JPS59224564A - 生物学的活性もしくは官能性化合物の複合化およびその調製およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的に活性もしくは官能性を有する化合物の一つも
しくはそれ以上を含む複合体は生物学的に活性もしくは
官能性を有する化合物である第１の化合物を該第１の化
合物の活性位置が保護されるような条件下においである
固体基材に結合もしくは固定され、その結果該第１の化
合物が該固体基材に結合されている間に該第１の化合物
をある誘導体化もしくは変性化化合物と誘導体化もしく
は結合することによって調製される。得られた複合体も
しくは複合化された第１の化合物はそれから該固体基材
に対する結合から解放されて複合体を得、該複合体は該
第１の化合物に結合された誘導体化化合物からなり、該
第１の化合物は該固体基材から解放された上でその官能
性もしくは生物学的活性位置が利用可能になる。例えば
アルカリホスファターゼは例えば、望ましくはパラアミ
ノベンジルホスホン酸（Ｐ−ＡＢＰＡ）のようなアルカ
リホスファターゼに対する競合阻害物質のような配位子
を通してデキストランビーズのような固体基材に付着さ
れる。該デキストランビーズはまず（Ｐ−ＡＢＰＡ）で
処理され、そしてこのようにして処理されたデキストラ
ンビーズにアルカリホスファターゼが接触をもたらされ
る。＃競合阻害物質は該アルカリホスファターセの活性
位置を占めるとともに同時に保護を行なっている間に該
アルカリホスファターゼがデキストランビーフ゛に結合
するための配位子としての役目をする。それによってか
くして結合されたアルカリホスファターゼは例えばビオ
チン化によって誘導体化もし７くは変性される。アルカ
リホスファターセのビオチン化化合物て、得られたビオ
チン化アルカリホメフ７ターゼはそれが固定されている
Ｐ−ＡＢＰＡ処理固体基材もしくはデキストランビーズ
に対する結合から離されもしくは移され、完全なアルカ
リホスファターゼとしての活性もしくは官能性位置を有
スるビオチン化アルカリホスファターゼを得る。

該複合体はまだデキストランビーズに付着し、ている間
にもし所望ならばアビジンとの接触によるようなある活
性もしくは官能性位置を有する第２の化合物もしくは成
分によって更に処理されることが出来、そして該処理に
よればビオチン化７゛ルカリホスフアターゼの変性化も
しくは誘導体化部分、即ちビオチンと結合しそしてかく
して生成されたアビジン−ビオチン化アルカリホスファ
ター七複合体はその後難される。例えばアビジン−ビオ
チン化アルカリホスファターゼよりなる複合体のような
複合体は例えばビオチン化ヌクレオチドもしくはビオチ
ン化ＤＮＡのようなビオチン化化合物のような他の化合
物の固定および／または位置決めのための検出システム
における検出子として用いられ得るであろう。

酵素は診断化学物質もしくは道具として現実にそして大
きな可能性のある用途を有している。例えばアルカリホ
スファターセのような酵素をビオチン基と接触すること
によりビオチン化すること、そして得られたビオチン化
酵素を例えば診断学的プローブのようなプローブとして
用いることが提案されている。不幸にしてアルカリホス
ファターゼがビオチン化される時、アルカリホスファタ
ーゼである酵素の酵素活性の約７０チが最終的に損失と
なることが見出されている。本質的にそれは例えば酸ホ
スファターゼおよびグリコシター、ゼのような他の酵素
の一般的な誘導体化もしくは変性もしくはビオチン化に
関しては真実であろう。例えばアルカリホスファターゼ
のような酵素の活性化されたビオチン（Ｎ−ハイドロキ
シサクシニアミド−ビオチン）によるビオチン化におい
て、ビオチン化は該酵素の反応位置で、もしくはその近
傍でリシン残渣のイプシロンアミノ基を介しそ起ること
は明らかになっている。同様にまたビオチンの結合は完
全な酵素活性のために重要である酵素の第三次構造を分
裂させることは明らかになっている。結局例えばビオチ
ン化のような例えはアルカリホスファターゼのような酵
素の直接変性もしくは誘導体化は診断学的目的もしくは
他の目的に対しテ有用なビオチン化されたアルカリホス
ファターゼのような満足に誘導体化された酵素を得るこ
とはなかった。

本発明ノ一つの目的は例えばアルカリホスファターゼ、
酸ホヌファターセのような酵素のビオチン化のような機
能もしくは生物学的活性化合物の変性もしくは誘導体化
、および他の酵素、もしくはビオチン化もしくは他のも
しくは同様な変性もしくは誘導体化が可能な生物学的官
能性もしくは活性化合物の変性もしくは誘導体化に対す
る改良された方法を提供することにある。

本発明の他の目的は例えば他の物質の位置決定もしくは
同定もしくは測定に関連して、診断学的目的のために本
来有用なビオチン化アルカリホヌフ１ターセもしくは酸
ホヌファターゼのような変性もしくは誘導体化活性もし
くは官能性化合物を提供することにある。

本発明の他の目的は容易にそれ自体結合しまたはビオチ
ンもしくはアビジン部分もしくは他の生物学的活性もし
くは官能性化合物もしくは複合体と容易に結合される化
合物のＦＡＭに有用な材料および手法を提供することに
ある。

本発明の実施の一つの特別な例においては酵素を基礎と
したもしくは結合された材料とこのような材料の調製お
よび診断学的プローブ等のような物質の利用のための手
法が提供される。

本発明に付随する他の目的は次にか＼げる詳細な説明に
照らして明らかにされるであろう。本発明の実施の少な
くとも一つの実施例において１．前述の少なくとも一つ
の目的が果されるであろう。

