JPS61264240A - 発光標識を用いた固相核酸ハイブリツド合成アツセイ - Google Patents
発光標識を用いた固相核酸ハイブリツド合成アツセイInfo
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- JPS61264240A JPS61264240A JP10077786A JP10077786A JPS61264240A JP S61264240 A JPS61264240 A JP S61264240A JP 10077786 A JP10077786 A JP 10077786A JP 10077786 A JP10077786 A JP 10077786A JP S61264240 A JPS61264240 A JP S61264240A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6823—Release of bound markers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、多様な生物学的試料からの核酸の検出および
／または定量のための、発光標識？用いた固相核酸ハイ
ブリッド形成アッセイの方法に関するものである。
／または定量のための、発光標識？用いた固相核酸ハイ
ブリッド形成アッセイの方法に関するものである。
（従来の技術）
核酸ハイブリッド合成は、多様な生物学的試料からの単
＠ホリヌクレオチドの検出に使用されてきた技術である
。上記技術は、バクテリアやウィルスのような微生物、
哨乳動物の遺伝子（例えば：鎌状赤血球ヘモグロビン）
、オンコジーン、および、他の多数の医学的に重要な遺
伝子の検出に使用されてきた。
＠ホリヌクレオチドの検出に使用されてきた技術である
。上記技術は、バクテリアやウィルスのような微生物、
哨乳動物の遺伝子（例えば：鎌状赤血球ヘモグロビン）
、オンコジーン、および、他の多数の医学的に重要な遺
伝子の検出に使用されてきた。
最も一般的な核酸ハイブリッド形成アッセイにおいては
、核酸試料（通常二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとして存
在する）全、まず単鎖の形とし、固体キャリア上に固定
する。上記核酸試料は、事前に制限ヌクレアーゼで切断
されていてもされていなくてもよい。通常ニトロセルロ
ース紙を固体キャリアとして使用するが、異なる紙も使
用され成功している。核酸試料は、ゲルマトリックス中
で電気泳動を行なってもよい。次に、固定された核酸試
料全、該核酸試料上の特異的な配列と相補的な、標識さ
れた核酸プローブとハイブリッド形成を行なわせる。核
酸プローグは、後に続く段階で検出される、放射性、酵
素、螢光、化学発光あるいは生物発光分子によって標識
され得る。
、核酸試料（通常二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとして存
在する）全、まず単鎖の形とし、固体キャリア上に固定
する。上記核酸試料は、事前に制限ヌクレアーゼで切断
されていてもされていなくてもよい。通常ニトロセルロ
ース紙を固体キャリアとして使用するが、異なる紙も使
用され成功している。核酸試料は、ゲルマトリックス中
で電気泳動を行なってもよい。次に、固定された核酸試
料全、該核酸試料上の特異的な配列と相補的な、標識さ
れた核酸プローブとハイブリッド形成を行なわせる。核
酸プローグは、後に続く段階で検出される、放射性、酵
素、螢光、化学発光あるいは生物発光分子によって標識
され得る。
核酸試料全固体キャリアに結合される手法は、以下に挙
げるもの？含めて、多数知られている：（１） 単鎖
ＤＮＡＩニトロセルロースに結合させること（サザン（
Ｅ 、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ著、Ｊ 、 Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ。
げるもの？含めて、多数知られている：（１） 単鎖
ＤＮＡＩニトロセルロースに結合させること（サザン（
Ｅ 、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ著、Ｊ 、 Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ。
Ｖｏｌ、９８．ｐｐ、５（１３−５２７（１９７５）；
（２１ＤＮＡをジアゾベンジルオキシメチル紙に結合さ
せること（ワール（Ｇ、Ｗａｈｌ）他著、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ。
（２１ＤＮＡをジアゾベンジルオキシメチル紙に結合さ
せること（ワール（Ｇ、Ｗａｈｌ）他著、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、ＶＯｌ、７６、 ｐＤ、３６８３−３６８
７（１９７９））；および（３１Ｄ Ｎ Ａ ２セルロ
ースに共有結合させること（ノールｙ、 （Ｂ 、 Ｎ
ｏ１ｅｓ ）他著、Ｃｅ１１．Ｖｏｌ、５＋ｐｐ、３０
１−３１０（１９７５））。溶液中のプローブを戸紙上
に固定されたＤＮＡあるいはＲＮＡとハイブリッド形成
を行なわせるために、多種の方法が可能である。上記方
法は、溶媒および使用される温度、標識されたプローブ
およびその特異的活性、および会合度全増大させるデキ
ストラン硫酸のような化合物の使用において異なる。
７（１９７９））；および（３１Ｄ Ｎ Ａ ２セルロ
ースに共有結合させること（ノールｙ、 （Ｂ 、 Ｎ
ｏ１ｅｓ ）他著、Ｃｅ１１．Ｖｏｌ、５＋ｐｐ、３０
１−３１０（１９７５））。溶液中のプローブを戸紙上
に固定されたＤＮＡあるいはＲＮＡとハイブリッド形成
を行なわせるために、多種の方法が可能である。上記方
法は、溶媒および使用される温度、標識されたプローブ
およびその特異的活性、および会合度全増大させるデキ
ストラン硫酸のような化合物の使用において異なる。
ハイブリッド形成を行なった分子の検出は、伝統的に、
デオキシヌクレオチドアルファ３２Ｐ三リン酸全用いた
ニックトランスレーションによってＤＮＡ１高い特異的
活性状態に標識すること（リグビー（Ｐ、Ｒｉｇｂｙ）
他著、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｌ−１３３、ｐｐ、
２３７−２５１（１９７７））およびこのＤＮＡヲ、戸
紙上に固定させたＤＮＡ試料とハイブリッド形成させる
ことによって行なわれた。放射性活性の使用を避ける手
段として、ａＵＴＰのＣ５残基にビオチン分子が導入さ
れた（レンジャー（Ｐ。
デオキシヌクレオチドアルファ３２Ｐ三リン酸全用いた
ニックトランスレーションによってＤＮＡ１高い特異的
活性状態に標識すること（リグビー（Ｐ、Ｒｉｇｂｙ）
他著、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 Ｖｏｌ−１３３、ｐｐ、
２３７−２５１（１９７７））およびこのＤＮＡヲ、戸
紙上に固定させたＤＮＡ試料とハイブリッド形成させる
ことによって行なわれた。放射性活性の使用を避ける手
段として、ａＵＴＰのＣ５残基にビオチン分子が導入さ
れた（レンジャー（Ｐ。
Ｌａｎｇｅｒ ）他著、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、 Ｖｏｌ。
Ｓｃｉ、、 Ｖｏｌ。
７８（２２）’、ｐｐ、６６３３−６ｓａ７（ｚ９ｓ１
））。
））。
このビオチン化されたａＵＴＰ２、ニックトランスレー
ションあるいはターミナルトランスフェラーゼ法（ｃｆ
、”エンゾ・バイオーツローブ・システム：末端標識キ
ット（Ｔｈｅ ：Ｌｎｚｏ Ｂｉｏ−ＰｒｏｂｅＳｙｓ
ｔｅｍ： Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ
Ｋｉｔ ）”、 ｘ７ゾ・バイオケム社、ニューヨ
ーク州ニューヨーク１００１３ ）によってＤＮＡに導
入することにより、ハイブリッド形成を行なったＤＮＡ
は、ビオチンの検出のための免疫学的手法の使用あるい
は、ＤＮＡハイブリッド分子中に導入されたビオチンに
対するアビジン（酵素あるいは螢光標識に結合させたも
の）の高い親和性の利用により、検出可能であった。ハ
イブリッド形成アッセイの変法の中で、サンドインチハ
イブリッド形成は二つのプローブ全利用したものだと言
えるニブロープ＃１はＤＮＡ試料を捕らえるために膜に
固定させ、プローブ＃２け、シグナルプローグとし７て
使用するため、放射的活性標識２施したＤＮＡ鎖とした
。
ションあるいはターミナルトランスフェラーゼ法（ｃｆ
、”エンゾ・バイオーツローブ・システム：末端標識キ
ット（Ｔｈｅ ：Ｌｎｚｏ Ｂｉｏ−ＰｒｏｂｅＳｙｓ
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Ｋｉｔ ）”、 ｘ７ゾ・バイオケム社、ニューヨ
ーク州ニューヨーク１００１３ ）によってＤＮＡに導
入することにより、ハイブリッド形成を行なったＤＮＡ
は、ビオチンの検出のための免疫学的手法の使用あるい
は、ＤＮＡハイブリッド分子中に導入されたビオチンに
対するアビジン（酵素あるいは螢光標識に結合させたも
の）の高い親和性の利用により、検出可能であった。ハ
イブリッド形成アッセイの変法の中で、サンドインチハ
イブリッド形成は二つのプローブ全利用したものだと言
えるニブロープ＃１はＤＮＡ試料を捕らえるために膜に
固定させ、プローブ＃２け、シグナルプローグとし７て
使用するため、放射的活性標識２施したＤＮＡ鎖とした
。
試料が存在しない場合には、結合しなかった標識された
ＤＮＡが洗い流され、パックグランドのノイズ以外はシ
グナルが存在しない状態となった。
ＤＮＡが洗い流され、パックグランドのノイズ以外はシ
グナルが存在しない状態となった。
（ランキ（Ｍ 、 Ｒａｎｋｉ ）、Ｇｅｎｅ、Ｍｏ１
．２１ ＋ ｐＩ）、７７−８５（１９８３； １９８
４年１２月４日発行されたランキらの米山特許４１４８
６．５３９号）。
．２１ ＋ ｐＩ）、７７−８５（１９８３； １９８
４年１２月４日発行されたランキらの米山特許４１４８
６．５３９号）。
上記の従来のハイブリッド形成アッセイの全ては、反応
が遅く、扱いにくく、時間がかがシ、手続上および主観
的誤り’に犯しがちである。迅速で、信頼でき、非常に
感度の高い核酸ハイブリッド形成の技術が必要とされて
いる。
が遅く、扱いにくく、時間がかがシ、手続上および主観
的誤り’に犯しがちである。迅速で、信頼でき、非常に
感度の高い核酸ハイブリッド形成の技術が必要とされて
いる。
（発明の要約）
本発明によれば、液体試料中の、ＤＮＡおよびＲＮＡ’
ｉ含む核酸の検出および／または定量のための、核酸ハ
イブリッド形成アッセイの改良法が提供された。本発明
のアッセイでは、核酸全単鎖とすることが可能であり、
ハイブリッド形成？行うことができるならば、その由来
に関わりなく、あらゆる核酸が使用可能である。上記核
酸全単鎖にすることあるいはハイブリッド形成可能にす
ることは、一般的にアッセイされる液体試料を与えるだ
ろう。
ｉ含む核酸の検出および／または定量のための、核酸ハ
イブリッド形成アッセイの改良法が提供された。本発明
のアッセイでは、核酸全単鎖とすることが可能であり、
ハイブリッド形成？行うことができるならば、その由来
に関わりなく、あらゆる核酸が使用可能である。上記核
酸全単鎖にすることあるいはハイブリッド形成可能にす
ることは、一般的にアッセイされる液体試料を与えるだ
ろう。
本発明のハイブリッド形成アッセイは、原理的には、ウ
ィルス、細菌、菌類および酵母のような生物を含む、Ｄ
ＮＡあるいはＲＮＡの検出および／または定量に使用可
能である。本ハイブリッド形成アッセイは、例えば、医
療微生物学、獣医微生物学、食品衛生調査、および植物
病の微生物に↓る診断法などに使用できる。適した材料
は、動物あるいは植物の組織ホモジエネート、血液、排
泄粘液および鼻粘液および尿道粘液である。本ハイブリ
ッド形成アッセイは、臨床用試料中に存在するレベルの
微生物全検出するのに十分感度がよいと信じられている
。上記アッセイを行なう前に、試料中に存在する微生物
を培養することによってあらかじめ増やすことも可能で
ある。
ィルス、細菌、菌類および酵母のような生物を含む、Ｄ
ＮＡあるいはＲＮＡの検出および／または定量に使用可
能である。本ハイブリッド形成アッセイは、例えば、医
療微生物学、獣医微生物学、食品衛生調査、および植物
病の微生物に↓る診断法などに使用できる。適した材料
は、動物あるいは植物の組織ホモジエネート、血液、排
泄粘液および鼻粘液および尿道粘液である。本ハイブリ
ッド形成アッセイは、臨床用試料中に存在するレベルの
微生物全検出するのに十分感度がよいと信じられている
。上記アッセイを行なう前に、試料中に存在する微生物
を培養することによってあらかじめ増やすことも可能で
ある。
本ハイブリッド形成アッセイは、例えば、（１）ベータ
溶血性連鎖球菌（ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ５ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏ−ｃｃｉ ）、ヘモフィルス・インフル
