JPS62158299A - Ｄｎａ／ｒｎａアツセイのためのアラビノ核酸プロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アラビノ核酸並びＫ　ＤＮＡまたばＲＮＡハ
イブリッド形成アッセイにおけるこの新規ポリヌクレオ
チドプローブの使用、特に全ての構成ヌクレオチド中に
結合部位を有するプローブに関する。これによシブロー
ブの各ヌクレオチドに対して検出部分を結合することか
でき、従ってそれが検出感度の改良にもつながる。

ＤＮＡ及びＲＮＡアッセイにおいて使用されるハイブリ
ッド形成プローブは、プローブが分析下の試料中の［標
的Ｊ　ＤＮＡまたはＲＮＡの相補的な鎖とハイブリッド
形成した後に二重鎖の検出を容易にするために、様々の
方法で標識される。

最も一般的には、プローブは、プローブの３′または５
′−末端上に放射能標識されたヌクレオチドを酵素で組
み込むことによって標識することができるＣ　Ａ　、　
Ｍ　、　Ｍａｘａｍらによる［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ
：Ｌ。

Ｖｏ１ｕｍｅＪ殖、４９９〜５６０（１９８０）］。代
替的に、高レベルの放射能標識されたヌクレオチドはニ
ックトランスレーションによシ取シ込むことができるＩ
：Ｐ、Ｗ−、Ｔ、Ｒｌｇｂｙらによる「Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉ
ｏｌ　Ｊ　ｉ１３゜２３７〜２５１（１９７７）］。後
者の方法は、プローブ中の構成ヌクレオチド尚り１の放
射性リンを組み入れることができるという固有の利点を
有しておシ、このようなプローブを使用するアッセイは
、ハイブリッド形成アッセイにおける最も高感度の検出
限度によって特徴づけられている。これらのプローブの
目立った欠点は、放射性同位元素の使用にともなう危険
性と不都合があげられる。

第２の型の標識は、プローブと１のヌクレオチドの中に
組み込まれたビオチニル化されたくリミジン塩基（ウラ
シルまたはアデノシン）を含むヌクレオチドの混合物と
を酵素を用いて合成することを含む〔例えばＰ、Ｒ，Ｌ
ａｎｇｅｒらＫよる「Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　Ｊ米国７８．６６３３〜６６３７（１９８１
）］。代替的にビオチニル化されたヒストンＨ１タンパ
ク質は、ＤＮＡ中の塩基と化学的に架橋結合されて標識
されたプローブを形成することができる［Ｍ、Ｒｅｎｇ
による「ｗｙｓｏ　：ｒ、　Ｊ　２（６）ｔ８１７〜８
２２（１９８３）蒐標的ＤＮＡの相補的な鎖に対してプ
ローブをハイブリッド形成した後、このハイブリッドを
プローブ中のビオチン部分に対して強固に結合している
アビジンに結合しているリポータ−分子によって処理す
る。該リポータ−は、アビジンに結合している透明な重
合性ミクロスフェア（０，Ｏ，Ｒｌｃｈａｒｄｓらによ
る［Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｈ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、　Ｊ米国
７６（２）、６７６〜６８０（１９７９）上またはアビ
ジン−フェリチン［：Ａ、５ｏｄｊａらによる「Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｊ５（２）、３８５〜４０
１　、　（１９７８））のいずれかであシ得る。これら
各々は、電子顕微鏡によシ可視化することができる。ま
たは、リポータ−は酵素の基質によシ処理された場合に
、可視的に検出可能な着色物質を生成するアビジン−酵
素複合体でありうる［Ｊ、、Ｔ、Ｌｅａｒｙらによる［
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｊ米国８０
．４０４５〜４０４９（１９８３）］。このようなプロ
ーブに基づくアッセイは、放射性物質の使用は避けるこ
とができるが、与えられたプローブ分子中わずか約２％
のヌクレオチドのみが、試料ＤＮＡの相補的鎮に対する
プローブの特異性を減することなくビオチン部分によシ
誘導されうる。この特異性の減少は、ビオチン部分の存
在によって相補的塩基が適切に組み合わされる能力が変
化してしまうことに起因する。放射性プローブに対する
これらのプローブ中への標識の組み込みの妹少は、検出
感度を低いものとする。

