KR19990014922A

KR19990014922A - 항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법

Info

Publication number: KR19990014922A
Application number: KR1019970708268A
Authority: KR
Inventors: 퓨선 자이티노글루; 프랜즈 비. 씨바우트
Original assignee: 에이치. 리 브라운; 그리니치테크놀로지스
Priority date: 1994-06-01
Filing date: 1996-05-14
Publication date: 1999-02-25
Also published as: EP0685980A3; DE4419249A1; DK0685980T3; KR100270632B1; ES2122390T3; EP0685980B1; EP0685980A2; JPH0847090A; ATE170697T1; DE59503410D1; US5581624A

Abstract

항원에 목적을 갖는 항체를 생체의 일부에 접촉시킨다. 생성된 항체/항원 복합체를 표지하고, 증폭시킬 수도 있다. 그런후, 동일 반응계 또는 비동일 반응계에서 표지된 항체/항원을 검정한다.

Description

항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법

비동일 반응계, 즉, 생체로부터 제거된 조직, 유체 또는 그 밖의 시료에서 항원을 검정하는 다수의 장치 및 방법이 공지되어 있다. 전형적인 원안에서, 단백질을 토끼, 사람 또는 그 밖의 숙주에 주입시키고, 숙주로 하여금 단백질에 대하여 항체를 생성시키도록 한 후, 숙주로부터 혈청을 제거 및 정제함으로써 표적 단백질상의 하나 이상의 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 그런후, 항체/항원 복합체의 형성을 선호하는 환경하에서 항체를 시료와 접촉시킨다. 항원의 양이 적거나 항체/항원 결합이 불량한 경우와 같이 신호가 미약한 경우에는, 일회 이상의 증폭 단계를 사용할 수도 있다. 전형적으로는, 육안식별이 가능한 색소포, 방사선, 형광, 올리고누클레오티드 또는 그 밖의 마커를 항체 또는 증폭 시약중의 하나에 접촉시켜서 항원 복합체의 검정을 용이하게 한다. 본원에서 사용되는 용어 표지와 마커는 본원에서 상호 대체적으로 사용된다.

상기 방법에서 사용된 항체는 표적 항원에 따라 다소 특이적으로 선택될 수 있으며, 보다 큰 또는 보다 작은 효율로 표적 항원에 결합할 수 있다. 전형적으로, 유용한 항체는 표적 항원에 대하여 우수한 특이성 및 표적 항원과의 약 10-10⁹의 결합 상수(ka)를 가질 것이다. 또한, 항체는 다클론성 또는 단클론성, 또는 두가지의 조합된 형태일 수 있다.

찰스 캔터(Charles Cantor)에 의해 고안된 공지된 면역 검정 방법에서는 두 개의 상이한 항체가 사용된다. 제 1 단계에서는, 비오틴화된, 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용하여 표적 항원(들)을 검정하고, 그런후, 제 2 단계에서는 항체를 사용하여 복합된 비오틴에 결합된 비오틴을 검정한다. 이러한 방법에서, 시험하고자 하는 시료를 제 1 항체를 함유하는 용액중에서 먼저 인큐베이션시킨다. 표적 항원이 존재하면, 몇몇 항체는 항원에 결합하여 비오틴화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 그런후, 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오틴화된 DNA, 및/또는 상보적 비오틴화된 DNA 용액에 연속적으로 인큐베이션시킴으로써 항체/항원 복합체를 증폭시키고, 각 단계 마다 항체/항원 복합체에 추가의 비오틴 부위를 첨가한다. 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지 증폭 단계를 반복하고, 각 단계의 마지막에는 비오틴에 대한 제 2 항체를 함유하는 용액중에서 상기 용액을 인큐베이션시킨다. 예를 들어, 색원체 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검정하는데 사용할 수 있는 효소로 상기의 제 2 항체를 표지한다. 적합하게 증폭시킨다면, 육안으로 식별할 수 있는 컨쥬게이트를 생성시킬 수 있다.

또 다른 공지된 면역 검정 방법은 면역-PCR (폴리머라아제 연쇄 반응) 방법(2)에 유리하다. 그러나, PCR 방법은 많은 횟수의 스트렙타비딘 및 비오틴화된 DNA 인큐베이션을 사용하는 대신에 비오틴화된 DNA로 인큐베이션까지는 캔터 방법과 유사하지만, 항체를 방출시킬 정도의 pH가 낮거나 높은 염 완충액을 사용하여 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 세척한다. 그런후, 생성된 세척 용액을 사용하여 적합한 대조군을 갖는 적합한 프라이머와 PCR 반응을 수행시킨다. 적어도 이론적으로는, PCR의 대규모 증폭 능력 및 이의 특성을 이용하여 단일 항원 분자를 검정한다.

또 다른 방법은 분자 임프린팅(imprinting) 기술(참조예: 출원인이 모스바취(Mosbach)인 미국특허 제 5,110,833호)에 의해 유용한 합성 항체를 이용할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 항체(들)는 합성 항체 및 그 밖의 항체 상동물을 포함한다.

이들 및 그 밖의 공지된 면역 검정 방법을 무생물에, 및 비동일 반응계에서 살아있는 세포(예를 들어, 종양 세포 (3))에 적용하였지만, 우리가 아는 바로는 동일 반응계에서는 결코 적용되지 않았다. 본원에서 사용되는 용어 동일 반응계는 항원 결합 단계 동안에 생체검사되거나, 그렇지 않은 경우에, 생체로부터 제거되는 것에 반하여, 항체 결합 단계 동안에 여전히 생체에 결합된 조직, 세포, 유체 및 그 밖의 생체의 일부를 언급한다. 본원에서 언급된 생체 및 생체의 일부는 사람, 동물 및 식물의 일부일 수 있다.

