CN101600805A - 与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法 - Google Patents

与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种不需要从细胞分离细胞膜等而能够直接使用活细胞且能够大范围地检测出与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物的简便且成本低的方法；本发明的目的还在于提供一种用于实施本发明的方法的试剂盒。本发明的与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法的特征在于，该方法包括：使具有能够与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物作用于细胞的工序；使具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物进一步作用于细胞的工序；对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的工序。

Description

与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测与细胞膜上的分子相互作用的化合物的方法、以及一种用于实施该方法的试剂盒。
背景技术
在构成细胞膜的磷脂双分子层中，存在大量的蛋白质或除磷脂以外的脂质等，且有的具有作为增殖因子受体、细胞粘附因子、离子通道等的功能。这些细胞膜上的分子能够在细胞膜内比较自由地移动，并重复地进行聚集和解离。尤其是多个细胞膜上的分子聚集而露出在细胞膜表面的称作筏(raft)的物质，起着成为细菌或病毒等的受体或细胞外信息向细胞内传达时的平台等重要的作用。因此，认识某些细胞膜上的分子与其它的什么样的细胞膜上的分子协作而发挥作用，在生物化学的研究上是极其重要的。
然而，细胞膜上的分子间的相互作用的解析非常困难。例如，作为分离检测与某靶蛋白质相互作用的蛋白质的方法，已知使特异性抗体与靶蛋白质作用而使其选择性地沉淀的免疫沉淀法。但是，该方法很难反映靶蛋白质和其它的蛋白质在生理条件下相互作用的状态。这是因为在该方法中，即使是其它的蛋白质与靶蛋白质在细胞膜上相互作用的情况，在从细胞膜分离了靶蛋白质的阶段也会有该相互作用消失的可能性。另外，虽然在活细胞的细胞膜上未发生相互作用，但是也有在蛋白质的分离阶段发生假性的相互作用的情况。
另外，已知将交联剂与靶蛋白质结合，使其与相互作用的蛋白质交联而进行识别的交联法。但是，在该方法中，由于交联剂分子的长度和形状被固定，因此能够被交联并检测出的只是一部分紧贴着的蛋白质。其结果，在通过该交联法进行的细胞膜上的分子间的相互作用的解析中，成功例很少。
因此，正在研究通过上述以外的方法来检测细胞膜上的分子间的相互作用的专门的技术。
例如，在专利文献1中，记载着与存在于细胞膜上的ABC(ATP BindingCassette)蛋白质相互作用的物质的筛选方法。该方法使显露着ABC蛋白质的膜组分、标记的三磷酸核苷、二磷酸核苷固定化物质、以及被测物质相接触。
另外，在专利文献2中记载着如下的方法：通过使细胞中膜贯通型蛋白质显露，再接触候补化合物，并检测未接触候补化合物时的膜贯通型蛋白质的分布变化，由此来筛选与膜贯通型蛋白质相互作用的候补化合物。
专利文献1：特开2005-24245号公报
专利文献2：特表2005-522227号公报
发明内容
存在于细胞膜上的蛋白质等的分子间的相互作用的检测，不仅在生物化学的研究上非常重要，而且在药剂开发上也非常重要，用于该检测的技术也正在开发。
但是，如专利文件1和2中记载的那样的技术中，具有必须事前对与细胞膜上的靶蛋白质相互作用的化合物进行预测、精制、试验的缺点。那样的话，必须预先得到关于多个细胞膜上的分子的知识，且不能检测细胞膜上的靶分子和未知分子之间的相互作用。另外，这些现有技术很难检测3种以上的分子之间的相互作用。
因此，本发明要解决的问题是提供一种不需要从细胞分离细胞膜等而能够直接使用活细胞、且能够大范围地检测出与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物的简便且成本低的方法。另外，本发明的目的还在于提供一种用于实施本发明的方法的试剂盒。
