JPH02502284A

JPH02502284A - オリゴヌクレオチド末端置換用非ヌクレオチド試薬

Info

Publication number: JPH02502284A
Application number: JP63508671A
Authority: JP
Inventors: アーノルド、ライル・ジョン; バット、ラム・サループ
Original assignee: エム・エル・テクノロジー・ベンチャーズ・エル・ピー
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 1990-07-26
Also published as: EP0310312A3; PT88643A; AU2608388A; DK267789D0; PT88643B; FI892691A; FI892691A0; EP0310312A2; DK267789A; KR890701767A; WO1989002933A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド末端置換用非ヌクレオチド試薬発明の分野この発明は、５°ヒドロキシ置換ヌクレオチドの製造に遺しにタイプの試薬に関するものであり、この置換基は、次に好都合には標準面相ヌクレオチド多量体合成におけるヌクレオチド環外アミンの脱保護に使用されている条件と同じアルカリ条件下で脱保護されて連結基を脱離し、次いで有用な部分、例えば標識または挿入剤と結合され得る。

技術概観臨床研究および診断において、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列（「標的ヌクレオチド」または単に「標的配列」と称する）の存在を測定する既知技術は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの実施である。このアッセイでは、標的配列の多量体プローブ（代表的にはオリゴヌクレオチド）が選択される。代表的な場合、プローブは標識され、すなわち、存在が容易に検出できるような原子または基が結合している。標識したプローブをハイブリダイゼーション条件下に標的ヌクレオチド配列を含む疑のある試料に暴露すると、標的はこのような標識プローブとハイブリッド形成する。試料中の標的配列の存在は、通常ハイブリッド形成および非ハイブリッド形成プローブを分離し、次いでプローブハイブリッド中の標識の存在を測定するか、または非ハイブリッド形成プローブ中の標識量を測定してハイブリッド形成した標識プローブの量を測定することにより、定性的または定量的に測定することができる。

既知標識技術としては、放射性標識、例えばＩ！Ｊまたは１Ｐをプローブにとり込ませる方法がある。しかしながら、放射性標識されたプローブの使用は、プローブの不安定さおよび放射性同位元素の取り扱いに伴う通常の危険を含めである種の障害を伴う。これらの障害を克服する努力が為される中で、さらに最近では、非放射性標識、例えばビオチン、ハブテンまたは蛍光団によるプローブの標識が為され１；。これらの非放射性標識の利用は、既に免疫診断領域において広範に適用されている。まｒ＝　Ｄ　Ｎ　ＡプΩ−ブの検出における非放射性標識の使用は、既に文献において報告されている。検出プロトコルの例としては、酵素抗体コンジュゲート（ハプテン標識の認識）または酵素アビジンコンジュゲート（ビオチン標識を認識）の使用がある。

合成ヌクレオチド多量体プローブに非放射性標識を結合するために開発された初期の方法には、プローブの合成および／または精製後の化学的修飾（「後修飾」）が含まれる。例えば、Ｒ，Ｃ，ビシジ等（ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー、１９８６．２３、ｊｌｌ−３１７頁）は、重亜硫酸触媒アミノ基転移反応を用いてラムダ・ファージＤＮＡのシトシン残基のＣ−６位に１．２−ジアミノエタンを結合させた。アミノ基転移しｔ：　Ｄ　Ｎ　Ａとビオチニル−ｅ−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により、ニトロセルロース上で相補的ＤＮＡとハイブリッド形成し、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体の使用により検出され得るビオチニル化ＤＮＡが生成されｋｃこの方法により合成りＮＡオリゴヌクレ芽チドの標識を試みた結果、そのＲＮＡハイブリッド形成に伴う融点の劇的な低下が観察された。

すなわち、シトシンにおける標識の結合は、ハイブリダイゼーションに伴う通常の塩基対形成を妨害すると思われるため、短い合成オリゴヌクレオチドの場合１こおいては適当な方法ではあり得ない。

別の後修飾方法には、ＤＮＡをランダムに標識するビオチンの光活性化可能な類似体の使用がある（Ａ、Ｃ，フォースター等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、１９８５．１３．７４５−７６１頁）。この方法もまた、塩基対形成を妨害し、その結果、標的オリゴヌクレオ、チドにより形成されたハイブリッドを不安定にするため、合成オリゴヌクレオチドの標識に特に適したものではない。

