JPS63282659A - 核酸の測定方法および測定剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、５−アザ−２′−デオキシシチジン（ｄａｚ
ａＣ）、ＤＮＡメチラーゼおよび抗−ＤＮＡメチラーゼ
抗体を用いる核酸の測定方法および測定剤に関する。

ＤＮＡハイブリダイゼーションの技術は、遺伝性のある
いは微生物性の疾患の研究および診断に、近年広く応用
されている。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ハイブ
リダイゼーション条件の下に、２個の一本鎖相補ＤＮＡ
分子が二重らせんを形成することに基づいている。同様
にして、一本鎖ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子は、ＤＮＡ／　
ＲＮＡハイブリッドを生じる。

特定の核酸配列を検出するには、検体中に含まれる核酸
を、変性により一本鎖に分離する。

次に、得られた一本鎖を不活性表面例えばニトロセルロ
ースまたはナイロン膜上に固定する。

その固定された一本鎖を相補ポリヌクレオチドと、固定
一本鎖配列および相補ポリヌクレオチド・プローブから
二本鎖が形成され得るように解離温度より低い温度で接
触させる。洗浄工程の後、ポリヌクレオチド・プローブ
と測定されるべき核酸配列より構成される生成二本鎖が
検出される。このｔ；めに、相補ポリヌクレオチド・プ
ローブをその位置を再び定めるのに適した方法で標識す
る。この標識は、通常、燐、ヨウ素、硫黄または水素の
ラジオアイソトープを取り込ませることによって行われ
る。

この方法の欠点の主たるものは、放射性物買を取り扱う
ことが必要となる点、およびそれに伴って様々な義務が
生じ安全措置を講じなければならない点である。このＩ
；め、核酸の放射性標識を非放射性検出系で置き換える
べく、多くの試みが従来より、なされている。すなわち
、ピリミジン環またはプリン環上に共有結合したビオチ
ンを含有するヌクレオチドトリホスフェート・アナロー
ブが合成されている（ＥＰ　６３．８７９参照）。これ
らのヌクレオチド誘導体はＲＮＡポリメラーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼの気質であることから、ビオチン−標
識ポリヌクレオチドを酵素的に調製しそしてそれらをハ
イブリダイゼーションに用いることができる。検出は、
従来より知られているアビジン／ビオチン相互作用に基
づいており、そして形成された二本鎖はアフイニテイ検
出系（例えばアビジン−ペルオキシダーゼ）を用いて検
出される。しかしながら、この方法には、極めて多くの
生物学的材料中にビオチンが存在し、そのため、それを
検出した結果しばしば障害となる信号が生じるという欠
点がある。

更に、近年では、抗原／抗体相互作用がＤＮＡハイブリ
ダイゼーションの検出に用いられている。ハイブリダイ
ゼーションが生起した後、古典的な免疫学的方法、例え
ば、場合により標識されている特異抗体／酵素接合体（
コンジュゲート）、を検出に用いる。この抗ｙＫ／抗体
反応における抗原は、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡ／Ｒ
ＮＡから形成された二本鎖とすることができる。すなわ
ち、ヨーロッパ特許出願ＥＰ　１３５．１５９では、二
本鎖天然（ｎａｔｉｖｅ）ＤＮＡに対するモノクローナ
ル抗体が用いられている。ヨーロッパ特許出願ＥＰ　１
６３．２２０においては、プローブとしてのリボ核酸、
および特異抗−ＤＮＡ／　ＲＮＡハイブリッド抗体が用
いられている。いずれの場合においても、測定されるべ
き核酸は、ハイブリダイゼーションが生起した後、特異
標識抗体を生成二重らせんまたはＤＮＡ／　ＲＮＡまた
はＲＮＡ／　ＲＮＡハイブリッドに結合させることによ
って検出される。

天然ＤＮＡに対する特異抗体を使用することの重大な欠
点は、ポリヌクレオチド・プローブが、ハイブリダイゼ
ーション条件下に、検出されるべきＤＮＡとハイブリダ
イズするとき、検出されるべきＤＮＡ二重らせんの部分
が形成され、この結果、抗体の非特異的結合を招く点で
ある。もう一つの欠点はプローブがリポ核酸に制約され
る点である。何故ならば、リポ核酸を使用する場合、ｐ
Ｈが高すぎたり、あるいはりボヌクレアーゼ活性が導入
されたりすることにょろりポ核酸の損傷または破壊を防
ぐには、特に厳しい条件がハイブリダイゼーション反応
に課せられるからである。

