JPS62503103A - ポリヌクレオドの誘導方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒポリヌクレオチドの誘導法Ｊ 本発明は、一般に誘導ポリヌクレオチドの製法に関する。特に９本発明は合成ポ リヌクレオチドの３°末端の誘導に関する。

官能基を核酸に結合させることによって、核酸の検出および定量を行うことがで きる。ハイブリダイゼーション検定（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ ）においては、標識した核酸プローブ（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ） を用いて、相補的なヌクレオチド配列をもつ標的核酸（ｔａｒｇｅｔ　ｎｕｃｌ ｅｉｃ　ａｃｉｄ）が試料中に存在するか調べる。標的はその後ハイブリダイゼ ーションによって保持体結合した核酸プローブに固定し、「サンドイッチ」を形 成する。このようなサンドインチは、保持体に結合された標識の量として検出可 能である０機能化技法は、核酸をレポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ ）に結合するための反応基を結合させることと、核酸を保持体上の反応基に結合 させることの双方に用いることができる。したがって、核酸を誘導する方法は、 ハイブリダイゼーション検定用の物質の調製に特に有効である。

ハイブリダイゼーション検定に用いるプローブの標識付けの一つの方法は、放射 性同位元素（例えば、ｓｔｐ、２Ｈまたは１１５１）をプローブと結合させるこ とである。しかしながら、放射性標識を検出する二つの通常の手法には、固有の 困難性があるために、この方法の有効性は限定される０通常の検出技法の一つで あるオートラジオグラフィー（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈν）は、写真乳剤 中で銀イオンを還元して銀粒子を形成させる手順であり、これは時間が掛かるも のである。もう一方の通常の検出技法であるシンチレーシッンカウンティング（ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ）は、高価な装置を必要とし且 つ一定の遅延が生じる。さらに。

放射性同位元素は、安全上の理由から特別に取扱う必要がある１２ＳＩ等のいく つかの放射性同位体の貯蔵寿命は比較的に短いので、臨床診断における放射性同 位体の有効性はさらに限定される。

非放射性標識付はシステムにおいては、検出を可能にするために、レポーター基 を用いてプローブの「標識付けｊを行い。

さらにシグナルをレポーター基と会合させて検出を可能にする、レポーターは、 プローブの存在または位置を表示するのに用いる薬剤である。信号そのものは、 直接に感知できるものであり１分離したまたは分離可能なシグナル分子によって 発生することができる。標識は、正確にはシグナル分子を取り込むタイプのレポ ーターである。

標識をプローブに結合する方法の一つが、　Ｗａｒｄ等、欧州特許出ｍＭ　６３ ，８７９号に記載されている。Ｗａｒｄは、ビオチア　（ｂｉｏｔｉｎ）レポー ター分子がプリン（ｐｕｔｉｎｓ）またはピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ） 環に共有結合したプローブの製法を開示している０選択されたビオチンプリンお よびピリミジンは１次に、酵素法によってプローブの核酸のリン酸ジエステルバ ソクポーン（ｐｈｏｓｐｈｏｄ　１ｅｓｔｅｒ　ｂａｃｋｂｏｎｅ）内に直接取 り込まれる。しかしながら、酵素技法は費用が嵩み、操作が難しい。

その他の方法では、タンパク質によって標識をプローブに結合する。−末鎖ポリ オウィルス（ｐｏｌｉｏ　ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡは、ビオチンのＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔ ｅｒ）と反応するタンパク質に自然連鎖させて、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）被覆 した球の特異な結合によって検出可能な、ビオチン塞化したレポーター基を有す るＲＮ＾Ｎａ−ブを得ることが出来る。Ｒｉｃｈａｒｄｓ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）＋　７６：　６７６−６８０　（ １９７９）　、同様に、ビオチン標識したチトクロームＣは、ホルムアルデヒド の存在するもとての反応によってＲＮＡに連結させ、その後にアビジン被覆した 球を標識付けることが出来る。Ｍａｎｎｉｎｇ等、　Ｃｈｒｏｗｌｏｓｏｍａ　 （Ｂｅｒｌ、）、　５３　：　１０７−１１７　（１９７５）、それにもかかわ らず、標識付けを必要とする核酸の全てが自然にタンパク質と結合することはな く、また核酸のチトクローム結合の位置ならびに量は容易に予測できないので、 末端標識付けのための化学合成手法がめられている。

