JPS60188095A - 受容部または目標部を形成する化学標識されたｄｎａおよびその他の生物学的物質を検出するための不均質系 - Google Patents
受容部または目標部を形成する化学標識されたｄｎａおよびその他の生物学的物質を検出するための不均質系Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の要約〕
受容部を形成するたとえば生物学的物質（たとえば化学
標識されたＤＮＡ）のような興味ある物質の検出および
／または同定は、２種以上の結合反応、たとえば糖蛋白
質もしくは糖基に対するレクチンの親和性およびビオチ
ンとアビジンもしくはストしブトアビジン（アビジン自
身はり，！蛋白質である）との間の親和性に関りする反
応を用いた不均質検出系を用いることにより改善される
。不均質検出系において特に有用なものは、ビオチニル
化されたレクチン、たとえばビオチニル１ヒされたコン
カナバリンＡ．ビオチニル化されたデキストラン、レク
チン−糖蛋白質複合体、たとえばレクチン−アビジンお
よびレクチン−酵素複合体、並びにスＩ・レプトアビジ
ンービオチニル化酵素複合体である。例として、補完的
単一鎖ＤＮＡに対しハイブリッド化された単一鎖グリコ
シル１ヒＤＮＡは、ハイブリッド化二重１１Ｍ Ｄ Ｎ
Ａをレクチン（たとえばコンカナバリンＡ）と接触さ
せて、グリコジル化ＤＮＡのグリコジル基を結合させ、
次いでビオチニル化デキストラン（多糖類）および次い
でレクチン−酵素複合体（たとえばコンカナバリン八−
西洋ワサビペルオキシダーゼもしくは酸性ボスフ１ター
ゼ）と接触させることにより検出される。さらに、スト
レプトアヒジンービオチニル化西洋ワザビペルオキシダ
ーセ゛からなる酵素複合体も使用される。レクチン−＾
・Ｖ素抜合体はビオチニル化デキストランの１′Ｉ，Ｉ
ｉ類成分に結合され、＄１，ｉｉ 頬はレクチンに結合
され、レクチンはハイブリッド化ＤＮＡのグリコジル基
に固定される。ストレプトアビジン−ビオチニル化ｒｉ
ｂ素複合体はビオチニル化デキストランのビオチン成分
に結合し、ビオチン成分は上記したように目標二＠鎮Ｄ
ＮＡのグリコジル基）に結合されたレクチンに結合する
。
標識されたＤＮＡ）のような興味ある物質の検出および
／または同定は、２種以上の結合反応、たとえば糖蛋白
質もしくは糖基に対するレクチンの親和性およびビオチ
ンとアビジンもしくはストしブトアビジン（アビジン自
身はり，！蛋白質である）との間の親和性に関りする反
応を用いた不均質検出系を用いることにより改善される
。不均質検出系において特に有用なものは、ビオチニル
化されたレクチン、たとえばビオチニル１ヒされたコン
カナバリンＡ．ビオチニル化されたデキストラン、レク
チン−糖蛋白質複合体、たとえばレクチン−アビジンお
よびレクチン−酵素複合体、並びにスＩ・レプトアビジ
ンービオチニル化酵素複合体である。例として、補完的
単一鎖ＤＮＡに対しハイブリッド化された単一鎖グリコ
シル１ヒＤＮＡは、ハイブリッド化二重１１Ｍ Ｄ Ｎ
Ａをレクチン（たとえばコンカナバリンＡ）と接触さ
せて、グリコジル化ＤＮＡのグリコジル基を結合させ、
次いでビオチニル化デキストラン（多糖類）および次い
でレクチン−酵素複合体（たとえばコンカナバリン八−
西洋ワサビペルオキシダーゼもしくは酸性ボスフ１ター
ゼ）と接触させることにより検出される。さらに、スト
レプトアヒジンービオチニル化西洋ワザビペルオキシダ
ーセ゛からなる酵素複合体も使用される。レクチン−＾
・Ｖ素抜合体はビオチニル化デキストランの１′Ｉ，Ｉ
ｉ類成分に結合され、＄１，ｉｉ 頬はレクチンに結合
され、レクチンはハイブリッド化ＤＮＡのグリコジル基
に固定される。ストレプトアビジン−ビオチニル化ｒｉ
ｂ素複合体はビオチニル化デキストランのビオチン成分
に結合し、ビオチン成分は上記したように目標二＠鎮Ｄ
ＮＡのグリコジル基）に結合されたレクチンに結合する
。
本発明は、受容部または目標部を形成する化学標識され
たＤＮＡおよびその他の生物学的物質を検出するための
不均質系に関するものである。
たＤＮＡおよびその他の生物学的物質を検出するための
不均質系に関するものである。
天然であっても或いは後にイ」着されたものであっても
、受容部または目標部を含有する化学標識されたＤＮＡ
またはその他の物質もしくは分子などの標識分子を検出
することは産業上、診断上および１・１学−ヒの観点か
ら重要な作業である。たとえば、二重鎖ＤＮＡに組み込
みうるビオチニル化ヌクレオチドが作成されている。こ
の種のビオチニル化ヌクレオチドを含有する単一組’４
Ｄ ＮΔは、補完的単一鎖ＤＮＡに対しハイブリッド
化された後に、各種のＩ）Ｎ Ａ物質を同定するために
使用されている。ハイブリッド化二市鎖ＤＮＡにおける
ビオチニル化ヌクレオチドの存在は一般にビオチンとア
ビジンとの一間の親和性に関与する反応により検出され
、一般にアビジンはビオチニル化酵素、たとえばビオチ
ニル化西洋ワサビペルオキシダーゼに結合される。スト
レプトアビジン アビジンの代用とすることができる。ビオチニル化ヌク
レオチドもしくはビオチニル化ＤＮＡを検出するための
試料としてストレプトアビジンもしくはアビジンを利用
することが、木出ＩＷｎ人によるヨＩーロソバ特許出階
部０．０６３，８７９号公報（１ ９ Ｂ ３年３月１
１日公開、１９８１年４月１７日出願の米国特許出階部
２５５，２２３号に基ツ＜〕に開示されている。上記ヨ
ーロッパ特許出願公ｆｌｉおよび米国特許出願明細書の
開示を参考のためここに開示の１部として引用する。
、受容部または目標部を含有する化学標識されたＤＮＡ
またはその他の物質もしくは分子などの標識分子を検出
することは産業上、診断上および１・１学−ヒの観点か
ら重要な作業である。たとえば、二重鎖ＤＮＡに組み込
みうるビオチニル化ヌクレオチドが作成されている。こ
の種のビオチニル化ヌクレオチドを含有する単一組’４
Ｄ ＮΔは、補完的単一鎖ＤＮＡに対しハイブリッド
化された後に、各種のＩ）Ｎ Ａ物質を同定するために
使用されている。ハイブリッド化二市鎖ＤＮＡにおける
ビオチニル化ヌクレオチドの存在は一般にビオチンとア
ビジンとの一間の親和性に関与する反応により検出され
、一般にアビジンはビオチニル化酵素、たとえばビオチ
ニル化西洋ワサビペルオキシダーゼに結合される。スト
レプトアビジン アビジンの代用とすることができる。ビオチニル化ヌク
レオチドもしくはビオチニル化ＤＮＡを検出するための
試料としてストレプトアビジンもしくはアビジンを利用
することが、木出ＩＷｎ人によるヨＩーロソバ特許出階
部０．０６３，８７９号公報（１ ９ Ｂ ３年３月１
１日公開、１９８１年４月１７日出願の米国特許出階部
２５５，２２３号に基ツ＜〕に開示されている。上記ヨ
ーロッパ特許出願公ｆｌｉおよび米国特許出願明細書の
開示を参考のためここに開示の１部として引用する。
さらに、グリコジル基もしくは糖成分、たとえばマルト
ース５乳糖，マンノース、トリオースによりヌクレオチ
ドおよびＤＮＡを標識し、かつ標識されたヌクレオチド
もしくはＤＮＡを糖基および＃Ｎ蛋白質に対し強力な親
和性を有するたとえばコンカナバリンへのようなレクチ
ンにより検出することも提案されている。グリコジル基
によるＤＮＡの４１１ｉ織および標識されたＤＮＡの検
出は、１９８２年６月２３日付は出願の本出願人による
米国特許出階部３９１，４４０号明＆ｍｌＮに開示され
ている。この米国特許出願の開示をここに開示の１部と
して引用する。
ース５乳糖，マンノース、トリオースによりヌクレオチ
ドおよびＤＮＡを標識し、かつ標識されたヌクレオチド
もしくはＤＮＡを糖基および＃Ｎ蛋白質に対し強力な親
和性を有するたとえばコンカナバリンへのようなレクチ
ンにより検出することも提案されている。グリコジル基
によるＤＮＡの４１１ｉ織および標識されたＤＮＡの検
出は、１９８２年６月２３日付は出願の本出願人による
米国特許出階部３９１，４４０号明＆ｍｌＮに開示され
ている。この米国特許出願の開示をここに開示の１部と
して引用する。
さらに、生物学的物質を検出するための池の技術も１１
を案されている。たとえば、１９８３年２月１６日付け
で公開されたヨーロッパ特許出階部０．０７１，９７６