생체 일부에 항원의 동일 반응계내 검정 방법을 적용하는 것은 매우 바람직하다. 예를 들어, 상기 방법은 실험실 또는 임상 세팅 영역의 외부에서 조직 시료를 취하지 않으면서 수행될 수 있다. 상기 결과를 거시적으로 가시화하는 경우에, 상기 방법은 현미경 또는 판 판독기와 같은 특수한 장치를 필요로 하지 않으면서 또한 수행될 수 있다(4). 예를 들어, 환자의 피부와 같은 생체 표면상 항원의 동일 반응계내 검정은 피부 표면상에 나타나는 바이러스, 박테리아, 균류 및 미코플라즈마와 같은 다수의 병원을 가려내는 분야에 용이하여, 건선과 같은 피부 질환을 검정하는데 도움이 될 수 있다. 항원의 동일 반응계내 검정은 검정이 개방 상처부위 또는 절개부위에서 또는 생체 충치의 구멍 부위에서 수행되는 것과 같이 피부의 표면 하부에 존재하는 항원을 검정하는데 또한 사용될 수 있다. 이들 및 그 밖의 경우에, 본원에서 상세하게 설명된 하나 이상의 장치 및 방법을 생체 일부에 적용하여 검정할 수 있는 경우에 항원은 생체 일부와 가장 밀접하게 관련되어 있다고 한다.

피부에서의 랑게르한스 및 그 밖의 분화된 세포가 존재하기 때문에, 항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법은 AIDS 및 몇몇 암을 포함하는 전신계 질환을 검정하고 예지하는데 또한 사용될 수 있다. 랑게르한스는 약 2%의 사람의 피부 세포 집단을 포함하는 전문적인 항원 제공 세포(APCs)이다. 이들 세포는 광범위한 국부 또는 전신 질환에 특성적인 피부 표면 순환 항원에서 축적되어 제공되는, 피부의 항원 제공 세포 및 외부의 항원 단편용 수탁소 둘 모두로서 작용한다. 예를 들어, AIDS의 경우에, 사람의 면역결핍 바이러스가 랑게르한스 세포(5)를 감염시킬 수 있다는 것과, 존재하는 랑게르한스 세포가 HIV-1 개그(gag) 단백질을 함유할 수 있으며 이들의 막(6,7)으로부터 싹트기 시작한 바이러스 입자를 갖는다는 것은 공지되어 있다. 프로바이러스 DNA(5), 및 태트(tat), 회전, 네프 및 외피 mRNA(8)는 랑게르한스 세포에서 입증되었고, HIV-특이적 핵산은 PCR을 사용하는 생체검사된 피부 견본(8)의 표면상에서 검정되었다.

물론, 질병 면역의 동일 반응계내 검정 방법은 반드시 랑게르한스 세포에 의존할 필요는 없다. 예를 들어, 케라틴세포는 사람의 유두종 바이러스(HPV)의 일차적인 표적인 상피세포이며, HPV 항원용 국부 시험은 본원에 상기한 장치 및 방법에 따라 발전될 수 있었다.

따라서, 항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법을 제공하는 것이 요구된다.

본 발명은 항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법에 관한 것이다.

도 1은 환자의 피부에 환 모양의 리테이너의 적용을 도시하는 다이아그램이다.

도 2는 제 1 및 제 2 항체를 사용하여 생체의 일부에서 항원을 검정하는 방법을 도시하는 다이아그램이다.

도 3은 면역-PCR을 사용하여 생체의 일부에서 항원을 검정하는 방법을 도시하는 다이아그램이다.

도 4는 항원을 확인하는 대안적인 원안으로부터 중요한 연속 단계를 도시하는 도면이다.

본 발명은 항체가 동일 반응계에서 생체의 일부에 접촉되고, 그런후, 생성된 항체/항원 복합체가 검정되는 항원의 동일 반응계 또는 비동일 반응계내 면역 검정 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태에서, 리테이너(retainer)를 환자의 피부 또는 점막과 같은 생체의 일부에 대고, 하나 이상의 제 1 항체를 리테이너 영역내에서 생체의 일부와 접촉시킨다. 몇몇의 제 1 항체는 생체의 일부 또는 그 인근의 부분에서 항원과 결합되고, 비결합된 제 1 항체는 세척된다. 그런후, 항체/항원 복합체는 적합한 수준으로 증폭되고, 제 2 항체는 항체/항원 복합체와 접촉되어 상기 복합체를 거시적으로 검정할 수 있도록 한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 생체의 일부로부터 제거하고, 비동일 반응계에서 결합 항체를 처리한다. 예를 들어, 결합된 항체/항원 복합체를 세척하여 생성된 세척 용액을 PCR 반응을 수행하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 리테이너(들)의 변화에 관한 것이다. 예를 들어, 제 1 리테이너는 항체 주입된 연고를 피부 표면과의 접촉을 유지시키는 결합을 포함할 수 있다. 적합하게 인큐베이션시킨 후에, 결합을 제거하고, 결합된 항체/항원 복합체를 동일 반응계, 비동일 반응계, 또는 몇몇의 두 조합된 형태를 사용하여 처리한다.

본 발명의 다른 양태는 목적을 구분하기 위한 패널 또는 일련의 시험을 포함한다.

본 발명의 이들 및 그 밖의 양태는 수로 나타내어진 도면을 참조하여 이하 설명을 통해서 보다 잘 이해될 것이다.

도면의 상세한 설명

도 1에서, 리테이너(1)는 환자의 손등(2) 피부에 놓여진다. 이 경우에, 리테이너(1)는 직경이 약 1cm, 높이가 0.5cm인 환이며, 리테이너(1)는 폴리프로필렌 플라스틱으로부터 제조된다. 물론, 상기 방법의 방해를 최소화시키는 그 밖의 크기 및 모양의 재료도 또한 사용될 수 있다. 접착제 층(3)이 리테이너(1)의 바닥을 피복하여 리테이너(1)를 손(2)에 부착하는데 사용되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 접착제는 보이스 케스케이드 오피스 프로덕츠(Boise Cascade office products: tel: 800-562-1746)에서 상품명 3M Scotch로 시판하는 제거 가능한 양면 고정면을 포함한다.