例えば酵素、神経ホルモンを含むホルモン、レクチン、
抗体、抗原、例えばステロイド結合蛋白質のような蛋白
質、ホルモン受容体等のような官能性化合物もしくは生
物学的活性化合物の変性もしくは誘導体化のための改良
された方法もしくは手法が提供される。例えば生物学的
に活性もしくは官能性化合物の一種もしくは二種以上も
しぐは生物学的に活性もしくは官能性位置を含む複合体
のような複合体は生物学的に活性もしくは官能性化合物
である第１の化合物を該第１の化合物の活性位置が保護
される条件下においである固体基材に結合もしくは固定
すること、このように該第１の化合物が該固体基材に結
合されている間に該第１の化合物は誘導体化もしくは変
性化化合物によって誘導体化もしくは結合することによ
って得られる。得られた複合体もしくは複合体化された
第１の化合物はそれから該固体基材に対する結合から解
放きれて複合体を得、該複合体は該第１の化合物に結合
されている誘導体化化合物と該第１の化合物とからなシ
、該固体基材から解放されてその官能性もしくは生物学
的活性位置が使用可能となる。例えば、アルカリホスフ
ェイトはデキストランビーズのような固体基材に対して
、望ましくはアルカリホスファターゼに対する競合阻害
物質、ｐ−アミノベンジルホスホン１ｉｔＣＰ−ＡＢＰ
Ａ）のような配位子を介して固体基材に結合せられる。

該デキストランビーズは最初にＰ−ＡＢＰＡによって処
理されそしてアルカリホスファターゼはこのようＫして
処理されたデキストランビーズとの接触をもたらされる
。該競合阻害物質Ｐ−ＡＢＰＡはアルカリホスファター
ゼの活性位置を同時に占めそして保護している間にアル
カリホスファターゼを該デキストランビーズに接触させ
るための配位子としての役目をする。それによって、か
くして結合されたアルカリホスファターゼは例えばビオ
チン化によるような誘導体化もしくは変性される。

該アルカリホスファターゼをビオチン化した上で、得う
れたビオチン化アルカリホスファターゼは固定されてい
る該Ｐ−ＡＢＰＡ処理固体基材もしくはデキストランビ
ーズに対する結合から離されもしくは取除かれ、アルカ
リホスファターゼ本来の官能性位置の活性を有するビオ
チン化アルカリホスファターゼを得る。デキストランビ
ーズにまだ結合している間、該複合体はある第２の化合
物もしくは成分によって更に処理されるが、該第２の化
合物もしくは成分はまた例えばもし所望なれはビオチン
化アルカリホスファターゼの変性さし、モしくは誘導体
化された部分、即ちビオチンと結合するであろうアビジ
ンとの接触によって活性もしくは官能性位置を有し、か
くして生成されたアビジン−ピオチン化アルカリホヌフ
ァターゼ複合体ｔｉ−’ｔの後難される。アビジン−ビ
オチン化アルカリホヌフ１ターゼからなる複合体のよう
なこの複合体はビオチン化ヌクレオチドもしくはビオチ
ン化ＤＮＡのようなビオチン化された化合物のような他
の化合物の同定および／″′！、ｆｃは位置決めのため
の検出システムにおいて検出子として用いられることが
出来るであろう。

より特殊には、そして例えばアルカリホスファターゼの
ような酵素のビオチン化に対して適用されるような本発
明の実施の強調によって、例えばアルカリホスファター
ゼのような酵素のビオチン化のだめの改良された方法も
しくは手法は酵素の競合阻害物質を固体基材、望ましく
は粒子状の基材に固定することによって与えられる。そ
れによって、該酵素はかくして固定された競合阻害物質
との接触をもたらされそのようにして該阻害物質は酵素
活性位置と相互作用を行なうかもしくはその位置を効果
的に占める。該阻害物質による該酵素活性位置の占有は
該酵素の続いて起るくオチン化の間、該酵素、即ち該酵
素活性位置を保護する役目をする。このようにして占め
られた該酵素の活性位置によって、該酵素はその時点で
基材に結合されている阻害物質に結合されそして例えば
活性化ビオチン、Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドービ
オチンと接触もしくは反応することによってビオチン化
される。この操作において該酵素はビオチン化されるか
もしくはビオチンまたは該酵素に結合されているビオチ
ン部分を与えられる。

それによって該酵素のビオチン化の後、得られたビオチ
ン化酵素は得られた生成物とともに基材に残存し固定さ
れている阻害物質から離され、そして実質的に影響され
ないその反応位置を有するビオチン化酵素の回収を行な
う。例えばビオチン化アルカリホスファターゼのような
ビオチン化酵素は一般に多くの化学的および／または診
断学的方法において有用である。

本発明の実施は酵素、特に活性化されたビオチン、Ｎ−
ハイドロキシーサクシンイミドービオチンと反応する酵
素のようなビオチン化され得る能力を有する酵素に対し
て広く適用され得る。このように適当な酵素はアルカリ
ホスファターゼおよび酸ホスファターゼのみでなく、例
えばβ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダー
ゼのようなグルコシダーゼを含む他の酵素をも含むもの
である。

上記に示されたように、該酵素のビオチン化は該酵素を
活性化ビオチン、Ｎ−ハイドロキシーサクシンイミドー
ビオチンと接触させもしくは反応させることによって容
易にもたらされる。しかしながら他の手法が酵素のビオ
チン化をもたらすために有用であシそしてビオチン化酵
素を生成するこのような手法のすべては本発明の実施に
おいて有用である。

本発明の実施において、ビオチン化されるべき酵素は先
ず競合阻害物質との接触をもたらされ、それによってそ
の後のビオチン化の操作の間酵素の反応もしくは活性位
置を一時的におよび／または保護するように占有する。

該酵素との接触がもたらされるに先立って該阻害物質は
先ず望ましくは基材に固定、付着もしくは結合せられる
。示されるように、該基材は固体基材もしくは粒子状固
体基材に固定せられるであろう。固定基材はガラス表面
もしくは塗膜、ポリアクリルアミド表面もしくは塗膜、
もしくは誘導体化ガラス表面もしくは塗膜、デキヌトラ
ンゲ／Ｉ／（セファローズ）表面もしく社塗膜、もしく
はポリスチレン表面もしくは塗膜が存在するかもしくは
有するものである。