エン、ザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌ、ｕｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ ）、肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ ）、マ
イコブラズ？ 、 、ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａ ｐｎｅｕｒｎｏｎ−ｉａｅ ）、およびマイコバ
クテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）のなどの細菌に
よる呼吸器感染；（２）インフルエンザＡ、 インフル
エンｆＢ、ノξラインフルエンザ（ｐａｒａｉｎｆｌｕ
ｓｎｚａ） （タイプＬ２および３）、呼吸性シンシチ
ウム ウィルス（ｒθ８ｐｉｒａｔＯｒ７ ＋３７ｎＣ
７−ｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、アデノウィルス（ａｄｅ
ｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、コロナウィルス（ｃｏｒｏｎａ
ｖｉｒｕθθθ）およびラインウィルス（ｒｈｉｎｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ ）のなどのウィルスによる呼吸器感染；
（３）サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ）、’
／ ’ｌ −ｙ 菌（ｓｈｉｇｅｌｌａｅ） 、エルシ
ニア・エンテロコリティ力（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、毒素原性大腸菌（ｓｎｔｅ
ｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ、 ｃｏｌｉ）、クロスト
リディウム・ディフィシ／ｌ／ （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｄｉｆｆｉ−ｃｉｌｅ）ｉよびキャンピロバクタ
ー（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）などの細菌による下
痢；（４） ロタウィルス（ｒｏｔａ−ｖｉｒｕｓｅ
ｓ ）、パルレボウィルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ
）、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ）
、およびエンテロウィルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅ
ｓ ）などのウィルスによる下痢；（５） ネイセリ
ア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ ）、トレポネマ令パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａｐａｌｌｉｄｕｍ） 、クラミゾイア・トリコモナ
ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒｉｃｈｏｍａｔｉｓ）な
どの細菌による性病；（６）単純ヘルＲスウイルスのよ
うなウィルスによる性病；（７）キャンデイダ・アルビ
カンス（Ｃａｎ−ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの
酵母による性病、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｌｓ）などの原生動物
による性病；（８） ベータ溶血性連鎖球菌（ｂｅｔ
ａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）
（グループＡ）、肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃ
ｉ ）、エンテロバクテリア（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ ）などの細菌による敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）
；および（９）サルモネラ菌（ｓａｌｍＯ−ｎｅｌｌａ
ｅ ） 、およびクロストリディウム・ベルフリンゲ／
ス（Ｃｌｏｓｔｒｌｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）
などの細菌の食品衛生、に存在する核酸を検出する
のに使用され得る。
溶血性連鎖球菌（ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ５ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏ−ｃｃｉ ）、ヘモフィルス・インフル
エン、ザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌ、ｕｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ ）、肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ ）、マ
イコブラズ？ 、 、ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａ ｐｎｅｕｒｎｏｎ−ｉａｅ ）、およびマイコバ
クテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）のなどの細菌に
よる呼吸器感染；（２）インフルエンザＡ、 インフル
エンｆＢ、ノξラインフルエンザ（ｐａｒａｉｎｆｌｕ
ｓｎｚａ） （タイプＬ２および３）、呼吸性シンシチ
ウム ウィルス（ｒθ８ｐｉｒａｔＯｒ７ ＋３７ｎＣ
７−ｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、アデノウィルス（ａｄｅ
ｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、コロナウィルス（ｃｏｒｏｎａ
ｖｉｒｕθθθ）およびラインウィルス（ｒｈｉｎｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ ）のなどのウィルスによる呼吸器感染；
（３）サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ）、’
／ ’ｌ −ｙ 菌（ｓｈｉｇｅｌｌａｅ） 、エルシ
ニア・エンテロコリティ力（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、毒素原性大腸菌（ｓｎｔｅ
ｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ、 ｃｏｌｉ）、クロスト
リディウム・ディフィシ／ｌ／ （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｄｉｆｆｉ−ｃｉｌｅ）ｉよびキャンピロバクタ
ー（ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）などの細菌による下
痢；（４） ロタウィルス（ｒｏｔａ−ｖｉｒｕｓｅ
ｓ ）、パルレボウィルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ
）、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ）
、およびエンテロウィルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅ
ｓ ）などのウィルスによる下痢；（５） ネイセリ
ア・ゴノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ ）、トレポネマ令パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａｐａｌｌｉｄｕｍ） 、クラミゾイア・トリコモナ
ス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒｉｃｈｏｍａｔｉｓ）な
どの細菌による性病；（６）単純ヘルＲスウイルスのよ
うなウィルスによる性病；（７）キャンデイダ・アルビ
カンス（Ｃａｎ−ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの
酵母による性病、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｌｓ）などの原生動物
による性病；（８） ベータ溶血性連鎖球菌（ｂｅｔ
ａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）
（グループＡ）、肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃ
ｉ ）、エンテロバクテリア（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ ）などの細菌による敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）
；および（９）サルモネラ菌（ｓａｌｍＯ−ｎｅｌｌａ
ｅ ） 、およびクロストリディウム・ベルフリンゲ／
ス（Ｃｌｏｓｔｒｌｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）
などの細菌の食品衛生、に存在する核酸を検出する
のに使用され得る。
本ハイブリッド合成アッセイに従えば、原核酸試料を単
鎖にし、ハイブリッド合成が可能な形とし、それによっ
てアッセイされる単鎖核酸試料を含む、測定可能な体積
の液体試料を調製する。少なくとも１５塩基のヌクレオ
チド配列２有する単鎖核酸筒〕フラグメント全、固体キ
ャリアと結合させる。固体キャリアは多数の直径約５０
ミクロン以下の非水溶性粒子２含む。少なくとも約１５
塩基のヌクレオチド配列？有する単鎖核酸第２フラグメ
ントは、発光標識あるいは後に発光標識が結合する発光
標識アクセプターと結合させる。後に述べるように、核
酸第１および第２フラグメントの相補的特異性は望まし
いアッセイ形態の選択によって決定される。核酸試料、
核酸第１フラグメントおよび核酸第２フラグメント？含
むハイブリッド′形成後、固体キャリアおよびそれに結
合している成分からなる固相？、液相から分離する。
鎖にし、ハイブリッド合成が可能な形とし、それによっ
てアッセイされる単鎖核酸試料を含む、測定可能な体積
の液体試料を調製する。少なくとも１５塩基のヌクレオ
チド配列２有する単鎖核酸筒〕フラグメント全、固体キ
ャリアと結合させる。固体キャリアは多数の直径約５０
ミクロン以下の非水溶性粒子２含む。少なくとも約１５
塩基のヌクレオチド配列？有する単鎖核酸第２フラグメ
ントは、発光標識あるいは後に発光標識が結合する発光
標識アクセプターと結合させる。後に述べるように、核
酸第１および第２フラグメントの相補的特異性は望まし
いアッセイ形態の選択によって決定される。核酸試料、
核酸第１フラグメントおよび核酸第２フラグメント？含
むハイブリッド′形成後、固体キャリアおよびそれに結
合している成分からなる固相？、液相から分離する。
ハイブリッド形成全同時にではなく、段階的に行なうの
であれば、固相？液相から段階的に分離することが望ま
しい。分離された固相の発光により、選択したアッセイ
形態に従って、液体試料中の核酸試料の検出および（あ
るいは）定量を行うことができるであろう。
であれば、固相？液相から段階的に分離することが望ま
しい。分離された固相の発光により、選択したアッセイ
形態に従って、液体試料中の核酸試料の検出および（あ
るいは）定量を行うことができるであろう。
本ハイブリッド形成アッセイは既存のアッセイ形態と比
較して、次の点において改良されている＝（１）固相が
、微小粒子に結合した核醒第１フラグメント全含んでい
る （２） 固相が実質的に懸濁された状態で、固相
と、核酸試料あるいは核酸第２フラグメントのいずれか
または両方２含む液相との間の少なくとも１回のハイブ
リッド形成反応が行なわれる。ハイブリッド形成が完了
した際に、固相が、マイクロスイルトレージョンによっ
て液体試料体積よりも実質的に小さい体積に濃縮される
点も、改良点である。濃縮の度合全適当に選択すること
によって、濃縮された固体キャリアに結合している実質
的に全ての発光標識の発光？測定することができる。
較して、次の点において改良されている＝（１）固相が
、微小粒子に結合した核醒第１フラグメント全含んでい
る （２） 固相が実質的に懸濁された状態で、固相
と、核酸試料あるいは核酸第２フラグメントのいずれか
または両方２含む液相との間の少なくとも１回のハイブ
リッド形成反応が行なわれる。ハイブリッド形成が完了
した際に、固相が、マイクロスイルトレージョンによっ
て液体試料体積よりも実質的に小さい体積に濃縮される
点も、改良点である。濃縮の度合全適当に選択すること
によって、濃縮された固体キャリアに結合している実質
的に全ての発光標識の発光？測定することができる。