도 1에 도시된 리테이너(1)에 대하여 다수의 대체물이 가능하다. 예를 들어, 대안적인 리테이너는 타원형 또는 다각형과 같은 몇가지 다른 횡단면 모양을 갖는다. 이것은 또한 시험 영역을 다수의 구획 또는 웰로 분리시키는 디바이더를 갖는다. 또한, 리테이너는 바닥 표면에 접착제를 구비할 필요는 없지만, 고무 밴드 또는 붕대와 같은 다른 수단을 사용하여 피부 또는 그 밖의 생체의 일부와 나란하게 유지시켜질 수 있다. 대안적인 리테이너는 예를 들어, 항체가 충분한 헝겊 조각을 갖는 접착 붕대와 같은 가요성 물질로 또한 구조화될 수도 있다. 시험하려는 항체 성분이, 상처, 물집 또는 하감으로 제공될 수도 있지만, 정상의 피부 표면 아래에 존재하거나, 시험하려는 항체 성분이 점막인 경우, 리테이너는 시험 영역에 인접한 피부에 고정될 수 있다.

생체의 일부에 고정되기에 적합하기 보다는, 생체의 일부를 받아들이기에 적합한 공동을 갖춘 리테이너를 제공하는 것도 또한 가능하다. 예를 들어, 리테이너는 하나 이상의 시약을 함유하는 시험관 또는 비이커를 포함할 수 있으며, 생체의 일부를 리테이너로 삽입시킴으로써 손가락과 같은 생체의 일부를 시약과 접촉시킬 수 있다.

적당한 시간 동안에 몇가지 수단을 사용하여 시험되는 생체의 일부와 특정 시약 사이의 접촉을 유지시킨다면, 더욱 다른 구체예가 가능하다. 표면 및 주변 온도를 포함하는 많은 인자 및 사용되는 시약에 따라서, 허용되는 시간은 커지거나 작아질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시험하려는 항체 성분이 상처 또는 함입을 포함하거나 컵 모양의 표면을 제공하는 경우에는, 어떠한 리테이너도 없이 필요한 단계를 수행하는 것이 가능할 수 있다. 시약이 충분하게 점성질이어서 생체의 일부와 접촉을 유지시키는 단계에 대하여 어떠한 리테이너도 없이 필요한 단계를 수행하는 것이 또한 가능할 수 있다.

도 2에서, 제 1 단계의 항체(4)는 표적 항원(들)(5)을 접촉시킬 기회를 갖는 경우에 피부 또는 그 밖의 생체의 일부(2)와 동일 반응계에서 접촉된다. 제 1 단계의 항체(4)는 표적 항원상에서 하나 이상의 항원 결정제와 결합할 수 있어야 하며, 이들 형태의 항체를 본질적으로 모든 확인 가능한 항원으로 배양시키는데 이용되기 때문에 단클론성 또는 다클론성 형태가 바람직하다. 제 1 항체는 항체를 생성시키는 통상의 방법중 하나에 따라 생성될 수 있다. 상기 항체는 표적 항원에 다소 선택적일 수 있으며, 표적 항원에 다소 강하게 결합될 수 있다. 몇몇 경우에, 다클론성 항체를 사용하게 되면, 이들이 다수의 에피토프를 인지하는 능력을 갖기 때문에 유리하겠지만, 특이도가 또한 감소하게 된다. 단클론성의 제 1 항체가 사용되는 경우에, 에티토프에 대한 항체를 천연 형태(9)로 배양하여 결합을 돕도록 하는 것이 바람직하다. 스크리닝 패널에서와 같이, 단클론성 또는 다클론성 항체의 몇몇 조합물이 또한 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예에서, 제 1 항체(4)는 비오틴에 컨쥬케이션된다(비오틴화된다). 페록시다아제 및 알칼리성 포스파타아제를 포함하는 다른 표지가 사용될 수도 있으며, 어떠한 표지에도 컨쥬게이션되지 않으면서 제 1 항체(4)를 사용하는 것이 또한 가능하다. 제 1 항체(4)는 액체 용액 또는 점성질의 페이스트를 포함하여, 다양한 형태로 존재할 수도 있다. 제 1 항체(4)는 접착제 붕대와 같은 표면상에 또한 증착될 수도 있으며, 이를 통해 조사하고자 하는 생체의 일부(2)와 접촉된다.

제 1 항체(4)에 선택적으로 결합하는 제 2 항체(6)가 도 2에 또한 도시되어 있다. 제 2 항체(6)는 이의 용이한 이용성, 저비용 및 보다 강한 신호를 주는 이의 능력 때문에 다클론성 항체 형태에 유리하며, 용이하게 사용하기 위해 액체 용액에 담그는 것이 바람직하다. 제 2 항체(6)는 비오틴 마커(7)에 컨쥬게이션될 수 있거나, 대안적으로는 콜로이드성 금, 효소 단편, 또는 어떠한 다른 적합하게 착색거나 색원 염료를 포함하는 색원체 물질, 또는 염료로 로딩된 리포솜에 결합될 수 있다.

시험을 수행하는데 필요한 시약의 사용은 도 2에는 도시되어 있지는 않다. 시험이 살아있는 세포상에서 수행되는 경우에, 비독성이면서 비교반된 시약을 사용하는 것은 분명 바람직하지만, 이것은 절대적인 요건은 아니며, 어떠한 음성적 효과라도 시험치에 대하여 가중되어야 한다.

신호의 세기 및 신호 대 잡음비에 따라서, 증폭 단계는 사용될 수도 사용되지 않을 수도 있다. 바꾸어 말하면, 이것은 항원의 함량 및 항원/항체 결합의 세기를 포함하여, 당해기술분야에 공지된 많은 인자에 의존한다는 것이다. 증폭 단계가 사용되는 경우에, 증폭 단계는 비오틴, 스트렙타비딘, 캔터에 의해 기술된 비오틴화된 DNA 기술(1)을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 문헌은 본원에 그대로 인용된다. 두 단계, 3 단계, PAP, 및 APAAP 방법을 포함하여, 다른 증폭 기술이 또한 적용될 수도 있다.

하나의 가능한 증폭 단계(도시하지 않음)에서, 분자로된 중합체와 같은 핵산의 단편 또는 상동물이 사용되어 스트렙타비딘/비오틴/항체 복합체에 결합될 수 있다. 상기 단편이 사용되는 경우, 비관련된 DNA 단편을 증폭시키는 가능성을 감소시키기에 충분히 우수하다. 예를 들어, 열친화성 박테리아로부터의 유전자 단편이 권장된다(10). 착색 물질로 표지하여 스트렙타비딘/비오틴/항체 복합체를 육안으로 용이하게 검정하는 것이 바람직하지만, 상기 단편도 비오틴 또는 형광 염료와 같은 그 밖의 마커로 또한 표지될 수 있다.