さらに別の後修飾方法では、様々なヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートが、酵素手段により短いＤＮＡプローブ中にとり込まれ得るアミン終止リンカ−により製造、された。アミンリンカ−は、アデニンのＮ６位（Ｌ、フレボン、ＰＣＴ出願第Ｗｏｓ６１０２９２９号、１９８６年５月２２日公開）、シトシンのＣＳ位（Ｄ、ワード等、ヨーロッパ特許公開番号００６３８７９．１９８２年３月ＩＩ日公開）が置換されている。一方法では、Ｃ５−修飾ｄＴｊＴＰのビオチニル化形態を、酵素ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型として相補的オリゴヌクレオチドによりオリゴヌクレオチドプライマーの３゛−末端に結合させた（Ａ、ムラスギおよびＲ，Ｂ。

ウォレイス、ＤＮＡ、１９８４．３．２６９−２７７頁、Ｐ、Ｒ，ランガー、Ａ、Ａ、ワルドロップおよびり、Ｃ，ワード、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ、１９８１゜７８．６６３３−６６３７頁）。別の方法では、酵素終止デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いてこれらのリンカ−修飾トリホスフェートをオリゴヌクレオチドの３°−末端に付加する方法が採られている（例えば、Ｌ、リレイ等、ＤＮＡ、５巻、３３３頁、１９８６参照）。これらの方法に対する障害としては、必要とされる精製段階の数、前精製オリゴヌクレオチドによる処理に固有のスケール・アップに対する制限、およびハイブリダイゼーション条件下、追加または修飾ヌクレオチド残基に伴う不適当な対形成または非対形成の可能性が含まれる。

別の後修飾方法では、カルボニルジイミダゾールを用いて５゛−ホスホリル化オリゴヌクレオチドの５“−末端にアミンリンカ−を結合させた（Ｂ、チュー、Ｇ、クールおよびり、Ｅ、オーゲル、ヌクレイツク・アシ゛ツズ・リサーチ、１９８３．１１，６５１３−６５２９頁）。この方法を用いて、非放射性検出フォーマットで使用されるビオチンを結合させ７：（Ｂ、チューおよびり、Ｅ、オーゲル、ＤＮＡ。

１９８５．４．３２７−３３１頁、Ａ、コレットおよびＥ、Ｈ，カワシマ、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８５．１３．１５２９−１５４１頁）。５゛−末端における標識の結合は、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブの妨害を総じて減少させるという利点を有する。しかしながら、さらにこの方法は、リンカ−結合に必要とされる段階の数、すなわち、酵素的ホスホリル基導入、イミダゾールとの反応、ｌ、２−ジアミノエタンまたは１．６−ジアミツヘキサンとの反応およびカラム精製段階といった煩わしさを伴う。

ざら？こ直接的な標識方法は、自動的固相ヌクレオチド多量体合成における一段階としての、アミンリンカ−結合の組み込みである。

文献に記載された幾つかの方法の中で、制限事項をもたないものは無い。バハター等（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８６．１４．７９８５−７９９５頁）は、カルボニルジイミダゾールを用いることにより、段階的自動合成の最後に合成オリゴヌクレオチドの５°−ヒドロキシルのアミノアルキル化を達成させた。オリゴヌクレオチドはさらにポリマー支持体に結合され１こ。この方法は精製を簡易化するという利点を有するが、反応条件は、最終段階を手で行うことを必要とした。ケンプ等（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８５、！３．４５−５７頁）は、縮合剤の存在下、固体支持体に結合された５°−ホスホリル化合成オリゴヌクレオチドに２−（ビオチニルアミド）エタノールを結合させに０幾分面倒なことに加えて、この方法は、結合した標識か脱保護および固体支持体からの脱離条件下で存続することを必要とする。すなわち、それは、化学的に敏感な標識の結合には適し得ない。

スミス等の方法（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８５．１３．２３９９−２４１２頁）は、５°−保護−５°−アミノ−５°−デオキシチミジン−３ °−０−ホスファ−アミダイトが最後の標準カップリング反応において結合される点で自動的オリゴヌクレオチド合成にさら７こ直接的に適用され得る。脱保護および固体支持体からの脱離中に遊離アミノ基が生成され、次いで様々な標識の結合に利用され得る。プローブおよび標的配列間の相補的関係を保つためにヌクレオチド骨格（すなわち、チミジン）を使用する１こめ、スミス等により記載されたタイプに属する８種の異なるリンカ−のいずれかを製造しなければならない。他方、場合によって°は、追加チミジン残基は、ミスハイブリダイゼーションにより標的配列に対する特異性の喪失を誘発し得る。