（望ましい実施態様および応用実施態様）本ハイブリッ
ド形成アッセイは直径約５０ミクロン以下の多数の非水
溶性粒子を含む固体キャリアを利用する。例えば、上記
粒子として、ポリスチレン・ラテックスのようなポリマ
ー粒子を使用できる。上記粒子は約０．２ミクロンから
５０ミクロ／の範囲の、望ましい直径を有する。
ド形成アッセイは直径約５０ミクロン以下の多数の非水
溶性粒子を含む固体キャリアを利用する。例えば、上記
粒子として、ポリスチレン・ラテックスのようなポリマ
ー粒子を使用できる。上記粒子は約０．２ミクロンから
５０ミクロ／の範囲の、望ましい直径を有する。
上記粒子は、螢光標識、燐光標識、原子螢光標識、化学
発光標識、あるいは生物発光標識の励起によって生じる
発光に関して実質的に透過性である。また、上記粒子は
、螢光標識、燐光標識、あるいは原子螢光標識の場合に
、標識を励起させる光線に対しても実質的に透過性であ
る。発光標識は、断面の一辺が約ＩＴｒｒｒｎ乃至５ｗ
ｎの範囲にある励起光束を有する装置によって測定され
る光学的発光？有する。発光は、固体キャリアがマイク
ロフイルトレーシヨンによって断面の一辺が約１乃至５
間の範囲に濃縮された後に測定される。
発光標識、あるいは生物発光標識の励起によって生じる
発光に関して実質的に透過性である。また、上記粒子は
、螢光標識、燐光標識、あるいは原子螢光標識の場合に
、標識を励起させる光線に対しても実質的に透過性であ
る。発光標識は、断面の一辺が約ＩＴｒｒｒｎ乃至５ｗ
ｎの範囲にある励起光束を有する装置によって測定され
る光学的発光？有する。発光は、固体キャリアがマイク
ロフイルトレーシヨンによって断面の一辺が約１乃至５
間の範囲に濃縮された後に測定される。
核酸第２フラグメントは、ハイブリッド形成反応の一部
あるいは全てが完了した後に発光標識が結合する発光標
識アクセプターに結合させてもよい。例えば、上記核酸
第２フラグメントは、ビオチンと該第２フラグメントと
の反応によって発光標識アクセプターに結合してもよい
。発光標識は、アビジン−発光標識複合体と、第２フラ
グメントに結合した発光標識アクセプターとの反応によ
って第２フラグメントと結合することになる。
あるいは全てが完了した後に発光標識が結合する発光標
識アクセプターに結合させてもよい。例えば、上記核酸
第２フラグメントは、ビオチンと該第２フラグメントと
の反応によって発光標識アクセプターに結合してもよい
。発光標識は、アビジン−発光標識複合体と、第２フラ
グメントに結合した発光標識アクセプターとの反応によ
って第２フラグメントと結合することになる。
ハイブリッド形成アッセイの速度および感度は、固体キ
ャリアが実質的に懸濁された状態で、ハイブリッド形成
反応全行なうことにより増大する。
ャリアが実質的に懸濁された状態で、ハイブリッド形成
反応全行なうことにより増大する。
固体キャリアの広い表面積は、核酸第２フラグメントあ
るいはこれに代えて核酸試料あるいは核酸第１フラグメ
ントの注目に値する量を固体キャリアに結合させて反応
させることができる。固体キャリアを実質的に懸濁させ
ることにより、固体キャリアに結合するハイブリッド形
成反応成分は、ハイブリッド形成反応が起こる液体溶媒
中に均等に分布する。このことにより、ハイブリッド形
成反応の迅速性および完全性は増大する。
るいはこれに代えて核酸試料あるいは核酸第１フラグメ
ントの注目に値する量を固体キャリアに結合させて反応
させることができる。固体キャリアを実質的に懸濁させ
ることにより、固体キャリアに結合するハイブリッド形
成反応成分は、ハイブリッド形成反応が起こる液体溶媒
中に均等に分布する。このことにより、ハイブリッド形
成反応の迅速性および完全性は増大する。
固体キャリアは、マイクロフイルトレーシヨンによって
、液体試料の体積よりも実質的に小さい体積となるよう
に濃縮される。上記の操作により、二つの利点全書る。
、液体試料の体積よりも実質的に小さい体積となるよう
に濃縮される。上記の操作により、二つの利点全書る。
第１に、核酸試料、あるいはある種のアッセイ形態の場
合には、核酸試料と直接にあるいは逆の相互関係のある
発光標識あるいは発光標識アクセプターが、検出および
／または定量に先立ち濃縮され、それによって濃縮率と
実質的に等しい率でアッセイの感度が増大する。第２に
、例えば、螢光光度計のような発光測定装置で実質的に
全ての発光標識全測定できるような体積にまで固体キャ
リアの体積を濃縮でき、それによって、「濃縮された体
積中に含まれる発光標識量」対「固体キャリアを含む溶
液が濃縮されていない場合に光束によって励起されるで
あろう標識量」の比率と実質的に等しい割合で、アッセ
イの感度が増大する。
合には、核酸試料と直接にあるいは逆の相互関係のある
発光標識あるいは発光標識アクセプターが、検出および
／または定量に先立ち濃縮され、それによって濃縮率と
実質的に等しい率でアッセイの感度が増大する。第２に
、例えば、螢光光度計のような発光測定装置で実質的に
全ての発光標識全測定できるような体積にまで固体キャ
リアの体積を濃縮でき、それによって、「濃縮された体
積中に含まれる発光標識量」対「固体キャリアを含む溶
液が濃縮されていない場合に光束によって励起されるで
あろう標識量」の比率と実質的に等しい割合で、アッセ
イの感度が増大する。
典型的な固体キャリアは、例えば、核酸第１フラグメン
トが結合する０８μｍ粒子の懸濁液全体積にして０．３
パーセント含む。上記懸濁液２ＯｐＱ中に含まれる固体
キャリアは、４．４ ｃＡの表面積および０．０６μ旦
の体積を持つ。サンドイッチ法においては、液体試料１
００μ℃中に含まれる核酸試料は、核酸第１フラグメン
トとの反応およびマイクロフイルトレーシヨン後、例え
ば１６６７倍に濃縮される。固体キャリアの体積が小さ
いことにより、都合良く濾過を行ない１−５鼠の大きさ
（すなわち、直径）にすることができる。第１フラグメ
ントとのハイブリッド形成によって固体キャリアと結合
する核酸試料は、標識全施した核酸第２フラグメントと
反応する。上記の操作により、固相の実質的に全ての螢
光は、前面螢光光度計によって測定可能となる。上記の
ような濃縮を行なわなければ、標準的な螢光光度計では
懸濁された固体キャリアに結合している標識のわずか１
−２パーセントしか励起されないであろう。このように
濃縮によって、濃縮による１６６７倍の感度の増強と、
実質的に全ての発光標識を測定することによる約７０倍
の感度の増強が組合わされ、全体としてｌｏＱＯＯＯ倍
以上の感度の増強が得られる。
トが結合する０８μｍ粒子の懸濁液全体積にして０．３
パーセント含む。上記懸濁液２ＯｐＱ中に含まれる固体
キャリアは、４．４ ｃＡの表面積および０．０６μ旦
の体積を持つ。サンドイッチ法においては、液体試料１
００μ℃中に含まれる核酸試料は、核酸第１フラグメン
トとの反応およびマイクロフイルトレーシヨン後、例え
ば１６６７倍に濃縮される。固体キャリアの体積が小さ
いことにより、都合良く濾過を行ない１−５鼠の大きさ
（すなわち、直径）にすることができる。第１フラグメ
ントとのハイブリッド形成によって固体キャリアと結合
する核酸試料は、標識全施した核酸第２フラグメントと
反応する。上記の操作により、固相の実質的に全ての螢
光は、前面螢光光度計によって測定可能となる。上記の
ような濃縮を行なわなければ、標準的な螢光光度計では
懸濁された固体キャリアに結合している標識のわずか１
−２パーセントしか励起されないであろう。このように
濃縮によって、濃縮による１６６７倍の感度の増強と、
実質的に全ての発光標識を測定することによる約７０倍
の感度の増強が組合わされ、全体としてｌｏＱＯＯＯ倍
以上の感度の増強が得られる。
本ハイブリッド形成アッセイを実行する際には、多数の
選択し得るアッセイ形態が可能である。以下に上記可能
なアッセイ形態のうちの数種を略述する。
選択し得るアッセイ形態が可能である。以下に上記可能
なアッセイ形態のうちの数種を略述する。
サンドイッチアッセイ法において、測定可能な体積中に
含まれる核酸試料；少なくとも１５塩基のヌクレオチド
配列を有し、上記固体キャリアに結合した核酸第１フラ
グメント；および少なくとも１５塩基のヌクレオチド配
列を有し、上記発光標識あるいは上記発光標識アクセプ
ターと結合した核酸第２フラグメントの相補的塩基対形
成により、固体キャリア結合三成分ハイブリット”分子
全形成させる。第１フラグメントは、核酸試料とハイブ
リッド形成が可能であシ、第２フラグメントは核酸試料
とはハイブリッド形成が可能であるが、第１フラグメン
トとはハイブリッド形成が不可能である。標識あるいは
標識アクセプターの他に、核酸試料、核酸第１フラグメ
ントおよび核駿第２フラグメントを含むので、得られた
固体キャリアに結合しているハイブリッドサンドイッチ
ここでは”三成分”と称する。
含まれる核酸試料；少なくとも１５塩基のヌクレオチド
配列を有し、上記固体キャリアに結合した核酸第１フラ
グメント；および少なくとも１５塩基のヌクレオチド配
列を有し、上記発光標識あるいは上記発光標識アクセプ
ターと結合した核酸第２フラグメントの相補的塩基対形
成により、固体キャリア結合三成分ハイブリット”分子
全形成させる。第１フラグメントは、核酸試料とハイブ
リッド形成が可能であシ、第２フラグメントは核酸試料
とはハイブリッド形成が可能であるが、第１フラグメン
トとはハイブリッド形成が不可能である。標識あるいは
標識アクセプターの他に、核酸試料、核酸第１フラグメ
ントおよび核駿第２フラグメントを含むので、得られた
固体キャリアに結合しているハイブリッドサンドイッチ
ここでは”三成分”と称する。
発光標識あるいは発光標識アクセプターが結合している
固体キャリア結合性三成分ハイブリッド分子は、上記三
成分ハイブリッド分子に結合していない発光標識あるい
は標識アクセプターから分離する。核酸試料と核酸第１
フラグメントとの間の相補的塩基対形成は、直径約５０
ミクロン以下の多数の非水溶性粒子を含み第１フラグメ
ントが結合する固体キャリアが実質的に懸濁された状態
で、行なわれる。固体キャリア結合性三成分ハイブリッ
ド分子の発光は、固体キャリアがマイクロフイルトレー
シヨンによって液体試料の体積よりも実質的に小さい体
積に濃縮された後、測定される。
固体キャリア結合性三成分ハイブリッド分子は、上記三
成分ハイブリッド分子に結合していない発光標識あるい
は標識アクセプターから分離する。核酸試料と核酸第１
フラグメントとの間の相補的塩基対形成は、直径約５０
ミクロン以下の多数の非水溶性粒子を含み第１フラグメ
ントが結合する固体キャリアが実質的に懸濁された状態
で、行なわれる。固体キャリア結合性三成分ハイブリッ
ド分子の発光は、固体キャリアがマイクロフイルトレー
シヨンによって液体試料の体積よりも実質的に小さい体
積に濃縮された後、測定される。
サンドインチ法の一つの態様では、三成分ノーイブリッ
ド分子は、第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に愚濁された状態で、核酸試料、核酸第１フラグ
メントおよび核酸第２フラグメントの相補的塩基対形成
を同時に行なうことによって形成される。この態様によ
れば、第１フラグメントと核酸試料との間のハイブリッ
ド形成と、核酸試料と第２フラグメントとの間のハイブ
リッド形成が実質的に同時に起こるようにするため、第
１フラグメントと第２フラグメント全液体試料に加える
。三成分ハイブリッド分子の形成後、固体キャリアをマ
イクロフイルトレーシヨンによって濃縮する。
ド分子は、第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に愚濁された状態で、核酸試料、核酸第１フラグ
メントおよび核酸第２フラグメントの相補的塩基対形成
を同時に行なうことによって形成される。この態様によ
れば、第１フラグメントと核酸試料との間のハイブリッ
ド形成と、核酸試料と第２フラグメントとの間のハイブ
リッド形成が実質的に同時に起こるようにするため、第
１フラグメントと第２フラグメント全液体試料に加える
。三成分ハイブリッド分子の形成後、固体キャリアをマ
イクロフイルトレーシヨンによって濃縮する。
標識が既に三成分ハイブリッド分子に結合している場合
には、その発光全測定する。発光標識アクセプターが三
成分ハイブリッド分子に結合している場合には、固体キ
ャリアが濃縮された状態でアクセプターに発光標識を結
合させるか、あるいは、上記発光標識の添加のために固
体キャリアを再懸濁する。後者の場合、発光標識の測定
に先立チ、マイクロフイルトレーシヨンによって、固体
キャリアを再度濃縮する。
には、その発光全測定する。発光標識アクセプターが三
成分ハイブリッド分子に結合している場合には、固体キ
ャリアが濃縮された状態でアクセプターに発光標識を結
合させるか、あるいは、上記発光標識の添加のために固
体キャリアを再懸濁する。後者の場合、発光標識の測定
に先立チ、マイクロフイルトレーシヨンによって、固体
キャリアを再度濃縮する。
上記のものと異なるサンドインチ法の態様では、第１フ
ラグメントが結合する固体キャリアが実質的に懸濁され
た状態で、まず核酸第１フラグメントを核酸試料とハイ
ブリッド形成させることにより、三成分ハイブリッド分
子全形成させる。上記の第１のハイブリッド形成反応に
より、第１フラグメントと核酸試料を含む二成分ハイブ
リッド分子が形成される。次に、核酸第２フラグメント
と二成分ハイブリッド分子に含まれる核酸試料の相補的
