JPS62158299A - Dna/rnaアツセイのためのアラビノ核酸プロ−ブ - Google Patents

Dna/rnaアツセイのためのアラビノ核酸プロ−ブ

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JPS62158299A
JPS62158299A JP61304070A JP30407086A JPS62158299A JP S62158299 A JPS62158299 A JP S62158299A JP 61304070 A JP61304070 A JP 61304070A JP 30407086 A JP30407086 A JP 30407086A JP S62158299 A JPS62158299 A JP S62158299A
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アラビノ核酸並びK DNAまたばRNAハ
イブリッド形成アッセイにおけるこの新規ポリヌクレオ
チドプローブの使用、特に全ての構成ヌクレオチド中に
結合部位を有するプローブに関する。これによシブロー
ブの各ヌクレオチドに対して検出部分を結合することか
でき、従ってそれが検出感度の改良にもつながる。
DNA及びRNAアッセイにおいて使用されるハイブリ
ッド形成プローブは、プローブが分析下の試料中の[標
的J DNAまたはRNAの相補的な鎖とハイブリッド
形成した後に二重鎖の検出を容易にするために、様々の
方法で標識される。
最も一般的には、プローブは、プローブの3′または5
′−末端上に放射能標識されたヌクレオチドを酵素で組
み込むことによって標識することができるC A 、 
M 、 Maxamらによる[Meth、Enzymo
:L。
Vo1umeJ殖、499〜560(1980)]。代
替的に、高レベルの放射能標識されたヌクレオチドはニ
ックトランスレーションによシ取シ込むことができるI
:P、W−、T、Rlgbyらによる「J、Mo1Bi
ol J i13゜237〜251(1977)]。後
者の方法は、プローブ中の構成ヌクレオチド尚り1の放
射性リンを組み入れることができるという固有の利点を
有しておシ、このようなプローブを使用するアッセイは
、ハイブリッド形成アッセイにおける最も高感度の検出
限度によって特徴づけられている。これらのプローブの
目立った欠点は、放射性同位元素の使用にともなう危険
性と不都合があげられる。
第2の型の標識は、プローブと1のヌクレオチドの中に
組み込まれたビオチニル化されたくリミジン塩基(ウラ
シルまたはアデノシン)を含むヌクレオチドの混合物と
を酵素を用いて合成することを含む〔例えばP、R,L
angerらKよる「Proc、Natl、Acad、
Sci、 J米国78.6633〜6637(1981
)]。代替的にビオチニル化されたヒストンH1タンパ
ク質は、DNA中の塩基と化学的に架橋結合されて標識
されたプローブを形成することができる[M、Reng
による「wyso :r、 J 2(6)t817〜8
22(1983)蒐標的DNAの相補的な鎖に対してプ
ローブをハイブリッド形成した後、このハイブリッドを
プローブ中のビオチン部分に対して強固に結合している
アビジンに結合しているリポータ−分子によって処理す
る。該リポータ−は、アビジンに結合している透明な重
合性ミクロスフェア(0,O,Rlchardsらによ
る[Proc−Nath、Acad、8ci、 J米国
76(2)、676〜680(1979)上またはアビ
ジン−フェリチン[:A、5odjaらによる「Nuc
l、Ac1ds Res、 j5(2)、385〜40
1 、 (1978))のいずれかであシ得る。これら
各々は、電子顕微鏡によシ可視化することができる。ま
たは、リポータ−は酵素の基質によシ処理された場合に
、可視的に検出可能な着色物質を生成するアビジン−酵
素複合体でありうる[J、、T、Learyらによる[
Proc、Natl、Acad、Sci、 J米国80