도 3에서, 항체(10)는 표적 항원(들)(5)에 선택적으로 결합하고, 생성된 항체/항원 복합체는 항체를 방출시킬 정도의 낮은 pH의 완충액으로 세척된다. 다수의 수단이 사용되어 적합한 항체 용리액을 달성할 수 있다. 예를 들어, 바탕 신호가 너무 큰 경우에, 높은 pH의 완충액인 시트르산나트륨(pH 6.0, 0.1M)이 사용되어 용리이전에 시료를 세척할 수 있다. 항체/스트렙타비딘/비오틴/DNA 복합체 용리액으로는 (1) 높은 염 농도(1-2M)의 PBS 완충액(pH 7.1)중의 NaCl, (2) 낮은 pH(3.5) 시트르산나트륨 완충액(0.1M), (3) WALPOLE(아세트산/아세트산나트륨) 완충액(pH 3.5), 또는 (4) 0.5-2% 도데실황산나트륨 용액이 사용될 수 있다. 생성된 세척 용액을 사용하여 결합된 DNA를 증폭시키는데 사용되는 PCR 반응을 수행한다. 도 3은 비오틴화된(12) 제 1 항체(10), 비오틴화된(12) 스트렙타비딘(14)의 용도, 및(2)의 설명에 따라 비오틴화된 DNA(16)에 관한 PCR 조작을 도시하고 있으며, 문헌(2)는 본원에 인용된다. 도시된 PCR 증폭 방법은 검정하고자 하는 항원의 수량이 매우 작은 경우, 예를 들어, 500분자인 경우에는 특히 유리하다.

도 4는 항원을 확인하기 위한 대안적인 프로토콜을 근거로 한 단계를 도시하고 있다. 단계 A에서, 비오틴화된(24) 단클론성 항체(22)는 세포 표면 항원(20)에 결합된다. 그런후, 단계 (B)에서, 콜로이드성 금(27)과 같은 마커를 지닌 스트렙타비딘(26)은 항체(22)의 비오틴 분자(24)에 결합된다. 단계 (C)에서, 비오틴화된 단일 가닥 DNA(ssDNA)(28)는 스트렙타비딘(26)에 결합되고, 단계 (D)에서, 상보적인 비오틴화된(24) DNA(30)는 이전에 복합된 DNA(28)에 혼성된다.

발명의 용도

본원에 기술된 장치 및 방법을 사용하여 AIDS, HIV, A형, B형, C형 간염 및 결핵을 포함하지만 이에 국한되지 않는 전신 질환의 발견 및 검정과 함께, 바이러스, 박테리아, 균류, 미코플라즈마를 포함하는 광범위한 발병제를 확인할 수 있다. 본원에 기술된 장치 및 방법은 스크리닝 공구로서 및 치료 섭생법의 예지 및 추적 조사용으로 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람의 유두종 바이러스(HPV) 족은 밀접하게 관련된 계통으로 구성되며, 특정 계통에 대하여 효과적인 치료 전략을 계발하기 위해서는 정확한 식별 공구가 요구된다. 상기한 시험과 같은 국소 피부 시험에서는 상기 공구가 선정된다. 또 다른 예시적인 용도는 흑색종 및 균상종 피부 감염증 사이의 차별적인 검정법을 포함한다. 현재의 방법은 보통 생체검사 및 병리학자에 의한 생체 검사 및 연속적으로 시료의 조사를 필요로 한다. 이러한 방법은 비용이 많이 들고 시간이 소모될 뿐만 아니라 침해하다. 비교해 보면, 하기 실시예 2의 방법하에서의 표피 시험을 사용하여 차별적으로 검정하게 하지만, 시간절약, 비용 절감 및 비침해성을 갖는다.

또한, 본원에 기술된 장치 및 방법은 운반 모드의 유동성에 의해 상당한 장점을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 따르면, 몇몇 시험은 실험실 없이 사용될 수 있으며, 비침해적이며 비독성적일 수 있다. 상기 시험은 임상의, 병원, 참고 실험실, 및 공공의 건강 편의시설에 의해서 뿐만 아니라 세계 도처의 불충분하게 계발된 및 계발되지 않은 분야에의 전문가에 의해 유리하게 사용될 수 있다.

실시예 1

캔터 타입의 증폭을 포함하는 시험은 하기와 같이 수행될 수 있다:

용액 A:일반 완충액

D-PBS pH 7.1 (둘벡코 식) 칼슘 마그네슘

(ICN 카탈로그 번호: 18-610-54)

무수 CaCl₂0.10g/L

KCl 0.20g/L

KH₂PO₄0.20g/L

MgCl₂6H₂O 0.10g/L

NaCl 0.80g/L

NaH₂PO₄7H₂O 2.16g/L

용액 B:블로킹 완충액.

칼슘 마그네슘(ICN 카탈로그 번호: 18-610-54)을 갖는 pH 7.1인 DBP (둘벡코 식)중의 2mg/ml 소의 태아 혈청(결정체)(ICN 카탈로그 번호:103700)

용액 Ca:제 1 항체 1

농축된 염소 혈청의 다클론성 칸디다 알비칸스 용액 B중의 1㎖의 1/1000 희석액(이뮤노-마이콜로직스 인코포레이티드(Immuno-mycologics Inc.), 전화번호: 800 - 654 - 3639).

용액 Cb:제 1 항체 2

용액 B중에서 1㎖의 10㎍/㎖ 맵(mab) NKI-C3 항흑색종 관련 Ag 25/110kd IgG1MAB (칼태그 래버러토리, 인코포레이티드(Caltag Laboratory, Inc.), 전화 번호: 800 - 874 -4007).

용액 Da:제 2 항체 1

용액 B중에서 50㎍/㎖의 비오틴화된 당나귀 앤티 염소 IgG(H+L)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) 카탈로그 번호: 705-065-003, 전화번호: 800-367-5296).