免疫学的反応における抗原は、ハプテンにより共有結合
的に修飾されたポリヌクレオチド・プローブとすること
もできる。これは、例えば、ハプテンをブリッジング・
メンバーを介してポリヌクレオチド・プローブに共有結
合的に結合することによって行われる（ＥＰ　１７３．
２５１）。この方法の欠点は、ハプテンによってポリヌ
クレオチドプローブと検出されるべきＤＮＡの間の効率
的ハイブリダイゼーションが制限される点である。修飾
されｔ；ヌクレオチドトリホスフェートの形で酵素的に
ＤＮＡ中に取り込むこともできるような比較的小さ目の
ハプテンは、ハイブリダイゼーション反応においてこの
ような大きな障害を生じることはない。従って例えば、
ブロモウラシル（ＥＰ　１０２．２２８参照）およびＮ
　−２−アセチルアミノフルオレン（ＥＰ　９７．６６
４参照）の使用が開示されている。ハイブリダイゼーシ
ョンは次いで、このＤＮＡ含有修飾ヌクレオチドに対す
る特異抗体により検出される。しかしながら、使用され
る修飾ヌクレオチドは、はとんど発癌物質であり、その
取扱いには必然的に予防措置をとらなければならず、ま
た健康に対する危険の可能性が伴う。

本発明の目的は、前述の諸欠点のない新しい剤および方
法を利用可能にすることにある。

この目的は、本発明により、ＤＮＡメチラーゼ、抗−Ｄ
ＮＡメチラーゼ抗体および５−アザ−２′−デスオキシ
シチジンまたは５−アザシチジンを用いた核酸測定方法
および核酸測定剤により達成される。

本発明は、測定されるべき核酸配列を一本鎖に変えそし
てそれら一本鎖を相補ポリヌクレオチド・プローブと反
応させることより成る検体中の核酸の測定方法において
、該ポリヌクレオチド・プローブ中のシチジンを５−ア
ザ−２′−デスオキシシチジンまたは５−アザシチジン
で置き換え、そしてこのプローブを場合により標識され
ていることのあるＤＮＡメチラーゼを結合しそしてその
メチラーゼを場合により標識されていることのある特異
抗−メチラーゼ抗体を介して、またはマーカーを介して
検出することによって測定することを特徴とする前記方
法に関する。

本発明は、更に、シチジンの代わりに５−アザ−２′−
デオキシシチジンまたは５−アザシチジンを含むポリヌ
クレオチド・プローブを含み、そして場合により標識さ
れていることのあるメチラーゼ、および場合により標識
されていることのある抗−メチラーゼ抗体を含む核酸の
測定剤に関する。ポリヌクレオチド・プローブは二本鎖
、一本鎖、または場合により標識されているメチラーゼ
との複合体の形であってもよい。

驚くべきことに、哺乳動物細胞からのＤＮＡメチラーゼ
の５−アザシチジンに対する高い結合親和性を利用する
ことにより測定されるべき核酸種の検出を首尾よく行う
ことができることを見出した。このために、ポリヌクレ
オチド・プローブ中のｄ−シチジンを５−アザ−２′−
デオキシシチジンで置き換える。検出は、生成するＤＮ
Ａハイブリッドを真核生物のＤＮＡメチルトランスフェ
ラーゼ（−ＤＮＡメチラーゼ）と共にインキュベーショ
ンし、安定なｄａｚａＣ／メチルトランスフェラーゼ複
合体を形成することにより行われる。これらの複合体は
、次いで、既知の免疫学的方法を用いて、ＤＮＡメチル
トランスフェラーゼに対する特異抗体により検出するこ
とができる。

真核生物のＤＮＡメチラーゼは、既知の方法により、例
えばヒト胎盤から単離される（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７４０．３２３　（１
９８３）参照）。精製酵素は「コンサーペーション（ｃ
ｏｎｓｅｒｖａｔ　１ｏｎ）Ｊおよび「ドノポ（ｄｅ　
ｎｏｖｏ）」メチラーゼ活性を有するｌ　９０ＫＤポリ
ペプチドである。これらの活性によって、ＤＮＡメチラ
ーゼは、一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方に結合する
。しかしながらｄａｚａＣで修飾されたＤＮＡへの結合
は、極めて安定性が高く、そのため、それは不安定化条
件、例えば高い塩濃度、の下でも解離しない。これによ
って、驚くべきことに、核酸への非特異的結合を完全に
抑え、そしてｄａｚａＣ−含有ＤＮＡに対するメチラー
ゼの結合のみを許す条件を見出すことが可能となる。メ
チラーゼとｄａｚａＣ−含有ＤＮＡとで構成される複合
体は厳しいハイブリダイゼーション条件にも耐えるので
、ＤＮＡメチラーゼおよびｄａｚａＣはハイブリダイゼ
ーション反応の検出に著しく適している。