.4045〜4049(1983)]。このようなプロ
ーブに基づくアッセイは、放射性物質の使用は避けるこ
とができるが、与えられたプローブ分子中わずか約2%
のヌクレオチドのみが、試料DNAの相補的鎮に対する
プローブの特異性を減することなくビオチン部分によシ
誘導されうる。この特異性の減少は、ビオチン部分の存
在によって相補的塩基が適切に組み合わされる能力が変
化してしまうことに起因する。放射性プローブに対する
これらのプローブ中への標識の組み込みの妹少は、検出
感度を低いものとする。
第3の型の標識は、ハイブリッド形成後に71イブリツ
ド中の酵素が基質により処理されて着色物質を生じさせ
るようになっているプローブに直接結合している酵素で
ある。この酵素は、プローブ中の塩基[:M、Reng
らによる[Nucl、Ac1dsRes、J 12(8
)、3435〜3444(1984)]、またはプロー
ブの末端に化学的に結合されているある長さのオリゴヌ
クレオチドに相補的なりNAの他の鎖中の塩基[、T、
G、Woodheadらによる[Biochem、 S
oc 、 。
Trans、 J 12(2)、275’〜280(1
984))K直接結合することができる。後者の場合に
おいて、プローブは相補的な標的DNAに対してノ・イ
ブリッド形成され、このノ・イブリッドは酵素標品を含
むオリゴヌクレオチドによシ処理される。標識されたオ
リゴヌクレオチドのこの鎖は、プローブの末端に化学的
に結合している相補DNAの一重鎖末端と結合する。酵
素リポータ−の可視化は、酵素の基質を着色物質へ転化
することによって達成される。
この操作に関連する主な欠点は、酵素結合が低レベルで
あシ、ノ・イブリッド形成の操作手順において典型的に
使用される厳密な条件(例えば高められた温度、非水性
溶媒)下におかれた場合に、#素活性が失なわれること
に起因する。
これらの標識方法のうち後者のものに関連する第2の欠
点は、酵素標識を含壱するオリゴヌクレオチドの合成鎮
が試料中に元来存在するヌクレオチドの配列に対して相
補的になり得る可能性にある。このように、ハイブリッ
ド形成プローブの末端に結合された塩基配列を損なう上
に、酵素標識されたオリゴヌクレオチドは、相補的塩基
の自然の配列に対して非特異的に結合して、それが負の
対照即ちブランクとして使用する試料中の背景的問題A
Kつながる。
第4の型の標識は、発螢光団をプローブの成分ヌクレオ
チド中の塩基[C,H,Yangらによる「J、Bio
chem、J 13.3615〜3620(1974)
λプローブの3′−末端[R,W、 Rlchards
onらによる「Nucl。
Ac1ds Res、J 11(8)、6167〜61
84(1983)上または5′−末端(0,H,Yan
gらKよる[Arch、Biochem。
Biophya、 J 155.70〜81 (197
3)]のいずれかに結合させることを含む。上記のよう
に、これらの方法の感度は、プローブの各複製中に組み
込まれうる少数の標識によって限定される。第50型の
標識は、プローブまたは標識−プローブ2本鎖中のある
抗原決定基に対応する抗体の使用を含むものである。こ
の前者の場合において、抗原決定基(例えばビオチン、
臭素、N−アセトキシ−2−アセチルアミノフルオレン
)はプローブのヌクレオチド中の塩基と共役結合する〔
例えはり、Manuelidisらによる「J、Ce1
l BiolJ95e617〜625(1982)l、
これらの抗原決定基は特異的ハイブリッド形成を妨害し
、プローブの有用性を制限することがある。後者の場合
において、二重鎖DNA−RNAハイブリッド自体は、
DNA−DNA及びRNA−RNA二重鎖より免疫学的
に区別することができる[G、T、RudkinらKよ
る「Nature J265 +472〜473(19
77)工このブローブー標的二重鎖中の抗原決定基は、
抗体−発蛍光団抱合体及び螢光顕微鏡によシ検出された
。標識されたプローブは、酵素(L、Manuelli
sらKよる前述の文■またはコロイド状金[N、J、H