용액 Db:제 2 항체 2

용액 B중에서 50㎍/㎖의 비오틴화된 염소 앤티마우스 IgG(H+L)(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 번호: 115-035-003, 전화번호: 800-367-5296).

용액 E:스트렙타비딘/20nm 금 용액

10㎍/㎖의 스트렙타비딘 20nm 금(ICN 카탈로그 번호 67-870-2, 전화번호: 800-854-0530).

용액 F:비오틴화된 DNA 용액.

용액 B중의 100㎍/㎖. DNA는 하기의 서열을 가지며, 이 서열은 Thermus aquaticus 박테리아의 DNA 리페어 유전자 recA의 제 1의 300개의 누클레오티드이다(10).

상기 DNA는 무작위 프리밍(priming) 방법(즉, 바이오프라임 비방사성 DNA 표지화 시스템, 카탈로그 번호: 18094-011 Gibco BRL, 전화번호: 800-828-6686) 및 그 밖의 대안적인 방법(즉, PCR)을 사용하여 비오틴-14-dCTP로 표지된다.

임상 시설에서:

1) 70% 에탄올로 피부를 문지름으로써 피부를 준비하고, 접착제 환 보호를 벗겨내고, 환을 피부에 부착시킨다.

2) 1㎖ 용액 A로 환의 내부를 세척한다.

3) 0.5㎖의 용액 C(제 1 항체)를 첨가하고, 3분 동안 기다린다.

4) 용액 A로 세 번 세척한다.

5) 0.5㎖의 용액 D(제 2 항체를 첨가하고, 3분 동안 기다린다.

6) 용액 A로 3번 세척한다.

7) 0.5㎖의 용액 E(스트렙타비딘/금 용액)를 첨가하고, 3분 동안 기다린다.

8) 용액 A로 3번 세척한다.

9) 0.5㎖의 용액 F(비오틴/DNA)를 첨가하고, 3분 동안 기다린다.

10) 용액 A로 3번 세척한다.

11) 0.5㎖의 용액 E(스트렙타비딘/금 용액)를 첨가하고, 3분 동안 기다린다.

붉은색으로 착색된 면역 착색제의 모양은 양성적인 결과를 나타낸다.

실시예 2

PCR 증폭을 포함하는 시험은 하기의 방법으로 달성될 수 있다. 하기 시약은 제조되고/되거나 구매된다.

용액 A: 일반 완충액

D-PBS pH 7.1 (둘벡코 식) 칼슘 마그네슘

ICN 카탈로그 번호: 18-610-54

무수 CaCl₂0.10g/L

KCl 0.20g/L

KH₂PO₄0.20g/L

MgCl₂6H₂O 0.10g/L

NaCl 0.80g/L

NaH₂PO₄7H₂O 2.16g/L

용액 B: 블로킹 완충액.

용액 Ca: 제 1 항체 1

농축된 다클론성의 백색 염소 혈청 칸디다균 용액 B중의 1ml의 1/1000 희석액(이뮤노-마이콜로직스 인코포레이티드(Immuno-mycologics Inc.), 전화번호: 800 - 654 - 3639).

용액 Cb: 제 1 항체 2

용액 Da: 제 2 항체 1

용액 Db: 제 2 항체 2

용액 B중에서 50㎍/㎖의 비오틴화된 염소 앤티마우스 IgG(H+L)(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호: 115-035-003, 전화번호: 800-367-5296).

용액 E: 스트렙타비딘 용액

(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호: 115-035-003, 전화번호: 800-367-5296)에서 시판하는 10㎍/㎖의 스트렙타비딘

용액 F: 비오틴화된 DNA 용액.

상기 DNA는 무작위 프리밍(priming) 방법(즉, 바이오프라임 비방사성 DNA 표지화 시스템 Gibco BRL, 카탈로그 번호: 18094-011 전화번호: 800-828-6686), 또는 300bp DNA 서열에서 비오틴화된 누클레오티드를 결합시키는데 사용될 수 있는 그 밖의 대안적인 방법(즉, PCR)을 사용하여 비오틴-14-dCTP로 표지된다.

용액 G: 용리액(1M NaCl/PBS)

용액 A중의 NaCl: 58.44g/L.

임상 또는 시험 시설에서:

(1) 70% 에탄올을 사용하여 문지름으로써 동일 반응계에서 환자의 피부를 준비한다.

(2) 상기에서 기술된 바와 같은 작업 공간이 있는 환 또는 그 밖의 리테이너의 접착제 보호물을 벗겨내고, 피부에 리테이너를 부착시켜서 시험하고자 하는 피부의 영역(시험 영역)을 형성시킨다.

(3) 1㎖의 용액 A를 사용하여 시험 영역 및 전체 작업 공간을 세척한다.

(4) 0.5㎖의 용액 C(제 1 항체)를 시험 영역에 첨가하고, 3분 기다린다.

(5) 시험 영역 및 전체 작업 공간을 용액 A를 사용하여 3번 세척한다.

(6) 0.5㎖의 용액 D(제 2 항체)를 시험 영역에 첨가하고, 3분 기다린다.

(7) 시험 영역 및 전체 작업 공간을 용액 A를 사용하여 3번 세척한다.

(8) 0.5㎖의 용액 E(스트렙타비딘 용액)를 시험 영역에 첨가하고, 3분 기다린다.

(9) 시험 영역 및 전체 작업 공간을 용액 A를 사용하여 3번 세척한다.

(10) 0.5㎖의 용액 F(비오틴/DNA)를 시험 영역에 첨가하고, 3분 기다린다.

(11) 시험 영역 및 전체 작업 공간을 용액 A를 사용하여 3번 세척한다.

(12) 0.3㎖의 용액 G(1㎖ NaCl/PBS)를 시험 영역에 첨가하고, 3분 기다린다.

(13) 사용된 용액 G를 시료로서 살균관에 수거하고, 7㎖ 무수 에탄올을 첨가한다. 실험실로 시료를 운반한다.

실험실에서:

(14) 시료가 DNA를 침전시키는 것을 돕기 때문에 시료를 -20℃에서 밤새 저장한다.

(15) 시료를 함유하는 관을 4℃에서 15분 동안 14K G로 회전시킨다.