一つの化学合成手法においては、核酸を酸化して３′−アルデヒドに変換し、さ らにアルキルジアミンまたはポリアミンを用いて縮合し、ビオチンの結合を行う レポーター基をつくる。Ｂｒｏｋｅｒ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、　５　：３６３−３８４　（１９７８）　、同様に、核酸の過沃素酸塩酸 化によって得たアルデヒドを用いて、核酸に蛍光標識を結合してもよい。Ｂａｕ ｍａｎ等、Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ。

、ＣｔＯＣｈｅｍ、、２９　：　２２７−２３７　（１９８１）　、しかしなが ら、自動化された核酸合成プロセスにおいて、保持体に結合したポリヌクレオチ ドにレポーター基を結合させる技術が望まれている。

５°標識付けの別の方法においては、ビオチンを２−（ビオチニルアミド）エタ ノールに変換し、さらにリン酸化した重合体保持ヌクレオチドに縮合する。ビオ チンのアミノエタノール誘導体を、リボース環の５°水酸基に縮合すると、ヌク レオチドの保護を取り除けば、安定したリン酸ジエステル結合が得られる。

Ｋｅ＋＊ｐｅ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３　：　４５ −５７　（１９８５）　＊　Ｌ、かじながら、この方法によって特異なレポータ ー基が結合するので、後に種々の望ましいレポーター基を結合するのに用いるこ とが可能な、−ｉ的な反応機能性を存するオリゴヌクレオチドの調製を教示する ものではない。

溶液中のヌクレオチドは、保護された６−アミノ−１−へフサノールリン酸塩を 用いた縮合によってアミン機能化されている、　Ｂａｋｅｒ等、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２２：　７１３５−７１４７（１９７２）　、　シかし、 これらの手順は実施するのが難しく、これまで固相合成には組み込まれていない 。

アフィニティークロマトグラフ４−　（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ｒａｐｈｙ）によるヌクレアーゼの精製を行うための、ヌクレオチドを保持体に 結合する別の方法では、Ｐ−アミノフェノールで３゛−誘導した１個のヌクレオ チドを、リンカ−（ｔｉｎｋｅｒ）によってゲルマトリックスに結合させる。こ のリンカ−は、臭化シアンおよびアジド（ａｚｉｄｅ）を用いて、３，３°ジア ミノジプロビルアミンをマトリックスに結合させることによって形成する。その 結果得られるアミン機能化ゲルを無水コハク酸で処理し、それからカルボジイミ ドを用いてアミン機能化ヌクレオチドに結合する。

Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ、＋　１２：　３０ ５９−３０６５　（１９７８）　ｅ　シｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、’、　２２：　７ １３５−７１４７　（１９７２）を参照のこと。

したがって、固相合成を行うポリヌクレオチドに、レポーター基を一般的に結合 させる方法および組成がめられる。

叉■ したがって９本発明は３゛機能化末端を有する調製された核酸の製法を提供する ものである。この方法の第１過程として。

カルボキシル酸機能化固相保持体を用いるか、あるいはアミン機能化固相保持体 を選定した無水物で処理するか、またはいずれかの末端でカルボキシル成分を含 有する分子と反応させることによって、保持体と無水物残基の間にアミド結合を 形成し。

その上にカルボキシル酸機能を形成する。

本発明の方法の第２過程として、カンプリング削が存在するもとで、第１過程で 得た生成物を９選定したヒドロキシルアミンリンカ−と結合させる。第２過程で 得られる生成物は、２個のアミド結合（ここでアミン機能化ビーズを用いる）お よび遊離ヒドロキシル基を有する重合体保持体である。