真核生物のＤＮＡメチラーゼに対するモノクローナル抗
体は、既知の方法により、例えばマウスを精製メチラー
ゼ免疫し、そしてハイブリドーマ細胞クローンを構築す
ることにより調製される（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、　３４．３３０　（１９８４）参照）。

ｄａｚａＣ−またはａｚａＣ−含有ポリヌクレオチド・
プローブの調製は、既知の酵素的方法により、例えばポ
リメラーゼＩの使用によるｄａｚａＣＴＰの取込みにツ
クトランスレーション；　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２．１
１８４　（１９７５）参照）により行うことができる。

しかしながら、このためには、５”ｄａｚａＣを相当す
るトリホスフェートに変えなければならない。これは、
１．５モル過剰のＰＯＣＱ、を５’−ｄａｚａＣに０°
Ｃで添加し、そして反応を１８°Ｃで１時間撹拌しなが
ら行うことにより行われる。次に２倍過剰のトリエチル
アンモニウムピロホスフェートを０℃で添加し、そして
反応を１８℃で１時間行う。形成された５　’−ｄａｚ
ａＣＴＰは、セルロース薄層クロマトグラフィーにより
、またはＨＰＬＣによって精製する。

酵素的取込みにより５’−ｄａｚａＣＴＰで標識された
ＤＮＡプローブは一本鎖または二本鎖の形でハイブリダ
イゼーションアッセイに用いることができる。５−アザ
−２′−デオキシシチジンはある条件下に加水分解され
、開環してデオキシリボフラノシル−３−グアニル尿素
を与える。この加水分解の起こり方は、一本鎖ＤＮＡの
場合よりも二本鎖ＤＮＡの場合の方がゆっくりとしてい
る。

この効果を利用すれば、ハイブリダイゼーションが生起
した後に、ハイブリダイズされないポリヌクレオチド・
プローブを除去せずに済ませることができる。

本発明により誘導体化された核酸と、分析されるべき検
体中の相補核酸との間の実際のハイブリダイゼーション
工程は、既知の方法により行われる。固相でのハイブリ
ダイゼーションが好ましい。このためには、核酸を一本
鎖に分離した後、検出されるべき核酸を固相に固定する
。

ニトロセルロースまたはナイロン膜が常法にならって用
いられる。その固定された核酸を、次に、ハイブリダイ
ゼーション条件下にｄａｚａＣ−含有ポリヌクレオチド
・プローブと接触させる。

そのハイブリダイゼーションは、次いで、常法にならっ
た洗浄およびプロッキング工程の後、ＤＮＡメチラーゼ
の添加の添加およびそれとのインキュベーションにより
検出することができる。

ｄａｚａＣ−含有ＤＮＡとＤＮＡメチラーゼの間の結合
定数が極めて高いことは、検出されるべきＤＮＡ。

ポリヌクレオチド・プローブおよびＤＮＡメチラーゼで
構成される極めて安定な複合体が形成されることを意味
する。未結合ＤＮＡメチラーゼおよびハイブリダイズさ
れないポリヌクレオチド・プローブを除去した後、ハイ
ブリダイゼーションを、例えば、モノクローナル・マウ
ス抗−ＤＮＡメチラーゼ抗体およびβ−ガラクトシダー
ゼと接合した第２の抗−マウスＩｇＧを用いて結合ＤＮ
Ａメチラーゼを検出することにより、検出することがで
きる。

更に、ｄａｚａＣおよびＤＮＡメチラーゼの使用は、Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーションを簡単に検出するための多
くの他の可能性をも提供する。すなわち、遺伝子操作に
よりまたは化学的に調製されたＤＮＡメチラーゼ／酵素
接合体、またはマーカーに結合されたＤＮＡメチラーゼ
を形成されたハイブリッドの検出に用いることができ、
また既知の結合アッセイに用いられるあらゆるマーカ−
（標識）を用いることができる。これによって抗−メチ
ラーゼ抗体とインキュベーションする必要がなくなる。

