NO850493L

NO850493L - Heterologt paavisningssystem

Info

Publication number: NO850493L
Application number: NO850493A
Authority: NO
Inventors: Elazar Rabbani
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1984-02-09
Filing date: 1985-02-08
Publication date: 1985-08-12
Also published as: DE3588078T2; AU3844485A; ES540250A0; EP0151492A3; ATE133261T1; US4889798A; ES8802188A1; CA1314810C; IL74262A0; EP0151492B1; DK61085A; ES554045A0; JPS60188095A; DK61085D0; ES8800439A1; EP0151492A2; DE3588078D1

Description

Påvisning av merkede molekyler såsom kjemisk merket DNA eller andre materialer eller molekyler som inneholder en reseptor eller en målrest, enten naturlig forekommende eller plassert der, er viktig utfra kommersielt, diagnostisk og vitenskapelig synspunkt. F.eks. er biotinylerte nukleotider som kan innføres i dobbeltkjedet DNA fremstilt. Enkeltkjedet DNA inneholdende slike biotinylerte nukleotider har blitt anvendt etter hybridisering med komplementært enkeltkjedet DNA til å identifisere forskjellige typer av DNA materialet. Forekomst av det biotinylerte nukleotid i det hybridiserte dobbeltkjedede DNA påvises generelt ved en reaksjon innebefattende affinitet mellom biotin og avidin, da avidin normalt er knyttet til et biotinylert enzym, såsom biotinylert pepperrot peroksydase. Streptavidin kan brukes i stedet for avidin i et slikt system. Anvendelsen av streptavidin eller avidin som en sonde for påvisning av biotinylerte nukleotider eller biotinylerte DNA er beskrevet i europeisk patentansøkning nr. 0063879 publisert 11. mars 1983 og avledet fra US patentansøkning nr. 255.223 av 17. april 1981.

Det har også vært foreslått å merke nukleotider og DNA med glykosylgrupper eller sukkerrester såsom maltose, laktose, mannose, triose og å påvise de således merkede nukleotider eller DNA med et lektin såsom Concanavalin A, som har en sterk affinitet til sukkergrupper og glykoproteiner. Merk-ingen av DNA med glykosylgrupper og påvisning av således merket DNA er beskrevet i US patentsøknad nr. 391.440 av 23. juni 1982.

Andre teknikker for påvisning av biologiske materialer er også foreslått. For eksempel inneholder europeisk patent-søknad nr. 0071976 av 16. februar 1983 kovalent binding av biotin til immunologisk aktivt materiale og kovalent binding av avidin til et enzym såsom pepperrotperoksydase. En annen påvisningsteknikk er beskrevet i europeisk patent-søknad nr. 0074520 publisert 23. mars 1983. Denne europe-iske patentsøknad beskriver en teknikk for påvisning av humant korionisk gonadotropin (HCG) inneholdende et lektin bundet til en fast bærer som er bragt i kontakt med en prøve, såsom en urinprøve mistenkt for å inneholder HGC. Etter fjerning av bærere bringes det resulterende lektin-fikserte HCG i kontakt med et antistoff og et fargebærer materiale. Nærvær av lektin-fiksert HCG vises ved farvedannelse.

Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forbedrede teknikker og materialer som kan anvendes ved identifikasjon og/eller bestemmelse av merkede materialer, spesielt kjemisk merkede biologiske materialer som gir en reseptor eller målrest på seg (f.eks., kjemisk-merket

DNA ) .

Det er et annet mål for oppfinnelsen å tilveiebringe en rask diagnostisk teknikk som er anvendelig for identifise-ring av merket DNA-materiale såsom biotinylert eller glykosylert DNA-materiale.

Et ytterligere mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe et sett som er spesielt anvendelig for identifikasjon og/ eller bestemmelse av biotinylerte og/eller glykosylert

DNA .

Et ytterligere mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en teknikk med forbedret sensitivitet og fleksibilitet for påvisning av spesielt kjemisk merkede, naturlige eller syntetiske, biologiske materialer.