号公報番よ、免疫学上活性な物質に対するビオチンの共
有結合、およびたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼの
ような酵素に対するアビジンの共有結合を含んでいる。
を案されている。たとえば、１９８３年２月１６日付け
で公開されたヨーロッパ特許出階部０．０７１，９７６
号公報番よ、免疫学上活性な物質に対するビオチンの共
有結合、およびたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼの
ような酵素に対するアビジンの共有結合を含んでいる。
他の検出技術が、１９８３年３月２３日付けで公開され
たヨーシトツバ特許出願第０．０７４，５２０号公報に
開示されている。このヨーロンパ特許出願公報は、ヒト
絨毛ゴナドトロピン（ＨｃＧ）を検出するだめの技術を
開示しており、レクチンをたとえばＨ Ｃ Ｇを含有す
ると思われる。たとえばｂ＋ｃ試１′．′．１のような
試料と接触させた固体支持体に結合させる。支持体から
外した後、得られるレクチン固定されたＨＣＧを次いで
抗体および色支持物質と接触させる。レクチン固定され
たＴＩ Ｃ Ｇの存在は着色により示される。」二記ヨ
ーロッパ特許出願公報の開示を本願開示の１部として引
用する。
たヨーシトツバ特許出願第０．０７４，５２０号公報に
開示されている。このヨーロンパ特許出願公報は、ヒト
絨毛ゴナドトロピン（ＨｃＧ）を検出するだめの技術を
開示しており、レクチンをたとえばＨ Ｃ Ｇを含有す
ると思われる。たとえばｂ＋ｃ試１′．′．１のような
試料と接触させた固体支持体に結合させる。支持体から
外した後、得られるレクチン固定されたＨＣＧを次いで
抗体および色支持物質と接触させる。レクチン固定され
たＴＩ Ｃ Ｇの存在は着色により示される。」二記ヨ
ーロッパ特許出願公報の開示を本願開示の１部として引
用する。
本発明の目的は、受容部または目標部を形成する４Ｍ職
物質、特に化学標識された化物学的物質（たとえば化学
標識されたＤＮＡ）の同定および／または測定において
有用な改良された技術および物質を提供することである
。
物質、特に化学標識された化物学的物質（たとえば化学
標識されたＤＮＡ）の同定および／または測定において
有用な改良された技術および物質を提供することである
。
本発明の他の目的は、たとえばビオチニル化された、ま
たはグリコジル化されたＤＮＡ物質のような標識ＤＮＡ
物質の同定に対し有用な迅速診１１Ｊｉ技術を提供する
ことである。
たはグリコジル化されたＤＮＡ物質のような標識ＤＮＡ
物質の同定に対し有用な迅速診１１Ｊｉ技術を提供する
ことである。
さらに本発明の目的は、ビオチニル化されたおよび／ま
たはグリコジル化されたＤＮＡの同定および／または測
定に対し特に有用なキットを提供することである。
たはグリコジル化されたＤＮＡの同定および／または測
定に対し特に有用なキットを提供することである。
さらに本発明の他の目的は、特殊な化学標識された天然
もしくは合成の生物学的物質を検出するための改良され
た感度および有能性を有する技術を提供することである
。
もしくは合成の生物学的物質を検出するための改良され
た感度および有能性を有する技術を提供することである
。
本発明のこれらおよびその池の目的は以下の説明から一
旧明らかとなるであろう。
旧明らかとなるであろう。
本発明によれば、不均質検出系およびこれと共に使用す
る成分、並びに不均質検出系のためのギフトが提供され
る。この不均質検出系は、アビジンもしくはストレプト
アビジンとビオチンとの間の親和性並びにレクチンと糖
蛋白質および／またはグリコジル基もしくは糖基との間
の親和性を使用する。本発明に、Ｊ９いて特に有用な成
分は、ビオチニル化レクチンおよびビオチニル化糖如１
（特にビオチニル化多糖類、たとえばビオチニル化デキ
ストラン）、ビオチニル化糖蛋白質およびビオチニル化
ｆｌｉ￥ｉ素である。
る成分、並びに不均質検出系のためのギフトが提供され
る。この不均質検出系は、アビジンもしくはストレプト
アビジンとビオチンとの間の親和性並びにレクチンと糖
蛋白質および／またはグリコジル基もしくは糖基との間
の親和性を使用する。本発明に、Ｊ９いて特に有用な成
分は、ビオチニル化レクチンおよびビオチニル化糖如１
（特にビオチニル化多糖類、たとえばビオチニル化デキ
ストラン）、ビオチニル化糖蛋白質およびビオチニル化
ｆｌｉ￥ｉ素である。
アビジンは約６８０００の分子量と、殆どの抗原に対す
る抗体の親和性を著しく越えたビオチンに対する極めて
高い親和性とを有する糖蛋白質である。特に、アビジン
分子はビオチン分子に対し４個の結合部位を与える。ア
ビジン−ビオチン親和性は、はぼ非可逆性であり、かつ
共有結合に匹敵するものである。蛋白質と糖蛋白質と酵
素とは、数個のビオチン分子と結合することができる。
る抗体の親和性を著しく越えたビオチンに対する極めて
高い親和性とを有する糖蛋白質である。特に、アビジン
分子はビオチン分子に対し４個の結合部位を与える。ア
ビジン−ビオチン親和性は、はぼ非可逆性であり、かつ
共有結合に匹敵するものである。蛋白質と糖蛋白質と酵
素とは、数個のビオチン分子と結合することができる。
アビジンとビオチンとの間の特殊なｔＪ１、相性ば、ア
ビジンとアビジン含有物質およびビオチン含有物質、た
とえばビオチニル化酵素、レクチンおよび多糖類との間
の巨大分子複合体を生成する可能性を与える。アビジン
に極めて近縁の分子であるストレプトアビジンは、ｋ丁
ましくはこの種の複合体において特にヒオチン標識され
たＤＮＡまたはグリコジル化されたＤＮＡの検出に関し
アビジンの代用となる。
ビジンとアビジン含有物質およびビオチン含有物質、た
とえばビオチニル化酵素、レクチンおよび多糖類との間
の巨大分子複合体を生成する可能性を与える。アビジン
に極めて近縁の分子であるストレプトアビジンは、ｋ丁
ましくはこの種の複合体において特にヒオチン標識され
たＤＮＡまたはグリコジル化されたＤＮＡの検出に関し
アビジンの代用となる。
レクチンおよびビオチニル化レクチンは、本発明による
不均質検出系の重要な成分である。
不均質検出系の重要な成分である。
レクチンは、糖残基の特異配列を識別する２個もしくは
それ以上の結合部位を有する蛋白質または糖蛋白質であ
る。元来、植物から単離されているが、レクチンは全ゆ
る種類の生物に見い出されている。本発明を実施する際
に−（１’ｌｋに使用されるレクチンは、Ｎ−アセチル
ガラクトースアミニルノ、（に対し特異性を有するトリ
コス・ビフｌコラス・アグルチニン、α−Ｄ−マンノー
スおよびα−Ｄ−グルコースに対し親和性を有するレン
チルレクチン、並びにガーデン豆レンチルレクチンを包
含する。その他多くのレクチンも知られており、かつ市
販されている。現在知られている数種の市販レクチンお
よび特殊な糖残基を下記第１表に示ず： 第 ■ 表 Ｌ・クチン 雁艷尺恍 コンカナバリンＡ （ジャック豆から） α−Ｄ−グルコースおよびα−Ｄ
−マンノース 大豆レクチン Ｄ−ガラクトースおよびＮ−アセチル Ｄ−ガラクトースアミン 小麦胚芽レクチン Ｎ−アセチルグルコースアミン ｏ−１−ス種子レクチン フコース 馬鈴薯レクチン さらに、本発明の実施に興味あるものは糖脂質であって
、これらは全ゆるプラスマ膜の表面に見られる少１１１
ηすｎ含有分子である。特に、糖脂質は、♀１１１胞表
面に露出された糖基を有する細胞１模の二重層の外側半
分に存在する。１−１５ ｆｌｌｉｌもしくはそれ以上
の中性糖類よりなる極性基を有する中性糖脂質が、成熟
核および原子核細胞のプラスマ映に広く分布している。
それ以上の結合部位を有する蛋白質または糖蛋白質であ
る。元来、植物から単離されているが、レクチンは全ゆ
る種類の生物に見い出されている。本発明を実施する際
に−（１’ｌｋに使用されるレクチンは、Ｎ−アセチル
ガラクトースアミニルノ、（に対し特異性を有するトリ
コス・ビフｌコラス・アグルチニン、α−Ｄ−マンノー
スおよびα−Ｄ−グルコースに対し親和性を有するレン
チルレクチン、並びにガーデン豆レンチルレクチンを包
含する。その他多くのレクチンも知られており、かつ市
販されている。現在知られている数種の市販レクチンお