本発明の方法の第３過程は、ポリヌクレオチド連鎖すなわち保持体の化学合成で あり、遊離ヒドロキシル基に始まり、さらにリンカ−と核酸の間にリン酸エステ ル結合を行う。

保持体上でポリヌクレオチド合成が完了した後９本方法の第３過程で得た生成物 をアンモニア含有溶液中で処理することによって、３゛第一級アミン機能を有す るポリヌクレオチドを保持体から加水分解する。

ましい　施嘘様の詳細なＵ 本発明による望ましい方法においては１合成時にアミノ基をポリヌクレオチドの ３”末端に結合させる。固相保持体は、多孔性でも非多孔性でもよく、即ち、コ ントロールトポアグラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ）＋シ リカゲル、ポリスチレン、アガロース、またはセファデックス等の重合体保持体 でもよい、最適であるとは言い難いが、ニトロセルロース試験紙（ｎｉｔｒｏｃ ｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｐａｐｅｒ）等の保持体を用いることもできる。カルボキシ ル酸基を用いてもよいが、保持体は望ましくはアミンで機能化させる。

アミン機能化固相保持体は、無水コハク酸または無水ピリミジン（ｐｙｒｉｏ＋ １ｄｉｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）等の無水物で処理する。現在量も望ましい 無水物は、無水フタル酸であるが、その理由は、加水分解による除去が容易であ り、またそれが形成するアミド結合が対称性であるからである。

無水物の使用は便利ではあるが、２つの末端カルボキシル酸成分を有するいかな る分子を用いることもでき、これらの基をＰ−二トロフェノールおよびジシクロ へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮＨ３を用いて活性化させ、さらにそ の結果得られた分子を固相保持体に縮合することができる。

縮合反応剤中にある化合物のうちでリンカ−として使用するのに適したものは、 末端アミノ基および末端水酸化物基を有する直鎖アミノアルコールを含む１−ヒ ドロキシルアミンである。

この過程においては、鎖中の炭素原子は１０個を超えず、１個から６個の範囲で あることが望ましい、このようなアミノアルコールとしては、メタノールアミン 、エタノールアミン、プロパツールアミン、ブタノールアミン、ペンタノールア ミン、ヘクサノールアミン、ヘプタツールアミン、オクタツールアミン。

ノナノールアミンおよびデカノールアミンがある。しかし、原理的には、ポリヌ クレオチドとの結合と、カルボキシル機能化保持体との結合とを、それぞれ形成 するのに用いることができるヒドロキシルならびにアミン基を有する分子であれ ば、どれでも用いることが出来る。たとえば、カルボキシル機能の還元の後にポ リリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）鎖を用いることも出来るが、その際の条件は 、保持体に結合するアミン基だけが露出しており、残りのものは全て適切なブロ ック基によって保護されていることである。同様に、リンカ−分子と保持体の間 のアミド結合の形成と競合するかまたは妨害するその他の反応基をブロックする ことが望ましい。

本発明にしたがって使用することのできるポリヌクレオチド生成のための化学合 成法としては、トリエステル合成、リン酸トリエステル法、テトラゾライド（ｔ ｅｔｒａｚｏｌｉｄｅ）誘導体およびヌクレオシドリン酸塩を用いる固相合成法 、ならびに１９８４年３月１４日に公開された英国特許出願ＧＢ　２，１２５． ７９８号およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ等９合衆国特許第４，４１５，７３２号に記 載されたホスホラミダイト法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＋ｎ１ｄｉｔｅ　ｍｅｔｈｏ ｄ）がある。

アンモニア溶液を用いて保持体結合した核酸配列を処理すると、先に生成したア ミド結合の加水分解が起こり、それによって、その３′末端に遊離第一級アミン 機能を持つアルキル鎖を有する生成オリゴヌクレオチドが、溶液中に遊離放出さ れる。オリゴヌクレオチドが一旦溶液から回収されると、遊離アミン機能は容易 にレポーター基の結合を行うことができる・３”第一級アミン機能化オリゴヌク レオチドの合成過程について述べた下記の実施例を参照して１本発明の方法を詳 細に説明する。