塩基対形成によって三成分ハイブリッド分子全形成させ
る。
ラグメントが結合する固体キャリアが実質的に懸濁され
た状態で、まず核酸第１フラグメントを核酸試料とハイ
ブリッド形成させることにより、三成分ハイブリッド分
子全形成させる。上記の第１のハイブリッド形成反応に
より、第１フラグメントと核酸試料を含む二成分ハイブ
リッド分子が形成される。次に、核酸第２フラグメント
と二成分ハイブリッド分子に含まれる核酸試料の相補的
塩基対形成によって三成分ハイブリッド分子全形成させ
る。
二成分ハイブリッド分子全生成する第１のハイブリッド
形成反応後には、マイクロフイルトレーシヨンによって
、固体キャリアを濃縮してもしなくてもよい。第２のハ
イブリッド形成反応は、固体キャリアが濃縮された状態
か、あるいは固体キャリアが再懸濁された後のいずれか
に行なう。いずれの場合にも、前述のサンドイッチ法の
態様中に述べた方法に従って濃縮した状態で、発光標識
全測定する。
形成反応後には、マイクロフイルトレーシヨンによって
、固体キャリアを濃縮してもしなくてもよい。第２のハ
イブリッド形成反応は、固体キャリアが濃縮された状態
か、あるいは固体キャリアが再懸濁された後のいずれか
に行なう。いずれの場合にも、前述のサンドイッチ法の
態様中に述べた方法に従って濃縮した状態で、発光標識
全測定する。
さらに別のサンドイッチ法では、核酸試料は、固体キャ
リアに結合した核酸第１フラグメントの添加および反応
に先立ち、核酸第２フラグメントと反応させる。
リアに結合した核酸第１フラグメントの添加および反応
に先立ち、核酸第２フラグメントと反応させる。
以下に述べる飽和法、競合的置換法、競合的結合法、お
よび関連するアッセイ法においては、（１）測定可能な
体積の液体試料中に含まれる、アッセイされる核酸試料
、（２）少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列を持ち
、固体キャリアに結合した核酸第１フラグメントおよび
（３）少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列を有し、
発光標識あるいは発光標識アクセプターと結合した核酸
第２フラグメントの相補的塩基対形成によって二種類の
異なる固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子全形成
させる。第１フラグメントは核酸試料とハイブリッド形
成が可能である。核酸第２フラグメントす、第１フラグ
メントとはハイブリッド形成が可能であるが、核酸試料
とはハイブリッド形成できない。得られた固体キャリア
に結合した二種類のハイブリッド分子のうち、一方は第
１フラグメントと核酸試料を含み、もう一方は第１フラ
グメントと第２フラグメントを含むことから、これら全
゛二成分”と呼ぶ。
よび関連するアッセイ法においては、（１）測定可能な
体積の液体試料中に含まれる、アッセイされる核酸試料
、（２）少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列を持ち
、固体キャリアに結合した核酸第１フラグメントおよび
（３）少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列を有し、
発光標識あるいは発光標識アクセプターと結合した核酸
第２フラグメントの相補的塩基対形成によって二種類の
異なる固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子全形成
させる。第１フラグメントは核酸試料とハイブリッド形
成が可能である。核酸第２フラグメントす、第１フラグ
メントとはハイブリッド形成が可能であるが、核酸試料
とはハイブリッド形成できない。得られた固体キャリア
に結合した二種類のハイブリッド分子のうち、一方は第
１フラグメントと核酸試料を含み、もう一方は第１フラ
グメントと第２フラグメントを含むことから、これら全
゛二成分”と呼ぶ。
発光標識あるいは標識アクセプターが結合している二種
類の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子は、上記
二種類の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子に結
合していない発光標識あるいは標識アクセプターから分
離する。（１）核酸第１フラグメントと（２１（１）核
酸試料あるいは（１１）核酸第２フラグメントとの間の
相補的塩基対形成は、直径約５０ミクロン以下の多数の
非水溶性粒子よシなり第１フラグメントが結合した固体
キャリアが実質的に懸濁された状態で行われる。固体キ
ャリア結合二成分ハイブリッド分子の発光は、マイクロ
フイルトレーシヨンによう固体キャリア全液体試料の体
積よシ実質的に小さい体積に濃縮した後に測定する。
類の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子は、上記
二種類の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子に結
合していない発光標識あるいは標識アクセプターから分
離する。（１）核酸第１フラグメントと（２１（１）核
酸試料あるいは（１１）核酸第２フラグメントとの間の
相補的塩基対形成は、直径約５０ミクロン以下の多数の
非水溶性粒子よシなり第１フラグメントが結合した固体
キャリアが実質的に懸濁された状態で行われる。固体キ
ャリア結合二成分ハイブリッド分子の発光は、マイクロ
フイルトレーシヨンによう固体キャリア全液体試料の体
積よシ実質的に小さい体積に濃縮した後に測定する。
連続的飽和法の態様では、二種類の固体キャリア結合二
成分ハイブリッド分子は、まず、核酸第１フラグメント
が結合する固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、
核酸試料と過剰の核酸第１フラグメント？ハイブリッド
形成させ、次に、（１）核酸試料とハイブリッド形成し
ていない核酸第１フラグメントと（２）核酸第２フラグ
メントとのハイブリッド形成を行なうことによって形成
される。
成分ハイブリッド分子は、まず、核酸第１フラグメント
が結合する固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、
核酸試料と過剰の核酸第１フラグメント？ハイブリッド
形成させ、次に、（１）核酸試料とハイブリッド形成し
ていない核酸第１フラグメントと（２）核酸第２フラグ
メントとのハイブリッド形成を行なうことによって形成
される。
この態様によれば、固体キャリア上には過剰数の第１フ
ラグメント部位があるため、結果としては、核酸試料は
可能な第１フラグメント部位の一部でのみハイブリッド
形成全行ない得ることになる。
ラグメント部位があるため、結果としては、核酸試料は
可能な第１フラグメント部位の一部でのみハイブリッド
形成全行ない得ることになる。
第２のハイブリッド形成反応では、標識あるいは標識ア
クセプターが結合した核酸第２フラグメントは残りの部
位？満たす。このアッセイ法においては、固相中の標識
量は、液体試料中に存在する核酸試料の量と逆に相関す
る。
クセプターが結合した核酸第２フラグメントは残りの部
位？満たす。このアッセイ法においては、固相中の標識
量は、液体試料中に存在する核酸試料の量と逆に相関す
る。
競合的置換法の態様では、二種類の固体キャリア結合二
成分ハイブリッド分子は、まず、核酸第１フラグメント
が結合した固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、
核酸第１フラグメントと核酸第２フラグメントをハイブ
リッド形成させ、次に、核酸第１フラグメント全核酸試
料とハイブリッド形成させることにより、ハイプリント
形成している核酸第２フラグメントとの置換と行なうこ
とにより、形成される。本アッセイ法では、第２フラグ
メントは実質的に全ての可能な第１フラグメント部位と
ハイブリッド形成？行なう。適切な反応条件のもとでは
、ハイブリッド形成した第１フラグメントは、競合的ハ
イブリッド形成反応が平衡に到達するまで、核酸試料に
よって置換される。このアッセイ法の場合、同相の発光
は、液体試料中の核酸試料量と逆に相関する。
成分ハイブリッド分子は、まず、核酸第１フラグメント
が結合した固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、
核酸第１フラグメントと核酸第２フラグメントをハイブ
リッド形成させ、次に、核酸第１フラグメント全核酸試
料とハイブリッド形成させることにより、ハイプリント
形成している核酸第２フラグメントとの置換と行なうこ
とにより、形成される。本アッセイ法では、第２フラグ
メントは実質的に全ての可能な第１フラグメント部位と
ハイブリッド形成？行なう。適切な反応条件のもとでは
、ハイブリッド形成した第１フラグメントは、競合的ハ
イブリッド形成反応が平衡に到達するまで、核酸試料に
よって置換される。このアッセイ法の場合、同相の発光
は、液体試料中の核酸試料量と逆に相関する。
競合的結合法の態様では、二種類の固体キャリ子結合二
成分ハイブリッド分子は、第１フラグメントが結合した
固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、（１）核酸
試料および（２）核酸第２フラグメントが、核酸第１フ
ラグメントに対して競合的に、相補的塩基対を同時に形
成することにより生成される。
成分ハイブリッド分子は、第１フラグメントが結合した
固体キャリアが実質的に懸濁された状態で、（１）核酸
試料および（２）核酸第２フラグメントが、核酸第１フ
ラグメントに対して競合的に、相補的塩基対を同時に形
成することにより生成される。
競合的結合法の他の態様においては、二種類の固体キャ
リア結合二成分ハイブリット“分子は、まず、核酸第１
フラグメントが結合した固体キャリアが実質的に懸濁さ
れた状態で、核酸試料を核酸第１フラグメントとハイブ
リッド形成させ、次に核酸第２フラグメントと上記核酸
第１フラグメントのハイブリッド形成により、上記核酸
第１フラグメントに対して競合させることにより、形成
させる。上述の競合法のいずれも、核酸試料および核酸
第２フラグメントが、核酸第１フラグメントに対して競
合する。上記競合的ハイブリッド形成反応は、一般的に
平衡状態に達するが、但し、競合的結合アッセイ法の感
度は、初めに核酸試料全核酸第１フラグメントと反応さ
せた方が増大することがしばしばある。
リア結合二成分ハイブリット“分子は、まず、核酸第１
フラグメントが結合した固体キャリアが実質的に懸濁さ
れた状態で、核酸試料を核酸第１フラグメントとハイブ
リッド形成させ、次に核酸第２フラグメントと上記核酸
第１フラグメントのハイブリッド形成により、上記核酸
第１フラグメントに対して競合させることにより、形成
させる。上述の競合法のいずれも、核酸試料および核酸
第２フラグメントが、核酸第１フラグメントに対して競
合する。上記競合的ハイブリッド形成反応は、一般的に
平衡状態に達するが、但し、競合的結合アッセイ法の感
度は、初めに核酸試料全核酸第１フラグメントと反応さ
せた方が増大することがしばしばある。
さらに異なる競合的結合法では、一種類は固体キャリア
に結合しており、他方は結合していない、二種類の二成
分ハイブリッド分子は、（１）測定可能な体積の液体試
料中に含まれている、アッセイされる核酸試料、（２）
少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列２有し、固体キ
ャリアに結合した核酸第１フラグメント、および（３）
少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列全有し、発光標
識または二種類の二成分ハイブリッド分子の形成後に発
光標識全結合する標識アクセプターが結合した核酸第２
フラグメント、の相補的塩基対形成にょシ、生成される
。核酸第１フラグメントは核酸試料とはハイブリッド形
成２行なわないが、核酸第２フラグメントは核酸試料あ
るいは核酸第１フラグメントとハイブリッド形成が可能
である。
に結合しており、他方は結合していない、二種類の二成
分ハイブリッド分子は、（１）測定可能な体積の液体試
料中に含まれている、アッセイされる核酸試料、（２）
少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列２有し、固体キ
ャリアに結合した核酸第１フラグメント、および（３）
少なくとも１５塩基のヌクレオチド配列全有し、発光標
識または二種類の二成分ハイブリッド分子の形成後に発
光標識全結合する標識アクセプターが結合した核酸第２
フラグメント、の相補的塩基対形成にょシ、生成される
。核酸第１フラグメントは核酸試料とはハイブリッド形
成２行なわないが、核酸第２フラグメントは核酸試料あ
るいは核酸第１フラグメントとハイブリッド形成が可能
である。
結合二成分ハイブリッド分子は、非結合二成分ハイブリ
ッド分子から分離する。（１）核酸第１フラグメントと
（２）核酸第２フラグメントとの間の相補的塩基対形成
は、直径約５０ミクロン以下の多数の非水溶性粒子より
なシ核酸第１フラグメントヲ結合した固体キャリアが実
質的に懸濁された状態で、行なわれる。固体キャリア結
合二成分ハイブリッド分子に結合している発光標識の存