(16) 10㎕ 트리스 EDTA 완충액(TE)중에서 상기 시료를 재현탁시킨다.

(17) DNA를 사용하여 하기의 프라이머를 갖는 recA 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행한다.

(18) PCR 생성물의 존재는 양성 결과를 나타낸다. PCR 생성물의 부재는 음성 결과를 나타낸다.

실시예 3

면역 피부의 동일 반응계내 검정 방법을 수행하기 위한 검정 킷은 하기 품목을 포함한다:

(1) 피부 세포에서 면역 검정 표적 분자의 접근 용이성을 증가시키는 에탄올, 아세톤 또는 사포닌과 같은 용매.

(2) 피부 표면에 제거 가능하게 부착될 수 있는 접착환. 환은 다양한 시약 용액이 제공되는 웰을 형성한다.

(3) 제 1 항체 용액.

(4) 제 2 항체 용액. 이 항체는 제 1 항체에 결합하고, 콜로이드성 금 또는 몇몇의 다른 대조 염료 및/또는 효소 마커에 컨쥬게이션된다.

(5) 하나 이상의 (a) 3-아미노-9-에틸 카르바졸(AEC)과 같은 색원체 시약; (b) 스트렙타비딘 용액; (c) 비오틴화된 DNA.

(6) 인산염 완충액 염수 또는 WALPOLE(아세트산/아세트산나트륨)와 같은 비독성의 세척 용액.

면역 검정 방법은 일반적으로 항체 용액으로 두 번의 단기간 인큐베이션, 및 비독성의 인산염 완충액 염수(PBS) 용액으로의 두 번의 세척으로 이루어진다. 이러한 적용을 수행하기 위해서는 15 내지 30분이 소요되며, 더 이상의 특별한 기술은 필요가 없다.

상기 킷은 하기와 같이 이용한다:

(7) 에탄올로 세척한 환자의 피부 영역 및 접착환을 세정된 영역에 제거 가능하게 부착한다. 접착환의 접착 부위에서, 환은 시험하고자 하는 피부 영역(시험 영역)을 형성시킨다.

(8) 제 1 항체 용액을 시험 영역과 접촉되게 한다.

(9) 인큐베이션 5 분후에, pH 7.1에서 인산염 완충용액을 사용하여 시험 영역 및 전체 작업 공간을 간단하게 세척하여 비결합된 항체를 제거한다.

(10) 제 2 항체 용액을 시험 영역과 접촉되게 한다.

(11) pH 7.1에서 인산염 완충용액을 사용하여 시험 영역을 세척한다.

(12) 표지로서 효소를 사용하는 경우에는, 3-아미노-9-에틸 카르바졸(AEC)와 같은 적합한 색원체 시약을 시험 영역과 접촉되게 한다.

6a) 표지로서 비오틴을 사용하는 경우에는, 스트렙타비딘 용액을 시험 영역과 접촉되게 한다. 5분 동안 스트렙타비딘을 인큐베이션시킨후, 인산 완충용액을 사용하여 시험 영역 및 전체 작업 공간을 세척한다.

6b) 비오틴화된 DNA를 시험 영역과 접촉되게 한다. 10분 후에, pH 7.1에서 인산 완충액을 사용하여 시험 영역 및 전체 작업 공간을 세척한 후에, WALPOLE(아세트산/아세트산나트륨)로 인큐베이션시킨다.

6c) 10X 인산염 완충액을 사용하여 WALPOLE 완충액을 중화된 상태로 회수한다.

6d) 그런후, WALPOLE/인산염 완충액의 일부를 사용하여 적합한 프라이머를 사용하는 폴리머라아제 연쇄 반응을 수행시킨다. DNA 단편 프로브를 증폭시키는 프라이머는 당해기술분야에 공지되어 있다. 대규모 열순환기를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응을 수행시키고, 겔 전기영동법을 사용하여 생성물의 존재 또는 부재를 시험할 수 있다.

실시예 4

아래 공급처에서 구입할 수 있는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 아구창 칸디다를 검정할 수 있다:

a. 메모리얼 슬로운-케터링 캔서 인스트.(Memorial Sloan-Kettering Cancer Inst.)에서 시판하는 염소의 다클론성 Ab

b. 바이오디자인 인터내셔날(Biodesign International)에서 시판하는 토끼의 다클론성 Ab

c. 이뮤노-마이콜로직스 인코포레이티드(Immuno-mycologics Inc.)에서 시판하는 염소의 다클론성 Ab

d. 버로스태트에서 시판하는 마우스 mab

e. 케미콘 인터내셔날(Chemicon International)에서 시판하는 마우스 mab

f. 바이오디자인 인터내셔날(Biodesign International)에서 시판하는 마우스 mab.

실시예 5

아래 공급처에서 구입할 수 있는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 아스페르길루스(Aspergillus)를 검정할 수 있다.

Aspergillus. c

a. 이뮤노-마이콜로직스, 인코포레이티드(Immuno-mycologics Inc.)에서 시판하는 응고된 염소의 다클론성 Ab

b. 이뮤노-마이콜로직스, 인코포레이티드(Immuno-mycologics Inc.)에서 시판하는 겔 분산 염소의 다클론성 Ab

Aspergillus. mycelia

c. 머리디안 다이아그노스틱 인코포레이티드(Meridian Diagnostic Inc.)에서 시판하는 염소의 다클론성 Ab

실시예 6

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 회저와 관련된 박테리아인 웰치균(Clostridium perfringens)을 검정할 수 있다:

웰치균(Clostridium perfringens) ABCD

a. 어큐리트 켐. 앤 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chem. Scientific Co.)에서 시판하는 ABCD 토끼의 다클론성 Ab

웰치균(Clostridium perfringens) C

b. 테크래브(Techlab)에서 시판하는 염소의 다클론성 혈청

웰치균(Clostridium perfringens) D

c. 테크래브(Techlab)에서 시판하는 염소의 다클론성 혈청

웰치균(Clostridium perfringens) E

d. 테크래브(Techlab)에서 시판하는 염소의 다클론성 혈청

실시예 7

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 파상풍균(tetanus)과 관련된 박테리아 및 톡소이드를 검정할 수 있다:

파상풍균(Clostridium tetani)

a. 메사추세츠 바이오라지컬 래브 오어 밀레스 인코포레이티드(Massachusetts Biological lab or MILES INC.)에서 시판하는 사람의 Ig 다클론성 Ab

파상풍균 톡소이드

b. 노어쓰 아메리칸 바이오라지칼 인코포레이티드(North Biological Inc.)에서 시판하는 사람의 혈청 다클론성 Ab

실시예 8

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 회저와 관련된 헤프페스 바이러스를 검정할 수 있다:

단순 헤르페스형 1

a. 바이오켐드 코포레이션 씨에이(Biochemed Corp. CA)에서 시판하는 염소 혈청

b. 바이오디자인 인터내셔날(Biodesign International)에서 시판하는 염소의 다클론성 IgG

c. 바아오제네시스(Biogenesis)에서 시판하는 마우스 mab

단순 헤르페스형 2

d. 코어텍스 비캄(Cortex Became)에서 시판하는 토끼의 다클론성 Ab

e. 바이오제네시스 리미티드(Biogenesis LTD)에서 시판하는 토끼 혈청의 다클론성 IgG

f. 코어텍스 비캄에서 시판하는 마우스 mab

g. 메디아 바티크, 인코포레이티드(Media Batik, Inc.)에서 시판하는 마우스 mab

실시예 9

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 유두종 바이러스를 검정할 수 있다:

일반적인 유두종 바이러스

a. 파셀 앤 로어 게엠베하 앤 컴패니(Passel Lore GmbH Co.)에서 시판하는 마우스 mab

b. 자임드 래버러토리(Zymed laboratory)에서 시판하는 토끼의 다클론성 Ab

유두종 바이러스 형태 1, 6, 11, 16, 18, 31

c. 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.)에서 시판하는 IgG 마우스 mab

유두종 바이러스 형태 16, E1, E4

d. 파미겐(Pharmigen)에서 시판하는 정제한 IgG1 17D5 mab

실시예 10

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 문둥병(한센병)과 관련된 박테리아인 나균(Mycobacterium leprae)을 검정할 수 있다:

a. 니아이드 레프로시 프로그램(NIAID Leprosy Program)에서 시판하는 세포벽 단백질 IgG1 mab

b. 니아이드 레프로시 프로그램에서 시판하는 주요 막 단백질 IgG1 mab

c. 니아이드 레프로시 프로그램에서 시판하는 박테리오페리틴 IgG1 mab

d. 니아이드 레프로시 프로그램에서 시판하는 세포벽 단백질 다클론성 Ab

e. 니아이드 레프로시 프로그램에서 시판하는 세포벽 단백질 다클론성 Ab

f. 니아이드 레프로시 프로그램에서 시판하는 페놀성 당지질 다클론성 Ab

실시예 11

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 매독과 관련된 박테리아인 매독트레포네마를 검정할 수 있다:

a. 인터내셔날 래브 포어 바이올(International Lab For Biol.)에서 시판하는 사람 혈청, 다클론성 WHO-3

b. 벡톤 디킨슨 마이크로바이오라지(Becton Dickinson Microbiology)에서 시판하는 다클론성의 토끼 혈청 Ig

c. 바이오메디칼 리소오스(Biomedical Resources)에서 시판하는 다클론성의 vdrl-반응성 사람 혈청

d. 싸이메득스 코포레이션(Scimedx Corp.)에서 시판하는 RRR-반응성 사람 혈청 2173

실시예 12

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 흑색종 관련 항원을 검정할 수 있다:

a. 칼태그 래버러토리 인코포레이티드(CALTAG LABORATORY INC.)에서 시판하는 25/110kd IgG1 mab NKI-C3

b. 어큐리트 케미칼 앤 싸이. 컴패니(Accurate Chemical Sci. Co.)에서 시판하는 IgG1 PAL-M1 mab

c. 어큐리트 케미칼 앤 싸이. 컴패니에서 시판하는 IgG1 PAL-M1 mab

d. 그 밖에-린스코츠 디렉토리는 항흑색종 항체에 대하여 30 이상의 엔트리를 함유한다. ('94-'95 Ed., 미국 95404 캘리포니아 그레인지 로오드 산타 로사 4877에 소재, 팩스:(415) 389-6025)

실시예 13

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 AIDS와 관련된 HIV를 검정할 수 있다:

a. 아이씨엔 파마슈티칼(ICN Pharm., 1995)에서 시판하는 HIV gp41 항체 MAb 2A2(카탈로그 번호: 158366)

b. 아이씨엔 파마슈티칼(ICN Pharm., 1995)에서 시판하는 HIV gp120, 항체 MAb 1c1(카탈로그 번호: 158367)

c. 어드밴스드 이뮤노케미칼 인코포레이티드(Advanced Immunochemical Inc.)에서 시판하는 HIV VAR2

d. 셀룰라 프로덕트 인코포레이티드(Cellular Product Inc.)에서 시판하는 HIV P17

e. 바이오디자인 인터내셔날(Biodesign International)에서 시판하는 HIV1 ENV HL1

f. 그 밖에-린스코츠 디렉토리는 단클론성 및 다클론성 항-HIV 항체 둘 모두에 대하여 70 이상의 엔트리를 함유한다

실시예 14

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 백혈병을 검진할 수 있다:

백혈병 HTLV

a. 듀퐁-레모르 리서치 프로덕츠에서 시판하는 HTLV P19 IgG2a 마우스 mab

b. 머릴랜드 록빌에 소재하는 네셔날 인스티튜트 오브 헬스(Nat'l Institutes of Health)에서 구입 가능한 HTLV-I IgG1 마우스 mab, 0.5αNIH-11

c. 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.)에서 시판하는 HTLV-gp21 IgG1

d. 세라-래브 리미티드에서 시판하는 HTLV-III p24 IgG1 6f10

e. 아일랜드 퍼블림 14에 소재하는 알토 바이오 리에이젼츠 리미티드(AALTO Bio Reagents Ltd.)에서 시판하는 양의 정제된 다클론성 단편인 HTLV-I GAG P19 111-130

f. 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.)에서 시판하는 HTLV-I p19/28 마우스 mab

g. 그 밖에-린스코츠 디렉토리는 백혈병 HTLV 항체 둘 모두에 대하여 25 이상의 엔트리를 함유한다

실시예 15

아래 공급처에서 시판하는 하나 이상의 하기 시약과 함께 상기한 장치 및 방법을 사용하여 그 밖의 많은 전신질환을 검진할 수 있다. 상기 질환은 폴리오마, 홍역, 풍진을 포함하며, 이들 항체에 대하여 린스코츠 디렉토리에 목록화되어 있다.