utchinsonらKよる「J、c!e11. Bi
olJ 95,609〜618(1982)]が抱合さ
れている抗体によっても検出することができる。
また、最終的な感度は、ノ・イブリッド形成の結果を検
出するのに有用な標識の数によって限定される。
本発明は、ノ・イブリッド形成効率または特異性に殆ん
ど影響を与えないで、ヌクレオチド1個当り1個の割合
で、最大数の非放射性標識を各プローブ中に組み込むこ
とによって、従来技術の限界を打ちゃぶったものである
本発明は、新規な核酸、アラビノ核酸に関する。
核酸の配列を同定するための本発明の方法は、a)標的
核酸を一重鎖にし、 b)この一重鎖にされた核酸を支持体上に固定し、 C)この一重鎖にされた核酸を一重鎖にされたアラビノ
核酸プローブとハイブリッド形成させ、 d)支持体を洗浄してこの支持体上く形成されたハイブ
リッド中に組み込まれていないアラビノ核酸を除去し、
次いで e)このハイブリッドを抗アラビノース抗体−標詭抱合
体と接触させその標識を検出することによって、支持体
上に形成されたハイブリッド中のアラビノ核酸の存在を
決定する段階からなる。
本発明は、DNA及びRNAアッセイのための新規ハイ
ブリッド形成プローブの合成及び使用にも関する。この
新規プローブ、アラビノ核酸(ANA)は、RNA及び
DNA各々中で見出される従来のリボースまたはチオキ
シリボース糖に取って替れるアラビノース糖を有する。
この特別の糖は、アラビノース糖及びその糖を含有する
プローブを選択的に@出するために使用され得る抗アラ
ビノース抗体−標識に対して結合部位を与える。この糖
アラビノースは、この合成プローブにのみ見られ、天然
のDNAまたはRNAには見出されないため、検出抗体
は、プローブ中のアラビノース部分に対してのみ結合す
る。
プローブは化学的方法または酵素を用いる方法のいずれ
かKよって合成することができる。
化学的合成は、リポースまたはデオキシリボースではな
くアラビノースを含有するヌクレオシド中の7ラビノー
ス糖の2′、3′、及び5′位の炭素原子上に保護基を
導入することを含む。このようなヌクレオシドは商業的
に入手可能である。保護基の結合の化学的性質及び方法
は、リボヌクレオクド及びデオキシヌクレオシド[:G
、H,Haki−meliahらによる「Oan、、T
、Ohem、 J 60.1106〜1113(198
2)) K対して明らかになっておシ、それをアラビノ
ヌクレオシド中の和尚する位置の保護についても採用す
ることができるC K 、K 、0g1lvieらKよ
るl’−0an、J、Ohem、 J 61.1204
〜1212(1983)l。
一度アラビノヌクレオシドの保護が達成されると、アラ
ビノ核酸プローブの化学的合成は、DNA及ヒRNAプ
ローブについて使用される方法において進行させること
が可能であって、その中で、適当なヌクレオチドは、連
続的に連結して、分析下試料中の標的DNAまたはRN
A中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
鎖を形成する(M、 H,caruthersらによる
1−Genetic Kngi−nθeringJ 4
.1〜17(1982))。
分析用の核酸には、多くの入手源がある。これらは、中
でも臨床試験片;細菌、ビールスクラミジア、リケッチ
ア、マイコプラズマのような様々の微生物;原生動物;
及び植物を包含する。抽出は、ハイブリッド形成アッセ
イのために供給源から核酸を採集するための1つの慣用
方法である。本発明のANAプローブを使用するための
操作手順は、従来のハイブリッド形成操作におけるもの
と酷似している。標的DNAまたはRNAはまず一重鎖
にされ次いで支持体上に固定化される。この固定化され
た一重鎖核酸をその後、標的中の塩基配列に対して相補
的なアラビノ核酸プローブによシ処理する。アラビノ核
酸プローブと相補的塩基配列とをノ・イブリッド形成さ
せる。ハイブリッド形成されなかった余分のANAプロ
ーブを除去すべく洗浄した後、プローブ−標識ハイブリ