在は、固体キャリア全マイクロフイルトレーシヨンによ
って、液体試料の体積よりも実質的に小さい体積に濃縮
した状態で、測定する。
ッド分子から分離する。（１）核酸第１フラグメントと
（２）核酸第２フラグメントとの間の相補的塩基対形成
は、直径約５０ミクロン以下の多数の非水溶性粒子より
なシ核酸第１フラグメントヲ結合した固体キャリアが実
質的に懸濁された状態で、行なわれる。固体キャリア結
合二成分ハイブリッド分子に結合している発光標識の存
在は、固体キャリア全マイクロフイルトレーシヨンによ
って、液体試料の体積よりも実質的に小さい体積に濃縮
した状態で、測定する。
競合的結合法の第２の型の態様では、二種類の二成分ハ
イブリッド分子は、核酸第１フラグメントが結合した固
体キャリアが実質的に懸濁された状態で、（１）核酸試
料および（２）核酸第１フラグが、核酸第２フラグメン
トに関して競合して、相補的塩基対形成全同時に行なう
ことにょシ形成される。
イブリッド分子は、核酸第１フラグメントが結合した固
体キャリアが実質的に懸濁された状態で、（１）核酸試
料および（２）核酸第１フラグが、核酸第２フラグメン
トに関して競合して、相補的塩基対形成全同時に行なう
ことにょシ形成される。
上記の全てのアッセイ法は、核酸を検出することおよび
／または定量することに使用される。試料中の核酸の存
在は、選択したアッセイ法に応じてシグナルの有無によ
り示される。バックグランド・ノイズは、核酸試料が全
く存在しない標準溶液についてアッセイを行ない、シグ
ナルの有無全決定することで差し引くことが可能である
。試料中の核酸は、核酸試料の存在に起因するシグナル
を、前述の核酸試料あるいは試料と相互反応性２持つ核
酸を多様な量で含む、既知の標準試料に対するシグナル
量と関連させるという既存の手法によって定量できる。
／または定量することに使用される。試料中の核酸の存
在は、選択したアッセイ法に応じてシグナルの有無によ
り示される。バックグランド・ノイズは、核酸試料が全
く存在しない標準溶液についてアッセイを行ない、シグ
ナルの有無全決定することで差し引くことが可能である
。試料中の核酸は、核酸試料の存在に起因するシグナル
を、前述の核酸試料あるいは試料と相互反応性２持つ核
酸を多様な量で含む、既知の標準試料に対するシグナル
量と関連させるという既存の手法によって定量できる。
下記の例は、ウシ胸腺ＤＮＡの検出における本ハイブリ
ッドアッセイの応用性２示すものである。
ッドアッセイの応用性２示すものである。
下記の例は、サンドイッチブツセ４イ法にょる；しかし
、下記例は本ハイブリッドアッセイの使途の多さおよび
感度２示すためのみに用いられるのであシ、いかなる方
法においてもその使途を制限することを意図するもので
はない。
、下記例は本ハイブリッドアッセイの使途の多さおよび
感度２示すためのみに用いられるのであシ、いかなる方
法においてもその使途を制限することを意図するもので
はない。
（実施例工）
ウシ胸腺ＤＮＡＪ−１、ディル（Ｒ，Ｄａｌｅ）他著、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｖｏｌ、 １４（１１）＋ ｐｐ、
２４４７−２４５７（１９７５） に述べられた手法の
変形によって、水銀処理を施した。ウシ胸腺ＤＮＡ１７
Ｘ１０ Ｍ（１４６ｎｍｏｌｅｌｏＤ ユ＝ ット）
の濃度で、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ６，
０２’ｍｌに加え、溶解？促進するため、マグネテイン
クスターラ−で−晩撹拌した。上記溶液は、５０℃に加
熱し、その温度に達したとき１５倍過剰量の酢酸水銀を
加えた。６０分後に試料全取り出し、氷上に置いた。上
記溶液に、塩化リチウムを濃度が０．００９Ｍとなるよ
うに加えた。試料は、過剰の塩化水銀を除去するため、
等容の酢酸エチルで６回抽出した。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｖｏｌ、 １４（１１）＋ ｐｐ、
２４４７−２４５７（１９７５） に述べられた手法の
変形によって、水銀処理を施した。ウシ胸腺ＤＮＡ１７
Ｘ１０ Ｍ（１４６ｎｍｏｌｅｌｏＤ ユ＝ ット）
の濃度で、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ６，
０２’ｍｌに加え、溶解？促進するため、マグネテイン
クスターラ−で−晩撹拌した。上記溶液は、５０℃に加
熱し、その温度に達したとき１５倍過剰量の酢酸水銀を
加えた。６０分後に試料全取り出し、氷上に置いた。上
記溶液に、塩化リチウムを濃度が０．００９Ｍとなるよ
うに加えた。試料は、過剰の塩化水銀を除去するため、
等容の酢酸エチルで６回抽出した。
水銀化されたＤＮＡはエタノール沈殿させ、冷やした無
水エタノールで洗浄し、中濃度の塩？含む制限エンドヌ
クレアーゼバッファー（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
）リス１）Ｈ７，４、および１０ｍＭＭｇ５Ｏ４）に再
懸濁した。ＤＮＡは以下の制限酵素で消化した：１μ９
のＤＮＡあたシ１ユニット（ユニットは、イリノイ州ア
ーリントンハイツのアマージャム社（Ａｍｍｅｒｓｈａ
ｍ、工ｎｃ、）から市販品として入手可能な材料によっ
て決定された）のＢ＞Ｌ ＩＩ Ｔ Ｈｌ ｎｄ ＩＮ
、およびＨｌｎｄ Ｉ［ｆ ０．７％アガロースゲル上
で５００塩基対フラグメントが検出できるまで反応させ
た。ＤＮＡは上記のように消化し、ゲルに流し、溝中へ
電気的に溶出することにより抽出し、エタノール沈殿さ
せ、５ｏｏμｇ／ｍｌの濃度で０．１ Ｍ酢酸ナトリウ
ムバッファーｐＨ６，０に再懸濁した。このＤＮＡはス
ルフヒドリル粒子へ適用して核酸第１フラグメントとし
て使用するために調製したものである。
水エタノールで洗浄し、中濃度の塩？含む制限エンドヌ
クレアーゼバッファー（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
）リス１）Ｈ７，４、および１０ｍＭＭｇ５Ｏ４）に再
懸濁した。ＤＮＡは以下の制限酵素で消化した：１μ９
のＤＮＡあたシ１ユニット（ユニットは、イリノイ州ア
ーリントンハイツのアマージャム社（Ａｍｍｅｒｓｈａ
ｍ、工ｎｃ、）から市販品として入手可能な材料によっ
て決定された）のＢ＞Ｌ ＩＩ Ｔ Ｈｌ ｎｄ ＩＮ
、およびＨｌｎｄ Ｉ［ｆ ０．７％アガロースゲル上
で５００塩基対フラグメントが検出できるまで反応させ
た。ＤＮＡは上記のように消化し、ゲルに流し、溝中へ
電気的に溶出することにより抽出し、エタノール沈殿さ
せ、５ｏｏμｇ／ｍｌの濃度で０．１ Ｍ酢酸ナトリウ
ムバッファーｐＨ６，０に再懸濁した。このＤＮＡはス
ルフヒドリル粒子へ適用して核酸第１フラグメントとし
て使用するために調製したものである。
（実施例２）
５０％Ｗ／ Ｖ アミノ粒子（直径０．６３μ、カタ
ログ番号＃３０−（１３０−１ （イリノイ州ム／プ
ライン、パンデソクス・ラボラトリーズ社）の懸濁液５
ｍｅＫ、５ｍＪノ０．１ Ｍ ’） ７酸バツフ ７−
ｐＨ７，Ｑおよび０５罰のジメチルスルホキシド中に
１２，５ｍ９の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）
（カールソン（Ｊ 、Ｃａｒｌｓｏｎ）他著、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｊ、 。
ログ番号＃３０−（１３０−１ （イリノイ州ム／プ
ライン、パンデソクス・ラボラトリーズ社）の懸濁液５
ｍｅＫ、５ｍＪノ０．１ Ｍ ’） ７酸バツフ ７−
ｐＨ７，Ｑおよび０５罰のジメチルスルホキシド中に
１２，５ｍ９の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）
（カールソン（Ｊ 、Ｃａｒｌｓｏｎ）他著、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｊ、 。
Ｖｏｌ、１７３．ｐｐ、７２３−７３７（１９７８）に
よる）？含む溶液を加えた。混合液は室温で１時間撹拌
し、次に、６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行なっ
た。
よる）？含む溶液を加えた。混合液は室温で１時間撹拌
し、次に、６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行なっ
た。
粒子は等容のリン酸バッファーで洗浄し、上記と同様に
遠心分離を行なった。得られた２−ピリジルジスルフィ
ドで修飾された粒子を、５ｒｔｔｌの０．１Ｍ酢酸バッ
ファーｐａｓ、ｏに再懸濁した。上記溶液に、４０ｍｇ
のＬ４−ジチオスレイトールを加え、室温で３０分間撹
拌した。粒子は上記と同様に遠心分離を行なった。上清
をデカンテーションし、０．６μワットマ／Ｆ紙によっ
て濾過した。粒子のチオール基含量は、モル吸光係数８
．０８Ｘ１０ Ｍ−ｃｍ−”ｋ用い、遊離されたピリ
ジン−２−チオン濃度全上清の３４３ ｎｍにおける吸
光度を測定することにより、推測した（スタックベリー
（Ｔ 、 ５ｔｕ−ｃｈｂｕｒ７）他著、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、 Ｖｏｌ、 １５Ｌ ｐｐ−４１７〜（１９７５
））。上清の吸光度は、４．２０．Ｄ・ユニットであシ
、固体１ｇあたり１０．５Ｘ１０ モルのチオール基
に相当する。粒子は１度脱イオン水で洗浄し、上記と同
様に遠心分離を行ない、５１ｒＬｅの０、１ Ｍ ＩＪ
ン酸バッファーｐＨ７，５に再懸濁した。
遠心分離を行なった。得られた２−ピリジルジスルフィ
ドで修飾された粒子を、５ｒｔｔｌの０．１Ｍ酢酸バッ
ファーｐａｓ、ｏに再懸濁した。上記溶液に、４０ｍｇ
のＬ４−ジチオスレイトールを加え、室温で３０分間撹
拌した。粒子は上記と同様に遠心分離を行なった。上清
をデカンテーションし、０．６μワットマ／Ｆ紙によっ
て濾過した。粒子のチオール基含量は、モル吸光係数８
．０８Ｘ１０ Ｍ−ｃｍ−”ｋ用い、遊離されたピリ
ジン−２−チオン濃度全上清の３４３ ｎｍにおける吸
光度を測定することにより、推測した（スタックベリー
（Ｔ 、 ５ｔｕ−ｃｈｂｕｒ７）他著、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、 Ｖｏｌ、 １５Ｌ ｐｐ−４１７〜（１９７５
））。上清の吸光度は、４．２０．Ｄ・ユニットであシ
、固体１ｇあたり１０．５Ｘ１０ モルのチオール基
に相当する。粒子は１度脱イオン水で洗浄し、上記と同
様に遠心分離を行ない、５１ｒＬｅの０、１ Ｍ ＩＪ
ン酸バッファーｐＨ７，５に再懸濁した。
（実施例３）
１ ｙｔｌの０．５％ｗ／ ｖ スルフヒドリル粒子
を６０００ ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清はデ
カンテーションし、粒子は氷上で保存した。水銀化され
た二本鎖ウシ胸腺ＤＮＡ’ｉ、変性させるため、１００
℃で５分間加熱し、急速に氷上で冷却した。
を６０００ ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清はデ
カンテーションし、粒子は氷上で保存した。水銀化され
た二本鎖ウシ胸腺ＤＮＡ’ｉ、変性させるため、１００
℃で５分間加熱し、急速に氷上で冷却した。
１０分後、得られた単鎖ＤＮＡ溶液を粒子に加え一晩冷
所に置いた、翌日、粒子全遠心分離し、上清をデカンテ
ーションし、結合していない過剰のＤＮＡＩ除去するた
めに０．１ Ｍ ＮａＣ４で洗浄した。
所に置いた、翌日、粒子全遠心分離し、上清をデカンテ
ーションし、結合していない過剰のＤＮＡＩ除去するた
めに０．１ Ｍ ＮａＣ４で洗浄した。
得られた粒子は、核酸第１フラグメントが結合してお沙
、０．１ Ｍリン酸バッファーｐＨ７，０で０．２５％
ｗ／ｖ になるように再懸濁した。
、０．１ Ｍリン酸バッファーｐＨ７，０で０．２５％
ｗ／ｖ になるように再懸濁した。
（実施例４）
ウシ胸腺°ＤＮＡ２、アガロースゲル上で、約３００塩
基対のバンドが得られるように、上記のように消化した
。１５マイクログラム全ゲルから取り、ＤＮＡとビオチ
ン−１１−ｄＵＴＰとのテーリング反応に使用した。上
記ＤＮＡのテーリングは、既知の手法〔二ンゾ・パイオ
ープローブ・システム−末端ラベルキット（Ｔｈｅ Ｅ
ｎｚｏ Ｂｉｏ−ＰｒｏｂｅＳｙｓｔｅｍ−Ｔｅｒｍｉ
ｎａｌ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）、１００１３ニユー
ヨーク州ニユーヨーク、エンゾ・バイオケム社〕によっ
て行なった。ＤＮＡ＝ｉ、アガロースゲル電気泳動によ
って３００塩基対の大きさのフラグメントが認められる
ように、１μ９ ＤＮＡあたシ１ユニット（決定された
ユニットおよび使用した製品は、イリノイ州アーリント
ンノ・イブのアマージャム社による）のＰｓｔＩ’に用
いて消化した。末端テーリング反応は、テーリングが行
なわれた全ヌクレオチドが７．５ ｎｍｏｌｅとなるよ
うに、９０分間行なった。ビオチン化されたａＵＴＰは
、１マイクログラムのＤＮＡあたり、３．７５ ｎｍｏ
ｌｅ含まれると推定される。
基対のバンドが得られるように、上記のように消化した
。１５マイクログラム全ゲルから取り、ＤＮＡとビオチ
ン−１１−ｄＵＴＰとのテーリング反応に使用した。上