第３の型の標識は、ハイブリッド形成後に７１イブリツ
ド中の酵素が基質により処理されて着色物質を生じさせ
るようになっているプローブに直接結合している酵素で
ある。この酵素は、プローブ中の塩基［：Ｍ、Ｒｅｎｇ
らによる［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、Ｊ　１２（８
）、３４３５〜３４４４（１９８４）］、またはプロー
ブの末端に化学的に結合されているある長さのオリゴヌ
クレオチドに相補的なりＮＡの他の鎖中の塩基［、Ｔ、
Ｇ、Ｗｏｏｄｈｅａｄらによる［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ
ｏｃ　、　。

Ｔｒａｎｓ、　Ｊ　１２（２）、２７５’〜２８０（１
９８４））Ｋ直接結合することができる。後者の場合に
おいて、プローブは相補的な標的ＤＮＡに対してノ・イ
ブリッド形成され、このノ・イブリッドは酵素標品を含
むオリゴヌクレオチドによシ処理される。標識されたオ
リゴヌクレオチドのこの鎖は、プローブの末端に化学的
に結合している相補ＤＮＡの一重鎖末端と結合する。酵
素リポータ−の可視化は、酵素の基質を着色物質へ転化
することによって達成される。

この操作に関連する主な欠点は、酵素結合が低レベルで
あシ、ノ・イブリッド形成の操作手順において典型的に
使用される厳密な条件（例えば高められた温度、非水性
溶媒）下におかれた場合に、＃素活性が失なわれること
に起因する。

これらの標識方法のうち後者のものに関連する第２の欠
点は、酵素標識を含壱するオリゴヌクレオチドの合成鎮
が試料中に元来存在するヌクレオチドの配列に対して相
補的になり得る可能性にある。このように、ハイブリッ
ド形成プローブの末端に結合された塩基配列を損なう上
に、酵素標識されたオリゴヌクレオチドは、相補的塩基
の自然の配列に対して非特異的に結合して、それが負の
対照即ちブランクとして使用する試料中の背景的問題Ａ
Ｋつながる。

第４の型の標識は、発螢光団をプローブの成分ヌクレオ
チド中の塩基［Ｃ，Ｈ，Ｙａｎｇらによる「Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｊ　１３．３６１５〜３６２０（１９７４）
λプローブの３′−末端［Ｒ，Ｗ、　Ｒｌｃｈａｒｄｓ
ｏｎらによる「Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　１１（８）、６１６７〜６１
８４（１９８３）上または５′−末端（０，Ｈ，Ｙａｎ
ｇらＫよる［Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｊ　１５５．７０〜８１　（１９７
３）］のいずれかに結合させることを含む。上記のよう
に、これらの方法の感度は、プローブの各複製中に組み
込まれうる少数の標識によって限定される。第５０型の
標識は、プローブまたは標識−プローブ２本鎖中のある
抗原決定基に対応する抗体の使用を含むものである。こ
の前者の場合において、抗原決定基（例えばビオチン、
臭素、Ｎ−アセトキシ−２−アセチルアミノフルオレン
）はプローブのヌクレオチド中の塩基と共役結合する〔
例えはり、Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓらによる「Ｊ、Ｃｅ１
ｌ　ＢｉｏｌＪ９５ｅ６１７〜６２５（１９８２）ｌ、
これらの抗原決定基は特異的ハイブリッド形成を妨害し
、プローブの有用性を制限することがある。後者の場合
において、二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド自体は、
ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖より免疫学的
に区別することができる［Ｇ、Ｔ、ＲｕｄｋｉｎらＫよ
る「Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ２６５　＋４７２〜４７３（１９
７７）工このブローブー標的二重鎖中の抗原決定基は、
抗体−発蛍光団抱合体及び螢光顕微鏡によシ検出された
。標識されたプローブは、酵素（Ｌ、Ｍａｎｕｅｌｌｉ
ｓらＫよる前述の文■またはコロイド状金［Ｎ、Ｊ、Ｈ
ｕｔｃｈｉｎｓｏｎらＫよる「Ｊ、ｃ！ｅ１１．　Ｂｉ
ｏｌＪ　９５，６０９〜６１８（１９８２）］が抱合さ
れている抗体によっても検出することができる。

また、最終的な感度は、ノ・イブリッド形成の結果を検
出するのに有用な標識の数によって限定される。

本発明は、ノ・イブリッド形成効率または特異性に殆ん
ど影響を与えないで、ヌクレオチド１個当り１個の割合
で、最大数の非放射性標識を各プローブ中に組み込むこ
とによって、従来技術の限界を打ちゃぶったものである
。