Hvordan disse og andre mål for oppfinnelsen nås vil fremgå klarere av den etterfølgende beskrivelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et heterologt påvisningssystem og bestanddeler som kan anvendes i forbindelse med dette og sett for utførelse av det heterologe påvisningssystem. Det heterologiske påvisningssystem utnytter affiniteten mellom avidin eller streptavidin og biotin, samtidig med affiniteten mellom et lektin og et glykoprotein og/eller en glykosyl eller sukkergruppe. Spesielt anvendelige bestanddeler ved utførelse av foreliggende oppfinnelse er de biotinylerte lektiner og biotinylerte sukkere (spesielt biotinylerte polysakkarider, såsom biotinylert dekstran), biotinylerte glykoproteiner og biotinylerte enzymer.

Avidin er et glykoprotein med en molekylvekt på ca. 68000 og en meget høy affinitet til biotin, som sterkt over-skrider affiniteten til et antistoff for de fleste antigener. Nærmere bestemt gir avidinmolekyler fire bindingspunkter for et biotinmolekyl. Avidin-biotinaffinitet er i det vesentlige irreversibel og sammenlignbar med en kovalent binding. Proteiner, glykoproteiner og enzymer kan konjugeres med flere biotinmolekyler. Den spesielle affiniteten mellom avidin og biotin gir mulighet til å danne makromolekylære komplekser mellom avidin og avidinholdige materialer og biotinholdige materialer såsom biotinylerte enzymer, lektiner og polysakkarider. Streptavidin, et molekyl som er nær beslektet med avidin, brukes fortrinnsvis i stedet for avidin i slike komplekser, spesielt i forbindelse med påvisning av et biotinmerket DNA eller glykosylert DNA.

Lektiner og biotinylerte lektiner er viktige bestanddeler i det heterolgoiske påvisningssystem ifølge foreliggende oppfinnelse. Lektiner er proteiner eller glykoproteiner med to eller flere bindingspunkter som gjenkjenner en spesifikk sekvens i sukkerrester. Selv om lektiner opprinne-lig ble isolert fra planter, er de funnet i alle typer organismer. Lektiner som hensiktsmessig anvendes ved ut-øvelse av foreliggende oppfinnelse er dolichos biflorus agglutinin, som har spesifisitet for gruppen N-acetylaga-laktosaminyl, lentillektin som har en affinitet til alfa-D-mannose og alfa-D-glukose i likhet med hageert lentillektin. Mange andre lektiner er kjente og kan kjøpes. Flere lektiner som kan kjøpes og de spesifikke sukkerrester som de gjenkjenner er angitt i den følgende tabell

I:

Også av interesse ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse er glykolipider som er oligosakkaridholdige molekyler man finner på overflaten av alle plasmamembraner. Nærmere bestemt foreligger glykolipider i den ytre halvdel av sjiktet til cellemembranen med sukkergruppen eksponert på celleoverflaten. De nøytrale glykolipider med polare hode-grupper som består av 1-15 eller flere nøytrale sukkere finnes bredt fordelt i plasmamembranene til både eukaryo-tiske og prokaryotiske celler. Noen glykolipider finnes bare i visse pattedyr og normalt bare i bestemte vev hos disse. F.eks. er galaktocerebrosid, et av de enkleste glykolipider som bare inneholder galaktose og sin polare hodegruppe, hovedglykolipidet i myelin. Flere komplekse glykolipider er gangliosidene hvorav ca. 30 er identifi-sert. Lektiner ville kunne anvendes for binding til de eksponerte glykolipide oligosakkaridgrupper som bærere eller substrater for cellemembranidentifikasjon p.g.a. den normale affinitet mellom lektiner og sukkergrupper.

Av spesiell interesse ved utøvelse av oppfinnelsen er glykoproteiner, spesielt enzymene såsom glykoseoksydase, peroksydase, pepperrotperoksydase, alkalifosfatase, syrefosfatase og fi> -galaktosidase. De ovennenvte enzymer er bare eksempler på mange kjente glykoproteiner eller enzymer som kan anvendes ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse.