記ＤＮＡのテーリングは、既知の手法〔二ンゾ・パイオ
ープローブ・システム−末端ラベルキット（Ｔｈｅ Ｅ
ｎｚｏ Ｂｉｏ−ＰｒｏｂｅＳｙｓｔｅｍ−Ｔｅｒｍｉ
ｎａｌ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）、１００１３ニユー
ヨーク州ニユーヨーク、エンゾ・バイオケム社〕によっ
て行なった。ＤＮＡ＝ｉ、アガロースゲル電気泳動によ
って３００塩基対の大きさのフラグメントが認められる
ように、１μ９ ＤＮＡあたシ１ユニット（決定された
ユニットおよび使用した製品は、イリノイ州アーリント
ンノ・イブのアマージャム社による）のＰｓｔＩ’に用
いて消化した。末端テーリング反応は、テーリングが行
なわれた全ヌクレオチドが７．５ ｎｍｏｌｅとなるよ
うに、９０分間行なった。ビオチン化されたａＵＴＰは
、１マイクログラムのＤＮＡあたり、３．７５ ｎｍｏ
ｌｅ含まれると推定される。
（実施例５）
ストレプトアビジン−Ｂ−フイコエリトリン（Ｓｔｒｅ
ｐｔａｖｉａｉｎ−Ｂ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ
、 Ｓ Ａ■−Ｂ ＰＥ ）ゲ、既知の手法（”フィコ
ビリプロティンの構成についてのノー） （Ｎｏｔｅｓ
ｏｎ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇＰｈｙｃｏｂｉｌｉ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）、 ９４４０４カリフオルニア州
フオスターシテイ、アプライド・ノξイオシステム社；
”生物学的分子へのフィコビリプロティンの結合（Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｔ。
ｐｔａｖｉａｉｎ−Ｂ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ
、 Ｓ Ａ■−Ｂ ＰＥ ）ゲ、既知の手法（”フィコ
ビリプロティンの構成についてのノー） （Ｎｏｔｅｓ
ｏｎ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇＰｈｙｃｏｂｉｌｉ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）、 ９４４０４カリフオルニア州
フオスターシテイ、アプライド・ノξイオシステム社；
”生物学的分子へのフィコビリプロティンの結合（Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｔ。
ＢｉｏｌｏｇｉｃａＩＭｏｌｅｃｕｌｅ日）”、オレゴ
ン州９７４４８゜ジャンクションシティ、モレキュラー
・ブローブス社）によって合成した。１６μ℃の３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミド１エステル（５ＰＤＰ、無水メタノール中に
新らたに混合されたもの１．３ ｍｑ／ｙｎｌ ）’ｔ
］−、４５ｍｇのＳＡＶに加え、室温で４０分間イン
キュベートした。３７５μＱのジチオスレイトール（カ
ップリングバッファー、０．１ Ｍリン酸ナトリウム、
０．１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７４中ｆ１Ｍ）’ｔ５ｍｇ
の５ＰＤＰで修飾したＢＰＥに加え、室温でインキュ（
−トシた。上記二種類の混合液は、ともに、カップリン
グバッファーを２回交換して、（それぞれ４リツトル）
、暗所で４℃にて透析を行なった。
ン州９７４４８゜ジャンクションシティ、モレキュラー
・ブローブス社）によって合成した。１６μ℃の３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミド１エステル（５ＰＤＰ、無水メタノール中に
新らたに混合されたもの１．３ ｍｑ／ｙｎｌ ）’ｔ
］−、４５ｍｇのＳＡＶに加え、室温で４０分間イン
キュベートした。３７５μＱのジチオスレイトール（カ
ップリングバッファー、０．１ Ｍリン酸ナトリウム、
０．１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７４中ｆ１Ｍ）’ｔ５ｍｇ
の５ＰＤＰで修飾したＢＰＥに加え、室温でインキュ（
−トシた。上記二種類の混合液は、ともに、カップリン
グバッファーを２回交換して、（それぞれ４リツトル）
、暗所で４℃にて透析を行なった。
透析後２５）の溶液？混合し、暗所で１６時間４℃に保
った。メタノール中の１ｘ】、ＯＭＮ−エチルマレイミ
ド１３３μρ？反応混合液に加え、室温に３０分間保っ
た。得られた混合液は低リン酸バッファー（０，ＯＯ］
、Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
７，０）ｆｆｉ２回勿交換して、透析？行なった（それ
ぞれ４リツトル）。５ＡＶ−合液を吸着させ、５罰の低
リン酸バッファーで洗い、１ｎｔｌずつのフラクション
とした。段階的溶出法により溶出バッファーを加えた（
全て０．１ ＭＮａＣＪｌ、ｐＨ７，（ｌ基本として、
それぞれ０．０（１３Ｍ、０．００５Ｍ、０．００８Ｍ
、−０，０１Ｍ、０．（１３Ｍ。
った。メタノール中の１ｘ】、ＯＭＮ−エチルマレイミ
ド１３３μρ？反応混合液に加え、室温に３０分間保っ
た。得られた混合液は低リン酸バッファー（０，ＯＯ］
、Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
７，０）ｆｆｉ２回勿交換して、透析？行なった（それ
ぞれ４リツトル）。５ＡＶ−合液を吸着させ、５罰の低
リン酸バッファーで洗い、１ｎｔｌずつのフラクション
とした。段階的溶出法により溶出バッファーを加えた（
全て０．１ ＭＮａＣＪｌ、ｐＨ７，（ｌ基本として、
それぞれ０．０（１３Ｍ、０．００５Ｍ、０．００８Ｍ
、−０，０１Ｍ、０．（１３Ｍ。
０．０５ Ｍ、 ０．１ Ｍ、 ０．４ Ｍ リ
ン駿全含む）。バッファーは、モル数が増加する順に流
し、溶出液が透明になったら交換した。求めるフラクシ
ョンは、０、０５ Ｍリン酸バッファー溶出液後に現れ
た。
ン駿全含む）。バッファーは、モル数が増加する順に流
し、溶出液が透明になったら交換した。求めるフラクシ
ョンは、０、０５ Ｍリン酸バッファー溶出液後に現れ
た。
（実施例６）
核酸第１フラグメントが結合した粒子（”第１フラグメ
ント粒子”）は、遠心分離し、ブレ・・イブリツド形成
バッファー〔５０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド１，５×デ
ンハｌレト溶液（１００Ｘ＝２％ＢＳＡベンテックス・
フラクションＶ （ｗ／ｖ） 、２％フィコール４００
（Ｗ／Ｖ）および２％ポリビニルピロリド：／（ｗ／
ｖ））、５ｘＳＳＰＥ（１ｘ＝０．１８ＭＮａＣ４、０
，０１Ｍリン酸ナトリウＡｐＨ７，７および１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）および１００ ｉｔ ９／ｍｌの変性したサケ
精子ＤＮＡ１前もって４２℃にしたもの〕で、第１フラ
グメント粒子が０．２５％（Ｗ／Ｖ）となるように再懸
濁した。４２℃で２時間インキュベートした。第１フラ
グメント粒子？遠心分離し、４２℃溶出バッファー（９
９％（ｖ／Ｖ）ホルムアミドおよび１０ｍＭ トリスｐ
ａ ７．ｓ）で１時間再懸濁した。第１フラグメント粒
子？遠心分離し、・次に、ハイブリッド形成バッファー
（５０％ホルムアミドｖ／ｖ、 ０．３ Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０（１３Ｍクエン酸ナトリウム、Ｏ，０００
２５Ｍ トリスｐ Ｈ７，４，０，０００２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡおよび１００μｇ／罰の変性させたサケ精子ＤＮ
Ａ１４２℃にあらかじめ温めたもの）で０．２５％（Ｖ
／Ｖ）となるように再懸濁させ、０、５ ｍｌの微量遠
心試験管に１００μρづつ分注した。
ント粒子”）は、遠心分離し、ブレ・・イブリツド形成
バッファー〔５０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド１，５×デ
ンハｌレト溶液（１００Ｘ＝２％ＢＳＡベンテックス・
フラクションＶ （ｗ／ｖ） 、２％フィコール４００
（Ｗ／Ｖ）および２％ポリビニルピロリド：／（ｗ／
ｖ））、５ｘＳＳＰＥ（１ｘ＝０．１８ＭＮａＣ４、０
，０１Ｍリン酸ナトリウＡｐＨ７，７および１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）および１００ ｉｔ ９／ｍｌの変性したサケ
精子ＤＮＡ１前もって４２℃にしたもの〕で、第１フラ
グメント粒子が０．２５％（Ｗ／Ｖ）となるように再懸
濁した。４２℃で２時間インキュベートした。第１フラ
グメント粒子？遠心分離し、４２℃溶出バッファー（９
９％（ｖ／Ｖ）ホルムアミドおよび１０ｍＭ トリスｐ
ａ ７．ｓ）で１時間再懸濁した。第１フラグメント粒
子？遠心分離し、・次に、ハイブリッド形成バッファー
（５０％ホルムアミドｖ／ｖ、 ０．３ Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０（１３Ｍクエン酸ナトリウム、Ｏ，０００
２５Ｍ トリスｐ Ｈ７，４，０，０００２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡおよび１００μｇ／罰の変性させたサケ精子ＤＮ
Ａ１４２℃にあらかじめ温めたもの）で０．２５％（Ｖ
／Ｖ）となるように再懸濁させ、０、５ ｍｌの微量遠
心試験管に１００μρづつ分注した。
１５０μ氾トリスバツフアー（ｐＨ７，５） あたり
１０μ９のウシ胸腺ＤＮＡおよび１５μ９の標識したＤ
ＮＡ第２フラグメントの混合液？１００℃で熱変性させ
た。上記溶液１５μυ？、ノ・イブリット−形成バッフ
ァー中の０．２５％第１フラグメント粒子１００μρ金
含む０５罰試験管に加えた。
１０μ９のウシ胸腺ＤＮＡおよび１５μ９の標識したＤ
ＮＡ第２フラグメントの混合液？１００℃で熱変性させ
た。上記溶液１５μυ？、ノ・イブリット−形成バッフ
ァー中の０．２５％第１フラグメント粒子１００μρ金
含む０５罰試験管に加えた。
再アニーリ／グ？行なわせるために、４２℃で１０時間
のインキュベート’に行なった。ハイブリッド形成後、
粒子’ｔ５０１７／Ｖ ホルムアミドおよび０．２ＸＳ
ＥＴ（２０ｘＳＥＴ＝３ＭＮａＣｉ、０．４ Ｍトリス
ｐＨ７，８およびＱ、 ０２ Ｍ ＥＤＴＡ）を用いて
３７℃で６回洗浄した、得られたサンドインチ三成分に
覆われた粒子は、最終的に１００μΩの０、１ Ｍ Ｉ
Ｊン酸バッファーｐＨ７，０に再懸濁し、１ウシ胸腺Ｄ
ＮＡハイブリッド形成混合液”？形成させた。
のインキュベート’に行なった。ハイブリッド形成後、
粒子’ｔ５０１７／Ｖ ホルムアミドおよび０．２ＸＳ
ＥＴ（２０ｘＳＥＴ＝３ＭＮａＣｉ、０．４ Ｍトリス
ｐＨ７，８およびＱ、 ０２ Ｍ ＥＤＴＡ）を用いて
３７℃で６回洗浄した、得られたサンドインチ三成分に
覆われた粒子は、最終的に１００μΩの０、１ Ｍ Ｉ
Ｊン酸バッファーｐＨ７，０に再懸濁し、１ウシ胸腺Ｄ
ＮＡハイブリッド形成混合液”？形成させた。
ネガティブ・コントロールとして、さらに２種類のハイ
ブリッド形成混合液全使用した。まず、１５０μρ ト
リスバッファーｐＨ７，５中に１０μ９の胎盤ＤＮＡと
１５μ９の標識した第２フラグメント？含む混合液？上
記と同様に１００℃で変性させた。第２に、１５０μρ
トリスバッファーｐＨ７，５中に１５μ９の標識した
ＤＮＡ第２フラグメントのみ？含むもの？、上記同様１
００℃で熱変性させた。上記コントロール混合液１５μ
℃全それぞれバッファー中に１００μすの０．２５％第
１フラグメント粒子？含む微量遠心試験管に加え、上記
同様にインキュイージョン、洗浄および再懸濁させるこ
とにより、”胎盤ＤＮＡコントロールハイブリッド形成
混合液”および”非核酸試料含有コントロールハイブリ
ッド形成混合液”をそれぞれ形成させた。
ブリッド形成混合液全使用した。まず、１５０μρ ト
リスバッファーｐＨ７，５中に１０μ９の胎盤ＤＮＡと
１５μ９の標識した第２フラグメント？含む混合液？上
記と同様に１００℃で変性させた。第２に、１５０μρ
トリスバッファーｐＨ７，５中に１５μ９の標識した
ＤＮＡ第２フラグメントのみ？含むもの？、上記同様１
００℃で熱変性させた。上記コントロール混合液１５μ
℃全それぞれバッファー中に１００μすの０．２５％第
１フラグメント粒子？含む微量遠心試験管に加え、上記
同様にインキュイージョン、洗浄および再懸濁させるこ
とにより、”胎盤ＤＮＡコントロールハイブリッド形成
混合液”および”非核酸試料含有コントロールハイブリ
ッド形成混合液”をそれぞれ形成させた。
（実施例７）
２５μΩのウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合液？自
動化９６ウエルアツセイプレート前面フルオロメーター
（スクリーン・マシン９６．イリノイ州ムンデライン、
バンデツクス・ラボラトリーズ社から入手可能）の３個
のウェルにそれぞれ加えた。同様のことを２５μＵの胎
盤ＤＮＡコントロールハイブリッド形成混合液および非
核酸試料含有コントロールハイブリッド形成混合液につ
いてそれぞれ繰りかえした。５０μρのウシ胸腺ＤＮＡ