標準自動的合成工程中に一次アミン修飾ジゴヌクレオチドの挿入に使用され得る化合物が提案された。、これらの化合物には、デオキシチミジン、デオキシアデニンおよびデオキシグアニンの類似体が含まれる（Ｇ、Ｂ、ドライヤー等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ、８２巻、９６８頁、１９８５、Ｊ、Ｌ、ルス、ＰＣＴ出願第ＷＯ３４１０３２８５号、１９８５年８月３０日公開）。しかしながら、これらの方法は、スミス等の方法と同じ制限を被る。

アグラワル等（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８６．１４．６２２７ −６２４５頁）は、最近、自動的固相ＤＮＡ合成に適用可能な標識結合方法を２種類報告した。第一の方法では、最終カップリング段階としてウリジン−２°、３°−保＠−５′−ホスファ−アミダイトまたは５゛−ホスファイトをオリゴヌクレオチドの５゜−末端に付加する。続いて２°−および３′−ヒドロキシルを脱保護し、ベリオダートを用いてジアルデヒドに酸化する。次いで、ビオチンヒドラジドを縮合し、水素化はう業物による処理後に環状リンケージを形成させる。この方法は、幾つかの後修飾段階が必要という不利点を有する。第二の方法では、エタノールアミンのＮ−保護−〇−ホスファーアミダイト誘導体を自動、的合成中の最終カップリング・サイクルにおいて加える。Ｎ−保護は、０−フルオレニルメトキシカルボニル基により達成される。

定義以下、この明細書（請求の範囲を含む）において使用されている語の定義を行う。

ヌクレオチド：　燐酸基、５炭素糖および富素含有塩基から成る核酸のサブユニット。５炭素糖は、ＲＮＡではリボースであり、ＤＮＡでは２−デオキシリボースである。この語はま１こそれらのサブユニットの類似体を包含する。

ヌクレオチド多量体：　ホスホジエステル結合により連結されたヌクレオチドまたはその類縁体の鎖。

オリゴヌクレオチド：　一般に長さ約ｌθ〜約１００ヌクレオチドであるが、長さ１００ヌクレオチドを越える場合もあり得るヌクレオチド多量体。それらは通常ヌクレオチド単量体から合成されると考えられているが、酵素的手段によっても製造され得る。

ポリヌクレオチド：　一般に長さ約１００ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチド多量体。これらは通常生物に由来するか、ま几は酵素的手段により得られる。

ヌクレオチド多量体プローブ：　第２ヌクレオチド多量体、通常ポリヌクレオチド内に含まれる標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド多量体。通常、標的配列中の対応する塩基と完全に相補的なプローブが選択される。しかしながら、プローブ中の１個またはそれ以上のヌクレオチドが標的配列中の対応する塩基に相補的ではないか、または合成起源の様々な部分がプローブ内のヌクレオチドを置換しているか、またはプローブの塩基間に挿入されている方が適当またはさらに望ましい場合もあり得る。代表的には、プローブは標識される。

オリゴヌクレオチドプローブ：　　１００ヌクレオチド未満であるが、２００ヌクレオチドを越えることもあり得る合成または酵素的起源のプローブ。

ハイブリダイゼーション：　相補的塩基間のワトソンークリック塩基対形成法により２つのヌクレオチド多量体間に形成された複合体である「ハイブリッド」の形成。

＾服旦！豊次に、この発明は、５°ヒドロキシ置換ヌクレオチドの製造に適した試薬を提供する。前述のヌクレオチドは、通常生物性または合成ヌクレオチド多量体、代表的には後者における最後のヌクレオチドである。標準ヌクレオチド多量体固相合成法を用いて所望の配列を合成した後、最後のヌクレオチドの５°ヒドロキシは脱保護され、次いで前記試薬の適当なカップリング基と反応することにより、置換ヌクレオチド多量体を生じ得る。試薬の連結部分がアシル官能基により保護される結果、前述のカップリング工程中試薬のポリマー化は阻害される。続いて連結部分は、環外アミンの脱保護に一般に使用されるのと同じ非不適アルカリ条件下で脱保護され、次いでヌクレオチド多量体の固相合成が行なわれ得る。すなわち、標準ヌクレオチド固相合成で使用される段階にさらに追加段階を加える必要も無く、アシル保護連結部分および環外アミンの脱保護は同時に達成され得る。