Et aspekt ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse innebefatter biotinylerte enzymer. Forskjellige teknikker kan anvendes under fremstilling av biotinylerte enzymer. Et eksempel på foretrukket teknikk er beskrevet i US patent-ansøkning nr. 486.924 av 20. april, 1983. Denne søknad beskriver en teknikk for biotinylering av enzymer, hvor enzymet bindes til et fast substrat, fortrinnsvis gjennom en konkurrerende inhibitor for dette, som beskytter enzy-mets aktive punkt mens enzymet eksponeres for biotin. Etter enzymet er biotinylert frigjøres det fra binding til den konkurrerende inhibitor som forblir bundet til det faste substrat. Mens det biotinylerte enzym fortsatt er bundet til det faste substrat kan alternativt ytterligere reaksjon eller kompleksdannelse såsom tilsetning av avidin eller streptavidin til det bundede biotinylerte enzym ut-føres. Etter binding av avidin eller streptavidin til det fikserte biotinylerte enzym kan det resulterende kompleks frigjøres fra det faste substrat. Ved å anvende denne tek-nikken kan forskjellige komplekser fremstilles. F.eks. kan det fikserte enzym bindes til et lektin i stedet for biotin under den resulterende dannelse av et enzym-lektinkompleks, som deretter kan fjernes fra binding til det faste substrat og anvendes som reagens i det heterologe system ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne teknikk kan også anvendes for fremstilling av biotinylerte lektiner og biotinylerte polysakkarider blant annet. Disse produkter samt enzymlektinkomplekset kan anvendes ved å fremstille andre store komplekser som inneholder andre enzymer", 'glykoproteiner og lignende.

Teknikker for utnyttelse av et enzymkompleks ved identifi-sering av et merket DNA er beskrevet i US patentsøknad nr. 490.712 av 2. mai 1983. Denne patentsøknad beskriver teknikker for analyse av genetisk materiale såsom DNA og RNA. Det genetiske materialet som skal analyseres eller identifiseres denatureres, fikseres til et substrat og hybridiseres med en sonde såsom en kjemisk merket sonde med en nukleotidsekvens komplementær til det genetiske materialet som skal identifiseres. Etter hybridiseringen mel lom den kjemisk merkede sonde og DNAet som skal identifiseres, knytes en enzymbestanddel som er virksom ved kontakt med et kromagen og gir en uløselig fargeutfelling eller farget produkt til sonden. Disse teknikker kan anvendes med det heterologe påvisningssystem ifølge foreliggende oppfinnelse og gi analyse og påvisning av genetisk materiale med forbedret sensitivitet, definisjon, nøyak-tighet og/eller hastighet. Det heterologe påvisningssystem i foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendelig både i kjente analytiske DNA teknikker såsom Southern blot analyse, Northern blot analyse, Western blot analyse, koloni-hybridisering, plaque løftinger, cytoplasmisk dot hybridisering og andre analytiske teknikker for identifikasjon av genetisk materiale såsom DNA og RNA.

De følgende eksempler viser utøvelsen av foreliggende oppfinnelse og er rettet på påvisning av forskjellige materialer såsom humant korionisk gonadotropin og DNA. I for-søkene som anvender biotinylert DNA og glykosylert DNA hybridiseres det merkede DNA til sitt komplementære DNA ved bruk av en blot prøveteknikk, hvori det hybridiserte DNA fikseres til et egnet substrat. Eksempel 1 inneholder en kombinasjon i overensstemmelse med det brede heterologe påvisningssystem i foreliggende oppfinnelse som innebefatter bruk av antistoffer til et spesifikt biologisk materiale under fiksering av materialet til et substrat, bruk av lektin som kan bindes til det biologiske materialet og

bruk av en signalrest som er spesifikk for lektinet.

Eksempel 1

Monoklonale antistoffer for humant korionisk gonadotropin (HCG) ble bundet til dekstran (Sepharose) kuler ved bruk av cyanogen bromid. I tillegg til bruk som koblingsreagensødelegger cyanogenbromidet det meste av affiniteten til Sepharose for lektinet Concanavalin A. Glasskuler eller polyakrylamidkuler kunne brukes i stedet for dekstranku-lene for å minimalisere kontrollnivåene for Concanavalin A binding.