叉友五上 ５０ミクロモルのアミノ基を含むアミン機能を有するコントロールトポアグラス （ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ｌ １ｌｉｎｏｉｓから入手できる）　５００　ｍｇを、無水ピリジン２Ｉ１１１と ４−ジメチルアミノピリジン６１　ｓｌｇが存在するもとで、無水フタル酸。

無水コハク酸あるいは無水ピリジンのいずれか２５０　Ｉｌｌｇ（１モル）と、 室温で３０分間反応させた。その結果得られた重合体を、塩化メチレン、エチル アルコール、およびエーテルですすぎ、乾燥させた。

次に、それぞれの重合体（４５０ｍｇすなわち４５ミリモル）を。

溶液中で、塩化メチレン　１．５　ｍｌｌとジシクロへキシルカルボジイミド（ ＤＣＣ）　３３０　ｔａｇと、室温で３０分間反応させた。ビーズよりも上の溶 液は傾瀉を行い、塩化メチレン２ＩＩ１１中の６−アミノ−１−ヘキサノール（ １１７＋ＩＩｇ／１モル）の溶液で置換し、室温で約８時間放置した。同様の処 理によって、各々の活性重合体の別の４５０　＋ｗｇを溶液に入れ、傾瀉の後に 、そのビーズを同等の条件下において、塩化メチレン２１１１中の１モルヘキサ ノールアミン溶液と反応させた。

このようにして溶液から得られた６つのヒドロキシ機能化エステルは下記の通り である。

（３）　ＣＰＧ−Ｎｉｌ−Ｃｏ−ＣＨｔ−Ｃ）Ｉｔ−Ｃｏ−ＮＨ−ＣＨｇ−ＣＨ ｚ−ＯＨ（４）　ＣＰＧ−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨｇ−ＣＨｚ−Ｃｏ−ＮＨ−（Ｃ１ｈ ）ｉ−ＯＨＣＯ−ＮＨ−（ＣＨり＆−ＯＨ 各ヒドロキシメチルエステルは、オリゴヌクレオチドを合成する保持体として用 いることが出来るが、　１．２．３および５の保持体だけを前述の用途に選択し た。オリゴヌクレオチド連鎖伸長のホスホラミダイト法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 合衆国特許４，４１５．７３２１号を参照のこと）を用いて、ジメトキシトリチ ル基によって３゛末端をブロックされたデオキシチミジン鎖を、保持体の活性ヒ ドロキシ基によって各保持体上に合成した。これらの手順によって１３個のチミ ジンをポリヌクレオチドに取り入れた時点で、保持体とのアミド結合を加水分解 し、３゛遊離第一級アミン基を有する遊離オリゴヌクレオチドを放出した。その 結果、１グラム当たり３７〜４０μモルのジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基を 含有する各々の保持された連鎖４０ｍｇを、室温において濃縮Ｎ）１．０Ｈ（４ ０Ｈｇ当たり２　ｍｊりによって処理した。その後に各溶液１００μｌを取って 乾燥させた。この処置によるペプチド結合加水分解率を調べるために、乾燥した 物質に０．１　Ｍ　Ｐ−トルエンスルホン酸を添加し、４９８ｎＩｌの分光測光 によってＤＭＴｒ基を定量した。

室温において、各溶液中のアミド結合の加水分解（すなわち、溶液中へのＤＭＴ ｒ−ＤＮＡの放出）を測定した。その結果を下記の第１表に示す。

星上表 片開　叉」蛇湯査　皿没れｔ［ｘ １８時間　１／フタル酸アミド結合　５７　％１８時間　２／フタル酸アミド結 合　５７　％１８時間　３／コハク酸アミド結合　２３　％１８　時間５　／ピ リジンアミド結合　６３　５４２時間　１／フタル酸アミド結合　９２　５４２ 時間　２／フタル酸アミド結合　９２　５４２時間　３／コハク酸アミド結合　 ５３　％４２時ｒａｌ　５／ピリジンアミド結合　１００　％この結果によると 、３゛機能化オリゴヌクレオチドが溶液中に最大限に放出されるのは１本発明の 方法に用いる無水物が、保持体中に対称アミド結合を生じる場合であることがわ かる。