その結果、生成されに置換ヌクレオチド多量体は、有用な部分、例えば非同位体標識に連結され得る５°「リンキング・アーム」を有する。

従って、この発明は、その広い態様において、５゛ヒドロキシ置換ヌクレオチド（また、代表的には、ヌクレオチド多量体の末端ヌクレオチド）の製造に適した試薬であって、式％式％（Ｘ　１　＝硫黄の場合、ｎ＝１Ｘ１＝アミノ基の場合、ｎ＝１または２ｍ＝１，２または３）を有する試薬を提供する。前述の式において、Ｙは非ヌクレオチドに基づくカップリング基であり、Ｒ１は非ヌクレオチド骨格であり、Ｘｌは硫黄またはアミノ基（アミノＮがＲ１および保護基のカルボニル炭素に結合されている置換アミノ基を含む）から選ばれる保護記条件下で）開裂されることにより、連結基Ｈ−Ｘ　１−を脱離し得る。成分が「非ヌクレオチド」であるということは、その成分の構造が、「ハイブリダイゼーションに顕著には関与しなし弓構造であることを指し、例えば前記構造は、ヌクレオチドとの重要な水素結合に関与してはならず、構成成分として５ヌクレオチド塩基またはその類似体の一つを有する構造は除外される。Ｙとしては、非不適カップリング条件下、ヌクレオチドの５゛ヒドロキシにＲ１をカップリングさせ得るものが選ばれる。「非不適」条件という語は、ポリマー・バックボーンおよびその糖、塩基、リンカ−・アームまたは他の成分、またはモノマー試薬に実質的には不適当な影響を及ぼさない条件であることを意味する。

さらに上式において、ｍは、通常の炭素の４価を満たすＲ２の適当な数を表す。

各Ｒ２は環状基の一部であり得る。また各Ｒ２は同一であり得るか、またはそれらは異なり得、Ｘｌがカップリング条件下では実質的に脱保護されない（そしてすなわち、その結果、試薬のポリマー化が阻害される）が、非不適アルカリ条件下で脱保護されることにより、非不適条件下でＸｌを何等かの有用な部分に結合させ得るようにアシル基のアルファ炭素が電気陰性を有するように各Ｒ２を選択することは重要であると考えられる。この点で、Ｒ２ｍの電気陰性度の一尺度は、ハメット方程式（この方程式の使用の概説および置換基パラメーター表については、Ｊ、コノリー・マーチン、「クオンティテイティブ・ドラッグ・デザイン、ア・クリティカル・イントロダクション」、マーセル・デツカ−、インコーホレイテッド、ニューヨーク、１９７８参照）ｌｏｇ　（ｋ／　ｋｏ）　−Ｐ　ｃｙ　ｐにより与えられる。この式は、前述した通り、水溶液中でパラ置換された安息香酸のイオン化について定義され得る。ただし、ｋ　＝パラ置換された安息香酸のイオン化の平衡定数。

ｋｏ　＝安息香酸のイオン化の平衡定数。

Ｐ＝２５℃における水中での安息香酸のイオン化についてｌ。

００として定義された定数。

σｐ＝特定バラ置換基に関する実験測定値。

σｐの陽性値は、特定置換基の電子撤回ポテンシャルを表す。

この発明の好ましい態様において、各Ｒ２はＦであり（すなわち、保護基はトリフルオロアセチルである）、σｐ（Ｐ−）は０１１５であり、σｐ（ＣＦｓ　　）＝０．５４である。すなわち、他の適当なＲ２ｆｆ１Ｃ−基には、Ｃ１，Ｃ− （σｐ＝０．３３）、Ｎ　　Ｇ（σｐ＝０．６６）、ＣＦｓＣＦｔ　　（σｐ＝０．５２）、ＣＨｓＣ（σｐ＝０．５０）、ＣＨ３０−Ｃ−（σｐ＝０．４５）が含まれ得、またはＸ１＝Ｎおよびｎ＝２の場合は、また環状Ｎ基を形成する基が含まれ得ることが予測される。