참고문헌

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10) Angov, E. and Camerini-Otero, R.D. The recA gene from the thermophile Thermus aquaticus YT1: cloning, expression, and characterization. J. Bacteriol. 176, 1405-1412(1994)

11) Current protocols in immunology National Institutes of Health Greene Wiley Editor Collican J.E. et al. 1991.

Claims

표적 항원에 결합되는 제 1 항체를 제공하는 단계;

동일 반응계에서 생체의 일부를 제 1 항체와 접촉시키는 단계;

제 1 항체를 항원과 결합시켜 항체/항원 복합체를 형성시키는 단계;

항체/항원 복합체를 표지하는 단계; 및

표지를 검정하는 단계를 포함하여, 생체의 일부와 밀접하게 관련된 표적 항원을 검정하는 방법.
제 1항에 있어서, 생체의 일부가 살아있는 환자의 피부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 리테이너를 피부와 나란히 제거 가능하게 위치시켜서 작업 공간을 형성시키는 단계, 및 작업 공간내에서 항원을 제 1 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 항체/항원 복합체를 증폭시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 항체/항원을 증폭시키는 단계가 동일 반응계에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 표지가 제 1 항체에 결합됨을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 표지가 증폭 동안에 항체/항원 복합체에 결합됨을 특징으로 하는 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 제 2 항체를 항체/항원 복합체와 접촉시켜서 복합체를 현미경으로 관찰할 수 있게 함을 특징으로 하는 방법.
표적 항원에 선택적으로 결합하는 표지된 제 1 항체를 제공하는 단계;

리테이너를 피부와 나란하게 위치시켜 작업 공간을 형성시키는 단계;

작업 공간내에서 피부를 제 1 항체와 접촉시키는 단계;

제 1 항체를 항원과 결합시켜서 항체/항원 복합체를 형성시키는 단계;

표지를 증폭시키는 단계; 및

표지를 검정하는 단계를 포함하여, 환자의 피부상에서 표적 항원을 검정하는 방법.
제 9항에 있어서, 표지가 비오틴을 포함하고, 증폭 단계가 비오틴화된 제 2 항원의 첨가를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 표지가 올리고누클레오티드를 포함하고, 증폭 단계가 폴리머라아제 연쇄 반응을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 항체/항원 복합체를 현미경으로 검정할 수 있게 하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
피부에 부착되어 시험 영역을 형성시킬 수 있는 리테이너; 시험 영역에서 표적 항원에 결합되어 항체/항원 복합체를 형성시키는 표지된 항체 용액; 및 표지 검정용 시약을 포함하여, 피부의 일정 부분과 밀접하게 관련된 표적 항원을 동일 반응계에서 검정하기 위한 면역 검정 킷.
제 13항에 있어서, (a) 색원체 시약; (b) 스트렙타비딘; 및 (c) 비오틴화된 올리고누클레오티드중 하나 이상의 시약을 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역 검정 킷.
제 14항에 있어서, 항체 용액이 단클론성 항체의 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 면역 검정 킷.
제 14항에 있어서, 항체 용액이 다클론성 항체를 함유함을 특징으로 하는 면역 검정 킷.
제 14항에 있어서, 리테이너가 항체 용액을 함유하는 일정 부분을 갖는 붕대를 포함함을 특징으로 하는 면역 검정 킷.
제 14항에 있어서, 리테이너가 시험 영역을 둘 이상의 부분으로 분리함을 특징으로 하는 면역 검정 킷.
생체의 일부와 밀접하게 관련된 표적 항원에 선택적으로 결합하는 항체;

생체에 제거 가능하게 부착되어, 항체가 인가되는 작업 공간을 형성시키는 리테이너;

제 1 항체에 결합되어 신호를 제공하는 표지;

신호의 화학적인 증폭을 포함하여, 생체의 질병을 동일 반응계에서 검정하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 항체가 단클론성 항체의 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 항체가 다클론성 항체를 함유함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 리테이너가 시험 영역을 둘 이상의 부분으로 분리시킴을 특징으로 하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 표지가 비오틴을 포함하고, 증폭이 비오틴화된 제 2 항원의 첨가를 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 표지가 올리고누클레오티드를 포함하고, 증폭이 폴리머라아제 연쇄 반응의 이용을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 19항에 있어서, 증폭이 동일 반응계에서 수행됨을 특징으로 하는 시험 방법.
제 20항 내지 제 25항중의 어느 한 항에 있어서, 신호를 현미경으로 검정할 수 있도록 하는 것을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 26항에 있어서, 질병이 진균성 병원체로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 27항에 있어서, 질병이 칸디다 알비칸스로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 27항에 있어서, 질병이 아스페르길루스로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 26항에 있어서, 질병이 종양을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 30항에 있어서, 질병이 흑색종을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 30항에 있어서, 질병이 백혈병을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 30항에 있어서, 질병이 폴리오마를 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 26항에 있어서, 질병이 세균성 병원체로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 34항에 있어서, 질병이 웰치균으로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 34항에 있어서, 질병이 파상풍균으로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 34항에 있어서, 질병이 나균으로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 34항에 있어서, 질병이 매독트레포네마로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 26항에 있어서, 질병이 바이러스 병원체로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 39항에 있어서, 질병이 홍역을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 39항에 있어서, 질병이 풍진으로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 39항에 있어서, 질병이 헤르페스 바이러스로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 39항에 있어서, 질병이 유두종 바이러스로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 39항에 있어서, HIV로 인한 감염증을 포함함을 특징으로 하는 시험 방법.
제 1항에 있어서, 생체의 일부가 생체 검사 없이 접근할 수 있는 식물의 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 60항에 있어서, 생체가 식물을 포함함을 특징으로 하는 방법.