本发明的发明人为了解决上述问题进行了反复深入的研究。其结果发现了如果应用自由基反应就能够达到上述目的。即，由于自由基化合物的反应性能非常高，能够与很多化合物尤其是蛋白质以共价键结合。而且，由于自由基化合物因其高的反应性能而不能稳定地存在，所以只与附近的化合物结合。因此，通常认为，如果应用自由基反应，只与附近的与靶化合物相互作用的化合物反应的可能性大，干扰少。
本发明的与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法的特征在于，该方法包括：使具有能够与细胞膜上的靶分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物作用于细胞的工序；
使具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物进一步作用于细胞的工序；
对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的工序。
本发明的试剂盒为用于实施上述本发明的方法的试剂盒，其中，该试剂盒包括：具有能够与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物；具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物；对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的手段。
附图说明
图1是表示只使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素时小鼠血清蛋白质等被生物素化的图表；
图2是表示只使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体和伴刀豆球蛋白A凝集素(ConA)时蛋白质等被生物素化的图表；
图3是表示添加了具有自由基消除作用的抗坏血酸时的生物素标记度的图表；
图4是表示本发明的方法中生物素标记反应的时间依赖性和HRP浓度依赖性的图表；
图5是表示使用了TS2/16抗体和作为二次抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体这两者时、和未使用TS2/16抗体只使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体时，与人宫颈癌细胞上的β1整合素相互作用的生物素标记化合物的差异的电泳结果；
图6是表示使用了TS2/16抗体和作为二次抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体这两者时、和未使用TS2/16抗体只使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体时，与人脑胶质瘤T98细胞上的β1整合素相互作用的生物素标记化合物的差异的电泳结果；
图7是(1)表示使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素化合物时、(2)表示只使用了烯丙基叠氮基-生物素化合物时，使用抗体微阵列对与β1整合素相互作用的受体酪氨酸激酶进行解析后的结果的照片；(3)表示使用NHS-生物素对各受体酪氨酸激酶的表达量进行解析后的结果的照片；
图8是(1)表示使用了HRP标记CTxB和烯丙基叠氮基-生物素化合物时、(2)表示使用了未标记CTxB和烯丙基叠氮基-生物素化合物时，使用抗体微阵列对与GM1相互作用的受体酪氨酸激酶进行解析后的结果的照片；(3)表示使用NHS-生物素对各受体酪氨酸激酶的表达量进行解析后的结果的照片。
具体实施方式
本发明的与细胞膜上的分子相互作用的化合物的检测方法的特征在于，该方法包括：
使具有能够与细胞膜上的靶分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物作用于细胞的工序(第一工序)；
使具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物进一步作用于细胞的工序(第二工序)；
对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的工序(第三工序)。
本发明的方法为检测与存在于细胞膜上的生物分子相互作用的化合物的方法。因此，根据本发明的方法，使关于细胞膜上的靶分子的作用的基础性研究或在组织间的相互作用的差异的检测等成为可能。例如，有可能使癌细胞和正常细胞中的差异变得清楚。
