白质对检测结果造成干扰；
3、本发明提供的固相矩阵，能一次性检测对多种青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体的反应装置，检测效率高；
4、本发明提供的C型固相矩阵，与N型固相矩阵相互印证，减少漏检、误检。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
制备本发明提供的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵：
(1)外购羧基型ELISA板，以聚谷氨酸为大分子聚氨基酸；
(2)将聚谷氨酸溶解于过量的乙醇水溶液中，加入酸性离子交换树脂作为催化剂，并加入几滴稀硫酸使得溶液呈酸性，加热至100～150℃反应3h，反应结束后，分离得到带有羧基保护基团(聚谷氨酸-乙酯)的聚谷氨酸；
(3)将聚谷氨酸(聚谷氨酸-乙酯)，投入带有羧基的改性酶标板板孔中，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温震荡反应过夜，洗涤多余物质并干燥酶标板；
(4)向酶标板板孔中加入5～10％的稀硫酸，于60～80℃温度下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板；
(5)将青霉素类或头孢菌素类抗生素投入改性酶标板板孔中，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温震荡反应过夜，洗涤多余物质并干燥即得到抗体检测的固相矩阵。
实施例2
将聚谷氨酸替换为6-氨基己酸，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
将聚谷氨酸替换为8-氨基辛酸，其余步骤与实施例1相同。
实施例4
将羧基型ELISA板替换为普通ELISA板，在投入反应前，采用傅克酰基化反应，以邻苯二甲酸酐为酰基化试剂，以体积比10∶1的无水二氯甲烷/硝基苯混溶液为溶剂，以三氯化铝为催化剂，反应前，将震荡箱做无水化干燥并放置干燥剂，干燥环境下将溶剂、邻苯二甲酸酐、三氯化铝置于酶标板的孔洞中，贴膜封存后将酶标板放置在震荡箱内，室温反应12h，将酶标板取出，洗去多余物质并干燥即可得羧基型酶标板。采用块组自制改性酶标板，进行和实施例1相同的操作步骤，得到3块抗体检测的固相矩阵。
实施例5
将步骤4脱保护修改为：取GDSL脂肪酶，配置1g/ml的水溶液，向酶标板板孔中加入3～5ml水解酯键的脂肪酶溶液，于室温下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板。其余步骤与实施例1相同。
对比例1
取用外购羧基型ELISA板，将青霉素类或头孢菌素类抗生素投入改性酶标板板孔中，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温震荡反应过夜，洗涤多余物质并干燥即得到抗体检测的固相矩阵。
对比例2
取用普通酶标板，先将抗原与人血清白蛋白(HSA)结合，然后利用酶标板对蛋白的吸附作用，将连接人血清白蛋白的抗原附着于酶标板上，制成抗原-HSA-酶标板。
实验例
配置目标抗体溶液A、人血清白蛋白溶液B、目标抗体与人血清白蛋白1:1比例的混合溶液C，三者蛋白质浓度一致。
实施例1～5以及对比例1～2制备的板各取三块，将溶液A、B、C分别加入同一批次板中，震荡反应半小时，使得抗体与抗原通过氢键和空间构象结合在一起，洗板后加入显色剂湿敷，然后利用酶标仪测OD值，测得的OD值如下表(空白不洗板：将溶液A、B、C分别加入普通的聚苯乙烯酶标板孔洞中，自然风干后加入显色剂湿敷，然后利用酶标仪测OD值)：
Figure BDA0003401034520000051
由上表可知，实施例1～5的数据相对于对比例1～2而言，在特异性上和准确度上更可信。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，包括抗原和聚苯乙烯酶标板以及连接抗原和酶标板的桥接分子，其特征在于，所述桥接分子为大分子聚氨基酸，所述聚苯乙烯酶标板为带有羧基的改性酶标板，所述抗原为青霉素类或头孢菌素类抗生素，大分子聚氨基酸通过其氨基与改性酶标板的羧基化学连接，青霉素类或头孢菌素类抗生素通过其氨基与大分子聚氨基酸的羧基相连。
2.如权利要求1所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，其特征在于，所述大分子聚氨基酸为聚谷氨酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸以及8-氨基辛酸中的一种。
3.如权利要求1所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，其特征在于，所述改性酶标板的改性方法为：以普通聚苯乙烯酶标板为反应基板，采用傅克酰基化反应，以邻苯二甲酸酐、苯均四酸二酐、偏苯三酸酐、四氢邻苯二甲酸酐中的一种酸酐为酰基化试剂，以体积比10∶1的无水二氯甲烷/硝基苯混溶液为溶剂，以三氯化铝为催化剂，反应前，将震荡箱做无水化干燥并放置干燥剂，干燥环境下将溶剂、酸酐、三氯化铝置于酶标板的孔洞中，贴膜封存后将酶标板放置在震荡箱内，室温反应10～15h，将酶标板取出，洗去多余物质并干燥即可得羧基型酶标板。
4.如权利要求1所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵，其特征在于，所述改性酶标板的改性方法为：以普通聚苯乙烯酶标板为反应基板，采用等离子发生器将含有羧基的物质喷涂在酶标板的孔洞表面。
5.如权利要求1～4任意一项所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)先将大分子聚氨基酸的羧基进行保护；
(2)然后将带羧基保护基团的大分子聚氨基酸投入带有羧基的改性酶标板板孔中，加入有机溶剂和缩合剂，使得大分子聚氨基酸的氨基与改性酶标板的羧基进行酰胺缩合反应；
(3)洗去反应残留物，脱去大分子聚氨基酸的羧基保护基团，将青霉素类或头孢菌素类抗生素投入改性酶标板板孔中，加入有机溶剂和缩合剂，使得青霉素类或头孢菌素类抗生素的氨基与大分子聚氨基酸的羧基进行酰胺缩合反应，洗去反应残留物。
6.如权利要求5所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护过程为：将大分子聚氨基酸溶解于过量的乙醇水溶液中，加入磷酸、芳基磺酸、烷基硫酸酯和酸性离子交换树脂中的一种作为催化剂，并加入几滴稀硫酸使得溶液呈酸性，加热至100～150℃反应3h左右，反应结束后，分离得到带有羧基保护基团的大分子聚氨基酸。
7.如权利要求6所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护基团脱去操作：向酶标板板孔中加入5～10％的稀硫酸，于60～80℃温度下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板。
8.如权利要求6所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大分子聚氨基酸的羧基保护基团脱去操作：向酶标板板孔中加入3～5ml水解酯键的GDSL脂肪酶溶液，于室温下振荡反应过夜，洗去多余物质，干燥酶标板。
9.如权利要求5所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的酰胺缩合反应，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温反应过夜，洗涤多余物质并干燥酶标板。
10.如权利要求5所述的C型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的酰胺缩合反应，以DMSO为溶剂，以1:1当量的EDCI、HOBT为缩合剂，室温反应过夜，洗涤多余物质并干燥酶标板。
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