本発明の実施において特に望ましいものはこのような表
面を有するもしくはこのような表面が存在する例えばセ
ファローズビーズのようなビーズのごとき粒状固形材料
であろう。このような表面に対する阻害物質の固定は該
阻害物質にこのような表面との接触がもたらされた時実
質的に容易に起るＯ 後続のビオチン化操作の間該酵素の活性もしくは反応位
置を保護するために用いられる阻害７物質に関して、酵
素に対する既知の競合阻害物質のいかなるものも有利に
用いられる。アルカリホスファターゼの場合には、この
ような阻害物質は１−アミノ−アントラキノンのジアゾ
ニウム塩、４−ベンゾリアミノ−２：５−ジメトキシー
アニリン、ｐ−ニトロアニリン、４−クロロ−２−ニト
ロアニリン、２：５ジクロロアニリン、Ｏ−Ｓ）アニシ
ジン、４−クロロ−０−アニンジン、５−ニトロ−〇−
アニンジン、５−クロロ−０−トルイジン、４−ニトロ
−〇−アニシジン、３−二１−ローｐ−トルイジン、３
−ニトロ−ｐ−アニンジン、４−アミノ−３：１７−シ
メチルアゾベンゼン、４−アミノ−２：５−ジメトキシ
−４−ニトロアゾベンゼン、４−アミノ−４′−メトキ
シジフェニルアミン、３−ニトロ−〇−トルイジン、４
−アミノ−４′−ニトロ−３＝６−シメトキシーアゾベ
ンゼン、４−アミノ−３′：１′−ジメチル−アゾベン
ゼン、２−メトキシ−５−ジエチルアミノ−ザルレフア
ニリン、２−ペンシルアミノ−４−メトキシ−トルイジ
ン、４−７ミノージフエニルアミン、ｐ−ｐ’−ジアミ
１ノジフェニルアミンを含む。例工ｔｒＪｆＪＲホヌフ
ァターゼのような他の酵素に対する阻害物質に関しては
、このような阻害物質はベンジルホスホン酸、フェニル
ホスホン酸、２−フェニルエチルホスホン酸、エチルホ
スホン酸、ｐ−ニトロベンジルホスホン酸、ｐ−クロロ
ベンジルホヌホンＬ　ｐ−アミノベンジルホスホン酸、
ｐ−アミノフェニルアルソン酸、シクロヘキシルメチ７
レホスホン酸、フヱニルアルソン酸、ｐ−アミノフェニ
ルアルソン酸およびホスホン酸のようなホスホン酸及び
アルソン酸を含む。グリコシダーゼ及びグリコースオキ
シダーゼのような他の酵素に関して有用な阻害物はｐ−
アミノフェニル−ベーターＤ−チオガラクトーピラノシ
ド、ｐ−アミノフェニル−ベーターローグルコ−ソーピ
ラノシド、３−アミノサクシニ、、−３７−アミツジプ
ロピラミンーベーターＤ−チオガラクト−ピラノシド、
ｐ−アミノグロピラミンーベーターＤ−チオガラクトピ
ラノシド、ｐ−アミノブチル−ベーターＤ−チオガラク
トシド、ｐ−アミノブチル−ベーターＤ−チオクルコー
ソビラノシドを含む。

前述の他の有用な阻害物及びその関連物に関してはＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ）’＋　　１９７８＋　　１７＋　
Ｎｏ−５ｌｐｐ、　　９１５−９１９；　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏ’、　
　１９７８．　３１．　　ｐｐ、　　４５４−４６０；
ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ）’５
ｉｃａ　Ａｃｔａ＋１９７９、　５６９．　　ｐｐ、　
　１５９−１７６に述べである。

適当な基材と酵素に対して固定されている阻害物質によ
って占められている活性もしくは反応位置を有すること
によって酵素が保護された後、このような保護されたも
のは例えばＮ−ノλイドロキシサクシンイミドービオチ
ン（ＮＨ８−ビオチン）のような活性化ビオチンによる
接触によってビオチン化され、該ビオチン化操作は約６
〜７のｐＨ範囲で行われ、得られたビオチン化酵素はそ
の後阻害物質から解放もしくは分離される。該固定され
ている阻害物質に対する結合から該ビオチン化酵素を解
放もしくは分離することは例えば該酵素に対するベンジ
ルホスホン酸の親和性に対して競合する増加されたもし
くは濃縮された燐酸イオンを含むバッファー中でｐＨを
約９に増加させることによって容易に行われる。

本発明の実施の特別な例を介して、アルカリホスファタ
ーゼ水溶液は例えばｐ−アミノベンジルホスホン酸（ｐ
−ＡＢＰＡ　）のようなアルカリホスファターゼ阻害物
質活性の競合阻害物質が付着もしくは固定されているデ
キストランゲルビーズ、セファローズとの接触をもたら
される。該固定されているｐ−ＡＢＰＡによる該アルカ
リホスファターゼの接触の上で、セファローズビーズに
対して固定されている該１）−ＡＢＰＡのベンジルホス
ホン酸部分は後に続くビオチン化のような後に続く置換
からそれを保護する酵素活性位置と相互作用もしくは該
位置を占有する。該酵素アルカリホスファターゼの反応
位置はかくして七ファ四−ズ固定ｐ−ＡＢＰＡに占有さ
れもしくは結合され、活性化ビオチン、Ｎ−ハイドロキ
シーサクシンイミドービオチンの水溶液は例えばｐＨ６
〜７において酵素との接触をもたらされる。これらの条
件下において、該ビオチンは酵素、アルカリホスファタ
ーゼの例えばアミン基もしくは蛋白質部分で結合もしく
は付着するであろう。その結果得られたビオチン化酵素
はビオチン化酵素をそれから洗い出すかもしくは離すこ
と、ｐＨを約９に増加させること、および燐酸イオンの
段々に濃縮した溶液を用いることによって固定されてい
る阻害物質との結合から取除かれる。分離そして分離物
からの回収のＬ　例えばビオチン化アルカリホスファタ
ーゼのような結果として得られた分離されたビオチン化
酵素は反応性ビオチン位置と結合しているかもしくはそ
の位置を利用出来るのでプローブと、して使用すること
が可能である。