本発明は、新規な核酸、アラビノ核酸に関する。

核酸の配列を同定するための本発明の方法は、ａ）標的
核酸を一重鎖にし、 ｂ）この一重鎖にされた核酸を支持体上に固定し、 Ｃ）この一重鎖にされた核酸を一重鎖にされたアラビノ
核酸プローブとハイブリッド形成させ、 ｄ）支持体を洗浄してこの支持体上く形成されたハイブ
リッド中に組み込まれていないアラビノ核酸を除去し、
次いで ｅ）このハイブリッドを抗アラビノース抗体−標詭抱合
体と接触させその標識を検出することによって、支持体
上に形成されたハイブリッド中のアラビノ核酸の存在を
決定する段階からなる。

本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡアッセイのための新規ハイ
ブリッド形成プローブの合成及び使用にも関する。この
新規プローブ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）は、ＲＮＡ及び
ＤＮＡ各々中で見出される従来のリボースまたはチオキ
シリボース糖に取って替れるアラビノース糖を有する。

この特別の糖は、アラビノース糖及びその糖を含有する
プローブを選択的に＠出するために使用され得る抗アラ
ビノース抗体−標識に対して結合部位を与える。この糖
アラビノースは、この合成プローブにのみ見られ、天然
のＤＮＡまたはＲＮＡには見出されないため、検出抗体
は、プローブ中のアラビノース部分に対してのみ結合す
る。

プローブは化学的方法または酵素を用いる方法のいずれ
かＫよって合成することができる。

化学的合成は、リポースまたはデオキシリボースではな
くアラビノースを含有するヌクレオシド中の７ラビノー
ス糖の２′、３′、及び５′位の炭素原子上に保護基を
導入することを含む。このようなヌクレオシドは商業的
に入手可能である。保護基の結合の化学的性質及び方法
は、リボヌクレオクド及びデオキシヌクレオシド［：Ｇ
、Ｈ，Ｈａｋｉ−ｍｅｌｉａｈらによる「Ｏａｎ、、Ｔ
、Ｏｈｅｍ、　Ｊ　６０．１１０６〜１１１３（１９８
２））　Ｋ対して明らかになっておシ、それをアラビノ
ヌクレオシド中の和尚する位置の保護についても採用す
ることができるＣ　Ｋ　、Ｋ　、０ｇ１ｌｖｉｅらＫよ
るｌ’−０ａｎ、Ｊ、Ｏｈｅｍ、　Ｊ　６１．１２０４
〜１２１２（１９８３）ｌ。

一度アラビノヌクレオシドの保護が達成されると、アラ
ビノ核酸プローブの化学的合成は、ＤＮＡ及ヒＲＮＡプ
ローブについて使用される方法において進行させること
が可能であって、その中で、適当なヌクレオチドは、連
続的に連結して、分析下試料中の標的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
鎖を形成する（Ｍ、　Ｈ，ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる
１−Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｋｎｇｉ−ｎθｅｒｉｎｇＪ　４
．１〜１７（１９８２））。

分析用の核酸には、多くの入手源がある。これらは、中
でも臨床試験片；細菌、ビールスクラミジア、リケッチ
ア、マイコプラズマのような様々の微生物；原生動物；
及び植物を包含する。抽出は、ハイブリッド形成アッセ
イのために供給源から核酸を採集するための１つの慣用
方法である。本発明のＡＮＡプローブを使用するための
操作手順は、従来のハイブリッド形成操作におけるもの
と酷似している。標的ＤＮＡまたはＲＮＡはまず一重鎖
にされ次いで支持体上に固定化される。この固定化され
た一重鎖核酸をその後、標的中の塩基配列に対して相補
的なアラビノ核酸プローブによシ処理する。アラビノ核
酸プローブと相補的塩基配列とをノ・イブリッド形成さ
せる。ハイブリッド形成されなかった余分のＡＮＡプロ
ーブを除去すべく洗浄した後、プローブ−標識ハイブリ
ッドを抗アラビノース抗体−標識抱合体によシ処理する
。

抗体自体は、アラビノース中のＣ２キラル部位またはア
ラビノースもしくはＡＮＡ構造中の他の抗原決定基に関
連する０２部位に対して形成される。（：０ｋａｂａｙ
ａｓｈｉらＫよる［０ａｎｃｅｒ　ＲｅａｅａｒｃｈＪ
３７，６１９〜６２４（１９７７）］抗体−抱合体は従
来の方法により調製することができる。標識は、酵素・
螢光、化学ルミネセンスまたは高分子であり得り、好ま
しいのは酵素である。