よび特殊な糖残基を下記第１表に示ず： 第 ■ 表 Ｌ・クチン 雁艷尺恍 コンカナバリンＡ （ジャック豆から） α−Ｄ−グルコースおよびα−Ｄ
−マンノース 大豆レクチン Ｄ−ガラクトースおよびＮ−アセチル Ｄ−ガラクトースアミン 小麦胚芽レクチン Ｎ−アセチルグルコースアミン ｏ−１−ス種子レクチン フコース 馬鈴薯レクチン さらに、本発明の実施に興味あるものは糖脂質であって
、これらは全ゆるプラスマ膜の表面に見られる少１１１
ηすｎ含有分子である。特に、糖脂質は、♀１１１胞表
面に露出された糖基を有する細胞１模の二重層の外側半
分に存在する。１−１５ ｆｌｌｉｌもしくはそれ以上
の中性糖類よりなる極性基を有する中性糖脂質が、成熟
核および原子核細胞のプラスマ映に広く分布している。
成る種のｔＪ、！ｉ脂質は成る種の哺乳動物にのみ見い
出され、一般に成る種の組織のみに見い出される。たと
えば、ガラクトースとその極性基とのみを有する最も簡
単な糖脂質の１種であるガラクトセレブロシ１ζは、ミ
ニリンにおける主たる１Ｍ脂質である。より複り１［な
糖脂質はガングリオシドであって、その約３０種が同定
されている。レクチンは、細胞膜同定のためのキャリヤ
もしくは基体として露出された糖脂質小糖類に結合する
のに有用である。何故なら、レクチンと糖基との間には
一般に親和性が存在するからである。
出され、一般に成る種の組織のみに見い出される。たと
えば、ガラクトースとその極性基とのみを有する最も簡
単な糖脂質の１種であるガラクトセレブロシ１ζは、ミ
ニリンにおける主たる１Ｍ脂質である。より複り１［な
糖脂質はガングリオシドであって、その約３０種が同定
されている。レクチンは、細胞膜同定のためのキャリヤ
もしくは基体として露出された糖脂質小糖類に結合する
のに有用である。何故なら、レクチンと糖基との間には
一般に親和性が存在するからである。
本発明の実施に際し、特に興味あるものはυ、！１へ丘
白’ｔ’ｊ、 １ｌＱｒａこ酵素たとえばグルコースオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、西洋ワサビベルオキシ
ダー上２アルカリ性ボスファターゼ、酸性ボスファクー
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。」二記醇素は、
本発明の実施に際し、有用である多くの公知糖蛋白質ま
たは酵素の単なる例示である。
白’ｔ’ｊ、 １ｌＱｒａこ酵素たとえばグルコースオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、西洋ワサビベルオキシ
ダー上２アルカリ性ボスファターゼ、酸性ボスファクー
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。」二記醇素は、
本発明の実施に際し、有用である多くの公知糖蛋白質ま
たは酵素の単なる例示である。
本発明の実ｈ１εにおける１局面は、ビオチニル化酵素
に関する。ビオチニル化酵素の作成には種々の技術を用
いることができる。代表的な好適技術は、本出願人によ
る１９８３年４月２ＯＬ＋ （’Ｉり出願の米国特許出
願第、１８６，９２４号明細書に開示されており、その
開示を俗名のため本山１ｔｉＴにおける開示の１部とし
てここに引用する。
に関する。ビオチニル化酵素の作成には種々の技術を用
いることができる。代表的な好適技術は、本出願人によ
る１９８３年４月２ＯＬ＋ （’Ｉり出願の米国特許出
願第、１８６，９２４号明細書に開示されており、その
開示を俗名のため本山１ｔｉＴにおける開示の１部とし
てここに引用する。
この米国出願は、酵素のビオチニル化技１４：ｉを開示
しており、酵素を好ましくは競合抑制剤を介して固体基
質に固定し、酵素をビオチンへ露出した際に、酵素の活
性７１１３位を保護する。酵素をビオチニル化した後、
これを固体基質に対し固定され続りる競合抑制剤に対す
るイ、１１合から外す。
しており、酵素を好ましくは競合抑制剤を介して固体基
質に固定し、酵素をビオチンへ露出した際に、酵素の活
性７１１３位を保護する。酵素をビオチニル化した後、
これを固体基質に対し固定され続りる競合抑制剤に対す
るイ、１１合から外す。
或イは、ビオチニル化酵素がまだ固体基ＪＩケにり・１
し、固定されている間に、たとえば固定ビオチニル化酵
素に対するアビジンもしくはストレプトアビジンの付加
のような反応或いは複合体生成を行なうことができる。
し、固定されている間に、たとえば固定ビオチニル化酵
素に対するアビジンもしくはストレプトアビジンの付加
のような反応或いは複合体生成を行なうことができる。
固定ビオチニル化酵素に対するアビジンもしくはストレ
プトアビジンの結合の後、ｉ４￥られた複合体を固体基
質から遊離させることができる。この技術を用いて各種
の複合体を作成することができる。たとえば、固定酵素
をビオチンでなくレクチンへ結合さ−ｌて酵素−レクチ
ン複合体を生成させ、次いでこれを固体基質に対する結
合から外して本発明による不向′１！り系での試薬とし
て使用することができる。さらに、この技術は特にビオ
チニル化レクチンおよびビオチニル化多糖類の作成に利
用することもできる。これら生成物、並びに酵素−レク
チン複合体を使用してその他の酵素、糖蛋白質などを包
含する他の大型複合体を装造するごとができる。
プトアビジンの結合の後、ｉ４￥られた複合体を固体基
質から遊離させることができる。この技術を用いて各種
の複合体を作成することができる。たとえば、固定酵素
をビオチンでなくレクチンへ結合さ−ｌて酵素−レクチ
ン複合体を生成させ、次いでこれを固体基質に対する結
合から外して本発明による不向′１！り系での試薬とし
て使用することができる。さらに、この技術は特にビオ
チニル化レクチンおよびビオチニル化多糖類の作成に利
用することもできる。これら生成物、並びに酵素−レク
チン複合体を使用してその他の酵素、糖蛋白質などを包
含する他の大型複合体を装造するごとができる。
標識１１ Ｎへの同定にｔＩＹ素複素体合体用する技術
は、本出願人による１９８３年５月２０付は出願の米国
特許出階部４９０，７１２号明ＩＩＩ書に開示されてい
る。この特許出願の開示をここに本出願の開示の１部と
して引用する。この米国特許出願は、たとえばＤＮＡお
よびＲＮＡのような遣１云物質の分析に対する技術を記
載している。
は、本出願人による１９８３年５月２０付は出願の米国
特許出階部４９０，７１２号明ＩＩＩ書に開示されてい
る。この特許出願の開示をここに本出願の開示の１部と
して引用する。この米国特許出願は、たとえばＤＮＡお
よびＲＮＡのような遣１云物質の分析に対する技術を記
載している。
分析し或いは同定すべき遺伝物質を変性させ、基質に固
定し、かつたとえば化学標識された試（；コ１のような
同定すべき遺伝物質に対し補完的なヌクレオナト配列を
存する試料とハイブリット化させる。化学標識試料と同
定すべきＤＮＡとの間のハイブリッド化の後、クロモゲ
ンと接触させて不溶性の着色沈澱物もしくは着色生成物
を与えるのに効果的な酵素成分を試料に結合させる。こ
れらの技術を本発明による不均質検出系に応用すること
ができ、改善された感度５精度および／または速度をも
って遺伝物質の分析および検出を可能にする。本発明の
不均質検出系は、特に周知の分析ＤＮＡ技術、たとえば
ザウザンブロノ１分析、ノーザンブロソト分１斤。
定し、かつたとえば化学標識された試（；コ１のような
同定すべき遺伝物質に対し補完的なヌクレオナト配列を
存する試料とハイブリット化させる。化学標識試料と同
定すべきＤＮＡとの間のハイブリッド化の後、クロモゲ
ンと接触させて不溶性の着色沈澱物もしくは着色生成物
を与えるのに効果的な酵素成分を試料に結合させる。こ
れらの技術を本発明による不均質検出系に応用すること
ができ、改善された感度５精度および／または速度をも
って遺伝物質の分析および検出を可能にする。本発明の
不均質検出系は、特に周知の分析ＤＮＡ技術、たとえば
ザウザンブロノ１分析、ノーザンブロソト分１斤。
ウェスタンプし１７ト分析、コロニーハイブリッド化・
プラークリフト、 ＄＋１＋胞質トノトハイブリソド化