本発明によるビオチン化酵素の特別な手法と応用ハアビ
ジンもしくはストレプトアビジンを含む混合液もしくは
比較的不純な物質からのアビジンおよび／またはストレ
プトアビジンの回収のタメに該ビオチン化酵素を用いる
ことであろう。アビジンおよびストレプトアビジンはビ
オチンと強く結合する。本発明の実施の見地において、
例えばビオチン化アルカリホスファターゼのよウナビオ
チン化酵素は該固定されている阻害物質から分離もしく
は単離もしくは遊離されずに、むしろ固定された阻害物
質にまだ結合している間に該ビオチン化酵素はアビジン
もしくはストレプトアビジンを含む混合物との接触をも
たらされるであろう。

アビジンもしくはストレプトアビジンを含む材料が効果
的に固定されているビオチン化酵素との接触をもたらさ
れる時、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジ
ンの間の強い結合親和性のために、該アビジンもしくは
ストレプトアビジンはアビジンもしくはストレプトアビ
ジンがこれらを含んでいる物質から取除かれもしくは引
きはがされる結果によって該効果的に固定されたビオチ
ンと反応もしくは結合されるであろう。その結果、得ら
れたビオチン化酵素はこの時点でそのビオチン部分に結
合しているアビジンもしくはストレプトアビジンを有し
、該固定されている阻害物質に対する接触から離されも
しくは取除かれ、そして例えばアルカリホスファターゼ
のような酵素からなる酵素複合体が回収され、該酵素複
合体はビオチン化されておシ、そしてこの時点で該ビオ
チン化酵素のビオチン部分に付着もしくは結合されてい
る更に付加されたアビジンもしくはストレプトアビジン
を有するであろう。この手法は、示されるように、これ
らを含んでいる不純物質からアビジンもしくはストレプ
トアビジンの精製および回収のだめの容易な方法を提供
する。更にこの手法はまた前記したように酵素、これに
結合するビオチンおよび既に酵素に固定されているビオ
チン部分に結合されているアビジンおよびストレプトア
ビジンからなる酵素複合体を与える手段を提供する。

この酵素−ビオチン−アビジンもしくはストレプトアビ
ジン複合体は例えばビオチン化ＤＮ、Ａ。

ビオチン化ペプチドもしくは蛋白質、ビオチン化抗原お
よび／−ｊたはビオチン化抗体のようなビオチン化基質
を探査、同定、検出、もしくは位置決めグローブとして
特に有用であろう。この応用において、例えばビオチン
化ＤＮＡのようなビオチン化基質の位置もしくは存在は
、ビオチン化基質にアルカルホスファターゼのような酵
素がらなり、順番に酵素、アビジンもしくはストレプト
アピジ／に固定されるビオチン部分に結合されたビオチ
ンに結合されている酵素複合体との接触をもたらすこと
によって測定されるであろう。アビジンもしくはストレ
プトアビジンはビオチンに対して強い結合親和性を有す
るので、該酵素複合体はビオチン化基質に対する曝露も
しくは接触の上で例えばビオチン化ＤＮＡのようなビオ
チン化基質のビオチン部分に固定されている酵素複合体
、酵素−ビオチン−アビジンもしくはストレプトアビジ
ンを結果として得ると云うことによって容易に固定され
るようになる。ビオチン化ＤＮＡ基質の位置決めもしく
は存在もしくは測定はその後利用可能に残存し℃いる該
酵素の反応位置から教えられもしくは明らかにされる適
当な化学反応もしくは物理的証明によって証明もしくは
明らかにされる０本発明の実施の更なる説明および記述
を介して、そして酵素、特にアルカリホスファターゼ、
酸ホスファターゼおよびホルモン受容体ノく−オキシダ
ーゼのような酵素の誘導体化に対する本発明の実施の適
用可能性を更に強調して、生物活性もしくは官能性複合
体、特にアルカリホスファターゼ−ビオチン−ストレプ
トアビジンからなる複合体の合成を明らかにする本発明
の実施例を以下にあげる。

実施例１ アルカリ−ホスファターゼ−ビオチン−ストレプトアビ
ジン複合体 アルカリホスファターゼ−ビオチン−ストレプトアビジ
ン複合体の調製において、アルカリホスファターゼ、ｍ
ｌゲルマトリクスに対して（）、　７　＃アルカリホス
ファターゼの容量を有する架橋６％ビーズ化アガロース
上の不動態化さ力たｐ−アミ７ペンジルホスホン１１（
ｐ−ＡＢＰＡ）、ビオチン化合物ＮＨ３−０７−ビオチ
ン、分子量約４７１゜０．００５Ｍ無水ジメチルスルホ
キサイド溶液９、約１０．２ｑ／ｍｌ蛋白質の濃度のス
トレプトアビジン。

ｐＨ８，０の０．０１Ｍ）リスＨＣＩ　、およびｐＨ８
，０の０．０１Ｍ）リスＨ（Ｊ？中の０．０１　Ｍ　Ｎ
ａ２　ＨＰ　０４をそれに関連する試薬として有利に用
いられる。

これら試薬を用いる複合体の調製において、セファｏ　
−ス−ｐ−アミノ−ベンジルホスホン酸（Ｓｅｐｈ−ｐ
−ＡＢＰＡ　）の５０％スラリーの２＃ｌｔはｐＨ８で
０．０１ＭトリスＨＣｌの１０谷量で平衡化された。ア
ルカリホスファターゼの１屑ｆ／１ｔｎｉの濃度を有す
る溶液およびストレプトアビジンの１０ｑ／ＩＩｔの濃
度の溶液はｐＨ８，０の０．０１Ｍ）リスＨＣＩに対し
て４”Ｃ２２４時間透析せしめられた。この操作におい
て、該バッファーの容量は３回変えられた。

透析されたアルカリホスファターゼの１ｔｙｔｌが５ｅ
ｐｈ　　Ｐ　　ＡＢＰＡの２５％ス５リー＋７）　４　
ｍｌに対して添加されそして室温で約３０分間回転機中
で充分混合された。その上で、該ゲルは小さいカラムの
中へ導ひかれそして再循還されることが出来る遊離酵素
として流出物中から採集された。該ゲルはそれからｐＨ
８の冷０．１０Ｍ）リスＨＣｌバッファーの１０容量で
洗滌された。