250 ul av Sepharose kulene ble inkubert med 20 ul (ca. 670 enheter) av et preparat inneholdende HCG i ca. 45 minutter ved romtemperatur. I kontrollforsøket ble hormon verken tilsatt eller var tilstede. Sepharosekulene ble vasket fem ganger med 2,5 ml alikvoter av fosfatpufret saltvann (PBS). Etter hver vask ble kulene skilt fra ved sentrifugering ved ca. 1000 xg i et minutt. Supernatantvæskene ble kastet og kulene ble vasket en gang med 2 ml 0,2 M imi-dazolpuffer, pH 6,8, 1 mM Mn++, 1 mM Ca++. Kulene ble igjen skilt fra ved sentrifugering. Imidazol Mn-Ca puffer ble valgt for å maksimalisere Concanavalin A binding.

Kulene ble så behandlet med 50 g jodert Concanavalin A, spesifikk aktivitet på 6400 cpm/ug i 400 pl 0,2 M imida-zolpuffer, pH 6,8, 1 mM Mn++ og 1 mM Ca++. Etter inkube-ring i ca. 30 minutter ved romtemperatur ble prøvene vasket tre ganger med 5 ml, alikvoter av 0,2 M NaCl. Radioak-tiviteten i supernatanten fra den siste vask er ca. 67 cpm/100 ul. Kulene ble så skilt fra ved sentrifugering, oppslemmet i 0,2 M NaCl og talt. For prøven som inneholdt HCG var 231.840 cpm bundet, og for kontrollen var 117.150 cpm bundet.

I tillegg til den radioaktive bestemmelse av det bundede Concanavalin A kunne nærvær av Concanavalin A bundet til HCG fiksert til kulene bestemmes i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse ved å tilsette og fiksere et enzym til det bundede Concanavalin A. Nærvær av således bundet enzym kunne bestemmes eller påvises ved vanlige midler, for eksempel ved å frembringe et hensiktsmessig enzym kromogenholdig substrat for reaksjon med det Concanavalin A bundede enzym. I eksempelet ovenfor anvendes et heterologt påvisningssystem inneholdende antistoffer for binding til HCG, HCGet bundet til lektinet, Conacanavalin A og lektinet bundet til et glykoprotein, enzymet.

I det ovennevnte eksempel ville bestemmelsen av mengden bundet Concanavalin A være bestemmelse med streptavidin-biotinylert pepperrot peroksydase enzymkompleks. Ifølge dette aspekt av det heterologe påvisningssystem i foreliggende oppfinnelse bindes streptavidin til Concanavalin A sammen med den biotinylerte pepperrot peroksydase og den således fikserte streptavidin biotinylerte pepperrot peroksydase påvises med et hensiktsmessig kromogen eller kromogen eller fargegivende reaksjon innebefattende den fikserte pepperrot peroksydase.

Eksempel 2

Et kompleks dannet av biotinylert DNA og streptavidin-biotin pepperrot peroksydase muliggjør påvisning av 100 peg DNA bundet til nitrocellulose papir. Denne sensiti-viteten til biotinylert DNA med streptavidin-biotin pepperrot peroksydase er vist i den ovenfor angitte US patentsøknad nr. 490.712. Glykosylert DNA og lektin for bestemmelsen av de glykosylerte DNA er ikke så sensitivt. Bruken av lektinsystemet for påvisningen av glykosylert DNA er fordelaktig imidlertid fordi enzymet som også glykosyleres, kan bindes direkte til det glykosylerte DNA-lektin uten ytterligere manipulering. Den spesielle bestanddel i denne oppfinnelse, biotinylert lektin, gir en spesiell teknikk ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse for å forbedre det glykosylerte DNA-lektinsystem for påvisningen av DNA.

DNA punkt flekker ble fremstilt ved bruk av naturlig glykosylert DNA (T^fagDNA) og hakktranslatert biotinylert

DNA. Nitrocellulose eller lignende filtere som inneholdt DNA punkt flekkene ble blokkert for å forhindre ikke-spesifikk binding av lektinet, Concanavalin A, til dette. Denne fremgangsmåte medfører blokkering ved ca. 50°C med 2% BSA, engangs vask med SSC og kontakt med 0,1% av det overflateaktive middel Triton X-100. DNA punkt flekkene ble så behandlet.