ハイブリッド形成混合液についても繰シかえした。スト
レプトアビジ：／−Ｂ−フイコエリトリン（ＳＡＹ−Ｂ
ＰＥ）は、ｌ ｍｅあたシ２．５μ９の濃度で、１％正
常ヤギ血清および１％胎児ウシ血清から成る希釈液で希
釈した。以下の方法は、ハイブリッド形成混合液を含む
それぞれのウェルごとに行なった：２０μ℃の希釈した
５ＡＴ−ＢＰＥ ＝ｉ加え、１５分インキュベートし、
２分間分離し、６０μρの等張液（１θｏｔｏｎ）で洗
浄し、２分分離し、６０μρの等張液で洗浄し、２分間
分離し、励起波長５４５ ｎ ｍ、螢光波長５７７ｎｍ
、螢光全決定する倍率は５倍に設定して測定した。
動化９６ウエルアツセイプレート前面フルオロメーター
（スクリーン・マシン９６．イリノイ州ムンデライン、
バンデツクス・ラボラトリーズ社から入手可能）の３個
のウェルにそれぞれ加えた。同様のことを２５μＵの胎
盤ＤＮＡコントロールハイブリッド形成混合液および非
核酸試料含有コントロールハイブリッド形成混合液につ
いてそれぞれ繰りかえした。５０μρのウシ胸腺ＤＮＡ
ハイブリッド形成混合液についても繰シかえした。スト
レプトアビジ：／−Ｂ−フイコエリトリン（ＳＡＹ−Ｂ
ＰＥ）は、ｌ ｍｅあたシ２．５μ９の濃度で、１％正
常ヤギ血清および１％胎児ウシ血清から成る希釈液で希
釈した。以下の方法は、ハイブリッド形成混合液を含む
それぞれのウェルごとに行なった：２０μ℃の希釈した
５ＡＴ−ＢＰＥ ＝ｉ加え、１５分インキュベートし、
２分間分離し、６０μρの等張液（１θｏｔｏｎ）で洗
浄し、２分分離し、６０μρの等張液で洗浄し、２分間
分離し、励起波長５４５ ｎ ｍ、螢光波長５７７ｎｍ
、螢光全決定する倍率は５倍に設定して測定した。
（表 １）
１ １．４１４ １，５９４ ６，５７６
１２，４０２２ １７５２ １．７９２ ６．
５５２ １４，０１（１３ １．７７２ １，
９２４ ６．２９４ １へ３５４平均 Ｌ６４６
１，７４０ ６，４７４ １３，９２２＊ 暫定
的螢光ユニット （実施例８） 前述のように精製した、１０μ９のウシ胸腺ＤＮＡ５０
０塩基対フラグメント？、ターミナルトランスフェラー
ゼバッファー（０，２２Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ７
，４）、 ｏ、 ＯＩ Ｍ ＭｇＣｆ１２、Ｑ、５ｍＭ
Ｈｇ−ｃｉＵＴＰ、０．ＯＩＭメルカプトエタノール僚
てのストックはＱ、Ｑ５ＭＴｒｉｓ−０４（ｐＨ７，４
）中で作製した）に加えた）。上記混合液に、２８４ユ
ニツトのターミナルトランスフェラーゼを加えた。３７
℃で３０分間インキュベート？行なった。得られたＨｇ
−ａＵＴＰで末端が標識されたＤＮＡＩ、前述のように
粒子に結合させた。
１２，４０２２ １７５２ １．７９２ ６．
５５２ １４，０１（１３ １．７７２ １，
９２４ ６．２９４ １へ３５４平均 Ｌ６４６
１，７４０ ６，４７４ １３，９２２＊ 暫定
的螢光ユニット （実施例８） 前述のように精製した、１０μ９のウシ胸腺ＤＮＡ５０
０塩基対フラグメント？、ターミナルトランスフェラー
ゼバッファー（０，２２Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ７
，４）、 ｏ、 ＯＩ Ｍ ＭｇＣｆ１２、Ｑ、５ｍＭ
Ｈｇ−ｃｉＵＴＰ、０．ＯＩＭメルカプトエタノール僚
てのストックはＱ、Ｑ５ＭＴｒｉｓ−０４（ｐＨ７，４
）中で作製した）に加えた）。上記混合液に、２８４ユ
ニツトのターミナルトランスフェラーゼを加えた。３７
℃で３０分間インキュベート？行なった。得られたＨｇ
−ａＵＴＰで末端が標識されたＤＮＡＩ、前述のように
粒子に結合させた。
（実施９１Ｊ９）
（＋［施例６のインキュベーションの継続時間を１０時
間から２時間に短縮したこと、およびＣ２＋５０μ℃の
ウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合液？、実施例６で
調製したものの半分のウシ胸腺ＤＮＡ＝ｉ用いて調製し
た（すなわち、５μ９のウシ胸腺ＤＮＡおよび１５μ９
の標識したＤＮＡ第２フラグメント？１５０μΩのトリ
スバッファーに加え、熱変性させた）こと、および第２
のウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合物２５μρと入
れ換えたことを除き、前述のように行なったサンドイッ
チアッセイ法を繰り返した。
間から２時間に短縮したこと、およびＣ２＋５０μ℃の
ウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合液？、実施例６で
調製したものの半分のウシ胸腺ＤＮＡ＝ｉ用いて調製し
た（すなわち、５μ９のウシ胸腺ＤＮＡおよび１５μ９
の標識したＤＮＡ第２フラグメント？１５０μΩのトリ
スバッファーに加え、熱変性させた）こと、および第２
のウシ胸腺ＤＮＡハイブリッド形成混合物２５μρと入
れ換えたことを除き、前述のように行なったサンドイッ
チアッセイ法を繰り返した。
（表 ２）
１ １．０５２ ９７２ ９，９３２ ４３
５２２ Ｌ５４２ ９５０ ａ９７８
４，７９８３ １．３５０ ＬＯ９２’Ｊ４８
８ ４．４５０平均 １，３１５ ＬＯＯ５９
，４６６夷５３３（外５名）
５２２ Ｌ５４２ ９５０ ａ９７８
４，７９８３ １．３５０ ＬＯ９２’Ｊ４８
８ ４．４５０平均 １，３１５ ＬＯＯ５９
，４６６夷５３３（外５名）
Claims (40)
- （１）１）測定可能である体積の液体試料中に含まれる
、アッセイされる単鎖核酸試料；２）少なくとも１５塩
基のヌクレオチド配列を持ち、固体キャリアに結合し、
上記核酸試料とハイブリッド形成が可能である、核酸の
単鎖第１フラグメント；および、３）少なくとも１５塩
基のヌクレオチド配列を持ち、発光標識あるいは三成分
ハイブリッド分子を形成させた後に発光標識が結合でき
る発光標識アクセプターが結合し、さらに、上記核酸試
料とはハイブリッド形成が可能であるが、上記核酸の第
１フラグメントとはハイブリッド形成を行なわない、核
酸の単鎖第２フラグメント；の三成分の相補的塩基対形
成により、固体キャリア結合三成分ハイブリッド分子を
形成させ；そして（イ）発光標識あるいは発光標識アク
セプターが結合している、固体キャリア結合三成分ハイ
ブリッド分子を、（ロ）上記固体キャリア結合三成分ハ
イブリッド分子に結合していない発光標識あるいは発光
標識アクセプターから分離すること；からなる核酸ハイ
ブリッド形成アッセイ法において、核酸の第１のフラグ
メントが結合した、直径約５０ミクロン以下の多数の非
水溶性粒子よりなる固体キャリアが実質的に懸濁された
状態である際に、核酸試料と核酸の第１フラグメントと
の間で相補的塩基対形成を行なわせること；および三成
分ハイブリッド分子が結合した固体キャリアがマイクロ
フイルトレーシヨンにより液体試料の体積よりも実質的
に小さい体積に濃縮された状態である際に、上記三成分
ハイブリッド分子に結合している発光標識の発光を測定
すること；を特徴とする方法。 - （２）発光標識が、螢光標識あるいは燐光標識あるいは
原子螢光標識あるいは化学発光標識あるいは生物発光標
識のいずれかである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）発光標識アクセプターがビオチンと核酸第２フラ
グメントとの反応によつて形成され、発光標識がアビジ
ン−発光標識複合体である、特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - （４）まず、核酸第１フラグメントが結合した固体キャ
リアが実質的に懸濁された状態で、核酸第１フラグメン
トを核酸試料とハイブリッド形成させて二成分ハイブリ
ッド分子を形成させ； 次に、核酸第２フラグメントを、上記二成分ハイブリッ
ド分子に含まれる核酸試料と相補的塩基対を形成させる
こと；により三成分ハイブリッド分子が形成される、特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）三成分ハイブリッド分子が、核酸第１フラグメン
トが結合した固体キャリアが実質的に懸濁された状態で
、核酸試料、核酸第１フラグメント、および核酸第２フ
ラグメントが同時に相補的塩基対形成を行なうことによ
り形成される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （６）不溶性粒子がポリマー粒子である、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （７）ポリマー粒子がラテックス粒子である特許請求の
範囲第６項記載の方法。 - （８）非水溶性粒子の直径が、約０．２ミクロンから約
５０ミクロンの範囲にある、特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - （９）発光標識が、断面の１辺が約１ｍｍ乃至５ｍｍの
範囲内にある励起光束を有する装置によつて測定可能な
光学的発光を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法
。 - （１０）非水溶性粒子が標識の励起光および、それによ
つて生じる発光に対して、実質的に透明である、特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （１１）非水溶性粒子が、発光標識の化学的あるいは生
物学的励起によつて生じる発光に対して、実質的に透明
である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１２）ミクロフイルトレーシヨンによつて濃縮された
固体キャリアが、断面の一辺が約１乃至５ｍｍの範囲に
ある状態で、発光を測定する、特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - （１３）核酸試料が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ、核酸第
１フラグメントがＤＮＡあるいはＲＮＡの単鎖フラグメ
ント、および核酸第２フラグメントがＤＮＡあるいはＲ
ＮＡの単鎖フラグメントである、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （１４）１）測定可能な体積の液体試料中に含まれる、
アッセイされる単鎖核酸試料；２）少なくとも１５塩基
のヌクレオチド配列を有し、固体キャリアに結合してお
り、上記核酸試料とハイブリッド形成可能である、単鎖
核酸第１フラグメント；および３）少なくとも１５塩基
のヌクレオチド配列を持ち、発光標識あるいは二種の固
体キャリア結合二成分ハイブリッド分子を形成させた後
に発光標識が結合できる発光標識アクセプターが結合し
、また、上記核酸第１フラグメントとハイブリッド形成
可能であるが、上記核酸試料とはハイブリッド形成でき
ない、単鎖核酸第２フラグメント；の三成分の相補的塩
基対形成により、二種の固体キャリア結合二成分ハイブ
リッド分子を形成させる；そして （イ）発光標識あるいは発光標識アクセプターが結合し
ている二種の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子
を、（ロ）上記二種の固体キャリア結合二成分ハイブリ
ッド分子に結合していない発光標識あるいは発光標識ア
クセプターから分離すること；からなる核酸ハイブリッ
ド形成アッセイ法において、 核酸の第１フラグメントが結合した、直径約５０ミクロ
ン以下の多数の非水溶性粒子を含む固体キャリアが実質
的に懸濁された状態で、（ａ）核酸の第１フラグメント
と（ｂ）核酸試料あるいは核酸の第２フラグメントとの
間で、相補的塩基対形成を行なわせること；および 二成分ハイブリッド分子の結合している固体キャリアが
マイクロフイルトレーシヨンにより、液体試料よりも実
質的に小さい体積に濃縮された状態で、上記二成分ハイ
ブリッド分子に結合している発光標識の発光を測定する
こと；を特徴とする方法。 - （１５）二種の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分
子が、 まず、核酸第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に懸濁された状態で、核酸試料を過剰の核酸第１
フラグメントとハイブリッド形成させ； 次に、１）核酸試料とハイブリッド形成していない、核
酸第１フラグメントと、２）核酸第２フラグメントをハ
イブリッド形成させること；により形成される、特許請
求の範囲第１４項記載の方法。 - （１６）二種の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分
子が、 まず、核酸第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に懸濁された状態で、核酸第１フラグメントを核
酸第２フラグメントとハイブリッド形成させ； 次に、核酸第１フラグメントと核酸試料とのハイブリッ
ド形成によつて、上記ハイブリッド形成を行なつた核酸
第２フラグメントを置換すること；により形成される、
特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１７）二種の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分