該ゲルはそれから低速の連続過流攪拌を行ないつ＼ｏ、
　６ｍｌの無水ジメチルスルホキサイドを滴加された０
、０１Ｍ）リスＨ（Ｊ？バッファーのｌｌ１ｌｌ中に再
分散された。続いて、同様な方法で０．００５ＭＮＨ３
−０７−ビオチンの１７８マイクロリツターが添加され
そして得られた混合物は回転機中で１．５時間室温にて
装置された。

装置期間の終りにおいて、ｐＨ８，０の冷０．０１Ｍト
リスＨＣ６の４５ｍ１が添加せられ、得られた混合液は
充分に攪拌された。４℃約３０・分間の放置後、上澄み
を取除く、この洗滌操作は二回あるいはそれ以上繰返さ
れた。得られた処理さカーかつ洗滌されたゲルは取出さ
れそして１ｍｌの透析されたストレプトアビジンが加え
られたｐ　Ｈ８，０の０．０１Ｍ）リスＨＣＩの：ｔｍ
ｒバッファー中に再分散され、次いで３７℃、３０分間
の攪拌および装置が行われた０該装置期間の終りにおい
て、該ゲルは小さいカラムの中へ充たされそして流出物
は遊離ストレプトアビジンとしてそれから採果ｔられ所
望ならば再循還せしめることが出来る〇該カラム中の該
ゲルはｐＩ（８，０の０．０１Ｍ）リスＭＣＩＩの１０
容量でそれから洗滌せられそして得られたアルカリホス
ンアターゼービオテンーストレグトアビジン複合体はｐ
Ｈ８，０の０．０１Ｍ）リスＨＣｌバッファー中の０．
０１Ｍ　Ｎａ２ＨＰ　０４と共にカラムから流出した。

この操作において５Ｍのフラクショ／が採集された。各
７ラクシヨンは各々のフラクションのｌＯμｌ、バッフ
ァーの４０μｌおよびｐＨ９，０の１０％ジエタノール
アミンバソファー中の２ｏｏｔｔ（ｌのｐ−二トローフ
ェニルホスフェイト（Ｉ　Ｑ／ｍｌ　）をとりそして室
温で約１０分前置し、得られた溶液をＯＤ４０５ｎｍで
読みとることによって検定さ力、た。酵素活性を示すフ
ラクションは集めら７′１．そしてビオチン化チトクロ
ームＣの小量が点盾せらり、ているニトロセルロース紙
に塗布さＤ、た。このようにして調製された複合体はＮ
ＢＴ−ＢＣＩＰ基質を用いてビオチ／の１００ｆモルを
検出することが出来そして螢光獲得基質、フラボン−３
−ジホスフェイトを用いで１ｆモルの検出が可能であっ
た。

本実施例は本発明の実施による生物学的活性もしくは官
能性化合物の調製を説明するのみならす非常に鋭敏な感
度とこのようにして得られた腹合体の実際の利用をも示
すものである。

実施例２ アルカリホスファターゼ−ビオチン　ストレットアビジ
ン−ビオテン−抗体複合体の調製アルカリホスファター
ゼービオチンーストレグトアピジンからなる複合体が実
施例１で述べられたと同様な方法で調製された。該複合
体を含むカラムはｐＨ８，０の１０ＭトリスＨＣｌで洗
滌されそしてその上へ１０ｍＭのｐＨ８，０）リスＨ（
Ｊ？中３り／ゴの濃度のビオチン化（Ｂ７）−ヤギ抗−
マウス抗体ＩｇＧの０．０５＊ｔが該カラムスラリーに
添加されそして穏やかな揺動により３７℃　１時間前置
された。その結果、該複合体はｐ　Ｈ８，０の１０ｍＭ
）リスＨＣｌバッファーによって広範囲にわたって洗滌
されそして該カラムの中へ戻された。

該カラム内容物はそれからｐＨ８，０の１０ｍＭ　ト！
ＪスＨＣ＃中の１０　Ｍ　Ｎａ　ＨＰＯ４で流出される
０該流出物のフラクションは回収され次のように試験さ
れた。

マウスＩｇＧはニトロセルロースＭ上にスポットされそ
して空気乾燥されＰＢＳ中０．５チツイ一ン２０界面活
性剤によって３０分間３７℃で閉鎖された。そこでＰＨ
３中の１％ＢＳＡ−０．１％ツイー７２０界面活性剤中
に希釈された該調製された複合体が加えられ穏やかな揺
動によって約１時間３７℃で前置され、次いで各々の洗
滌時間５分間でＰＢＳ中１チＢＳＡ中の０．１％ツイー
ン２０界面活性剤で三回の洗滌が行われ、次いで１０ｍ
ＭトリスＨＣ１による洗滌が行われた。得られた試験ニ
トロセルロース紙に対して基質ＮＢＴ−ＢＣＩＰ−ベロ
ナールが添加されそして３７℃で前置され、スポットさ
れたマウスＩｇＧは展開さ冶そしてかくして調製された
複合体によっτ検出された。

前記したように本発明の実施は複合体がビオチン化アル
カリホスファターゼのようなビオチン化酵素のような酵
素からなる本発明による複合体の調製に関して強調され
て来た。しかしながら前記したように、本発明の実施は
例えば競合酵素阻害物質が固体マトリクス上で不動態化
されているような酸ホスファターゼ、グリコシダーゼ、
もしくはいかなる種類の酵素のような他の酵素に対して
も適用可能である。更に変性もしくは誘導体化成分もし
くは化合物はビオチンが望ましいけれども、誘導体化も
しくけ変性化合物はまたグリコジル基を誘導体化もしく
は変性されるべき化合物に対して供与する化合物もしく
は成分もまた用いられることが出来る。例えば本発明の
実施において、本発明による化合物はグリコジル基もし
くは他の糖部分との結合によって変性されるであろう。