下記の実施例において３本発明の方法の効率を調べる。

大笈拠１ 誘導された固相保持体上の合成によるオリゴデオキシヌクレオチドの３゛機能化 の効率を試験するために、下記の配列（７）　５’ＨＯ−ＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣ ＴＡＡＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＣを有するデオキシオリゴヌクレオ チドを、各々の保持体（８）および（９）　４０　ｍｇ（約２μモル）上に化学 的に合成した。

化学合成は、縮合反応に、５°−ジメトキシトリチル−３°メトキシ、　ＮＮ’ −ジメチルアミノホスホラミダイトを用いた固相亜リン酸塩法（Ｃａｒｕｔｈｅ ｒｓ等１合衆国特許４，４１５．７３２号）によって実施した。固体保持体（８ ）上の最初の合成サイクルでは、５゛−ジメトキシトリチル−デオキシシチジル −３゛−メトキシ−ＮＮ’−ジメチルアミノホスホラミダイトを使用した。それ 以降については、２つの保持体上の合成サイクルは同じである。最終サイクルの 後に、ジメトキシトリチル基はＤＮＡから除去され、さらに２個のオリゴデオキ シヌクレオチドは保持体から外され１合成サイクルのその部分からは２個の保持 体が確認された。最終サイクルの後に、ジメトキシトリチル基はＤＮＡから取り 出し、さらに３０℃で１８時間の間、１５Ｍ　ＮＨ４ＯＨ２ｍ　ＩＩを用いて、 ２つのオリゴデオキシヌクレオチドを保持体から取り出し、その後に保護を取り 除いた（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ等、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　５ａｃ１１０３ ＋　３１８５−３１９１　（１９８１））。

オリゴデオキシヌクレオチドは、変性条件（７Ｍ尿素）のもとで、１２％のポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。各レーンの最低速度泳動バンド （全紫外線吸収物質の９０％以上に相当する）をゲルから切断した。２つの第１ ノゴデオキシヌクレオチドをゲルから抽出し、　１０　ｍＭの）　ＩＪエチルア ンモニウム重炭酸塩、　ｐＨ７，０，を用いて、１０Ｉ１１１セフアデンクスＧ ５０／４０（シグマ）カラムで脱塩した。オリゴデオキシヌクレオチドは分光測 光による定量をおこない、凍結乾燥させた。分析ポリアクリルアミドゲル電気泳 動によって生成物を分析したところ、この生成物は均質であり、また保持体（８ ）から得たデオキシオリゴヌクレオチドは、保持体（９）から得たデオキシ第１ ノゴヌクレオチドよりも、かなりゆっくりした移動度で泳動することがわかった 。保持体（８）から得たデオキシオリゴヌクレオチドの式は、下記のように確定 した。

さらに保持体（９）から得たデオキシオリゴヌクレオチド番よ、同じデオキシヌ クレオチド配列であるが、最初のデオキシヌクレオチドの３′−末尾が欠けてい た。

精製過程後に回収した生成物の収量は下記のとおりであった。

第■表 デオキシヌクレオチド 組成 ε２６０／　ε２８０ 肚夏通　去皿孤 ３゛−機能化デオキシ　Ａ、。Ｃ＋＋ＧｚＴｅ　１．８５　１．８４ヌクレオチ ド ３°−ｏｆｔデオキシ　＾１゜Ｃ＋＋ＧｔＴｓ　１−８５　１．８２オリゴヌク レオチド 下記の実施例では、３゛−フルオレジイン標識オリゴヌクレオチドを調製する。