ッドを抗アラビノース抗体−標識抱合体によシ処理する
抗体自体は、アラビノース中のC2キラル部位またはア
ラビノースもしくはANA構造中の他の抗原決定基に関
連する02部位に対して形成される。(:0kabay
ashiらKよる[0ancer ReaearchJ
37,619〜624(1977)]抗体−抱合体は従
来の方法により調製することができる。標識は、酵素・
螢光、化学ルミネセンスまたは高分子であり得り、好ま
しいのは酵素である。
抗体−標識抱合体はアラビノース糖に特異的に結合する
が、天然のRNAまたはDNA中に存在するリボースま
たはチオキシリボースには結合しない。系よシ過剰の未
結合抗体−酵素抱合体を除去するための洗浄のような処
理の後に、これを酵素の支持体−よシ処理して、試料中
の標的核酸の存在を示す着色物質のような検出可能な信
号を生成させる。酵素以外の標識ももちろん適幽に検出
することができる。
代替的には、酵素または他のs識に抱合し得るレクチン
のような他の結合剤の使用も考えることができる。この
ような抱合体のためのアッセイ方法も上記の方法と類似
のものである。
アラビノ核酸プローブはいくつかの独特の利点を有して
いる。1のアラビノース結合部位はハイブリッド形成プ
ローブの各ヌクレオチド中に組み込まれることができる
ので、各ヌクレオチドは、放射性同位元素により通常得
られるレベルにおいて標識するためにそれに結合されて
いる抗アラビノース抗体標識を有することかできる。同
時に、放射性物質の危険も避けられる。
加えて、これらの充分に標識されたプローブは、放射標
識されたプローブが放射標識の高エネルギー崩壊物質に
よる溶解のために受けるような減成を、受けることはな
い。さらに、ANAの検出性は、プローブの糖骨格中の
02炭素原子に関する転化されたキラリティに基づくも
のであシ、またC2炭素原子に関する化学結合は、プロ
ーブまたはプローブ標的ハイブリッドのらせん構造内ま
たはらせん構造間の構造の決定に必要であるので、プロ
ーブの特異性及びプローブ標識のハイブリッドの安定性
は著しく影響を受けるとは考えられない。塩基の相補的
配列に対するプローブの特異性を敦えることなく達成さ
れるANAプローブの高度の標識によって、本発明のプ
ローブは従来技術の化学的に誘導されたプローブよシも
優れたものとされる。最後に、プローブ中のアラビノー
スは抗体−酵素抱合体を使用して特異的忙検出されるこ
とができる。
酵素標識の使用の利点は、基質から生成物への大量の転
換による高度のシグナル拡大による。
このように、アラビノース検出のための抗体−酵素抱合
体は、放射能標識されたプローブの高度なプローブ標識
特性の利点のみならず、酵素による非放射分析アッセイ
のシグナル拡大の利点も有するものである。
実施例 1 A、プローブ合成のための保護されたアラビノ核酸の化
学的合成 ヌクレオチドの化学的重合化によるプローブ合成は、塩
基ダアニン、シトシン、アデニン及びウラシルまたはチ
ばンを含む少くとも4つの保護されかつ活性化されたア
ラビノ核酸の入手が要求される。個々のこれら保護され
た核酸は、商業的に入手可能な相当するヌクレオチドか
ら調製することができる。
ヌクレオシドに対する保護及び活性化基の附加に関して
は、保護されかつ活性化されたヌクレオシドアラビノウ
ラシル(araU)の調製について説明する。他のアラ
ビノ核酸は同一の方法によシ保護されかつ活性化された
。加えてシトシン及びアデニンを含むヌクレオシドは塩
基自体上でベンゾイル基の形態をなす保護基を要求し、
一方グアニンはインブチリル保診基を要求シタ。
第1に1ジメトキシトリチル(DMT )基をアラビノ
ースの5′−炭素上の水酸基に導入した。これは、−5
℃において30−のピリジンに溶解した6、5ミリモル
のβ−D−アラビノウラシルに対して、8等分された7
、 75 ミIJモルのジメトキシトリチルクロライド
(DMTCA)を1時間の間隔をおいて加えた。最後の
添加から1時間後に、反応混合物を氷水中釦注加し過剰
のジメトキシトリチルクロライドを消失させ、約25℃