また、蛋白質修飾に関する技術分野において常用されるアミノ保護基の幾つかは、この発明における適当なアミノ保護基として有用であると予測され得る。（蛋白質アミノ保護基の概要については、「ザ・ベプタイズ、３巻、プロテクション・才ブ・ファンクショナル・グループス・イン・ペブタイド・シンセシス」（Ｅ、グ巳スおよびＪ。

マインホファー編、アカデミツク・プレス、１９８１）参照）。これらはトリフルオロアセチル、フタロイルおよびマレオイルを含み得る。

次に、好ましくはＸ　ｌ　＝Ｎであり、少なくとも１個および好ましくは各Ｒ２はハロゲン（最も好ましくは各Ｒ２はふっ素である）から選ばれる。代表的には、Ｒ１はアルキルであり、望ましくは１〜１０個の炭素原子を有する非環状炭化水素鎖である。

一〇−Ｐ−Ｒ”　　および　　−〇−Ｐ−Ｘ’Ｒ′ を有する基から選択される。上式において、Ｘ″＝＝ハロゲンましくはＣＩ）または置換アミノ（好ましくはジアルキルアミ人または複素環Ｎ−アミン）、ｘ３＝ハロゲン（好ましくはＣＩ）、アミノ（好ましくは複素環Ｎ−アミノ）、または０−１Ｒ３＝アルキル、好ましくはメトキシ、エトキシ、クロロフェノキシまたはベータシアノエトキシから選ばれるアルコキシ、またはアリールオキシ、Ｒ’＝アルキル、好ましくはメトキシ、エトキシまたはベーターシアノエトキシから選ばれるアルコキシ、またはＸ３＝−〇−の場合のみＨｏまた５゛ヒドロキシ位に連結部分を有するヌクレオチド多量体の製造方法が開示されている。この方法は前記タイプの試薬を用いて非不適条件下で行なわれる。

概ね、この方法では、まずヌクレオチド多量体における末端ヌクレオチドの５゛ヒドロキシに°Ｙを介して（すなわち、Ｙは連結基として機能し、Ｙの全部まには一部は実際のカップリング後に残存している場合もしていない場合もあり得る）Ｒ１を連結させる。次いで、この生成物を非不適アルカリ条件に暴露することにより、任意の連結部分および保護環外アミンおよびホスフェートがあればそれらも全て同時に脱保護する。

図面図面を用いてこの発明の実施態様の記載を行う。

第１図は、この発明の試薬の合成を示す。

第２図は、この発明の置換ヌクレオチド多量体の合成を示す。

第３図は、第２図に示された方法により製造された置換ヌクレオチド多量体の標識方法であり、ビオチン標識を前記多量体のアミン連結部分に連結させる方法を示す。

発明の実施態様の詳細な記載下記実施例１−５は、この発明の様々な態様を示す。特に、実施例１では、この発明の試薬の合成を詳述している。実施例２では、実施例１で製造されに試薬および合成ヌクレオチド多量体間のカップリング反応による、この発明の置換ヌクレオチド多量体の合成を記載している。さらに実施例３では、この発明の他の置換ヌクレオチド多量体の合成を示し、実施例４および５では、その置換ヌクレオチド多量体への標識の結合を詳述している。

実施例１第１図は、下記合成の概要を示す。

匹：　６−アミノ−１−ヘキサノール、５−エチルトリフルオロチオアセテート　Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＮ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロメトキシホスフィンは、アルドリッチ・ファイン・ケミカルズ（ミルウォーキー、ワイオミング）の製品であった。

（ａ）６−トリフルオロアセトアミド−ｌ−ヘキサノール（Ｒ’）酢酸エチル無水物（１５ｚｆｆ）中６−アミノ−へキサノール（ＩＩＸＩ−；１７ｇ、ｌＯミリモル）の撹はんスラリーに、Ｓ−エチルトリフルオロチオアセテート（２ｇｇ、１５ミリモル）を滴下した。Ｓ−エチル・トリフルオロチオアセテートの滴下が完了すると、直ちに透明な溶液が得られた。室温で５時間反応混合物を撹はん後、さろに０　、５　ｚＱのＳ−エチルトリフルオロチオアセテートを加えに。