细胞膜上存在着各种各样的细胞膜上的分子。例如存在于细胞膜上的蛋白质，有存在于磷脂双分子层的表层的表面性蛋白质、和至少一部分存在于磷脂双分子层中的内在性蛋白质等。本发明中所谓的存在于“细胞膜上”是指至少一部分露出于细胞膜的外侧。例如，作为细胞膜上的蛋白质，除其一部分存在于细胞内、一部分露出于细胞膜的外侧的蛋白质以外，还有直接与磷脂结合的蛋白质、或者通过脂质或寡糖而与细胞膜结合的蛋白质、与露出于细胞膜的外侧的蛋白质进一步结合的蛋白质等。该蛋白质的功能没有特别的限定，例如，有将从来自于细胞外的化合物得到的信息传达到细胞内、或者将细胞内的信息传达到细胞外等的功能等。
细胞膜上的分子的种类没有特别的限定。例如，除了上述的蛋白质以外，还有脂质等。另外，存在结合于蛋白质上的糖链的一部分或全部露出于细胞膜外的情况，此时也包括这样的糖链。尤其，含有糖链的脂质是细胞膜的重要的构成成分之一，脂质部分存在于磷脂双分子层，糖链部分露出于细胞外。通常认为该糖脂在筏被浓缩而存在，与筏的生成有关。
“相互作用”的种类没有特别的限定，不仅包括通过共价键或静电偶合等具体的键而发挥功能的情况，还包括蛋白质和一个以上的化合物比较地接近而发挥功能的情况。
与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物没有特别的限定，可以例示出例如：存在于细胞膜中的蛋白质、糖脂、磷脂、胆固醇等，还有，离子或配体等来自于细胞外的信息传达物质等。
以下，按照实施的顺序对本发明的方法详细地说明。
(1)第一工序
在本发明中，首先，使具有与细胞膜上的靶分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物作用于细胞。通过该工序，能够使具有自由基化功能的部分与细胞膜上的靶分子选择性地结合。
细胞膜上的靶分子，适当选择将要识别与该分子相互作用的化合物的靶分子即可，对其种类等没有特别的限定。与该细胞膜上的分子选择性地结合的部分，可以根据细胞膜上的靶分子适当选择。可以举出例如：与细胞膜上的分子特异性结合的抗体、或与该分子上所结合的糖链等特异性地结合的肽等。优选使用抗体。另外，在一次抗体与细胞膜上的靶分子结合时，该选择性结合的部分也可以为将该一次抗体进行二次标记的抗体。
所谓自由基化促进部分，是指能够将后述的第二工序中使用的化合物自由基化的部分。将化合物自由基化时，通常使用过氧化氢等的过氧化物或光等，但它们会对活细胞造成损伤。由于本发明的方法的特征在于：能够检测活细胞的细胞膜中的化合物之间的相互作用，因此不能使用对活细胞造成损伤的物质。作为该自由基化促进部分，可以例示出辣根过氧化物酶等的过氧化物酶、或氯高铁血红素等的血红素化合物等。
本工序中使用的化合物具有与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分。这些部分可以直接被结合，也可以通过肽链或亚烷基等的交联基团(リンカ一基)结合。作为这些部分直接被结合的化合物，可例示出：细胞膜上的靶分子的抗体等的通过自由基促进部分被修饰的化合物。该化合物可以利用市售的化合物，或者可以通过使用HRP(辣根过氧化物酶)标记试剂盒等的常规方法来配制。
使具有与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化部分的化合物作用于细胞时，向细胞添加该化合物的水溶液，再进行培养(Incubate)即可。该化合物的水溶液的浓度可以适当调整，通常相对于培养液的浓度为1-100μg/mL的程度即可。培养的条件也可以考虑所使用的细胞的种类和酶的最适温度而适当调整，通常为在0℃至37℃的程度下进行10分钟至5小时的程度即可。
培养后，为了除去过量的上述化合物而对细胞进行洗涤。洗涤通过多次重复在除去上清液后加入PBS(磷酸盐缓冲液)等并平稳地搅拌的操作即可。
(2)第二工序
接下来，使具有能够被上述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物作用于经过了第一工序的细胞。在该工序中，通过与靶化合物选择性地结合的自由基化促进部分使该化合物被自由基化，并与附近的化合物结合。
被自由基化促进部分自由基化的基团，使用与所使用的自由基化酶相应的基团即可。例如，可以使用适当地选自羟基、叠氮基、卤素基团、吲哚基等中的的至少一种。