において回転蒸発器上でガム状にした。この生成物、5
’ −DMT araUをクロロホルム/メタノールの
9575混合物を溶離液とするMerck Kiese
1ge160シリカゲル上のカラムで単離した。収率9
0〜95%であった。
その後tert−プチルジメチシリル基(TBDMS 
)をアラビノ核酸中のアラビノースの3′−炭素上の水
酸基に導入した。
上記のようにして調製された5’ −DMT araU
5.5ミリモルをジメトキシエタン(110m/)中に
溶解し、トリメチルアミン44ばリモルを加えた。次に
硝酸銀16.5 ミIJモルを加え、混合物を室温にお
いて1時間攪拌した。その後t+3rt−ブチルージメ
チルシリルクロライド16.5ミリモルを加え、この反
応混合物を室温において5時間攪拌した。反応混合物を
沢過して重1′A酸ナトリウム10%の溶液中に入れ、
この水性混合物を塩化メチレンによシ2度抽出した。有
機抽出物を蒸発乾固させ、5’ −DMT 、 3’ 
−TBDMSaraUを酢酸エチルを溶離液とするMe
rck Kieselgel 60シリカゲルカラムに
よシフ5%の収率で単離した。
予め調製された5’ −DMT、3’ −TBDMSa
raU 5.4ミリモルをピリジン4〇−中に溶解し次
いで一45℃に冷却することによって、ベンゾイル(B
z Q a Mをヌクレオシド中のアラビノースの2′
−・炭素上の水酸基に導入した。
塩化メチレン中の過剰の塩化ベンゾイル(6,6ミリモ
ル)を攪拌された反応混合物に滴加し、滴加終了後に一
45℃において30分間維持した。
この反応混合物を加温し、−20℃において2時間保っ
た。未反応の塩化ベンゾイルを加水分解すべく水を加え
た後に、混合物全回転蒸発装置によりガムにし、5’−
DMT、3’ −TBDMS、2’ −Bz araU
をトルエン及び酢酸エチルの50150混会物を溶離液
とするシリカケルカラム上で単離した。
6′−炭素上の水酸基上の一時的な遮断基(TBDMS
)を、IMのテトラブチルアンモニウムフルオライド(
THF中)2,5ミリモルによる25℃における0、5
時間の5’ −DMT、3’ −TEDMEI、2’ 
−Bz ara UO1782の処理により除去した。
5’−DMT 、 2’−BZ araUを酢酸エチル
を溶離液とするシリカゲルカラムによシ単離した。
ヌクレオチドの調uKおける最終工程は、ホスフィンに
よる3′−炭素上の水酸基の活性化を含む。5’ −D
MT、2’−Bz araU(77fiモル)をジイソ
プロピルエチルアミン48μtを含む塩化メチレン0.
237!中に溶解した。次に注射器を用い”’(N、N
−ジインプロビルメチルホスフオンアミジン酸クロライ
ド30μtを、20℃において攪拌された反応混合物へ
加えた。15分後に、反応混合物を酢酸エチルにより希
釈し、(飽和)水性重炭酸ナトリウムによシ抽出した。
有機相を水性重炭酸塩より分離し、 Na2SO4によ
り乾燥させ、回転蒸発装置によシ減少させて所望の活性
化されかつ保瞼されたヌクレオチドを生成した。
B、プローブ合成 オリゴマーANAプローブの合成は、同様の保護されか
つ活性化されたデオキシヌクレオチドを用いるDNAプ
ローブの生成に対して開発された操作に従うことができ
ると考えられる(M、H。
0aruthersらKよる[Genetic Eng
ineeringJ 4゜1〜17)。これらの操作に
従って、合成における第1の工程は、スターター誘導さ
れたアラビノヌクレオシドをシラノール誘導されたシリ
カ支持体に加えることよりなる。これは適切な5′−D
MT 、 2’−Bzアラビノヌクレオシドをコハク酸
無水物と反応させることよシ行なわれる。スクシニル化
されたアラビノヌクレオシドは、p−二トロフェノール
及びジシクロへキシルカルボジイミドと反応させること
により、p−ニトロフェニルエステル忙転化される。活
性化されたヌクレオシドを、ジメチルホルムアミド、ジ
オキサン及びトリエチルアミンの混合物中において、ア
ミノプロピル−誘導化されたシリカゲルと反応させる。
シリカ上の未反応シラノール基を、無水酢酸との反応に