子が、核酸第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に懸濁された状態で、１）核酸試料と、２）核酸
第２フラグメントとを同時に核酸第１フラグメントと競
合させて相補的塩基対を作らせることにより、形成され
る、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１８）二種の固体キャリア結合二成分ハイブリッド分
子が、 まず、核酸第１フラグメントが結合した固体キャリアが
実質的に懸濁された状態で、核酸試料と核酸第１フラグ
メントとをハイブリッド形成させ；次に、核酸第２フラ
グメントを上記核酸第１フラグメントとハイブリッド形
成させることにより、上記核酸第１フラグメントに対し
て競合させること； により、形成される、特許請求の範囲第１４項記載の方
法。 - （１９）発光標識が、螢光標識あるいは燐光標識あるい
は原子螢光標識あるいは化学発光標識あるいは生物発光
標識のいずれかである、特許請求の範囲第１４項記載の
方法。 - （２０）発光標識アクセプターが、ビオチンと核酸第２
フラグメントとの反応によつて形成され、発光標識がア
ビジン−発光標識複合体である、特許請求の範囲第１４
項記載の方法。 - （２１）不溶性粒子がポリマー粒子である、特許請求の
範囲第１６項記載の方法。 - （２２）ポリマー粒子がラテックス粒子である、特許請
求の範囲第１４項記載の方法。 - （２３）非水溶性粒子が約０．２ミクロンから約５０ミ
クロンの範囲の直径を有する、特許請求の範囲第１４項
記載の方法。 - （２４）発光標識が、断面の一辺が約１ｍｍ乃至５ｍｍ
の範囲にある励起光束を有する装置によつて測定される
光学的発光を有する、特許請求の範囲第１４項記載の方
法。 - （２５）非水溶性粒子が標識を励起する光束およびそれ
によつて生じる発光に対して実質的に透明である、特許
請求の範囲第１４項記載の方法。 - （２６）非水溶性粒子が、発光標識の化学的あるいは生
物学的励起によつて生じる発光に対して実質的に透明で
ある、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （２７）マイクロフイルトレーシヨンによつて濃縮され
た固体キャリアの断面の一辺が約１ｍｍ乃至５ｍｍの範
囲である状態で発光標識が測定される、特許請求の範囲
第１４項記載の方法。 - （２８）核酸試料が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡであり、
核酸第１フラグメントがＤＮＡあるいはＲＮＡの単鎖フ
ラグメントであり、核酸第２フラグメントがＤＮＡある
いはＲＮＡの単鎖フラグメントである、特許請求の範囲
第１４項記載の方法。 - （２９）１）測定可能な体積の液体試料中に含まれる、
アッセイされる単鎖核酸試料；２）少なくとも１５塩基
のヌクレオチド配列を持ち、固体キャリアに結合し、ま
た、上記核酸試料とはハイブリッドを形成し得ない、単
鎖核酸第１フラグメント；および３）少なくとも１５塩
基対のヌクレオチド配列を持ち、発光標識あるいは二種
の二成分ハイブリッド分子を形成させた後に発光標識が
結合できる発光標識アクセプターが結合した、上記核酸
試料あるいは上記核酸第１フラグメントとハイブリッド
形成可能な単鎖核酸第２フラグメント；の相補的塩基対
形成によつて、一種は固体キャリアに結合し、もう一種
は固体キャリアに結合しない、二種の二成分ハイブリッ
ド分子を形成させ；そして 固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子を固体キャリ
ア非結合二成分ハイブリッド分子から分離すること；よ
りなる核酸ハイブリッド形成アッセイ法において、 核酸第１フラグメントが結合した直径約５０ミクロン以
下の多数の非水溶性粒子よりなる固体キャリアが実質的
に懸濁された状態で、（イ）核酸第１フラグメントと、
（ロ）核酸第２フラグメントとの間で相補的塩基対形成
を行なわせること；および二成分ハイブリッド分子が結
合する固体キャリアがマイクロフイルトレーシヨンによ
つて実質的に液体試料の体積よりも小さい体積に濃縮さ
れた状態で、固体キャリア結合二成分ハイブリッド分子
に結合している発光標識の発光を測定すること；を特徴
とする方法。 - （３０）二種の二成分ハイブリッド分子が、核酸第１フ
ラグメントが結合した固体キャリアが実質的に懸濁され
た状態で、１）核酸試料と、２）核酸第１フラグメント
とが、核酸第２フラグメントに対して競合して同時に相
補的塩基対形成を行なうことによつて形成される、特許
請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３１）発光標識が螢光標識、燐光標識、原子螢光標識
、化学発光標識あるいは生物発光標識のいずれかである
、特許請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３２）発光標識アクセプターが、ビオチンと核酸第２
フラグメントとの反応によつて形成され、発光標識がア
ビジン−発光標識複合体である、特許請求の範囲第３１
項記載の方法。 - （３３）不溶性粒子がポリマー粒子である、特許請求の
範囲第２９項記載の方法。 - （３４）ポリマー粒子がラテックス粒子である、特許請
求の範囲第３３項記載の方法。 - （３５）非水溶性粒子が約０．２ミクロンから約５０ミ
クロンの範囲の直径を有する、特許請求の範囲第２９項
記載の方法。 - （３６）発光標識が、断面の一辺が約１ｍｍ乃至５ｍｍ
の範囲の励起光束を持つ装置によつて測定される光学的
発光を有する、特許請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３７）非水溶性粒子が、標識を励起させる光およびそ
れによつて放射される発光に対して実質的に透明である
、特許請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３８）非水溶性粒子が、発光標識の化学的あるいは生
物学的励起によつて生じる発光に対して、実質的に透明
である、特許請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３９）マイクロフイルトレーシヨンによつて濃縮され
た固体キャリアが、断面の一辺が約１ｍｍ乃至５ｍｍの
範囲にある状態で発光が測定される、特許請求の範囲第
２９項記載の方法。 - （４０）核酸試料が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡであり、
核酸第１フラグメントがＤＮＡあるいはＲＮＡの単鎖フ
ラグメントであり、核酸第２フラグメントがＤＮＡある
いはＲＮＡの単鎖フラグメントである、特許請求の範囲
第２９項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72900185A | 1985-04-30 | 1985-04-30 | |
| US729001 | 1985-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61264240A true JPS61264240A (ja) | 1986-11-22 |
Family
ID=24929163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10077786A Pending JPS61264240A (ja) | 1985-04-30 | 1986-04-30 | 発光標識を用いた固相核酸ハイブリツド合成アツセイ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0200113A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61264240A (ja) |
Families Citing this family (16)
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|---|---|---|---|---|
| US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| FI80476C (fi) * | 1987-10-09 | 1990-06-11 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
| US5104791A (en) * | 1988-02-09 | 1992-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle counting nucleic acid hybridization assays |
| EP0436547B1 (en) * | 1988-05-10 | 1994-11-30 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for rapid nucleic acid detection |
| CA2011818A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-09-17 | Fred T. Oakes | Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid |
| EP0557456A4 (en) * | 1990-11-14 | 1995-11-15 | Siska Diagnostics Inc | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
| GB9127415D0 (en) * | 1991-12-24 | 1992-02-19 | Swordfish Int Ltd | Solid support bound detection and diagnostic system |
| WO1993020234A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A rapid, high capacity nucleic acid based assay |
| GB9322723D0 (en) * | 1993-11-04 | 1993-12-22 | Tepnel Medical Ltd | Determining nucleic acids |
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| US5981180A (en) * | 1995-10-11 | 1999-11-09 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods |
| US6015664A (en) * | 1995-11-03 | 2000-01-18 | Mcw Research Foundation | Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B |
| US6449562B1 (en) | 1996-10-10 | 2002-09-10 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method |
| US6309824B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-30 | Hyseq, Inc. | Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| US8148171B2 (en) | 2001-10-09 | 2012-04-03 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3853987A (en) * | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| CA1180647A (en) * | 1981-07-17 | 1985-01-08 | Cavit Akin | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| EP0124124A3 (en) * | 1983-05-02 | 1987-08-26 | Enzo Biochem, Inc. | Method and materials useful for the analysis and detection of genetic material |
-
1986
- 1986-04-18 EP EP86105375A patent/EP0200113A3/en not_active Withdrawn
- 1986-04-30 JP JP10077786A patent/JPS61264240A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0200113A3 (en) | 1987-03-18 |
| EP0200113A2 (en) | 1986-11-05 |
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