标记基团的种类也没有特别的限定，可以使用生物化学领域中所使用的标记基团。例如，可以使用生物素；若丹明类、荧光素类、德克萨斯红(テキサスレツド)类、花色素苷类等的荧光显色基团；含32P、35S、14C等的放射性同位素的取代基；用于标记的肽；以及半抗原等。
能够被自由基化的基团和标记基团，从为了使标记基团不受自由基的影响、或使其合成变得容易等的理由考虑，优选通过交联基团进行结合。作为交联基团，可以例示出：亚烷基、醚基、硫醚基、叠氮基、以及这些基团的两种以上的组合。
作为该化合物的具体的例子，可举出下述的化合物。在下述化合物中，能够被自由基化的基团为叠氮基-羟苯基，标记基团为生物素基团。但是，在下述化合物中，交联基团的具体的结构，除了减小自由基对标记基团的影响、和使化合物的合成变得容易以外，没有特殊的意义，因此可以取代为其它的交联基团。
Figure A20088000331400111
具有能够被自由基化的基团和标记基团的化合物以溶液状态添加到细胞即可。具体来说，使用10-100μg/mL程度的水溶液即可。该化合物难溶于水时，也可以以不会对所使用的细胞造成不良影响的程度添加二甲亚砜或乙醇等的有机溶剂。
能够被自由基化促进部分自由基化的化合物，由于反应性能高，在自由基的状态下能够移动的距离短，所以只与存在于细胞膜上的靶分子附近的分子结合。例如，有以下见解：通过激光分子失活法产生的羟基自由基的移动距离最大为半径约为1.5nm、通过荧光辅助光失活法(Fluorophore-assistedlight inactivation)产生的单线态氧自由基的移动距离约为1-50nm(J.C.Liao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2659(1994年)、S.Beck等，Proteomics，2，247(2002年)等)。另外，本发明的发明人使用胶体金粒子和电子显微镜进行了不同的实验，暗示了由辣根过氧化物酶产生的自由基存在于距探针分子100nm以内。从以上的见解可知，通过本发明的反应产生的自由基能够与距细胞膜上的靶分子100nm以内的分子结合，且不与存在于更远的位置的分子结合。
反应的条件适当调整即可，例如可以为在0℃-37℃下进行5分钟至1小时的程度。另外，为了抑制光引起的自由基化，反应优选在暗处进行。
上述反应后，通过洗涤除去过量的化合物。更具体地说，通过多次重复在除去上清液后在PBS等的存在下平稳地搅拌的操作即可。
(3)第三工序
在该工序中，对与被自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别。更具体来说，首先，用匀浆器等将细胞物理破碎。结果，细胞膜被细小地破碎而成为被称为微粒体的直径约为100nm的小细胞(小胞)。将该微粒体通过离心分离等由核分离，将得到的微粒体组分利用裂解液等溶解。
然后，使用得到的溶解液，通过例如蛋白质印迹、抗体阵列、质谱分析法、免疫沉淀法、免疫组织染色等的常规方法来识别标记的化合物。这些方法可以通过考虑主要在第二工序中使用的标记基团的种类来进行选择，另外，也可以将这些方法两种以上组合而使用。
作为更具体的方法，例如，首先将得到的溶解液中所含的化合物分离。具体的分离方法从生物化学领域中通常使用的方法中适当选择即可。例如，可以使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或凝胶过滤色谱等利用分子量对化合物进行分离的方法、或者使用与抗体结合的微阵列的方法等。
将化合物分离后，根据对应于所使用的标记基团的方法，对标记的化合物进行识别。例如，在使用荧光显色基团作为标记基团时，用荧光显色基团中固有的荧光波长进行解析即可。在使用生物素作为标记基团时，通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素使生物素化的酶特异性结合。作为该酶，只要使用碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶等，并使对应于各酶的显色试剂作用，就能够对标记的化合物进行识别。另外，由于标记基团通过自由基反应在与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物上以共价键结合，所以即使经过上述工序，也不会与该化合物分离。
本发明的试剂盒为用于实施上述本发明的方法的试剂盒，其中，该试剂盒包括：
具有能够与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物；