抗体−標識抱合体はアラビノース糖に特異的に結合する
が、天然のＲＮＡまたはＤＮＡ中に存在するリボースま
たはチオキシリボースには結合しない。系よシ過剰の未
結合抗体−酵素抱合体を除去するための洗浄のような処
理の後に、これを酵素の支持体−よシ処理して、試料中
の標的核酸の存在を示す着色物質のような検出可能な信
号を生成させる。酵素以外の標識ももちろん適幽に検出
することができる。

代替的には、酵素または他のｓ識に抱合し得るレクチン
のような他の結合剤の使用も考えることができる。この
ような抱合体のためのアッセイ方法も上記の方法と類似
のものである。

アラビノ核酸プローブはいくつかの独特の利点を有して
いる。１のアラビノース結合部位はハイブリッド形成プ
ローブの各ヌクレオチド中に組み込まれることができる
ので、各ヌクレオチドは、放射性同位元素により通常得
られるレベルにおいて標識するためにそれに結合されて
いる抗アラビノース抗体標識を有することかできる。同
時に、放射性物質の危険も避けられる。

加えて、これらの充分に標識されたプローブは、放射標
識されたプローブが放射標識の高エネルギー崩壊物質に
よる溶解のために受けるような減成を、受けることはな
い。さらに、ＡＮＡの検出性は、プローブの糖骨格中の
０２炭素原子に関する転化されたキラリティに基づくも
のであシ、またＣ２炭素原子に関する化学結合は、プロ
ーブまたはプローブ標的ハイブリッドのらせん構造内ま
たはらせん構造間の構造の決定に必要であるので、プロ
ーブの特異性及びプローブ標識のハイブリッドの安定性
は著しく影響を受けるとは考えられない。塩基の相補的
配列に対するプローブの特異性を敦えることなく達成さ
れるＡＮＡプローブの高度の標識によって、本発明のプ
ローブは従来技術の化学的に誘導されたプローブよシも
優れたものとされる。最後に、プローブ中のアラビノー
スは抗体−酵素抱合体を使用して特異的忙検出されるこ
とができる。

酵素標識の使用の利点は、基質から生成物への大量の転
換による高度のシグナル拡大による。

このように、アラビノース検出のための抗体−酵素抱合
体は、放射能標識されたプローブの高度なプローブ標識
特性の利点のみならず、酵素による非放射分析アッセイ
のシグナル拡大の利点も有するものである。

実施例　１ Ａ、プローブ合成のための保護されたアラビノ核酸の化
学的合成 ヌクレオチドの化学的重合化によるプローブ合成は、塩
基ダアニン、シトシン、アデニン及びウラシルまたはチ
ばンを含む少くとも４つの保護されかつ活性化されたア
ラビノ核酸の入手が要求される。個々のこれら保護され
た核酸は、商業的に入手可能な相当するヌクレオチドか
ら調製することができる。

ヌクレオシドに対する保護及び活性化基の附加に関して
は、保護されかつ活性化されたヌクレオシドアラビノウ
ラシル（ａｒａＵ）の調製について説明する。他のアラ
ビノ核酸は同一の方法によシ保護されかつ活性化された
。加えてシトシン及びアデニンを含むヌクレオシドは塩
基自体上でベンゾイル基の形態をなす保護基を要求し、
一方グアニンはインブチリル保診基を要求シタ。

第１に１ジメトキシトリチル（ＤＭＴ　）基をアラビノ
ースの５′−炭素上の水酸基に導入した。これは、−５
℃において３０−のピリジンに溶解した６、５ミリモル
のβ−Ｄ−アラビノウラシルに対して、８等分された７
、　７５　ミＩＪモルのジメトキシトリチルクロライド
（ＤＭＴＣＡ）を１時間の間隔をおいて加えた。最後の
添加から１時間後に、反応混合物を氷水中釦注加し過剰
のジメトキシトリチルクロライドを消失させ、約２５℃
において回転蒸発器上でガム状にした。この生成物、５
’　−ＤＭＴ　ａｒａＵをクロロホルム／メタノールの
９５７５混合物を溶離液とするＭｅｒｃｋ　Ｋｉｅｓｅ
１ｇｅ１６０シリカゲル上のカラムで単離した。収率９
０〜９５％であった。