などの分析技術において、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡ
のような遺伝物質を同定するのに特に有用である。
プラークリフト、 ＄＋１＋胞質トノトハイブリソド化
などの分析技術において、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡ
のような遺伝物質を同定するのに特に有用である。
以下、実施例により、たとえばピト絨毛ゴナトｌ−＋：
＋ピンおよびＤＮＡのような各種物質の検出に向のられ
る本発明の実施につき説明する。
＋ピンおよびＤＮＡのような各種物質の検出に向のられ
る本発明の実施につき説明する。
ビオチニル化ＤＮＡおよびグリコジル化ＤＮＡを使用す
る試験において、標識ＤＮＡをプロット試験技術により
補完的ＤＮＡにハイブリット比させ、このハイブリッド
化ＤＮＡを適当な基質に固定する。実施例１は本発明の
広範な不均質検出系に一致する組み合せを含み、基質に
対する物質の固定に際し、特異的な生物学的物質に対す
る抗体を使用すること、生物学的物質に結合しうるレク
チンを使用すること、およびレクチンに対し特異的な信
号成分を使用することを含む。
る試験において、標識ＤＮＡをプロット試験技術により
補完的ＤＮＡにハイブリット比させ、このハイブリッド
化ＤＮＡを適当な基質に固定する。実施例１は本発明の
広範な不均質検出系に一致する組み合せを含み、基質に
対する物質の固定に際し、特異的な生物学的物質に対す
る抗体を使用すること、生物学的物質に結合しうるレク
チンを使用すること、およびレクチンに対し特異的な信
号成分を使用することを含む。
ソこｈ旬１列 １
ヒト絨毛ゴリー１゛トロピン（ＩＩＣＧ）に対するモノ
クローナル抗体を、臭化シアノーゲンを用いてデキスＩ
・ラン（セファロース）ビーズへ結合さ・Ｕた。結合剤
としてのその使用に加え、臭化シアノーゲンはレクチン
コンカナバリンＡに対するセファロースの親和性の殆ど
を破壊する。
クローナル抗体を、臭化シアノーゲンを用いてデキスＩ
・ラン（セファロース）ビーズへ結合さ・Ｕた。結合剤
としてのその使用に加え、臭化シアノーゲンはレクチン
コンカナバリンＡに対するセファロースの親和性の殆ど
を破壊する。
ガラスピーズまたはポリアクリルアミドビーズをデキス
トランビーズの代りに使用して、コンカナバリンＡ結合
の比較レベルを最小にすることもできる。
トランビーズの代りに使用して、コンカナバリンＡ結合
の比較レベルを最小にすることもできる。
２５０μｌのセファロースビーズを２０μｐ（〜６７０
単位）のＨＣＧを含有する調製物と共に室温にて約４５
分間培養した。比較試験においては、ホルモンを添加し
ないか、或いは存在させなかった。セファロースビーズ
を２．５ ｍｌの燐酸緩徂ｉ塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄
した。各洗浄の後、ビーズを１１０００Ｘの遠心分離に
より１分間分！！ｌｌｌシた。上′ａ液を捨て、次いで
ビーズを２ｍｌの０，２モルイミダゾ−／ｌ／ 緩ｆｆ
ｆｊ液（ｐ１１６．８）、１ミリモルＭｎ” 、ｌ ミ
’） 七）Ｌｉ Ｃａ”で１回洗浄した。これらビーズ
を再び遠心分離により分＋Ｍｌｌ Ｌだ。コンカナバリ
ンＡ結合を最大化１− ルイミダゾールＭｎ−Ｃａ緩衝
液を選択した。
単位）のＨＣＧを含有する調製物と共に室温にて約４５
分間培養した。比較試験においては、ホルモンを添加し
ないか、或いは存在させなかった。セファロースビーズ
を２．５ ｍｌの燐酸緩徂ｉ塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄
した。各洗浄の後、ビーズを１１０００Ｘの遠心分離に
より１分間分！！ｌｌｌシた。上′ａ液を捨て、次いで
ビーズを２ｍｌの０，２モルイミダゾ−／ｌ／ 緩ｆｆ
ｆｊ液（ｐ１１６．８）、１ミリモルＭｎ” 、ｌ ミ
’） 七）Ｌｉ Ｃａ”で１回洗浄した。これらビーズ
を再び遠心分離により分＋Ｍｌｌ Ｌだ。コンカナバリ
ンＡ結合を最大化１− ルイミダゾールＭｎ−Ｃａ緩衝
液を選択した。
次いで、ビーズを５０ｇの沃素化：ｌンヵリーハリンＡ
（０，２モルイミダゾール緩ｉｈ液４００μｐにおけ
る６ ４００ｃｐｍ ７１１ｇの比活性、ｐｌ＋６．８
、ＩｔυモルＭｎ＋＋および１ミリモルｃａ＋＋）で処
理した。室温にて約３０分間培養した後、これら試料を
５ｍｌの０．２モルＮａＣｌで３回洗浄した。
（０，２モルイミダゾール緩ｉｈ液４００μｐにおけ
る６ ４００ｃｐｍ ７１１ｇの比活性、ｐｌ＋６．８
、ＩｔυモルＭｎ＋＋および１ミリモルｃａ＋＋）で処
理した。室温にて約３０分間培養した後、これら試料を
５ｍｌの０．２モルＮａＣｌで３回洗浄した。
最後の洗浄からの上澄液における放射能は約６７ ｃｐ
ｍ ／ １００μｌであった。次いで、これらビーズを
遠心分離により分離し、０．２モルＮａＣｌにＩＹ！′
、濁させ、そして計数した。Ｉ−Ｉ ＣＧを含有する試
料につき２３１，８４０ ｃｐｍが結合され、比較につ
いては１１７，１５０ ｃｐｍが結合された。
ｍ ／ １００μｌであった。次いで、これらビーズを
遠心分離により分離し、０．２モルＮａＣｌにＩＹ！′
、濁させ、そして計数した。Ｉ−Ｉ ＣＧを含有する試
料につき２３１，８４０ ｃｐｍが結合され、比較につ
いては１１７，１５０ ｃｐｍが結合された。
結合コンカナバリンＡの放射能測定に加え、ビーズに固
定されたＨ ＣＧに結合しているコンカナバリンＡの存
在を本発明の実施により測定し７、この際酵素を結合コ
ンカナバリンＡに添加しかつ固定させる。このように結
合された酵素の存在を常套手段により、ずなわぢコンカ
ナバリンＡ結合した酵素と反応する適当な酵素クロ／ ［ゲン含有基質を与えることにより測定または証明する
。上記の例において、ＨＣＧと結合する抗体、レクチン
に対し結合したＩ（ＣＧ、コンカリ−バリンΔおよび゛
ｌＪｊ＋蛋白質に結合したレクチン、酵素を含む不均質
検出系を使用した。
定されたＨ ＣＧに結合しているコンカナバリンＡの存
在を本発明の実施により測定し７、この際酵素を結合コ
ンカナバリンＡに添加しかつ固定させる。このように結
合された酵素の存在を常套手段により、ずなわぢコンカ
ナバリンＡ結合した酵素と反応する適当な酵素クロ／ ［ゲン含有基質を与えることにより測定または証明する
。上記の例において、ＨＣＧと結合する抗体、レクチン
に対し結合したＩ（ＣＧ、コンカリ−バリンΔおよび゛
ｌＪｊ＋蛋白質に結合したレクチン、酵素を含む不均質
検出系を使用した。
上記の例において、結合コンカナバリンへの１７１の測
定は、ストレプトアビジン−ビオチニル化西洋ワサヒベ
ルオキシダーゼ酵素複合体による検出を可１ｊピにする
。本発明による不均質検出系によれば、ストレプトアビ
ジンはコンカナバリンＡに幻しビオチニル化西洋ワサビ
ペルオキシダーゼと共に結合し、かつ固定されたストレ
プトアビジン−ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダー
ゼは固定西洋ワサビペルオキシダーゼに関与する適当な
りロモゲンもしくは発色性または着色物生成反応により
証明される。
定は、ストレプトアビジン−ビオチニル化西洋ワサヒベ
ルオキシダーゼ酵素複合体による検出を可１ｊピにする
。本発明による不均質検出系によれば、ストレプトアビ
ジンはコンカナバリンＡに幻しビオチニル化西洋ワサビ
ペルオキシダーゼと共に結合し、かつ固定されたストレ
プトアビジン−ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダー
ゼは固定西洋ワサビペルオキシダーゼに関与する適当な
りロモゲンもしくは発色性または着色物生成反応により
証明される。
実施例２
ビオチニル化ＤＮＡおよびストレプトアビジン−ヒオチ
ン西洋ワサビベルオキシダーセにより生成ささる複合体
は、ニトロセルロース紙に結合した１ ００ ｐｃｇの
ＤＮＡの検出を可能にする。ストレゾ１−アヒジンービ
オナンワサワザビペルオキシダーセによるビオチニル化
ＤＮＡのこの感度しｊ、」二記米国ｑ−’ｒ許出ＩＱ」
１第１１９０，７１２ ’号明８１０ Ｆｊに示されて
いる。グリコジル比ＤＮＡの測定に列するグリコジル化