具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物；
对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的手段。
本发明的试剂盒中，各化合物和识别的手段可以使用与本发明的方法中说明过的相同的物质。
根据本发明的方法，能够使用活细胞大范围地检测出与存在于细胞膜上的生物分子相互作用的化合物。此时，不需要对可能相互作用的化合物进行事前预测、分离并使用。而且，本发明的方法可以非常简便地且低成本地实施。因此，本发明的方法以及用于实施本发明的方法的试剂盒，不仅在生物化学的研究上，在药剂开发等上也能够利用，因此在产业上极其重要。
实施例
以下通过列举实施例对本发明进行更详细地说明，但是，本发明当然不受下述实施例的限定，可以在能够适合上述·后述的宗旨的范围内适当进行变更而实施，它们均包括在本发明的技术范围内。
实施例1
向表面经MaxiSorp处理后的96孔微孔板(Nunc制)中添加小鼠血清(Cedarlane Laboratories制)的20％的PBS溶液，通过在37℃下培养40分钟，用小鼠血清将表面覆盖。用2％的BSA-PBS溶液(牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液)阻断后，添加50μL的未标记抗小鼠IgG抗体(10μg/mL；CHEMICON制)、HRP标记抗小鼠IgG抗体(10μg/mL；Promega制)、FITC标记抗小鼠IgG抗体(10μg/mL；DAKO制)、或者HRP标记抗兔IgG抗体(10μg/mL；cappel制)，各自在室温下培养40分钟。洗涤培养板并在冰上冷却后，在各孔中添加50μL下述烯丙基叠氮基-生物素化合物的PBS溶液(40μg/mL；Pierce制)，在暗处在4℃下培养10分钟。
Figure A20088000331400141
然后，将各孔洗涤后，为了除去结合的抗体而添加2M盐酸，在室温下培养40分钟。再次将各孔仔细地洗涤后，在各孔内使用ABC检测试剂盒(Vector laboratories制)检测生物素化的分子。使用邻苯二胺并以490nm的吸光度测定显色。另外，为了比较，只添加各抗体不添加烯丙基叠氮基-生物素时，以及不添加各抗体只添加烯丙基叠氮基-生物素时，也同样地进行试验。各孔中的显色强度的测定结果如图1所示。
如图1所示，使用了HRP标记抗小鼠IgG抗体时，烯丙基叠氮基-生物素化合物通过HRP(辣根过氧化物酶)的作用与存在于板表面的蛋白质结合，显色强度被选择性地提高。
实施例2
在实施例1中使用的板中添加山羊血清(Dako制)的20％的PBS溶液，通过在37℃下培养40分钟，用山羊血清将表面覆盖。用2％的BSA-PBS溶液阻断后，添加50μL的伴刀豆球蛋白A外源凝集素或者HRP标记伴刀豆球蛋白A外源凝集素(各自10μg/mL；生化学工业制)，各自在室温下培养40分钟。洗涤板并在冰上冷却后，在各孔中添加50μL实施例1中烯丙基叠氮基-生物素化合物的PBS溶液(40μg/mL；Pierce制)，在暗处在4℃下培养10分钟。另外，由于伴刀豆球蛋白A外源凝集素识别高甘露糖型糖链、混合型糖链、以及双链复合型糖链等，所以能够与板表面上的大量的血清糖蛋白质结合。将各孔洗涤后，为了除去结合的伴刀豆球蛋白A外源凝集素而添加2M盐酸，在室温下培养40分钟。然后，与实施例1同样地操作，测定结合于板表面的生物素的量。结果如图2所示。
如图2所示，使用了HRP标记伴刀豆球蛋白A外源凝集素时，烯丙基叠氮基-生物素化合物通过HRP的作用与存在于板表面的蛋白质结合，显色强度被选择性地提高。
实施例3
在实施例1和2中，只有使用了用HRP标记的IgG或者伴刀豆球蛋白A外源凝集素的情况，生物素才与存在于板表面的蛋白质结合，这认为是烯丙基叠氮基-生物素化合物被HRP自由基化的原因，这一点通过实验得到了证实。具体来说，在使用了用HRP标记的IgG或者伴刀豆球蛋白A外源凝集素时，与烯丙基叠氮基-生物素化合物一起，测定了因添加具有自由基捕捉能力的1mM的抗坏血酸引起的相对的显色强度的变化。以未添加抗坏血酸时的吸光度(OD490)为100％，添加了抗坏血酸时的相对值如图3所示。
如图3所示，添加了抗坏血酸时，约90％的生物素的结合受阻碍。因此，烯丙基叠氮基-生物素化合物通过HRP被自由基化而结合于板表面这一情况得到了证实。
实施例4