実施例３ ３゛−アミンオリゴデオキシヌクレオチドを、実施例１の手順に従って調製した 。別のオリゴデオキシヌクレオチドを調製した。これは最初とものと同じではあ るが、３２Ｐ標識をも組み込んであり、また１５４０　ｃｐｍ／ｆｍの比放射能 を有した。　１００　ｍＭ　炭酸ナトリウム緩衝液１７μｌ中の５ｚｐ−標識オ リゴデオキシヌクレオチド２．９５　ｎモルに、　ＤＭＳＯ中の２５　ｄフルオ レジインイソチオシアン酸塩（ライスコンシン州ミルウオーキーのＡｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｅ＋ｌｌ１ｃａｌ　Ｃｏ、＋０７μモルを加えた。この溶液を攪拌した 後、３７℃で１時間インキュベートした。さらに炭酸塩緩衝液１７μｌと、フル オレジインイソチオシアン酸塩溶液１７μｌを加えた。３７℃で２時間開いた後 に、オリゴデオキシヌクレオチドをエタノール沈澱させ、６Ｍ尿素、１５％ポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。

生成物はオートラジオグラフィーによって同定し、適切なバンドを分離し、さら に溶出剤としてｌＯＩＩＩＭトリエチルアンニモウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ）を用 いて、セファデックスＧ５０１５０カラムによって溶離、ゲルろ過を行った。生 成物を分離したところ。

３０％収量（０，７５ｐモル）であった。

分析ポリアクリルア之ドゲル電気泳動ならびにオートラジオグラフィーによって 生成物を分析した結果、生成物は均質であり、また開始物質よりも特有のゆっく りとした移動度で泳動することが分かった。

生成物の紫外線分光分析の結果、この生成物は下記に示すように、フルオレジイ ン機能化デオキシオリゴヌクレオシドの正しい分光特性を有することがわかった 。

Ａ　、−２６，３６Ｘ１０’ Ａ””　＝　０．２０ ｎｔ＆０／ＡＸ＠０＝　１．８６ Ａ、（フルオレジイン）　−７，５Ｘ１０’Ａ”’　＝０．０６ 下記の実施例では、３°−ビオチン標識付きオリゴデオキシヌクレオチドを調製 した。

実施例４ 標識付けしていない３”アミン核酸２００ピコモル、およびｐＨ８，３の１００ 　ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝８４０８モルに、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシ ニミドエステル溶液ＣＤ？ＩＳＯ中で１０　＋ｎｇ／ｍｊ！）４０ｐモルを加え た。この溶液を攪拌し、２５℃で３０分間インキュベートした。さらに重炭酸塩 緩衝液４０μＥ、およびビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル溶液４ ０μｌを添加した。

３０分後に、生成物をエタノール沈澱させ、６モル尿素−２０％ポリアクリルア ミドゲルによる電気泳動によって精製した。適切なバンドをオートラジオグラフ ィーで同定し１分離し、ゲル溶離し、さらにセファデックスＧ５０１５０カラム においてゲルろ過を行った。生成物は、放射性標識で分析したところ、４０％収 量で分離され、　２０％分析ポリアクリルアミドゲル上において均質であった。

下記の実施例では、ニトロセルロースフィルターに結合した相補的標的ＤＮＡへ の３°変更したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実証する。

災宛匠１ ３′の位置の核酸を変更させる影響を調べ、また１例えばビオチンあるいはフル オレジインを用いてさらに機能化を行うことの影響を調べるために　２１ｐ−標 識付けした３°アミンポリヌクレオチド（上記のように合成を行った）を、ニト ロセルロースに結合させた相補的標的ＤＮＡにハイブソリド化させた。次にこれ らのハイブリダイゼーション錯体を、洗浄条件を次第に厳しい条件に変えて洗浄 し２本発明による３”変更が、これらの核酸配列のハイブリダイゼーションに利 用出来る程度に及ぼす影響を調べた。

具体的には、プラスミドｐＨｃ１８ｓａｃ−１２０ｐｇを、制限酵素Ｈｉｎｄｌ ｌｌを用いて消化し、線形化した。線形化プラスミドＤＮＡ１μｇを含有する部 分標本（２μｊりを、ニトロセルロースフィルター上にスポットした。このニト ロセルロースフィルターを、３ＭＭのワットマンろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　ｐａｐ ｅｒ）上で飽和した０、５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣｌに浸して、このＤ ＮＡを変性させた。次に。