ＤＮＡおよびレクチンはそれ程感度か良くない。グリコ
ジル化ＤＮへの検出に列するレクチン系の使用は、しか
しながら有利である。何故なら、酵素はグリコツル化さ
れているが、直接にグリコジル化ＤＮＡ−レクチンに対
し、阿らの操作なしに結合されうるからである。本発明
の特殊成分、すなわちビオチニル化レクチンは、本発明
におりる特殊技術を提供してＤＮＡ検出のためのグリコ
ジル化ＤｔｙｌＡ−レクチン系を改善する。
ン西洋ワサビベルオキシダーセにより生成ささる複合体
は、ニトロセルロース紙に結合した１ ００ ｐｃｇの
ＤＮＡの検出を可能にする。ストレゾ１−アヒジンービ
オナンワサワザビペルオキシダーセによるビオチニル化
ＤＮＡのこの感度しｊ、」二記米国ｑ−’ｒ許出ＩＱ」
１第１１９０，７１２ ’号明８１０ Ｆｊに示されて
いる。グリコジル比ＤＮＡの測定に列するグリコジル化
ＤＮＡおよびレクチンはそれ程感度か良くない。グリコ
ジル化ＤＮへの検出に列するレクチン系の使用は、しか
しながら有利である。何故なら、酵素はグリコツル化さ
れているが、直接にグリコジル化ＤＮＡ−レクチンに対
し、阿らの操作なしに結合されうるからである。本発明
の特殊成分、すなわちビオチニル化レクチンは、本発明
におりる特殊技術を提供してＤＮＡ検出のためのグリコ
ジル化ＤｔｙｌＡ−レクチン系を改善する。
天然のグリコジル化ＤＮＡ（Ｔ午 ファージＤ、ＮΔ）
およびニック昂１釈されたビオチニル化ＤＮへを使用し
てＤＮＡドツトプロットを作成した。ＤＮＡドツトプロ
ットを含有するニトロセルロースなどのフィルタを、こ
れに対するレクチン、ずなわぢコンカナバリンＡの非特
異的結合を防止すべく処理した。この手順は約５０°Ｃ
にて２％ＢＳＡで阻止し、ＳＳＣにて１回洗浄し、かつ
０，１％の表面活性剤トリトンＸ −１００と接触さ・
Ｕて行なった。次いで、これらＤＮＡトノドブＩＩＩノ
ドを処理した。
およびニック昂１釈されたビオチニル化ＤＮへを使用し
てＤＮＡドツトプロットを作成した。ＤＮＡドツトプロ
ットを含有するニトロセルロースなどのフィルタを、こ
れに対するレクチン、ずなわぢコンカナバリンＡの非特
異的結合を防止すべく処理した。この手順は約５０°Ｃ
にて２％ＢＳＡで阻止し、ＳＳＣにて１回洗浄し、かつ
０，１％の表面活性剤トリトンＸ −１００と接触さ・
Ｕて行なった。次いで、これらＤＮＡトノドブＩＩＩノ
ドを処理した。
これらＤＮＡドツトプロットを、予め二ツク１’ｉｌ＋
訳により約２０％ビオチニル化の程度までビオチニル化
した補完的ＤＮＡと接触さゼだ。これらの試験を丁記第
■表に示す。
訳により約２０％ビオチニル化の程度までビオチニル化
した補完的ＤＮＡと接触さゼだ。これらの試験を丁記第
■表に示す。
第■表
ビオチニル化ＤＮＡ キャリヤＤＮＡ
２ Ｂ ４．５ ｎｇ
ｌ、 ０ｇ ’ ４．５ ｎｇ
５００ ｐｃｔ ４．５ｎｇ
２５０ ｐｅｇ ４．５ ｎｇ
１２５ ｐｃＩ！’ ４．５ ｎａ
６２．５ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ
３１．２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ
ｌ５．６２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ 比較阻止後、ス
トレプトアビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダー
ゼ複合体をビオチニル化ＤＮＡプロットに対し２０μβ
／ ｃｎｌの量で添加し、次いで３７゛Ｃにて４５分間
培養した。これらプロットをそれぞれ高塩緩衝液で５分
間ずつ３回かつそれぞれ低塩緩衝液にて室温で５分間ず
つ２回洗浄した。その後、ＤＡＢ（１０℃リモルのトリ
スにおりる０、５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７，６−ＩＯ９０２
％ＣｏＣｌ２ ）を暗所中で約０℃にて１０分間加えた
。その後、０．０２％のＨ２０２−を加えて複合体を直
ちに検出した。
トレプトアビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダー
ゼ複合体をビオチニル化ＤＮＡプロットに対し２０μβ
／ ｃｎｌの量で添加し、次いで３７゛Ｃにて４５分間
培養した。これらプロットをそれぞれ高塩緩衝液で５分
間ずつ３回かつそれぞれ低塩緩衝液にて室温で５分間ず
つ２回洗浄した。その後、ＤＡＢ（１０℃リモルのトリ
スにおりる０、５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７，６−ＩＯ９０２
％ＣｏＣｌ２ ）を暗所中で約０℃にて１０分間加えた
。その後、０．０２％のＨ２０２−を加えて複合体を直
ちに検出した。
グリコジル１ヒＴ＋フアージＤＮＡを用いるグリコジル
化ＤＮＡプロットを、下記箱■表に示すように試験した
： 第■表 ］ファージＤＮＡ キャリヤＤＮＡ ５００ ｐｃｇ４．５ ｎｇ ２５０ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ １２５１＋ｃ、ｒ！４．５ ｎ（Ｈ ６２，５ρｃｇ ４．５ ｎｇ ３．１．２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ ｌ５．６２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｔＸ７．８１２５
ｐｃｇ ４．５ ｎｇ ３．９ ｐｃｇ ４．５ Ｂ 比較 ゾロノドを阻止した後、ビオチニル化コンカナバリンへ
をプロットのストリップへ、５ミリ℃ル トリス（ｐｌ
＋７．０ ） 、１ミリモル ＭｎＣｌ２．１ミリモル
ＣａＣｌ□ および１００ミリモルＮａＣｌとしノこ′
ｒＣＭＮｌ容ン皮における２０μＩｉ ／ ｃＪまたば
１００μＨ／ｍｌの量で施こし、これらプロットを３７
°Ｃで室温にて１時間培養した。実験績−果は、Ｔ Ｃ
Ｍ Ｎ ＨＨ市液（１００〜２００ｍ１）による洗／１
１が高いバンクグランドにトロセルロースＡＧＥに対す
るコンカナバリンへの非特異的結合）を与えたことを示
している。
化ＤＮＡプロットを、下記箱■表に示すように試験した
： 第■表 ］ファージＤＮＡ キャリヤＤＮＡ ５００ ｐｃｇ４．５ ｎｇ ２５０ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ １２５１＋ｃ、ｒ！４．５ ｎ（Ｈ ６２，５ρｃｇ ４．５ ｎｇ ３．１．２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｇ ｌ５．６２５ ｐｃｇ ４．５ ｎｔＸ７．８１２５
ｐｃｇ ４．５ ｎｇ ３．９ ｐｃｇ ４．５ Ｂ 比較 ゾロノドを阻止した後、ビオチニル化コンカナバリンへ
をプロットのストリップへ、５ミリ℃ル トリス（ｐｌ
＋７．０ ） 、１ミリモル ＭｎＣｌ２．１ミリモル
ＣａＣｌ□ および１００ミリモルＮａＣｌとしノこ′
ｒＣＭＮｌ容ン皮における２０μＩｉ ／ ｃＪまたば
１００μＨ／ｍｌの量で施こし、これらプロットを３７
°Ｃで室温にて１時間培養した。実験績−果は、Ｔ Ｃ
Ｍ Ｎ ＨＨ市液（１００〜２００ｍ１）による洗／１
１が高いバンクグランドにトロセルロースＡＧＥに対す
るコンカナバリンへの非特異的結合）を与えたことを示
している。
したがって、１ミリモルのグルコース溶液を他の実験に
おいて洗浄緩衝液に置換した。これらの実験におい°ζ
、ニトロセル１；１−スｌ虐紙に４１′けるグリコジル
化ＤＮへフ゛ロットを２％ＢＳＡにより５０゛Ｃで阻止
し、ＳＳＣおよび０．１％表面活性剤トリトンＸ−１０
０で１回りシ洋した。
おいて洗浄緩衝液に置換した。これらの実験におい°ζ
、ニトロセル１；１−スｌ虐紙に４１′けるグリコジル
化ＤＮへフ゛ロットを２％ＢＳＡにより５０゛Ｃで阻止
し、ＳＳＣおよび０．１％表面活性剤トリトンＸ−１０
０で１回りシ洋した。
７０ＭＮ緩衝液における１００μＨ／ｍｌまたは２０μ
ｊ！ ／ ｃＡの量のビオチニル化コンカナバリンＡを
３７°Ｃで６０分聞方１１ｉこし、次いでそれぞれ１ミ
リモルのα−Ｄ−グルコースにより５分間づつ５回洗浄