かくして変性もしくは誘導体化された複合体はそれから
例えばアビジンそれ自体がビオチン基もしくはビオチン
化化合物のビオチン部分に結合するような仕方で、それ
自体がグリコジル基に結合している例えばコンカナバリ
ンＡのようなレクチンと反応せしめられる。

酵素に対する付加における合併した開示から明らかなよ
うに、神経ホルモンを含むホルモン、ホルモン受容体、
レクチン、抗原、抗体、蛋白質のような他の生物学的活
性の官能性化合物はこ＼に述べられているのと同様な方
法で変性され広範囲な用途を有する生物学的活性もしく
は官能性複合体の構成に用いられる。例えば、本発明の
実施により適当に調製さノまた複合体はその関連する抗
原もしくは抗体を探し出しすしてそ力、に固定する抗体
もしくは抗原を一個の末端位置に持つ複合体、その関連
するホルモン受容体を探し出しそれに結合するようにな
るホルモン、グリコジル化化合物を探し出しそれに結合
するレクチンを含むことが出来る。該複合体の他の末端
位置は適癌な基質の存在において有効な酵素のような適
当な信号部分を含み色信号もしくは他の化学的もしくは
物理的変化もしくは螢光を与えそれによって複合体の他
の末端にターゲットが結合していることを知らせる。例
えば、該複合体の他の末端がホルモンである時、複合体
は関連するホルモン受容体に対して、例えばそれを含ん
でいる組織中で探し出すためにもしくはグローブとして
用いら力、る。ホルモン受容体に結合されている複合体
のホルモン末端によって該複合体の他端に提供さね、て
いる酵素は前記したように該複合体のホルモン末端部分
がホルモン受容体に位置および／または結合し−Ｃいる
ことを知らせるために用いられるであろう。同様な方法
で、該複合体は抗体、抗原、スフロ順ド、グルコシル化
有機分子、ビオチン化分子もしくは基質等前記したより
な関心のある他のターゲットを探し出すために用いられ
得る。

上述の開示に照らし−Ｃ述べられた技術で明きらかなよ
うに、本願の実施にあたっては多くの変更、改変および
置き換えが可能であり、とｆｌらは本願の精神及び範囲
から離れるものではない。