その後ｔｅｒｔ−プチルジメチシリル基（ＴＢＤＭＳ　
）をアラビノ核酸中のアラビノースの３′−炭素上の水
酸基に導入した。

上記のようにして調製された５’　−ＤＭＴ　ａｒａＵ
５．５ミリモルをジメトキシエタン（１１０ｍ／）中に
溶解し、トリメチルアミン４４ばリモルを加えた。次に
硝酸銀１６．５　ミＩＪモルを加え、混合物を室温にお
いて１時間攪拌した。その後ｔ＋３ｒｔ−ブチルージメ
チルシリルクロライド１６．５ミリモルを加え、この反
応混合物を室温において５時間攪拌した。反応混合物を
沢過して重１′Ａ酸ナトリウム１０％の溶液中に入れ、
この水性混合物を塩化メチレンによシ２度抽出した。有
機抽出物を蒸発乾固させ、５’　−ＤＭＴ　、　３’　
−ＴＢＤＭＳａｒａＵを酢酸エチルを溶離液とするＭｅ
ｒｃｋ　Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０シリカゲルカラムに
よシフ５％の収率で単離した。

予め調製された５’　−ＤＭＴ、３’　−ＴＢＤＭＳａ
ｒａＵ　５．４ミリモルをピリジン４〇−中に溶解し次
いで一４５℃に冷却することによって、ベンゾイル（Ｂ
ｚ　Ｑ　ａ　Ｍをヌクレオシド中のアラビノースの２′
−・炭素上の水酸基に導入した。

塩化メチレン中の過剰の塩化ベンゾイル（６，６ミリモ
ル）を攪拌された反応混合物に滴加し、滴加終了後に一
４５℃において３０分間維持した。

この反応混合物を加温し、−２０℃において２時間保っ
た。未反応の塩化ベンゾイルを加水分解すべく水を加え
た後に、混合物全回転蒸発装置によりガムにし、５’−
ＤＭＴ、３’　−ＴＢＤＭＳ、２’　−Ｂｚ　ａｒａＵ
をトルエン及び酢酸エチルの５０１５０混会物を溶離液
とするシリカケルカラム上で単離した。

６′−炭素上の水酸基上の一時的な遮断基（ＴＢＤＭＳ
）を、ＩＭのテトラブチルアンモニウムフルオライド（
ＴＨＦ中）２，５ミリモルによる２５℃における０、５
時間の５’　−ＤＭＴ、３’　−ＴＥＤＭＥＩ、２’　
−Ｂｚ　ａｒａ　ＵＯ１７８２の処理により除去した。

５’−ＤＭＴ　、　２’−ＢＺ　ａｒａＵを酢酸エチル
を溶離液とするシリカゲルカラムによシ単離した。

ヌクレオチドの調ｕＫおける最終工程は、ホスフィンに
よる３′−炭素上の水酸基の活性化を含む。５’　−Ｄ
ＭＴ、２’−Ｂｚ　ａｒａＵ（７７ｆｉモル）をジイソ
プロピルエチルアミン４８μｔを含む塩化メチレン０．
２３７！中に溶解した。次に注射器を用い”’（Ｎ、Ｎ
−ジインプロビルメチルホスフオンアミジン酸クロライ
ド３０μｔを、２０℃において攪拌された反応混合物へ
加えた。１５分後に、反応混合物を酢酸エチルにより希
釈し、（飽和）水性重炭酸ナトリウムによシ抽出した。

有機相を水性重炭酸塩より分離し、　Ｎａ２ＳＯ４によ
り乾燥させ、回転蒸発装置によシ減少させて所望の活性
化されかつ保瞼されたヌクレオチドを生成した。

Ｂ、プローブ合成 オリゴマーＡＮＡプローブの合成は、同様の保護されか
つ活性化されたデオキシヌクレオチドを用いるＤＮＡプ
ローブの生成に対して開発された操作に従うことができ
ると考えられる（Ｍ、Ｈ。

０ａｒｕｔｈｅｒｓらＫよる［Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇＪ　４゜１〜１７）。これらの操作に
従って、合成における第１の工程は、スターター誘導さ
れたアラビノヌクレオシドをシラノール誘導されたシリ
カ支持体に加えることよりなる。これは適切な５′−Ｄ
ＭＴ　、　２’−Ｂｚアラビノヌクレオシドをコハク酸
無水物と反応させることよシ行なわれる。スクシニル化
されたアラビノヌクレオシドは、ｐ−二トロフェノール
及びジシクロへキシルカルボジイミドと反応させること
により、ｐ−ニトロフェニルエステル忙転化される。活
性化されたヌクレオシドを、ジメチルホルムアミド、ジ
オキサン及びトリエチルアミンの混合物中において、ア
ミノプロピル−誘導化されたシリカゲルと反応させる。