在实施例1中，使用HRP标记抗小鼠IgG抗体、或者不使用，将与烯丙基叠氮基-生物素化合物的反应时间变更为1分钟、3分钟或者5分钟，进行同样的实验。另外，将HRP标记抗小鼠IgG抗体的浓度变更为1、2或者20μg/mL，进行同样的实验。变更了反应时间的实验的结果如图4的(1)所示，变更了HRP标记抗小鼠IgG抗体的浓度的实验的结果如图4的(2)所示。
如图4的(1)和图4的(2)所示，HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素化合物的反应依赖于反应时间和HRP的量而进行。因此，可知该反应为酶反应。
实施例5
使用含有10％FBS的RPMI 1640培养基(Sigma制)，将人宫颈癌细胞HelaS3细胞在37℃、5％CO2气氛下进行培养。然后，将培养细胞在4℃下冷却20分钟后，用PBS洗涤一次，添加含有结合于β1整合素的TS2/16抗体的杂交瘤培养液(8μg/mL)，在4℃下培养1小时。接着，添加用于二次标记TS2/16抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(10μg/mL；Promega制)，在4℃下培养1小时。用PBS洗涤后，添加实施例1中使用的烯丙基叠氮基-生物素化合物的40μg/mL的PBS溶液，在4℃下在暗处培养30分钟。用PBS二次洗涤后，用含有5％的FBS(或者2％的BSA)以及蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor cocktail、Sigma制)的50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl、pH为7.4)将细胞回收至艾本德试管(Eppendorf tube)，使用带有21G针头的注射器进行破碎。以3000rpm离心5分钟除去核后，收集微粒体组分，并用裂解液(20mM的Tris-HCL、pH为7.4)、150mM的NaCl、5mM的EDTA、1％的NP-40、10％的甘油、以及蛋白酶抑制剂)溶解。
在非还原条件下使用8％的凝胶将上述得到的试剂进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到PVDF膜上，使用ABC检测试剂盒和化学发光免疫印迹检测试剂(ECL western blot detection reagents、Amashambioscience制)，检测被生物素化的蛋白质。另外，作为阴性对照，除未使用TS2/16抗体以外，进行同样的实验。结果如图5所示。另外，图中的“2nd Ab”表示作为二次抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体。
如图5所示，未使用TS2/16抗体只使用HRP标记抗小鼠IgG抗体时，在120kDa和91kDa附近可以看到条带。可以认为这是来自内在性的生物素持有分子、或具有与烯丙基叠氮基生物素的反应性能的内在性分子的条带。另一方面，使用了TS2/16抗体时，不仅在120kDa和91kDa附近可以看到条带，还检测出各种各样的蛋白质。这表示能够检测出与β1整合素相互作用的蛋白质，其中β1整合素与TS2/16抗体直接结合。因此，证实了通过本发明的方法能够检测与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物。
实施例6
用与实施例5同样的方法来培养人胶质瘤T98细胞。对该培养细胞进行与实施例5同样的处理后，检测被生物素化的蛋白质，结果如图6所示。
如图6所示，与未使用TS2/16抗体只使用HRP标记抗小鼠IgG抗体时相比，使用了TS2/16抗体和HRP标记抗小鼠IgG抗体这两者时，生物素标记化条带在约200kDa附近被确认。另外，综合考察图5和图6的结果时，明确了：即使是来自于同一个人的细胞，在宫颈癌细胞和胶质瘤细胞中，与β1整合素相互作用的化合物也不同。
实施例7
通过与实施例5同样的方法，使HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素化合物依次作用于HelaS3细胞，得到微粒体组分的溶解试剂。将该试剂添加到点样有42种抗受体酪氨酸激酶抗体的抗体阵列(R&Dsystems制，Human Phospho-RTK Array)中，在4℃下培养过夜。洗涤后，用与实施例5同样的方法检测被生物素化的受体酪氨酸激酶。另外，作为比较，除未使用TS2/16抗体以外进行同样的条件的实验。进一步，替代HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素化合物的组合，使用作为非特异性的生物素标记化试剂的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-生物素，进行确认各受体酪氨酸激酶的表达量的实验。使用了TS2/16抗体的结果如图7的(1)所示，未使用该抗体的结果如图7的(2)所示，使用了NHS-生物素的结果如图7的(3)所示。