別の態様例においては、ｄａｚａＣ−含有ポリヌクレオ
チド・プローブをハイブリダイゼーションの前にＤＮＡ
メチラーゼとインキュベートし、そして形成されたＤＮ
Ａメチラーゼ／ポリヌクレオチド・プローブ複合体をハ
イブリダイゼーションに用いる。この場合にも、検出さ
れるべき核酸とのハイブリダイゼーションは、ノ１イブ
リダイゼーションおよび常法にならった洗浄工程を行っ
た後、抗−ＤＮＡメチラーゼ抗体をメチラーゼに既知の
方法により結合させることにより検出される。マーカー
または酵素に結合されたＤＮＡメチラーゼとポリヌクレ
オチド・プローブとで構成される複合体を直接用いれば
、この工程を省くことができる。

更に、抗−ｄａｚａＣ抗体を、検出されるべきＤＮＡと
ハイブリダイゼーションさせた後でｄａｚａＣ−含有ポ
リヌクレオチド・プローブとインキュベートすることも
できる。そのハイブリダイゼーションは、次いで、マー
カーを付した第２の抗体を用いて既知の免疫学的方法に
より、あるいはその抗−ｄａｚａＣ抗体がマーカーまた
は酵素に結合されている場合には直接的に、検出される
。

ＤＮＡメチラーゼは天然ＤＮＡに対しても結合すること
から、ＤＮＡメチラーゼ、またはマーカーまたは酵素に
結合されたメチラーゼ、および天然の一本鎖または二本
鎖のＤＮＡから構成される共有結合複合体を、近紫外線
域での照射により、あるいはタンパクおよび核酸間の他
の既知の化学的架橋反応により、容易に形成することが
できる。この複合体は次いでハイブリダイゼーションに
直接使用でき、また常法により検出することができる。

核酸をｄａｚａＣＴＰの取込みによって修飾してもハイ
ブリダイゼーション反応には全く影響しないばかりか、
ハイブリダイゼーション反応で形成されたＤＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッドは、次いでＤＮＡメチラーゼを結合させ
ることにより強化される。

ＤＮＡメチラーゼ上のいくつかのエピトープが特異抗体
に結合できそれによって付加的な増幅が生じるので、感
度を更に増大させることができる。

本発明の方法を用いることにより、既知の核酸測定方法
と少くとも同程度に良好な分析結果を簡単に得ることが
できる。ＤＮＡメチラーゼのｄａｚａＣ−含有ＤＮＡに
対する結合定数は極めて高く、従って極めて低い濃度域
においてさえ、ＤＮＡメチラーゼのｄａｚａＣ不含ＤＮ
Ａに対する障害となる非特異的結合を伴うことのない検
出が可能である。

実施例　ｌ ニックトランスレーションによるｄａｔａｃ−含有ポリ
ヌクレオチド・プローブの調製 ｌａｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＢｃａｍ　３２２５）を
５００ＵＭｄａｚａＣＴＰ、および２ｐ９のＤＮＡ５ｅ
　Ｉおよび５００ＵのＤＮＡポリメラーゼＩと共に５０
μａ容量として標準的条件下（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、
　ｄＴＴＰ（各５０μＭ）、１μＭ　ｄＣＴＰ、　５ｍ
Ｍ　ＭｎＣｆｆ、、５０Ｊｎ／　ｍＱ　ＢＳＡ、　５０
＋Ｍ　トリス−ＨＣＱ。

ｐＨ７，５）に１５℃でインキュベートする。１時間後
、ｔｏｏｕの１２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加により反応を止め
る。その混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラムで
のクロマトグラフィにかけてａｚａＣで修飾されたＤＮ
Ａを未反応ヌクレオチドトリホスフェートから除去する
。

そのＤＮＡは排斥容量中を移行しそして４００μＱの１
０１１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７，６に溶出される。

実施例　２ 一本鎖ｄａｚａＣ−含有ポリヌクレオチド・プローブの
調製 ５ｐｍｏＱの一本鎖Ｍ１３ｃａｍｐ５ＤＮＡを、Ｍ１３
ｃａｍｐ５にクローン化されたカンピロバクタ−（Ｃａ
ｍｐｙ　１ｏ−ｂａｃｔｅｒ）　ＤＮＡに相補的な５ｐ
ｍｏ＜＋の合成オリゴヌクレオチド（６ＯＮ）でハイブ
リダイズさせる。得られるプライマー／鋳型複合体を１
００ＵのＤＮＡポリメラーゼ（クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ
）酵素）およびｄＧＴＰ。

ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ（各２００μＭ）、５μＭ　ｄＣ
ＴＰ、　７５０ＵＭ　ｄａｚａＣＴＰと共に、５０ｕＱ
の５ｍＭ　ＭｎＣＱ、、５０＋Ｍ）すスーＨＣＲ，ｐＨ
７，５、および５０μｇｌ　ｍＱ　ＢＳＡ中、１５℃で
インキュベートする。４５分後に反応を止め、そしてそ
の混合物を８％変性ポリアクリルアミドゲルで分画する
。１５ＯＮより大きい一本鎖ｄａｚａＣ−含有ＤＮＡを
溶出させそしてそれはハイブリダイゼーションに用いら
れる。

実施例　３ ａ）　　ｄａｚａＣ−含有ポリヌクレオチド・プローブ
とのハイブリダイゼーション 様々な量の変性カンピロバクタ−ＤＮＡ（１ｏｎ９〜１
１）９）をドツト−プロット装置を用いてナイロン膜に
適用する。そのフィルターを６０°Ｃで６×ＳＳＣ（塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５　Ｘ　Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ　（牛血清アルブミン／ポリビニルピロリド
ン／フィコール）、０．５％ＳＯ３および２０μｇ　／
　ｒａ　Ｑ変性ニシン精子ＤＮＡ、中で１時間プレハイ
ブリダイズさせた後、本格的なハイブリダイゼーション
を、３００　ｎ　９　／　ｍ　Ｑ濃度の実施例１で得た
ニックトランスレーションによるｄａｚａｃ−含有ＤＮ
Ａグローブの添加により、６０℃で３時間行う。次にそ
のフィルターを既知の方法により漸減ＳＳＣ濃度を用い
て所望の厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）まで洗浄する
。

ｂ）　　ＤＮＡメチラーゼのＤＮＡ／ｄａｚａＣ−ＤＮ
Ａハイブリッドへの結合 前記ハイブリダイゼーション反応で形成され、そして検
出されるべきＤＮＡおよびｄａｚａＣ−含有ＤＮＡプロ
ーブから構成されるハイブリッドを検出するために、ハ
イブリッドをＤＮＡメチラーゼと共にインキュベートす
る。これは、前記ナイロン膜を２０ｍＭ　トリス緩衝剤
、ｐＨ７，５，５＋ｎｌＪ　ＥＤＴＡ。

０　、５ｍＭジチオエリトロール、２％グリセロール、
１％ＢＳＡ、　１０μＭＳ−アデノシルメチオニン、中
の１μ９／ｒａＱ　ＤＮＡメチラーゼと共に３７℃で１
５分間振盪しながらインキュベートすることにより行わ
れる。未結合ＤＮＡメチラーゼは、そのフィルターを各
々５分間、２０１１Ｍ　）リス緩衝剤、ｐＨ７，５，５
ＤＩＭ　ＥＤＴＡ、　０．４Ｍ　ＮａＣ（＋を用い、次
いで２０ｍＭ　トリス緩衝剤、ｐＨ７，５，５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、　０．ＩＭ　Ｎａ（Ｊを用いて室温で洗浄する
ことにより除去する。

Ｃ）　　モノクローナル・マウス抗−ＤＮＡメチラーゼ
抗体、およびβ−ガラクトシダーゼと接合した第２の抗
−マウスＩｇＧによる結合メチラーゼの検出 ｂ）で得た膜を、ＩＸＰＢｓ（燐酸ナトリウム）、ｐＨ
７，５、および０．１％ツイ−７（ｔｗｅｅｎ）２０　
’ｔ’洗浄後、それを１ＸＰＢｓ、　０．１％ＢＳＡ中
、マウス抗−ＤＮＡメチラーゼ抗体（１μ９／　ｌ１１
２）と共に室温で３０分間インキュベートする。次に、
β−ガラクトシダーゼ抗−マウスー１ｇＧ抗体を添加し
、再び室温で３０分間インキュベートする。未結合抗体
をＩＸＰＢｓで５回洗浄することにより除去する。

次にその混合物を酵素基質溶液（ＰＢＳ、　ｐＨ７，５
、中、０．５１１１ｇ／　ｍＱ　５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−ガラクトシド、ｌ　ｍＭ　ＭｇＣ
Ｑ＊、３ｍＭフェリシアン化カリウム、３ｍＭフェロシ
アニド）と共に室温で少くとも１時間インキュベートす
る。このようにして、５０ｐｇのカンピロバクタ−ＤＮ
Ａを容易に検出することができる。