シリカ上の未反応シラノール基を、無水酢酸との反応に
よシ遮断した。この工程によシ３′−末端においてそれ
に結合されたヌクレオシドを有するシリカゲルが得られ
、従ってこのヌクレオシドは合成されるプローブの３′
−末端に存在する。

次のヌクレオチドをその後シリカ支持体に結合している
ヌクレオシドに加えることができる。

上記のようＫｖｒ４製されたシリカ−ヌクレオシド生成
物をアセトニトリル中のｐ−トルエンスルホン酸によシ
処理して、シリカ支持体に結合したヌクレオ、−シトの
５′−炭素原子上の水酸基から酸に不安定なジメトキシ
トリチル基を除去した。

支持体上のヌクレオシドを適切なアラビノヌクレオチド
ホスフォアミタイトによ多縮合して生長スるプローブの
５′−末端へ次のヌクレオチドを加えた。この反応は、
縮合反応を促進させるために乾燥アセトニトリル中にお
いて、テトラゾールの存在下で行なわれる。支持体上の
アラビノヌクレオシドの未反応５′−水酸基を、ジメチ
ルアミノピリジン中の無水酢酸との１〜２分間の処理に
よりｇ断する。前記の縮合反応によシ形成される亜リン
酸トリエステルは、水性テトラヒドロフラン中における
ヨウ素と２，６−ルチジンの混合物によ９１〜２分間処
理することによって、リン酸エステルに酸化される。こ
の工程は、ヌクレオチドを生長するプローブに加えるこ
とＫより終了する。追加のヌクレオチドは、プローブの
５′−末端上のアラビノース中の５′−水酸基から保護
基を除去することＫよって始められる上記の反応手順を
繰シ返すことＫより加えることができる。

プローブ配列の合成が完了した場合に、オリゴマープロ
ーブをジオキサン中のトリエチルアミン及びチオフェノ
ールと反応させ、各ヌクレオチド結合中のリン酸トリエ
ステルをリン酸ジエステルに転化した。その後プローブ
はき水酸化アンモニウムによる２０℃におけや３時間の
反応によシリカ支持体よシ分裂させる。この処理によシ
、プローブ中の各アラビノース部分の２′−水酸基から
ベンゾイル保護基が、また塩基からすべての保護基が除
去される。オリゴマー　ＡＮＡプローブを逆相液体クロ
マトグラフィーによシ単離し、プローブの５′−末端上
の最後のジメトキシトリチル基か８０％のｋｆｔＲによ
る処理によシ除去されて精製されたＡＮＡプローブが生
成されるが、これはノ１イブリッド形成アッセイ中での
使用に供することができる。

Ｏ，ハイブリッド形成操作 ＡＮＡプローブを使用するための操作子１泊は通営利用
される様々のハイブリッド形成アッセイの手順に沿って
行ないうると考えられ、またＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブをＡＮＡプローブと置きかえるととＫよる制限は無い
ものと予測される。

最初に標的または試料の核酸をいずれかの好都合な方法
によシ調製する。核酸をいずれかの従来方法により変性
させて一重鎮状態にする。例えばＤＮＡを適切な緩衝剤
中で９５℃において５分間加熱することＫよ）変性する
ことができる。

代替的に、変性は、ＤＮＡを０．２５ＮのＮａＯＨＫよ
９１０分間処理するととＫよっても行なうことができる
。この場合において、変性の後に、同量の酸（例えばＨ
Ｃｌ　）を加えて一重鎖ＤＮＡを含む溶液を中性化させ
ることが必要である。この点において、ＤＮＡの支持体
への結合を最も効果的にするために、試料のイオン強度
を調節することも必要である。−重鎮にされたＤＮＡの
復元率を低下させるために、変性されたＤＮＡを氷上で
冷却することも望ましい。

標的核酸を支持体の表面上で固定化することができる。

典型的には支持体はニトロセルロース膜が選ばれていた
。この材料を使用する場合は、標的核酸のアリコートは
、膜上にスポットされるかまたはドツト−プロットもし
くはスロット−プロットマニホルドのような装置内に含
まれる膜を介してゆつ＜Ｄ濾過することかできる。標的
核酸をニトロセルロースに適用した後、膜を乾燥させニ
トロセルロースへの結合を確実にするために約８０℃に
おいて０．５〜２．０時間真空Ｆ中で加熱した。