如图7所示，使用HRP标记抗小鼠IgG抗体和烯丙基叠氮基-生物素化合物对与β1整合素相互作用的化合物进行解析的结果可知，多种受体酪氨酸激酶在相互作用着。另外，从在未使用HRP标记抗小鼠IgG抗体时，完全未检测出被生物素标记的受体酪氨酸激酶，由此可知在本发明的方法中干扰极少。进一步，将图7的(1)和图7的(3)进行比较，可以看出，β1整合素和受体酪氨酸激酶的相互作用的强度，与从图7的(3)能够掌握的各受体酪氨酸激酶的表达量不相关。
如上所述，证实了本发明的方法能够正确地且以良好的灵敏度检测与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物。
实施例8
使烯丙基叠氮基-生物素化合物作用于用与实施例5同样的方法培养的HelaS3细胞，并继续作用于与作为糖脂的GM1特异性地结合的HRP标记霍乱毒素B亚基(CTxB)或者未标记的CTxB，得到微粒体组分的溶解试剂。对于得到的溶解试剂，使用与实施例7同样的抗体阵列，检测与GM1相互作用的受体酪氨酸激酶。进一步，与实施例7同样地使用NHS-生物素进行确认各受体酪氨酸激酶的表达量的实验。使用了HRP标记CTxB和烯丙基叠氮基-生物素化合物的结果如图8的(1)所示，使用了未标记CTxB和烯丙基叠氮基-生物素化合物的结果如图8的(2)所示，使用了NHS-生物素的结果如图8的(3)所示。
如图8所示，使用了HRP标记CTxB和烯丙基叠氮基-生物素化合物时，作为与作为糖脂的GM1相互作用的化合物，仅检测出了主要的两种受体酪氨酸激酶。它们为表皮生长因子受体和酪氨酸激酶受体(ephrin)A2。由该结果可知只有特别限定的受体酪氨酸激酶与GM1相互作用。与此相对，在使用NHS-生物素对各受体酪氨酸激酶的表达量进行确认的实验中，可知除上述的两种以外的受体酪氨酸激酶也在细胞中表达。因此，可知GM1与受体酪氨酸激酶的相互作用不依赖于受体酪氨酸激酶的表达量。
如上所述，证实了通过本发明的方法能够选择性地检测与细胞膜上的靶分子相互作用的化合物。

Claims (6)

1、一种检测与细胞膜上的分子相互作用的化合物的方法，其特征在于，该方法包括：
使具有能够与细胞膜上的靶分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物作用于细胞的工序；
使具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物进一步作用于细胞的工序；
对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的工序。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，使用辣根过氧化物酶或者血红素化合物作为所述自由基化促进部分。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用选自由羟基、叠氮基、卤素基团、以及吲哚基组成的组中的一种或两种以上作为所述能够被自由基化促进部分自由基化的基团。
4、根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，使用生物素、荧光显色基团、含放射性同位素的基团、标记肽、或者半抗原作为所述标记基团。
5、根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，通过蛋白质印迹、抗体阵列、质谱分析法、免疫沉淀法、或者免疫组织染色来识别结合有自由基化的化合物的细胞膜上的分子。
6、一种用于实施权利要求1-5中任意一项所述的方法的试剂盒，其中，该试剂盒包括：
具有能够与细胞膜上的分子选择性地结合的部分和自由基化促进部分的化合物；
具有能够被所述自由基化促进部分自由基化的基团和标记基团的化合物；
对与被所述自由基化促进部分自由基化的化合物结合的化合物进行识别的手段。
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