特許出願人　　エンシー　バイオケム。

インコーポレイティド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、第１の化合物の活性位置が保護されるような条件下
   において該第１の化合物を固体基材に付着もしくは固定
   すること、該第１の化合物の活性位置が該固体基材に付
   着しおよび／または固定されることによって保護されて
   いる間に該第１の化合物をある誘導体化化合物で誘導体
   化もしくは結合すること、該固体基材に対して付着して
   いる得られた複合化された該第１の化合物を解放して該
   複合体を生成すること（該複合体は該第１の化合物に結
   合されている該誘導体化化合物からなり、該第１の化合
   物は該固体基材から解放した上でその活性位置を利用出
   来る）からなることを特徴とする第１の化合物の複合体
   を調製する方法。 ２、第１の化合物の活性位置が保護されるような条件下
   において該第１の化合物を固体基材に付着もしくは固定
   すること、該第１の化合物の活性位置が該固体基材に付
   着しおよび／または固定されることによって保護されて
   いる間に該第１の化合物をある誘導体化化合物で誘導体
   化もしくは結合すること、得られた誘導体化もしくは結
   合された第１の化合物へ第２の化合物を結合すること（
   該第２の化合物は該第１の化合物を誘導体化するために
   用いられる誘導体化化合物に対して特異的に結合する能
   力を有する）、該固体基材に対して付着している得られ
   た複合化された該第１の化合物を解放して該複合体を生
   成すること（該複合体は該誘導体化化合物に結合してい
   る該第２の化合物と、該第１の化合物に結合されている
   該誘導体化する化合物からなり、該第１の化合物は該固
   体基材から解放した上でその活性位置を利用出来るンか
   らなることを特徴とする第１の化合物の複合体を調製す
   る方法。 ８、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物は酵素である。 ４、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物はホルモンである。 ５、　「％許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該第１の化合物はホルモン受容体である。 ６、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物は担体もしくはステロイドと結合している
   蛋白質である。 ７、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物はレクチンである。 ８、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物は抗体である。 ９、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第４の化合物は抗原である。 １０、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該第１の化合物は蛋白質である。 比　「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物はアルカリホスファターゼである。 １２、特許請求の範囲１．」に記載の方法において、該
   第１の化合物はグリコシダーゼである。 １３、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該第１の化合物は酸ホスファターゼである。 １４、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該誘導体化化合物はビオチンである〇１５、「特許請求
   の範囲１．」に記載の方法において、該第１の化合物は
   グリコシダーゼであり、該誘導体化化合物はビオチンで
   あり、該得られた複合体はビオチン化グリコシダーゼで
   ある０１６、「特許請求の範囲２．」に記載の方法にお
   いて、該第１の化合物は酵素である。 １７、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物はホルモンである。 １８、　　「％許請求の範囲２．４に記載の方法におい
   て、該第１の化合物はホルモン受容体である。 １９、「特許請求の範囲２．］に記載の方法において、
   該第１の化合物は担体もしくはステロイドと結合してい
   る蛋白質である。 ２０、「特許請求の範囲２」に記載の方法において、該
   第１の化合物はレクチンである。 ２１、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物は抗体である。 ２２、特許請求の範囲２．」に記載の方法において、該
   第１の化合物は抗原である。 ２３、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物は蛋白質である。 ２４、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物はアルカリホスファターゼである。 ２５、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物はグリ−コシダーゼである。 ２６、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物は酸ホスファターゼである。 ２７、「特許請求の範囲２」に記載の方法にしいて、該
   誘導体化化合物はビオチンである。 ２８．「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第２の化合物はアビジンである。 ２９、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第２の化合物はストレプトアビジンである。 ３０、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該固体基材はセファローズ基材であり、該第１の化合物
   がグリコシダーゼで該誘導体化化合物がビオチンであり
   、該得らり、た複合体はビオチン化グリコシダーゼであ
   る。 ３１、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該第１の化合物はグリコシダーゼであり、該誘導体化化
   合物がビオチンで該第２の化合物がストレプトアビジン
   であり、該得られた複合体はヌトレプトアビジンービオ
   チン化グリコシダーゼである。 ３２、特許請求の範囲１．コに記載の方法において、該
   固体基材はガラス基材、変性ガラス基材、ポリスチレン
   基材、ポリアクリルアミド基材もしくはデキストランゲ
   μ又はセファローズ基材である。 ３８［特許請求の範囲２．」に記載の方法において、該
   固体基材はガラス基材、誘導化又は変性ガラス基材、ポ
   リスチレン基材、ポリアクリルアミド基材もしくはデキ
   ストランゲル又はセファローズ基材である。 あ、「特許請求の範囲１．Ｊに記載の方法において、該
   基材は該第１の化合物がある競合抑制物質を介して該基
   材に付着する前に該第１の化合物に対する該競合抑制物
   質によって前処理される。 ３５、「特許請求の範囲３４．」に記載の方法におイー
   ｃ、該ｍ合抑制物質Ｆｉｐ−アミノベンジルホヌホン酸
   であり該基材はセルファローズ基材であり、該第１の化
   合物はアルカリホスファターゼであり該誘導体化化合物
   はビオチンである。 ３６、「特許請求の範囲２．」に記載の方法において、
   該基材は該第１の化合物がある競合抑制物質を介して該
   基材に付着する前に該第１の化合物に対する該競合抑制
   物質によって前処理される。 看、「特許請求の範囲３６Ｊに記載の方法において、該
   競合抑制物質はｐ−アミノベンジルホヌホン酸であり該
   基材はセルファローズ基材であ’）　、該ｍ１の化合物
   はアルカリホスファターゼであり該誘導体化化合物はビ
   オチンであり、該第２の化合物はストレプトアビジンも
   しくはアビジンである。 ３８、「特許請求の範囲１．」に記載の方法において、
   該複合体は該面体基材に付着している間に第２の化合物
   を含む流動体もしくは混合物に接触もしくは接近せしめ
   られ、該第２の化合物は該第１の化合物を誘導体化する
   ために用いられる該誘導体化化合物に対して特異的に結
   合する能力を有し、それによって該第２の化合物を含む
   該流動体もしくは混合物から該第２の化合物を抽出もし
   くは除去する。 器、活性もしくは機能位置を有する第１の化合物−該第
   ４の化合物は誘導体化化合物によす誘導体化もしくは結
   合されているーおよび該第１の化合物に結合せられてい
   る該誘導体化化合物に対して特異的に結合する能力を有
   する第２の化合物とからなる、ことを特徴とする複合体
   ０４０、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体にお
   いて、該第１の化合物は酵素である。 ４１、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物はホルモンである。 ４２、特許請求の範囲３９．」に記載の複合体において
   、該第１の化合物はホルモン受容体である。 ４３、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物は担体もしくはステロイドと結合し
   ている蛋白質である。 弱、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体において
   、該第１の化合物はレクチンである。 ４５、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物は抗体である。 ４６、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物は抗原である。 ４７、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物は蛋白質である。 ４８、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物はアルカリホスファターゼである。 ４９、「特許請求の範囲３９．」に記載の化合物におい