よシ遮断した。この工程によシ3′−末端においてそれ
に結合されたヌクレオシドを有するシリカゲルが得られ
、従ってこのヌクレオシドは合成されるプローブの3′
−末端に存在する。
次のヌクレオチドをその後シリカ支持体に結合している
ヌクレオシドに加えることができる。
上記のようKvr4製されたシリカ−ヌクレオシド生成
物をアセトニトリル中のp−トルエンスルホン酸によシ
処理して、シリカ支持体に結合したヌクレオ、−シトの
5′−炭素原子上の水酸基から酸に不安定なジメトキシ
トリチル基を除去した。
支持体上のヌクレオシドを適切なアラビノヌクレオチド
ホスフォアミタイトによ多縮合して生長スるプローブの
5′−末端へ次のヌクレオチドを加えた。この反応は、
縮合反応を促進させるために乾燥アセトニトリル中にお
いて、テトラゾールの存在下で行なわれる。支持体上の
アラビノヌクレオシドの未反応5′−水酸基を、ジメチ
ルアミノピリジン中の無水酢酸との1〜2分間の処理に
よりg断する。前記の縮合反応によシ形成される亜リン
酸トリエステルは、水性テトラヒドロフラン中における
ヨウ素と2,6−ルチジンの混合物によ91〜2分間処
理することによって、リン酸エステルに酸化される。こ
の工程は、ヌクレオチドを生長するプローブに加えるこ
とKより終了する。追加のヌクレオチドは、プローブの
5′−末端上のアラビノース中の5′−水酸基から保護
基を除去することKよって始められる上記の反応手順を
繰シ返すことKより加えることができる。
プローブ配列の合成が完了した場合に、オリゴマープロ
ーブをジオキサン中のトリエチルアミン及びチオフェノ
ールと反応させ、各ヌクレオチド結合中のリン酸トリエ
ステルをリン酸ジエステルに転化した。その後プローブ
はき水酸化アンモニウムによる20℃におけや3時間の
反応によシリカ支持体よシ分裂させる。この処理によシ
、プローブ中の各アラビノース部分の2′−水酸基から
ベンゾイル保護基が、また塩基からすべての保護基が除
去される。オリゴマー ANAプローブを逆相液体クロ
マトグラフィーによシ単離し、プローブの5′−末端上
の最後のジメトキシトリチル基か80%のkftRによ
る処理によシ除去されて精製されたANAプローブが生
成されるが、これはノ1イブリッド形成アッセイ中での
使用に供することができる。
O,ハイブリッド形成操作 ANAプローブを使用するための操作子1泊は通営利用
される様々のハイブリッド形成アッセイの手順に沿って
行ないうると考えられ、またDNAまたはRNAプロー
ブをANAプローブと置きかえるととKよる制限は無い
ものと予測される。
最初に標的または試料の核酸をいずれかの好都合な方法
によシ調製する。核酸をいずれかの従来方法により変性
させて一重鎮状態にする。例えばDNAを適切な緩衝剤
中で95℃において5分間加熱することKよ)変性する
ことができる。
代替的に、変性は、DNAを0.25NのNaOHKよ
910分間処理するととKよっても行なうことができる
。この場合において、変性の後に、同量の酸(例えばH
Cl )を加えて一重鎖DNAを含む溶液を中性化させ
ることが必要である。この点において、DNAの支持体
への結合を最も効果的にするために、試料のイオン強度
を調節することも必要である。−重鎮にされたDNAの
復元率を低下させるために、変性されたDNAを氷上で
冷却することも望ましい。
標的核酸を支持体の表面上で固定化することができる。
典型的には支持体はニトロセルロース膜が選ばれていた
。この材料を使用する場合は、標的核酸のアリコートは
、膜上にスポットされるかまたはドツト−プロットもし
くはスロット−プロットマニホルドのような装置内に含
まれる膜を介してゆつ<D濾過することかできる。標的
核酸をニトロセルロースに適用した後、膜を乾燥させニ
トロセルロースへの結合を確実にするために約80℃に
おいて0.5〜2.0時間真空F中で加熱した。
支持物質はニトロセルロースに限定する必要性はない。
例えば、Gθne 5creen■(デュポン社製)ま