DNA punkt flekkene ble bragt i kontakt med komplementært DNA som var ca. 20% biotinylert ved hakktranslation. Disse prøver er vist i tabell II nedenunder.

Etter blokkering ble streptavidin-biotin pepperrot peroksydase kompleks tilsatt i mengden 20 ul/cm 2 til de biotinylerte DNA flekker og inkubert ved 37°C i 45 minutter. Flekkene ble renset tre ganger i 5 minutter hver i en sterk saltpuffer og to ganger 5 minutter hver i en svak saltpuffer ved romtemperatur. Derpå ble DAB (0,5 mg/ml i 10 mM Tris ved en pH 7,6 pluss 0,02% CoCl2) påført i 10 minutter ved ca. 0°C i mørket. Deretter ble 0,02%

^ 2°2 t^-^- satt for øyeblikkelig påvisning av komplekset.

De glykosylerte DNA flekker som anvender glykosylert T^fag DNA ble testet som indikert i den følgende tabell III. Etter blokkering av flekkene ble biotinylert Concanavalin A påført strimlene med flekker i mengde på 20 ul/cm2 eller 100 ug/ml i TCMN løsning laget av 5 mM Tris pH 7,0, 1 mM MnC12' 1 mM CaC12 og 100 mM NaCl og flekkene ble inkubert ved 37°C i 1 time i en fuktig atmosfære. De eks-perimentelle resultater viser at rensing med TCMN puffer (100-200 ml) førte til høy bakgrunn (ikke-spesifikk binding av Concanavalin A til nitrocellulosepapiret).

Følgelig ble 1 mM glukoseløsning brukt i stedet for vaske-pufferen i et annet sett eksperimenter. I dette sett av eksperimenter ble de glykosylerte DNA flekker på nitrocel-lulosefilterpapir blokkert ved 50°C med 2% BSA, vasket en gang med SSC og 0,1% overflateaktivt middel, Triton X-100. Biotinylert Concanavalin A i en mengde 100 pq/' ml eller 20^1/cm<2>i TCMNpuffer ble påført ved 37°C i 60 minutter, etterfulgt av fem rensinger eller dyppinger på 5 minutter hver med 1 mM alfa-D-glukose og tre dyppinger eller rensinger 5 minutter med TCMN. Streptavidin-biotinpepperrot peroksydasekomplekset ble så påført ved 37°C i 30 minutter og vasket med en sterk saltpuffer og en svak saltpuffer, etterfulgt av påvisning av flekken ved bruk av DAB-F^C^, som beskrevet forut. De observerte resulta-

ter viste en sterkt øket sensitivitet for påvisningen av det glykosylerte DNA.

De ovenstående eksempler illustrerer den fleksible og brede anvendelighet av det heterologe påvisningssystem ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke bare avhenger av en ligande eller reaksjon eller affinitet. Når et målmateriale er knyttet til dette er en biotinrest, et homologt påvisningssystem kjent som inneholder et enzymkompleks omfattende avidin eller streptavidin-biotinenzym, f.eks. streptavidin-biotin pepperrotperoksydase. Når målmaterialet er glykosylert DNA er et annet homologt påvisningssystem kjent som inneholder lektin for binding til de glykosylerte DNA eller andre sukkergrupper knyttet til målmaterialet, og et enzym eller enzymkompleks som kan bindes til lecitinet. Lecitinet forbinder både målresten, glyko-lysert DNA og signalresten som omfatter enzymet.