１．５　Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍのトリス、　ｐＨ８，０，で会包和した３ＭＭ のワンドマンろ紙にこの物質を暴露して中和し、さらに２　Ｘ　５ＳＰＥで飽和 した３■のワットマンろ祇に移した。

その後、ニトロセルロースを３０分間風乾し、８０℃で２時間ベーキングした。

　５　Ｘ　５ＳＰＥならびに各々０．２％のウシ血清アルブミン＋　Ｆｉｃｏｌ ｌおよびポリビニルとロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ　ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ） 中で、　５０℃で３時間ブレハイブリダイゼーションをおこなった。ハイブリダ イゼーションは　３ｆｆｉｐ−ポリヌクレオチドプローブ１ピコモル、変性ヒト 胎盤ＯＮへ２００”ｇ、および各々０．２％のウシ血清アルブミン、　Ｆｉｃｏ ｌｌおよびポリビニルピロリドン。

さらに０．２％の５ｔ）Ｓを含有する５ＸＳＳＰＥ溶液２．ｅ中において、５０ ℃で１５分間ニトロセルロースをインキュベートすることによって達成した０次 に、ニトロセルロースを、第■表に示すように種々の温度において、６　Ｘ　Ｓ ＳＣ中で５分間にわたって３回洗浄した。フィルターに残った放射能を、液体シ ンチレーションカウンティングによって測定した。５０％のハイブリダイゼーシ ョンプローブが保持された温度が、その核酸の溶解温度であると判断した。

ｚ１表 ３゛フルオレジイン標°核 温度ユニ）　ハイブリダイゼーション（％）３゛アミン核酸 温度（℃）　・ハイブリダイゼーション（％）下記の核酸の理論溶解温度Ｔ＋ａ は７８％である。Ｓｕｇｇｓ等１匣１ｏ　ｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏ　Ｕｓｉｎ 　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ、　Ｂｒｏｗｎ等、（編集）。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　６８３−６９３頁（１ ９８１）。

裏」１表 ３”フルオレジイン標識ヌクレオチド　７２　℃３゛アミン核酸　６７　℃ 第■表および第■表を比較すれば、核酸の３゛変更は、ハイブリダイゼーション Ｔ１１にほとんど影響しないことが容易にわかる前述の説明を考慮すれば、当業 者には発明の様々な変更が可能であろう０例えば、ヒドロキシルアミンとして、 還元カルボキシル基をもつポリリシンを使用することによって、多重レポーター 基（すなわち、ポリリシン成分の複数個のアミン基における）をポリヌクレオチ ドに結合することができる。したがって、添付した請求の範囲に示す限定のみを 本発明に付すべきである。

国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．機能化ポリヌクレオチドの調製法で，保持体結合したカルボキシル基および ヒドロキシルアミンリンカー分子のアミノ基をアミド結合し，ヒドロキシルアミ ンリンカー分子のヒドロキシル基において，ポリヌクレオチドの合成を開始し， アミンと保持体結合したカルボキシル基の間のアミド結合を加水分解し． リンカー分子によってアミン基に結合したポリヌクレオチドを回収する 過程から成るもの。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記ポリヌクレオチド配列が，デオキシ リボ核酸配列であるもの。
3. ３．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記ポリヌクレオチド配列が，リボ核酸 配列であるもの。
4. ４．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記ヒドロキシルァミンが，１個から１ ０個の炭素原子を含有するもの。
5. ５．請求の範囲第４項に記載の方法で，前記ヒドロキシルアミンが，メタノール アミン，エタノールアミン，プロパノールアミン，ブタノールアミン，ベンタノ ールアミン，ヘクサノールアミン，ヘプタノールアミン，オクタノールアミン， ノナノールアミンおよびデカノールアミンから成るグループから選定されるもの 。