   て、該第１の化合物はグリコシダーゼである。 ５０、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該第１の化合物はグルコースオキシダーゼである。 ５１、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体におい
   て、該誘導体化化合物はビオチンであり、該第２の化合
   物はアビジンもしくはストレプトアビジンである。 ５２、特許請求の範囲３９．」に記載の複合体において
   、該第１の化合物はアルカリホスファターゼであり、該
   誘導体化化合物はビオチンであり、該第２の化合物はス
   トレプトアビジンもしくはアビジンである。 ５８、「特許請求の範囲３９．」に記載の複合体に′お
   いて、該第１の化合物は酸ホスファターゼであり、該誘
   導体化化合物はビオチンであり、該第２の化合物はアビ
   ジンもしくはストレプトアビジンである。 ５４、ｒ特許請求の範囲３９薯に記載の複合体において
   、該第１の化合物はグリコシダーゼであり、該誘導体化
   化合物はビオチンであり、該第２の化合物はストレプト
   アビジンもしくはアビジンである。 ５５、化学的にラベルされたヌクレオチドに、活性もし
   くは機能位置を有する第１の化合物、複合体の該第１の
   化合物に結合される誘導体化化合物、および該誘導体化
   化合物に対して特異的に結合する能力を有しそしてそれ
   に結合されている第２の化合物とからなる複合体との接
   触をもたらすこと（該第２の化合物はまた核化学的にラ
   ベルされるヌクレオチドを化学的にラベルするために用
   いられる化午部分に対して結合する能力を有し、それに
   よって該複合体は該ヌクレオチドに結合される該化学的
   にラベルする部分に結合されるようになる）、そして該
   化学的にラベルされたヌクレオチドに結合されている該
   複合体の結果として得られた結合物を該複合体を構成し
   ている該第１の化合物の活性もしくは機能位置が該基材
   において観察し得る変化を生成するために有効であるよ
   うな条件下で基材との接触をもたらすことによってその
   時点で該複合体の該第２の化合物に結合されている該化
   学的にラベルされたヌクレオチドの存在を明らかにする
   ことからなることを特徴とする化学的にラベルされたヌ
   クレオチドを検出する方法。 ５６、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。 ５７、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該ヌクレオチドはりポヌクレオチドである０ ５８、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはデオキシリボ
   ヌクレオチドであり、該デオキシリボヌクレオチドはあ
   るポリデオキシリボヌクレオチドもしくはあるＤＮＡ分
   子の成分からなる０ ５９、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはりボヌクレオ
   チドであり、該リボヌクレオチドはあるポリリボヌクレ
   オチドもしくはＲＮＡ分子の成分からなる。 ６０、化学的にラベルされたヌクレオチドに第１の化合
   物、複合体の該第１の化合物に結合されている誘導体化
   化合物、および該誘導体化化合物に対して特異的に結合
   する能力を有しそしてそれに結合されている第２の化合
   物からなる複合体との接触をもたらすこと（該第２の化
   合物はまた該化学的にラベルされるヌクレオチドを化学
   的にラベルするために用いらｈる化学部分に対して結合
   する能力を有し、それによって該複合体は該ヌクレオチ
   ドの該化学的にラベルする部分に結合されるように々す
   、該第１の化合物は螢光を発することが出来る）、そし
   て該複合体に結合されている該化学的にラベルされたヌ
   クレオチドの結果として得られた結合物を放射線に対し
   て曝露して該複合体からなる該第１の化合物から螢光を
   導き出し、かくして該複合体に結合されている該化学的
   にラベルされたヌクレオチドの存在を示しもしくは明ら
   かにすることからなることを特徴とする化学的にラベル
   されたヌクレオチドを検出する方法。 ６１、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはビオチン化ヌ
   クレオチドであり、該複合体は該第１の化合物としてホ
   ースラディツシュパーオキシダーゼ、該誘導体化化合物
   としてビオチン、該第２の化合物としてストレプトアビ
   ジンもしくはアビジンからなる。 ６２、特許請求の範囲５５．」に記載の方法において、
   該化学的にラベルされたヌクレオチドはビオチン化ヌク
   レオチドであり、該複合体は該第１の化合物としてアル
   カリホスファターゼ、該誘導体化化合物としてビオチン
   、該第２の化合物としてストレプトアビジンもしくはア
   ビジンからなる。 ６３、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはビオチン化ヌ
   クレオチドであり、該複合体は該第１の化合物として酸
   ホスファターゼ、該誘導体化化合物としてビオチン、該
   第２の化金物としてストレプトアビジンもしくはアビジ
   ンからなる。 ６４、化学的にラベルされたヌクレオチドに第１の化合
   物と第２の化合物とを有する複合体との接触をもたらす
   こと（該第２の化合物は該第１の化合物に対して特異的
   に結合する能力を有し、該第２の化合物はフルオレセイ
   ン化され、該第１の化合物はまた該化学的にラベルされ
   るヌクレオチドを化学的にラベルするために用いられる
   該化学部分に関して結合する能力を有し、しかして該複
   合体は該第１の化合物を介して該核酸の化学的にラベル
   する部分に結合されるように々る）、そして該複合体の
   該第１の成分に結合されている該化学的にラベルされた
   ヌクレオチドの結果として得ら力、た結合物を放射線に
   対して曝露し、それによって該複合体の該第１の化合物
   に結合されている該第２の化合物は螢光を導出され、か
   くして該複合体に結合されている該化学的にラベルされ
   たヌクレオチドの存在を示しもしくけ明らかにすること
   からなることを特徴とする化学的にラベルさ負だヌクレ
   オチドを検出する方法。 ６５、「特許請求の範囲６４．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはビオチン化ヌ
   クレオチドであり、該第１の化合物はヤギ抗−ビオチン
   抗体であり、該第２の化合物はフルオレセイン化つサギ
   抗−ヤギ抗体である。 ６６、「特許請求の範囲５５．」に記載の方法において
   、該化学的にラベルされたヌクレオチドはグリコジル化
   ヌクレオチドであり、該複合体は該第１の化合物として
   レクチンからなる。 ６７、「特許請求の範囲６６、」に記載の方法において
   、該レクチンはコンカナバリンＡである。 ６８、ホルモンを含んでいる物質に、複合体に該ホルモ
   ンとの接触をもたらす条件下において該複合体との接触
   をもたらすこと（該複合体は該ホルモンと接触した時、
   該ホルモンとの結合に対する活性もしくは機能位置を有
   するホルモン受容体、該複合体の該ホルモン受容体に結
   合されているある誘導化化合物、および該誘導化化合物
   に結合されている第２の化合物とからなり、該第２の化
   合物は該ホルモンに結合されている該複合体がある基材
   との接触をもたらされる時、該複合体は該基材において
   観察されることが出来る変化を生じ得るような活性もし
   くは機能位置を有する）、該複合体に該ホルモンとの接
   触をもたらし該複合体を該ホルモン受容体を介して該ホ
   ルモンに結合すること、および得られたホルモン結合複
   合体に該基材との接触をもたらし該基材において観察可
   能な変化をもたらしそれによって該物質中に該ホルモン
   が存在することを明らか忙することからなることを特徴
   とするホルモンを検出する方法。 ６９、抗体を含んでいる物質に、複合体に該抗体との接
   触をもたらす条件下において該複合体との接触をもたら
   すこと（該複合体は該抗体と接触した時該抗体と結合す
   るだめの該抗体に対する抗原、該複合体の該抗原に結合
   される誘導体化化合物、および該誘導体化化合物に結合
   されている第２の化合物からなり、該第２の化合物は該
   抗体に結合されている該複合体がある基材との接触をも
   たらされる時、該複合体は該基材において観察可能な変
   化を生成することが可能であるような活性もしくは官能
   性位置を有する）、該複合体に該抗体との接触をもたら
   し該抗原を介して該複合体を該抗体に結合すること、お
   よび得られた抗体結合複合体に該基材との接触をもたら
   し該基材において観察可能な変化をもたらしそれによっ
   て該物質中に該抗体が存在していることを明らかにする
   ことからなることを特徴とする抗体を検出する方法。 ７０、複合体に接続した時にある抗原に対する結合のた
   めの該抗原に対する抗体、該複合体の該抗体に結合され
   た誘導体化化合物、および該誘導体化化合物に結合され
   た第２の化合物からなる該複合体に抗体との接触をもた
   らす条件下において、該抗原を含んでいる物質に該複合
   体との接触をもたらすこと（該第２の化合物は該抗原に
   結合されている該複合体がある基材との接触をもたらさ
   れる時、該複合体が該基材において観察可能な変化を生
   ずるような活性もしくは官能性位置を有する）、該複合
   体に該抗原との接触をもたらして該複合体を該抗体を介
   して該抗原に結合すること、および得られた抗原結合複
   合体に該基材との接触をもたらして該基材において観察
   可能な変化をもたらし、それによって該物質の該抗原の
   存在を明らかにすることからなることを特徴とする抗原
   を検出する方法、。