実施例　４ 一本鎖ｄａｚａＣ−含有ＤＮＡプローブとＤＮＡメチラ
ーゼとのインキュベーション 実施例２で調製された一本鎖ｄａｚａｃ−含有ＤＮＡプ
ローブを実施例３ｂに記載した方法と同様にしてＤＮＡ
メチラーゼ（１０μｇ／ＩＩＱ）と共にインキュベート
する。未結合メチラーゼ部分を除去するために、その混
合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００カラムでのクロマ
トグラフィーにかける。得られるＤＮＡグローブ／メチ
ラーゼ複合体は極めて安定していて、実施例３ａに記載
されているようなカンピロバクタ−ＤＮＡの検出に用い
ることができる。

このためのハイブリダイゼーション温度は、ＤＮＡメチ
ラーゼで標識されていないプローブ／ＤＮＡハイブリッ
ドに対して予測される解離温度よりも３５℃低い。生じ
たハイブリダイゼーションの検出は、実施例３ｃに記載
されているように行われる。

実施例　５ ＤＮＡメチラーゼ／ペルオキシダーゼ接合体とのハイブ
リダイゼーションの検出 実施例３で形成され、そして検出されるべきＤＮＡおよ
びｄａｚａＣ−含有ＤＮＡプローブで構成されるハイブ
リッドを検出するために、それをＤＮＡメチラーゼ／ペ
ルオキシダーゼ接合体と共にインキュベートする。その
インキュベーションは、実施例３ｂに記載されているよ
うなりＮＡメチラーゼとのインキュベーションと同様に
して行われる。

結合、および未結合ＤＮＡメチラーゼ／酵素接合体の除
去の後、１ｏＯｎ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，
５、中の０．０２５％過酸化水素および４００μｇ／ｍ
Ｑアミノエチルカルバゾールより成るペルオキシダーゼ
基質溶液を添加し、室温で顕著な呈色反応が起こるまで
インキュベーションすることにより、ハイブリダイゼー
ションが直接検出される。

ＤＮＡメチラーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの
接合体は、ヘテロニ官能性結合試剤であるＮ−スクシン
イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを
用いて既知の方法により調製される。

特許出願人　　メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミ
ツト豐ベシュレンクテルφハフツング７１□　′　で、 代理人　弁理士南　　　孝　　夫Ｘブー１・・１ジ・ ＼・・−・：・７゛′

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）検体中の核酸を測定するために、測定されるべき核
   酸配列を一本鎖に変え、そしてそれら一本鎖を相補ポリ
   ヌクレオチド・プローブと反応させることより成る検体
   中の核酸の測定方法であって、該ポリヌクレオチド・プ
   ローブ中のシチジンを５−アザ−２′−デオキシシチジ
   ンまたは５−アザシチジンで置き換え、そしてこのプロ
   ーブを、場合により標識されていることのあるＤＮＡメ
   チラーゼと結合させそしてそのメチラーゼを、場合によ
   り標識されていることのある特異抗−メチラーゼ抗体を
   介して、またはマーカーを介して検出することによって
   測定することを特徴とする前記検体中の核酸の測定方法
   。 ２）ＤＮＡメチラーゼ／ＤＮＡプローブ複合体が、マウ
   ス抗−ＤＮＡメチラーゼ抗体およびマウスＩｇＧ抗体に
   より、または抗−マウスＩｇＧ抗体／酵素接合体により
   、検出される請求項１記載の方法。 ３）５−アザ−２′−デオキシシチジンまたは５−アザ
   シチジンを含有するポリヌクレオチ ド・プローブが、５−アザ−２′−デオキシシチジンま
   たは５−アザシチジンを含有する核酸に対する、場合に
   より標識されていることのある特異抗体、または抗体／
   酸素接合体により検出される、請求項１記載の方法。 ４）検出されるべき核酸が、固相に対して、直接に、ま
   たは固定された相補核酸を介して、結合される請求項１
   〜３のいずれかに記載の方法。 ５）シチジンの代わりに５−アザ−２′−デオキシシチ
   ジンまたは５−アザシチジンを含むポリヌクレオチド・
   プローブを含み、そして場合により標識されていること
   のあるメチラーゼ、および場合により標識されているこ
   とのある抗−メチラーゼ抗体を含む核酸の測定 剤。 ６）ポリヌクレオチド・プローブが、二本鎖、一本鎖ま
   たは場合により標識されていることのあるメチラーゼと
   の複合体の形である請求項５記載の測定剤。