I det heterologe påvisningssystem ifølge foreliggende oppfinnelse ligger imidlertid en foretrukket utførelses-form i bruk av kombinasjonen som innebefatter affinitet mellom biotin og avidin eller biotin og streptavidin og affiniteten mellom et lektin og et glykoprotein. Dette heterologe påvisningssystem kombineres faktisk uventet trekkende til to homologe påvisningssystemer. Når f.eks. målet inneholder biotingruppe såsom biotinylert DNA, vil påvisningssystemet anvende et kompleks, hvilket inneholder avidin eller streptavidin og biotinylert lektin. Dette komplekset ville fiksere eller binde seg til biotindelen av målet, og ville vises ved å bringe i kontakt med^dette og fiksere til lektindelen av kompleks et enzym som inneholder en glykosylgruppe såsom pepperrot peroksydase. Dette enzym ville så aktiveres eller anvendes til å signa-lisere sin binding til det avidinbiotinylerte lektinkompleks. Dertil kunne det avidinbiotinylerte lektinkompleks påvises ved kontakt med enzymkomplekset, streptavidin-biotinylert enzym såsom streptavidin-biotinpepperrot peroksydase .

For påvisning av et glykosylert eller sukkerholdig målmateriale kunne biotinylerte lektiner benyttes direkte til dette, etterfulgt av binding av et glykoprotein såsom pep perrot peroksydaseenzym til det således fikserte lektin. Nærvær av det tilknyttede enzym påvises direkte ved egnet fargeforandringsreaksjon. Dertil kunne det biotinylerte lektin som er bundet til målmaterialet bringes i kontakt med et enzymkompleks, f.eks. streptavidin-biotin pepperrotperoksydase. Dette system vil gi to signaler, et som skyldes bindingen av enzymet direkte til lektinet og det andre av bindingen av streptavidin-biotinenzymkomplekset til biotinresten i det biotinylerte lektin. Også fordi et lektin har en affinitet for glykoproteiner og fordi avidin og streptavidin er glykoproteiner, kunne ikke-markert lektin anvendes med eller i stedet for et biotinylert lektin.

Anvendeligheten av de biotinylerte lektiner og biotinylerte enzymer ved bruk av det heterologe påvisningssystem ifølge oppfinnelsen er vist ovenfor. En annen spesiell bestanddel, et biotinylert polysakkarid, såsom biotinylert dekstran eller biotinylert agarose gir også fordeler ved bruk av oppfinnelsen. F.eks. ved påvisning av et sukker-merket målmateriale ville et lektin bringes i kontakt med det glykosylerte DNA for feste til dette. Dekstran eller biotinylert dekstran ville så bringes i kontakt med lektinet som nå var fiksert til det glykosylerte DNA. Dekstranet ville knytte seg til lektinet, og det således tilknyttede dekstran ville påvises ved kontakt med et lektin-enzymkompleks, idet lektinet i lektin-enzymkomplekset ville knytte seg til dekstranet. Hvis et biotinylert dekstran ble anvendt i stedet for eller i tillegg til dekstranet, kunne det biotinylerte dekstran knyttet til det målfikserte lektin påvises ved kontakt med et deretter tilsatt lektinenzymkompleks og ved kontakt med et avidin eller streptavidin-biotin-enzymkompleks. Avidin eller streptavidin-biotin-komplekset ville binde seg til biotinresten i det biotinylerte dekstran. På grunn av at mange punkter foreligger i dekstran eller biotinylert dekstran for binding til sonden eller signalgivende lektin-enzym-kompleks og/eller avidin eller streptavidin-biotin-enzymkompleks, kan man oppnå en betydelig signalfor-

sterkning eller forstørrelse.

Ved bruk av foreliggende oppfinnelse kan man derfor oppnå en signalforstørrelse eller forsterkning ved å anvende i kombinasjon et lektin eller biotinylert lektin, et dekstran eller biotinylert dekstran for binding til dette og for videre binding av et lektinkompleks, eller et avidin eller streptavidinenzymkompleks eller et avidin-biotindek-strankompleks med eventuell utnyttelse av et lektin-enzyrn-kompleks eller et streptavidin- eller avidin-biotin-enzymkompleks.