たはBiotrans■(工ONラジオケミカルズ社製
)のような電荷を有するナイロン支持体をも使用するこ
とができる。核酸を固定する場合には、膜の製造業者に
より1発された操作手順を用いるべきである。これは、
ドツト−プロットマニホルドまたは試料核酸の電気泳動
による分離の後に通常使用される転移方法(例えばサザ
ン法)の1つKよって核酸を膜に固定する場合忙適用さ
れる。
他の操作手順忙おいて、標的核酸はそれを支持物質に固
定化された「捕獲」核酸の鎖にノ・イブリッド形成する
ことによって固定化することができる。この捕獲核酸は
、標的核酸中の短い塩基配列に対して相補的であり、目
的外の実質量の他の核酸を含みうる溶液からそれを特異
的に捕獲する。
支持物質にしつかり固定化された目的の核酸は、−重鎮
にされているかまたは変性された状態であり、相補的な
塩基配列を含むANAプローブとのハイブリッド形成に
とって有用である。
固定化された標的核酸及び支持体を次に特異的なANA
プローブに対する非特異的結合部位を除去するために一
般的なりNA (例えば音波処理されたサケの精子DN
A )を含む緩衝溶液にょ夛処理することができる。典
型的には、この一般的DNAは、100μFV′mtの
濃度で緩衝液中に存在し、支持物質名1crn2に対し
てこの予備ハイブリッド形成緩衝液100μtが必要と
される。この予備ハイブリッド形成緩閏液は、10%の
硫酸デキストランナトリウム、0.1%の硫酸ドデシル
ナトリウム、50%のホルムアミド、並びに塩化ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム及びEDTAの混合物である5
spzをも含有することができる。
さらに、この緩衝液はフィコール、ポリビニルピロリド
ン及びウシ面前アルブミンの混合物であるデンハルト(
Denhardt)の試薬をも含むことができる。
核酸が固定化されている支持体は、ANAプローブが非
特異的に結合し得る固定化された核酸上の部位を遮断す
るために数時間から一晩の範囲の時間において、高めら
れた温度(例えば37℃〜65℃)にて、この緩衝混合
物中で予備ノ・イブリッド形成される。予備成形の後に
、典型的には10〜100 ng/’mlである所望の
最終濃度となるよ−うにANA iセーブを予備形成用
緩衝剤に加えた。その後ハイブリッド形成を適当な昼め
られた温度(例えば67〜b な時間、通常は1晩行なう。
ハイブリッド形成後、支持体に非特異的に結合し得るA
NAプローブを除去すべく、一連の緩衝剤により支持体
を洗浄する。典型的には、洗浄の操作が進行するにつれ
て、緩衝剤中の塩の濃度を低下させ洗浄の温度を上昇さ
せた。一連の洗浄の後に、支持体を適当な緩衝液によシ
すすぎ、洗浄用緩衝剤から後で加えられる抗体−酵素抱
合体の活性に悪影響を与えうる試薬を除去した。
D、抗体の検出 ANAプローブ分子中の7ラビノースを検出するために
、多クローン性または単クローン性のいずれかの抗体を
使用することができる。多クローン性抗体は変性された
DNAに対する抗体を産生ずるために用いられるいかな
る好都合な方法によっても産生ずることができる〔例え
ば、8、Cohn及びM、W、Liebermanによ
る「J、Biol(!hem、 J 259.1245
6〜62(1984)) 。同様に、単クローン性抗体
は多数の操作のうちいずれKよっても産生ずることがで
きる(H,G、Gratznθrによる「8cienc
eJ 218,474〜5(1982))。
適当な担体タンパク′X(例えばBAA )に抱合され
ているアラビノヌクレオチドは、抗体産生における免疫
原としても作用することができる。
しかし、ANAプローブ単独(iたは相補的核酸に対し
てハイブリッド形成されたもの)が好ましい。代替的に
は免疫原として作用させるべくプローブを担体タンパク
質に抱合させることもできる。0kabayashiら
は血漿中の1−β−D−アラビノフラノシルシトシン(
ara−C)に対する抗体の産生について報告している
([CancθrResearchJ 37.619〜