もしくは浸漬し、或いはそれぞれＴＣＭＮにより５分間
づつ３回浸漬し、または洗浄した。次いで、ストレプト
アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体を３７℃にて３０分間施し、高塩緩ｆｌｌｊ液および
低塩緩衝液で洗浄し、次いで上記と同様にＤＡＢ−Ｔ（
２０２を用いてプロットを検出した。測定した結果は、
グリコジル化Ｄ Ｎ Ａの検出に対する極めて向上した
感度を示している。
ｊ！ ／ ｃＡの量のビオチニル化コンカナバリンＡを
３７°Ｃで６０分聞方１１ｉこし、次いでそれぞれ１ミ
リモルのα−Ｄ−グルコースにより５分間づつ５回洗浄
もしくは浸漬し、或いはそれぞれＴＣＭＮにより５分間
づつ３回浸漬し、または洗浄した。次いで、ストレプト
アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体を３７℃にて３０分間施し、高塩緩ｆｌｌｊ液および
低塩緩衝液で洗浄し、次いで上記と同様にＤＡＢ−Ｔ（
２０２を用いてプロットを検出した。測定した結果は、
グリコジル化Ｄ Ｎ Ａの検出に対する極めて向上した
感度を示している。
上記実施例は、１つのりガントもしくは反応または親和
性のみに依存しない本発明による不均質検出系の有能性
および広範な応用性を示し−（いる。目標物質にビオチ
ン成分を結合した場合、アビジンもしくはストレプトア
ビジン−ビオチン酵素、たとえばストレプトアビジン−
ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼからなる酵素複
合体を含む均質検出系が知られている。
性のみに依存しない本発明による不均質検出系の有能性
および広範な応用性を示し−（いる。目標物質にビオチ
ン成分を結合した場合、アビジンもしくはストレプトア
ビジン−ビオチン酵素、たとえばストレプトアビジン−
ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼからなる酵素複
合体を含む均質検出系が知られている。
目標物質がグリコジル化ＤＮＡである場合、グリコジル
化ＤＮＡまたはその他の目標物質に結合した糖基に結合
させるためのレクチンおよびレクチンに結合しうる酵素
または酵素複合体を含む均質検出系も知られている。レ
クチンは目標成分、ずなわぢグリコジル化ＤＮＡと酵素
からなる信号成分との両者に結合する。
化ＤＮＡまたはその他の目標物質に結合した糖基に結合
させるためのレクチンおよびレクチンに結合しうる酵素
または酵素複合体を含む均質検出系も知られている。レ
クチンは目標成分、ずなわぢグリコジル化ＤＮＡと酵素
からなる信号成分との両者に結合する。
しかしながら、本発明による不均質検出系において、好
適具体例は、ビオチンとアビジンま）こばビオチンとス
トレプトアビジンとの間の親和性およびレクチンと糖蛋
白質との間の親和性を含む組み合せを使用する。この不
均質検出系は、効果上、２種の均質検出系の特徴を予想
外に組み合せている。たとえば、目標がビオチン基、た
とえばビオチニル化ＤＮＡを含有する場合、検出系はア
ビジンもしくはストレプトアビジンとビオチニル化レク
チンとを含有する複合体を使用する。この複合体は目標
のビオチン部分に固定され或いは結合し、たとえば西洋
ワサビペルオキシダーゼのようなグリコジル基を有する
酵素を複合体のレクチン部分に接触させ、或いは固定す
ることにより証明される。次いでこの酵素を活性化し或
いは使用して、アビジン−ビオチニル化しクヂン複合体
に対する結合を指令する。さらに、アビジン−ビオチニ
ルｊヒレクチン複合体は、酵素複合体、ずなわらストレ
プトアビジン−ビオチニル化酵素、たとえばストレプト
アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼと接触
させて証明することができる。
適具体例は、ビオチンとアビジンま）こばビオチンとス
トレプトアビジンとの間の親和性およびレクチンと糖蛋
白質との間の親和性を含む組み合せを使用する。この不
均質検出系は、効果上、２種の均質検出系の特徴を予想
外に組み合せている。たとえば、目標がビオチン基、た
とえばビオチニル化ＤＮＡを含有する場合、検出系はア
ビジンもしくはストレプトアビジンとビオチニル化レク
チンとを含有する複合体を使用する。この複合体は目標
のビオチン部分に固定され或いは結合し、たとえば西洋
ワサビペルオキシダーゼのようなグリコジル基を有する
酵素を複合体のレクチン部分に接触させ、或いは固定す
ることにより証明される。次いでこの酵素を活性化し或
いは使用して、アビジン−ビオチニル化しクヂン複合体
に対する結合を指令する。さらに、アビジン−ビオチニ
ルｊヒレクチン複合体は、酵素複合体、ずなわらストレ
プトアビジン−ビオチニル化酵素、たとえばストレプト
アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼと接触
させて証明することができる。
グリコジル化されたまたは糖類含有の目標物質を決定す
るため、ビオチニル化レクチンをこれに直接結合させ、
次いでたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のよう
な′ＩｆＭ蛋白質を固定レクチンへ結合さ・ける。固定
酵素の存在は、適当な着色変化反応により直接に証明さ
れる。さらに、目標物質に結合したビオチニル化レクチ
ンを酵素複合体、たとえばストレプトアビジンビオチン
西洋ワサビペルオキシダーゼと接触さセることができる
。この系は２つの信号を与え、１つはレクチンに対する
酵素の直接結合により与えられ、また１つはビオチニル
化レクチンのビオチン成分に対するストレプトアビジン
−ビオチン酵素複合体の結合により与えられる。
るため、ビオチニル化レクチンをこれに直接結合させ、
次いでたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のよう
な′ＩｆＭ蛋白質を固定レクチンへ結合さ・ける。固定
酵素の存在は、適当な着色変化反応により直接に証明さ
れる。さらに、目標物質に結合したビオチニル化レクチ
ンを酵素複合体、たとえばストレプトアビジンビオチン
西洋ワサビペルオキシダーゼと接触さセることができる
。この系は２つの信号を与え、１つはレクチンに対する
酵素の直接結合により与えられ、また１つはビオチニル
化レクチンのビオチン成分に対するストレプトアビジン
−ビオチン酵素複合体の結合により与えられる。
また、し・クチンは糖蛋白質に対する親和性を有しかつ
アヒ゛ジンとストレプトアビジンとは１店蛋白質である
ため、標識されていないレクチンをビオチニル化レクチ
ンと共にまたはその代りに使用することができる。
アヒ゛ジンとストレプトアビジンとは１店蛋白質である
ため、標識されていないレクチンをビオチニル化レクチ
ンと共にまたはその代りに使用することができる。
本発明の不均質検出系におりるビオチニル化レクチンお
よびビオチニル化酵素の用途につき」１記に説明した。
よびビオチニル化酵素の用途につき」１記に説明した。
他の特殊成分、すなわちたとえばビオチニル化デキスト
ランもしくはビオチニル化アガロースのようなビオチニ
ル化多糖力°！も本発明に利点をもたらす。たとえば糖
類標識した目標物質の検出において、レクチンをグリ：
１シル化ＤＮＡと接触させてこれに結合させろ。
ランもしくはビオチニル化アガロースのようなビオチニ
ル化多糖力°！も本発明に利点をもたらす。たとえば糖
類標識した目標物質の検出において、レクチンをグリ：
１シル化ＤＮＡと接触させてこれに結合させろ。
次いで、デキストランまたはビオチニル化デキストラン
をレクチンと接触させて、グリコジル１ヒＤＮＡに固定
させる。アギスト９フ１月はレクチンに結合し、かつ結
合したデキストランはレクチン−酵素複合体との接触に
より証明され、レクチン−酵素複合体のうちレクチンは
デキストランに結合している。ビオチニル化デキストラ
ンをデキストランの代りに或いはそれに加えて使用すれ
ば、目標に固定されたレクチンに結合したビオチニル化
デキストランは後に添加されたレクチン酵素複合体との
接触、並びにアビジンもしくはストレプトアビジン−ビ