Mange kombinasjoner kan anvendes ved bruk av oppfinnelsen for påvisning av biotinylerte, glykosylerte eller sukker-merkede målmaterialer. Slike kombinasjoner kan innebefatte lektin, et biotinylert lektin, et dekstran eller et polysakkarid, et biotinylert dekstran eller polysakkarid, avidin, et lektin-avidinkompleks, et lektin-enzymkompleks, et avidin eller streptavidin-biotinylert enzymkompleks, eller et biotinylert glykoprotein. Spesielt i forbindelse med lektiner og biotinylerte lektiner kan man også anvende immunobiologisk aktive materialer, såsom antigener, antistoffer og anti-antistoffer i det kombinerte heterologe påvisningssystem i foreliggende oppfinnelse. Se for eksempel US patent nr. 4.289.747.

For en fagmann vil det i lys av den foregående beskrivelse være åpenbart at mange modifikasjoner, erstatninger og forandringer er mulig ved bruk av foreliggende oppfinnelse innenfor rammen eller ideen av denne.

Claims

1. Kompleks,karakterisert vedat det inneholder et biotinylert lektin.

2. Kompleks ifølge krav 1, karakterisert vedat det videre inneholder en eller flere av gruppen avidin, streptavidin og et biotinylert enzym.

3. Kompleks,karakterisert vedat det inneholder et lektin og et glykoprotein valgt fra gruppen avidin og streptavidin.

4. Kompleks ifølge krav 3, karakterisert vedat det videre inneholder en eller flere av gruppen bestående av et enzym og et biotinylert enzym.

5. Kompleks,karakterisert vedat det inneholder et lektin og et biotinylert polysakkarid.

6. Kompleks ifølge krav 5, karakterisert vedat det videre inneholder en eller flere av gruppen et enzym, et biotinylert enzym, avidin og streptavidin.

7. Kompleks,karakterisert vedat det inneholder et lektin, et sakkarid, et biotinylert enzym og et glykoprotein valgt fra avidin og streptavidin.

8. Kompleks,karakterisert vedat det inneholder et biotinylert dekstran.

9. Kompleks ifølge krav 8, karakterisert vedat det videre inneholder et lektin, et enzym og et glykoprotein valgt fra gruppen avidin og streptavidin.

10. Kompleks ifølge krav 9, karakterisert vedat enzymet er biotinylert .

11. Kompleks ifølge krav 10, karakterisert vedat lektinet er biotinylert .

12. Kompleks ifølge krav 10, karakterisert vedat det videre inneholder et lektin tilknyttet enzym.

13. Hybridisert dobbeltkjedet DNA-sekvens omfattende en streng som erkarakterisert vedminst et nukleotid merket med en sakkaridrest, nukleotidet knyttet til et kompleks omfattende et biotinylert lektin, et biotinylert enzym og et glykoprotein valgt fra gruppen avidin og streptavidin.

14. DNA sekvens ifølge krav 13,karakterisert vedat komplekset videre inneholder et biotinylert dekstran.

15. Hybridisert dobbeltkjedet DNA-sekvens omfattende en kjede,karakterisert vedat minst et biotinylert nukleotid er tilknyttet et kompleks omfattende et.biotinylert lektin, et enzym og et glykoprotein valgt fra gruppen avidin og streptavidin.

16. Hybridisert dobbeltkjedet DNA-sekvens omfattende en kjede,karakterisert vedminst et nukleotid merket med en sakkaridrest og som har knyttet til det merkede nukleotid et kompleks omfattende lektin, dekstran, og et enzym, idet en del av lektinet er knyttet til sakkaridet og dekstranet, og en annen del av lektinet er knyttet til dekstranet og enzymet.

17. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær av et biotinylert nukleotid,karakterisert vedat man bringer det biotinylerte nukleotid i kontakt med et kompleks omfattende et biotinylert lektin, et enzym og et glykoprotein valgt fra gruppen avidin og streptavidin.

18. Fremgangsmåte ved bestemmelse av nærvær av et glykosylert eller sakkaridmerket nukleotid,karakterisert vedat man bringer glykosyl eller sakkaridresten til nukleotidet i kontakt med et kompleks omfattende lektin og et enzym.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat man anvender et lektin osm er biotinylert, et enzym som er biotinylert og kompleks ytterligere omfattende et glykoprotein valgt fra avidin eller streptavidin.