624(1977)) oこれらの抗体は、2′位にの
み存在するara−Uとは異なるデオキシシチジンまた
はシチジンとは交差反応しない。このことは、DNA中
のデオキシリボースまたはRNA中のリボースと交差反
応しないANA中のアラビノースに対して適当な特異性
を有する抗体が産生されうることを非常に強く提案する
ものである。
E、抗体−酵素抱合体のv4製 酵素に対する抗体の抱合は周知の方法によシ夾施するこ
とができる。例えば酵素上の7ミノ基と抗体を結合する
ためにグルタルアルデヒドを使用することは、一般的な
方法であるC H。
WallinらKよる[cancer Letters
J 22.163〜170(1984))。この操作手
順を用いて、酵素(例えばパーオキシダーゼ)を18時
間室温においてグルタルアルデヒドと反応させる。ケ゛
ル濾過カラム中の過剰のグルタルアルデヒドを除去した
後に、活性化された酵素を24時間4℃において抗体と
反応させる。抗体−酵素抱合体をその後透析、硫酸アン
モニウム沈殿及びゲル濾過クロマトグラフィーによシ精
製する。例えばJ。
W、 Freytagらによ名「clln、ohem、
 J 30.417〜420(1984)またはO,O
,Leflerらによる「01in、 C!hem、J
30、1809〜1811 (1984)に記載されて
いるような異質二官能架橋剤を使用する抱合操作をも使
用することができる。パーオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリもしくは
酸ホスファターゼまたは他のいかなる有用な酵素をも抗
体(またはその断片)に対して抱合されうシ、次いでA
NAプローブ中のアラビノースの検出のために使用する
ことができると考えられる。
F、ハイブリッドの検出 抗体−酵素抱合体の膜に対する非特異的吸着を減少させ
るための試薬を含む遮断緩衝剤中において、ハイブリッ
ド形成された試料をインキュベートする。典型的には1
%のウシ血清アルブミンを含む緩衝剤を使用する。遮断
緩衝剤による処理後に、抗体が標的核酸に対してノ・イ
ブリッド形成されたプローブの鎖中の各アラビノース部
分を認識してかつそれに結合する機会を与えるような時
間の間、膜を適切な抗体−酵素抱合体とともにインキュ
ベートする。抗体−酵素抱合体は、プローブ中のアラビ
ノースに対して特異的な抗体またはその断片に対して共
有結合した酵素よシなる。
プローブに対して抗体−酵素抱合体が結合した後に、I
的核酸に対してハイブリッド形成したプローブに結合し
た抱合体を含むようになった膜を、一連の緩衝剤で再び
況浄して未結合の抱合体及び非特異的に結合し℃いる抱
合体を支持体より除去する。適当な酵素基質及び/また
はクロモケ゛ンを支持体上の生成物とともにインキュベ
ートし、規定の時間発色現像を進行させた。ハイブリッ
ド形成の程度は、所定時間経過後の発色現像の程度と現
像された全体の発色を測定することにより定量すること
ができる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)アラビノ核酸。 2)構成ヌクレオチドの塩基が、アデニン、グアニン、
    シトシン、チアミン及びウラシルからなる群から選ばれ
    る特許請求の範囲第1項に記載の核酸。 5)a)標的核酸を一重鎖にし; b)その一重鎖にされた核酸を支持体上に固定し; c)前記一重鎖にされた核酸を一重鎖にされたアラビノ
    核酸プローブとハイブリット形 成させ; d)支持体を洗浄してこの支持体上に形成されたハイブ
    リット中に組み込まれていない アラビノ核酸を除去し;次いで e)それを抗アラビノース抗体標識抱合体と接触させか
    つその標識を検出することによ って、支持体上に形成されたハイブリッド 中のアラビノ核酸の存在を決定する段階 からなる核酸配列の同定方法。 4)標識が酵素である特許請求の範囲第3項に記載の方
    法。
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