オチン−酵素複合体との接触により証明することができ
る。アビジンもしくはストレプトアビジン−ビオチン複
合体はビオチニル化デキストランのビオチン成分に結合
する。試料または信号発生レクチン−酵素複合体および
／またはアビジンもしくはストレプトアビジン−ビオチ
ン酵素複合体と結合さ−Ｕ・るためデキストランまたは
ビオチニル化デ；トストランにより多くの部位が与えら
れるので、相当な信号増幅もしくは増大が得られる。
をレクチンと接触させて、グリコジル１ヒＤＮＡに固定
させる。アギスト９フ１月はレクチンに結合し、かつ結
合したデキストランはレクチン−酵素複合体との接触に
より証明され、レクチン−酵素複合体のうちレクチンは
デキストランに結合している。ビオチニル化デキストラ
ンをデキストランの代りに或いはそれに加えて使用すれ
ば、目標に固定されたレクチンに結合したビオチニル化
デキストランは後に添加されたレクチン酵素複合体との
接触、並びにアビジンもしくはストレプトアビジン−ビ
オチン−酵素複合体との接触により証明することができ
る。アビジンもしくはストレプトアビジン−ビオチン複
合体はビオチニル化デキストランのビオチン成分に結合
する。試料または信号発生レクチン−酵素複合体および
／またはアビジンもしくはストレプトアビジン−ビオチ
ン酵素複合体と結合さ−Ｕ・るためデキストランまたは
ビオチニル化デ；トストランにより多くの部位が与えら
れるので、相当な信号増幅もしくは増大が得られる。
したがって、本発明によれば、信号の増大もしくは（、
ｙＬ＋幅は、レクチンもしくはビオチニル化レクチンと
組み合せてデキストランもしくはビオチニル化デキスト
ランを使用して結合させ、ざらにレクチン複合体または
アビジンもしくはストレプＩ・アビジン酵素複合体また
はアビジン−ビオチン−デキストラン複合体を結合させ
、Ｑ終的にレクチン−酵素複合体またはストレプトアビ
ジンもしくはアビジン−ビオチン酵素複合体を使用する
。
ｙＬ＋幅は、レクチンもしくはビオチニル化レクチンと
組み合せてデキストランもしくはビオチニル化デキスト
ランを使用して結合させ、ざらにレクチン複合体または
アビジンもしくはストレプＩ・アビジン酵素複合体また
はアビジン−ビオチン−デキストラン複合体を結合させ
、Ｑ終的にレクチン−酵素複合体またはストレプトアビ
ジンもしくはアビジン−ビオチン酵素複合体を使用する
。
ビオチニル化された、またはグリコジル化された、また
は糖標識された目標物質を検出するための本発明におい
て、多くの組み合せを使用することができる。これらの
組み合せはレクチン、ビオチニル化レクチン、デキスト
ランもしくは多糖１ｊ１．ビオチニル化デキストランも
しくハｅ 糖％Ｉｉ 、アビジン、レクチン−アビジン
’ｆｋ合体、レクチンー酵素複合体、アビジンもしくは
ストレプトアビジン−ビオチニル化酵素複合体およびビ
オチニル化糖蛋白質を包含する。特にレクチンおよびビ
オチニル化レクチンとの関連において、免疫学上活性な
物質、たとえば抗原１抗体および反抗体を本発明の組み
合せ不均質検出系に使用することができる。たとえば、
米国１）Ｍ許第４．２１１９．７４７ ｓ３が挙げられ
、その開示をここに本山１９１の開示の１部として引用
する。
は糖標識された目標物質を検出するための本発明におい
て、多くの組み合せを使用することができる。これらの
組み合せはレクチン、ビオチニル化レクチン、デキスト
ランもしくは多糖１ｊ１．ビオチニル化デキストランも
しくハｅ 糖％Ｉｉ 、アビジン、レクチン−アビジン
’ｆｋ合体、レクチンー酵素複合体、アビジンもしくは
ストレプトアビジン−ビオチニル化酵素複合体およびビ
オチニル化糖蛋白質を包含する。特にレクチンおよびビ
オチニル化レクチンとの関連において、免疫学上活性な
物質、たとえば抗原１抗体および反抗体を本発明の組み
合せ不均質検出系に使用することができる。たとえば、
米国１）Ｍ許第４．２１１９．７４７ ｓ３が挙げられ
、その開示をここに本山１９１の開示の１部として引用
する。
以上、本発明を好適具体例につき説明したが、」１記の
説明から本発明の思想および範囲を逸脱することなく多
くの改変、置換および変更をなしうろことが当業者には
了解されよう。
説明から本発明の思想および範囲を逸脱することなく多
くの改変、置換および変更をなしうろことが当業者には
了解されよう。
特許出願人 エンシー ハイオケム
二Ｊ−ｖＬ： ネ市 ｊＪ＝ ’ｒＭ” （方ｊυ１、
Ｊｌ’ｌの表示 昭［１０００年 特語願 第２０９９６し２、発明の名
称 ３、？山」［をする＝Ｕ １川！１との閏Ｉ系 Ｉｌｊ、許出願人（ＪＥＩ−リｉ
アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州１００１３、ニュ
ー ヨーニハｌソン ストＩＪ−１・３２５番 名称 エンシー ハイオゲム ・インコーボレ・イテノ
１イし表と エラザール ラハンニー （国ＮＸ） （−？メッカ合衆国） ４、代理人
Ｊｌ’ｌの表示 昭［１０００年 特語願 第２０９９６し２、発明の名
称 ３、？山」［をする＝Ｕ １川！１との閏Ｉ系 Ｉｌｊ、許出願人（ＪＥＩ−リｉ
アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州１００１３、ニュ
ー ヨーニハｌソン ストＩＪ−１・３２５番 名称 エンシー ハイオゲム ・インコーボレ・イテノ
１イし表と エラザール ラハンニー （国ＮＸ） （−？メッカ合衆国） ４、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （］）ビオチニル化されたレクチンを含む複合体。 （２）アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチニル
化された酵素よりなる群からｉｆｆ Ｉｌｉ！されるＩ
ｆｄｔもしくはそれ以上の要素をさらに含む特許請求
の範囲第１項記載の複合体。 （３）ｒｉＶ素が酸性ボスファターゼ、グルコースオキ
シダーゼ、西洋ワザビペルオキシダービ。 アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーＪ？、
クロ１：Ｊベルオキシダーゼおよびモナミンオキシダー
ゼよりなる群から選１尺されることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の複合体。 （４）レクチンがコンカナバリンＡ、大豆アグルチニン
、小麦胚芽アグルチニン、ウレソクス・７Ｊ−１コベウ
ス・アグルチニンＩ、落花生アグルチニン、リシヌス・
コムニス・アグルチニン■、ソｙ ムオルス・ブルガリ
ス・アグルヂニン、ヤボニカ・アグルチニン、 ｌ’：
Ｉ−トス種イレクチンおよび馬鈴薯レクチンよりなる群
から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１項
または第２項記載の複合体。 （５）レクチンとアビジンおよびストレプトアビジンよ
りなる群から選択される糖蛋白質とを含む複合体。 （６）酵素およびビオチニル化された酵素よりなる１１
′１から選択される１種もしくはそれ以上の′）！Ｓ素
をさらに含む特許請求の範囲第５ｒｒｉ記載の複合体。 （７）レクチンがコンカナバリンＡ、大豆アグルチニン
、小麦胚芽アグルチニン、ウレノクス・ヨーロベウス・
アグルチニンＩ、落花生アグルチニン、リシヌス・コム
ニス・アグルチニンｌ、ファセオルス・ブルガリス・ア
グルチニン、ヤボニカ・アグルチニン、ロートス種子レ
クチンおよび馬鈴薯レクチンよりなる群から選択される
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項記
載の複合体。 （８）酵素が酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ。 アルカリ性ボスファクーゼ、β−ガラクトシダーセ゛、
クロロペルオキシダーゼおよびモナミンオキシダーゼよ
りなる群から選択されるごと４：特徴とする特許ｉ１７
をの範囲第６項記載の複合体。 （９）Ｌ−クチンとビオチニル化された多糖類とを含む
複合体。 （１０）酵詣、ビオチニル化された酵素、アビジンおよ
びストレプトアビジンよりなる群から選択される１種も