支持物質はニトロセルロースに限定する必要性はない。

例えば、Ｇθｎｅ　５ｃｒｅｅｎ■（デュポン社製）ま
たはＢｉｏｔｒａｎｓ■（工ＯＮラジオケミカルズ社製
）のような電荷を有するナイロン支持体をも使用するこ
とができる。核酸を固定する場合には、膜の製造業者に
より１発された操作手順を用いるべきである。これは、
ドツト−プロットマニホルドまたは試料核酸の電気泳動
による分離の後に通常使用される転移方法（例えばサザ
ン法）の１つＫよって核酸を膜に固定する場合忙適用さ
れる。

他の操作手順忙おいて、標的核酸はそれを支持物質に固
定化された「捕獲」核酸の鎖にノ・イブリッド形成する
ことによって固定化することができる。この捕獲核酸は
、標的核酸中の短い塩基配列に対して相補的であり、目
的外の実質量の他の核酸を含みうる溶液からそれを特異
的に捕獲する。

支持物質にしつかり固定化された目的の核酸は、−重鎮
にされているかまたは変性された状態であり、相補的な
塩基配列を含むＡＮＡプローブとのハイブリッド形成に
とって有用である。

固定化された標的核酸及び支持体を次に特異的なＡＮＡ
プローブに対する非特異的結合部位を除去するために一
般的なりＮＡ　（例えば音波処理されたサケの精子ＤＮ
Ａ　）を含む緩衝溶液にょ夛処理することができる。典
型的には、この一般的ＤＮＡは、１００μＦＶ′ｍｔの
濃度で緩衝液中に存在し、支持物質名１ｃｒｎ２に対し
てこの予備ハイブリッド形成緩衝液１００μｔが必要と
される。この予備ハイブリッド形成緩閏液は、１０％の
硫酸デキストランナトリウム、０．１％の硫酸ドデシル
ナトリウム、５０％のホルムアミド、並びに塩化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム及びＥＤＴＡの混合物である５
ｓｐｚをも含有することができる。

さらに、この緩衝液はフィコール、ポリビニルピロリド
ン及びウシ面前アルブミンの混合物であるデンハルト（
Ｄｅｎｈａｒｄｔ）の試薬をも含むことができる。

核酸が固定化されている支持体は、ＡＮＡプローブが非
特異的に結合し得る固定化された核酸上の部位を遮断す
るために数時間から一晩の範囲の時間において、高めら
れた温度（例えば３７℃〜６５℃）にて、この緩衝混合
物中で予備ノ・イブリッド形成される。予備成形の後に
、典型的には１０〜１００　ｎｇ／’ｍｌである所望の
最終濃度となるよ−うにＡＮＡ　ｉセーブを予備形成用
緩衝剤に加えた。その後ハイブリッド形成を適当な昼め
られた温度（例えば６７〜ｂ な時間、通常は１晩行なう。

ハイブリッド形成後、支持体に非特異的に結合し得るＡ
ＮＡプローブを除去すべく、一連の緩衝剤により支持体
を洗浄する。典型的には、洗浄の操作が進行するにつれ
て、緩衝剤中の塩の濃度を低下させ洗浄の温度を上昇さ
せた。一連の洗浄の後に、支持体を適当な緩衝液によシ
すすぎ、洗浄用緩衝剤から後で加えられる抗体−酵素抱
合体の活性に悪影響を与えうる試薬を除去した。

Ｄ、抗体の検出 ＡＮＡプローブ分子中の７ラビノースを検出するために
、多クローン性または単クローン性のいずれかの抗体を
使用することができる。多クローン性抗体は変性された
ＤＮＡに対する抗体を産生ずるために用いられるいかな
る好都合な方法によっても産生ずることができる〔例え
ば、８、Ｃｏｈｎ及びＭ、Ｗ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎによ
る「Ｊ、Ｂｉｏｌ（！ｈｅｍ、　Ｊ　２５９．１２４５
６〜６２（１９８４））　。同様に、単クローン性抗体
は多数の操作のうちいずれＫよっても産生ずることがで
きる（Ｈ，Ｇ、Ｇｒａｔｚｎθｒによる「８ｃｉｅｎｃ
ｅＪ　２１８，４７４〜５（１９８２））。

適当な担体タンパク′Ｘ（例えばＢＡＡ　）に抱合され
ているアラビノヌクレオチドは、抗体産生における免疫
原としても作用することができる。

しかし、ＡＮＡプローブ単独（ｉたは相補的核酸に対し
てハイブリッド形成されたもの）が好ましい。代替的に
は免疫原として作用させるべくプローブを担体タンパク
質に抱合させることもできる。０ｋａｂａｙａｓｈｉら
は血漿中の１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（
ａｒａ−Ｃ）に対する抗体の産生について報告している
（［ＣａｎｃθｒＲｅｓｅａｒｃｈＪ　３７．６１９〜
６２４（１９７７））　ｏこれらの抗体は、２′位にの
み存在するａｒａ−Ｕとは異なるデオキシシチジンまた
はシチジンとは交差反応しない。このことは、ＤＮＡ中
のデオキシリボースまたはＲＮＡ中のリボースと交差反
応しないＡＮＡ中のアラビノースに対して適当な特異性
を有する抗体が産生されうることを非常に強く提案する
ものである。

Ｅ、抗体−酵素抱合体のｖ４製 酵素に対する抗体の抱合は周知の方法によシ夾施するこ
とができる。例えば酵素上の７ミノ基と抗体を結合する
ためにグルタルアルデヒドを使用することは、一般的な
方法であるＣ　Ｈ。

ＷａｌｌｉｎらＫよる［ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
Ｊ　２２．１６３〜１７０（１９８４））。この操作手
順を用いて、酵素（例えばパーオキシダーゼ）を１８時
間室温においてグルタルアルデヒドと反応させる。ケ゛
ル濾過カラム中の過剰のグルタルアルデヒドを除去した
後に、活性化された酵素を２４時間４℃において抗体と
反応させる。抗体−酵素抱合体をその後透析、硫酸アン
モニウム沈殿及びゲル濾過クロマトグラフィーによシ精
製する。例えばＪ。

Ｗ、　Ｆｒｅｙｔａｇらによ名「ｃｌｌｎ、ｏｈｅｍ、
　Ｊ　３０．４１７〜４２０（１９８４）またはＯ，Ｏ
，Ｌｅｆｌｅｒらによる「０１ｉｎ、　Ｃ！ｈｅｍ、Ｊ
３０、１８０９〜１８１１　（１９８４）に記載されて
いるような異質二官能架橋剤を使用する抱合操作をも使
用することができる。パーオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリもしくは
酸ホスファターゼまたは他のいかなる有用な酵素をも抗
体（またはその断片）に対して抱合されうシ、次いでＡ
ＮＡプローブ中のアラビノースの検出のために使用する
ことができると考えられる。

Ｆ、ハイブリッドの検出 抗体−酵素抱合体の膜に対する非特異的吸着を減少させ
るための試薬を含む遮断緩衝剤中において、ハイブリッ
ド形成された試料をインキュベートする。典型的には１
％のウシ血清アルブミンを含む緩衝剤を使用する。遮断
緩衝剤による処理後に、抗体が標的核酸に対してノ・イ
ブリッド形成されたプローブの鎖中の各アラビノース部
分を認識してかつそれに結合する機会を与えるような時
間の間、膜を適切な抗体−酵素抱合体とともにインキュ
ベートする。抗体−酵素抱合体は、プローブ中のアラビ
ノースに対して特異的な抗体またはその断片に対して共
有結合した酵素よシなる。

プローブに対して抗体−酵素抱合体が結合した後に、Ｉ
的核酸に対してハイブリッド形成したプローブに結合し
た抱合体を含むようになった膜を、一連の緩衝剤で再び
況浄して未結合の抱合体及び非特異的に結合し℃いる抱
合体を支持体より除去する。適当な酵素基質及び／また
はクロモケ゛ンを支持体上の生成物とともにインキュベ
ートし、規定の時間発色現像を進行させた。ハイブリッ
ド形成の程度は、所定時間経過後の発色現像の程度と現
像された全体の発色を測定することにより定量すること
ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アラビノ核酸。 ２）構成ヌクレオチドの塩基が、アデニン、グアニン、
   シトシン、チアミン及びウラシルからなる群から選ばれ
   る特許請求の範囲第１項に記載の核酸。 ５）ａ）標的核酸を一重鎖にし； ｂ）その一重鎖にされた核酸を支持体上に固定し； ｃ）前記一重鎖にされた核酸を一重鎖にされたアラビノ
   核酸プローブとハイブリット形 成させ； ｄ）支持体を洗浄してこの支持体上に形成されたハイブ
   リット中に組み込まれていない アラビノ核酸を除去し；次いで ｅ）それを抗アラビノース抗体標識抱合体と接触させか
   つその標識を検出することによ って、支持体上に形成されたハイブリッド 中のアラビノ核酸の存在を決定する段階 からなる核酸配列の同定方法。 ４）標識が酵素である特許請求の範囲第３項に記載の方
   法。