しくはそれ以上の要素をさらに含む特許請求の範囲第９
項記載の複合体。 （１１）レクチンがコンカナバリンΔ、大豆アグルチニ
ン、小麦胚芽アグルチニン、ウレソクス・ヨーロペウス
・アグルチニン１．落花生アグルチニン、リシヌス・コ
ムニス・アグルチニン■、ファセオルス・ブルガリス・
アグルチニン、ヤボニカ・アグルチニン、ロートス種子
レクチンおよび馬鈴薯レクチンよりなるｉＹから選択さ
れることを特徴とする特許請′５Ｙの範囲第９項または
第１０項記載の複合体。 （１２）酵素がアルカリ性ボスファターゼ、酸性ボスフ
ァターゼ、グルコースオキシダーセ、β−ガラクトシダ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、モナミンオキシダ
ーゼおよびクロロペルオキシダーゼよりなる群から選択
されることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の
複合体。 （１３）レクチンと、１゛唐類と、ビオチニル化された
酵素と、アビジンおよびストレプトアビジンよりなる群
から選択される糖蛋白質とを含む複合体。 （１４）Ｍ’素がアルカリ性ボスファターＵ、酸性ボス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、西洋ワザビペルオギシダーゼ、モナミンペルオ
キシダーゼおよびりＬ月１ペルオキシダーゼよりなる群
から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１３
項記載の複合体。 （１５）糖類が単糖類および多糖類よりなる群から選択
されることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の
複合体。 （１Ｇ）レクチンがコンカナバリンＡ、大豆アグルチニ
ン、小麦胚芽アグルチニン、ウレノクス・ヨー１：Ｊペ
ウス・アグルチニン■、落花生アグルチニン、リシヌス
・コムニス・アグルチニンＩ、ファセオルス・ブルガリ
ス・アグルチニン１ヤボニカ・アグルチニン１ ロート
ス種イレクチンおよび馬鈴薯レクチンよりなる群から選
択されることを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載
の複合体。 （１７）ビオチニル化されたデキストランを含む複合体
。 （１８）レクチンと、酵素と、アビジンおよびストレプ
トアビジンよりなる群から選択される糖−蛋白質とをさ
らに含む特許請求の範囲第１７項記載の複合体。 （１９）酵素がビオチニル化ヒされていることを特徴と
する特許請求の範囲第１８項記載の複合体。 （２０）レクチンがビオチニル化されていることを特徴
とする特許請求の範囲第１９項記載の複合体。 （２１）レクチン結合した酵素をさらに含む特許請求の
範囲第１９項記載の複合体。 （２２） ｉｉ；１３ｒ４成分で標識された少なくとも
】個のヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドがビオチ
ニル化されたレクチンとビオチニル化されたｔ１ケ素と
アビジンおよびストレプトアビジンよ、りなる群から選
択される糖蛋白質とからなる複合体と結合したことを特
徴とするストランドを含むハイブリット化二重鎖ＤＮＡ
配列。 （２３）複合体がビオチニル化されたデキストランをさ
らに含むことを特徴とする特許請求の範囲第２２項記載
のＤＮＡ配列。 （２４）糖類成分が単糖類および多糖類よりなる群から
選択されることを特徴とする特許請求の範囲第２２項ま
たは第２３項記載のＤＮＡ配列。 （２５） 酵Ｊがアルカリ性ボスファターゼ、酸性ホス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、モナミンオキシ
ダーゼおよびクロロベルオキソダーゼよりなる群から選
択されることを特徴とする特許請求の範囲第２２項また
は第２３項記載のＤＮＡ配列。 （２６）ビオチニル化されたレクチンと酵素とアビジン
およびストレプトアビジンよりなる群から選択される糖
蛋白質とからなる複合体を結合した少なくとも１個のビ
オチニル化されたヌクレオチ１−′を特徴とするストラ
ンドを含むハイブリノＩζ化二重鎮ＤＮＡ配列。 （２７）糖類成分で標識された少なくともｌｌｌ１ｉＩ
のヌクレオチドを含み、かつ前記標識されたヌクレオチ
ドにレクチンとデキストラン生酵素とからなる複合体を
結合してなり、レクチンの１部を前記糖類と前記デキス
トランとに結合し、かつレクチンの他の１部を前記デキ
ストランと前記酵素とに結合したことを特徴とするスト
ランｌ′を含むハイブリット化二重鎮ＤＮＡ配列。 （２８）糖類成分が単糖類および多糖類よりなる群から
選択されることを特徴とする特許請求の範囲第２７項記
載のＤＮＡ配列。 （２９）ビオチニル１ヒされたヌクし・オチトを、ビオ
チニル化されたレクチンと酵素とアビジンおよびストレ
プトアビジンよりなる群から選択される糖蛋白質とから
なる複合体に接触させることを特徴とするビオチニル化
されたヌクレオチドの存在の決定方法。 （３０）ヌクレオチドのグリコジルもしくは才ｐｉ ！
Ｊｔ成分を、セフチンと酵素とからなる複合体に接触さ
せることを特徴とするグリコジル化されたまたは糖類標
識されたヌクレオチドの存在の決定方法。 （３１）レクチンがビオチニル化され、酵素がビオチニ
ル化され、かつ複合体がアビジンおよびストレプトアビ
ジン る糖蛋白ＷＴをさらに含むことを特徴とする特許請求の
範囲第３０項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57873284A | 1984-02-09 | 1984-02-09 | |
| US578732 | 1984-02-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188095A true JPS60188095A (ja) | 1985-09-25 |
Family
ID=24314075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60020996A Pending JPS60188095A (ja) | 1984-02-09 | 1985-02-07 | 受容部または目標部を形成する化学標識されたｄｎａおよびその他の生物学的物質を検出するための不均質系 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4889798A (ja) |
| EP (1) | EP0151492B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60188095A (ja) |
| AT (1) | ATE133261T1 (ja) |
| AU (1) | AU3844485A (ja) |
| CA (1) | CA1314810C (ja) |
| DE (1) | DE3588078T2 (ja) |
| DK (1) | DK61085A (ja) |
| ES (2) | ES8802188A1 (ja) |
| IL (1) | IL74262A0 (ja) |
| NO (1) | NO850493L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07165800A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-27 | Res Dev Corp Of Japan | 人工蛋白質超分子とその製造法 |
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| ES8707343A1 (es) * | 1985-06-13 | 1987-07-16 | Amgen | Un metodo para aislar una secuencia de acido nucleico objetivo seleccionada |
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