さらに半時間反応混合物を撹はん後、アセトン−ジクロロメタン（５ニア比）中シリカゲル薄層クロマトグラフィーを行った結果、出発アミノ−へキサノール（ｎ）の消失が示されたにニンヒドリン噴霧）。０．］Ｍピペリジンによる噴霧を行い、１５分後、ニンヒドリン噴霧を行い、１１０℃で２−３分間プレートを加熱しｆ二後、ＴＬＣプレートの明視化により、ソルベントフロント付近の速く動く広いスポットが示された（Ｒｆｏ、８５）。石油エーテル（６０１ｆｆ）を反応混合物に加え、不透明溶液を一２０℃で１６時間貯蔵すると、無色粉末が得られ、これを冷たい（−２０℃）石油エーテル（３ｘ５ｘＲ）で洗浄しｆこ。次いで、生成物を真空下短く乾燥し、次に５Ｊ１ｇの１０１ピリジン−水混合物で１０９Ｊ間処理することにより、■で形成され乙かもしれないＱ−トリフルオロアセチル基を加水分解した。反応混合物を濃縮乾固し、残留物をピリジン（４Ｘ　１０ｘ１２）と共に濃縮すると、ガム形態の化合物（ＩＶ）１．１９（４７１）が得みれた。

（ｂ）６−）リフルオロアセトアミドヘキサン−１−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィンＩ乾燥ＴＨＦ（１０ｘ１２）に化合物ＩＶ（０，４２６９，２ミリモル）を含む撹はん溶液に、アルゴン雰囲気下、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１，４ｘ＋２．８ミリモル）を加え、次いでＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロ−メトキシホスフィン（０，７９ｇ、４ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で半時間撹は人後、白色沈澱物をろ過した。ろ液を酢酸エチル（６０１１Ｑ）で希釈し、５％炭酸ナトリウム溶液（３Ｘ　１５ｘＣ）で洗浄した。次いで、有機層をＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、濃縮すると流動状シロップが得られ、これを１６時間真空乾燥すると、所望の化合物０．７９（９４％）が得られたが、これはそれ以上精製せずに使用した。所望のホスファ−アミダイト（１）の存在は、３１ＰＮＭＲにより確認された（ＣＤｓＣＮ中、トリメチルホスフェヘート、外部標準）：（ｐｐｍ）１１７．４゜実施例２アミノ−リンカ−Ｉと合成りＮＡフラグメントとの自動的カップリング。

第２図の図式は、ヌクレオチド多量体の自動的合成、それに続くアミン−リンカ −試薬Ｉの自動的付加に含まれる段階の概略を示している。定められた配列によるヌクレオチド多量体のポリマー支持体合成は、まずアプライド・バイオシステムズ（ｒＡ　Ｂ　Ｉ　Ｊ）モデル３８０Ａまたはバイオサーチ・モデル８６００ＤＮＡンンセサイザーを用い、メーカーの合成プログラムの修飾バージョンを用いて行なわれた。この修飾では、酸化段階の前に塩基性水洗（１０％水、２％ピリジン−ＴＨＦ中）段階が採用されている（第２図参照）。この修飾を含めることにより、合成全体における副反応が最小限に抑えられた。

アミン−リンカ−１の自動的カップリングは、それをアセトニトジル中０．２モル溶液としてＡＢ１３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーの＃６位置に充填することにより行なわれに０この方法を用いると、アミノ−リンカ−は、一般的構造（Ｖ）を有する５゛−ジメトキシ・トリチル−Ｎ−保護−ヌクレオシド　ベーターシアノエ≠ルホスファーアミダイトが付加される場合と同様に樹脂結合Ｎ−保護オリゴマ一の５°−ヒドロキンル基に付加された。最終塩基性水洗および酸化段階後、室温で１時間濃ＮＨ，ＯＨ水溶液で処理することにより樹脂結合オリゴマーを樹脂から開裂させた。次いで、５５℃で１６時間ＮＨ，ＯＨ溶液を加熱することにより、オリゴマーを脱保護した。この段階はヌクレオチドの環外アミンおよび連結アミン部分を（トリフルオロアセチルを開裂して一次アミンを脱離させることにより）同時に脱保護する。水酸化アンモニウム溶液を濃縮後、粗生成物を１２％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル電気泳動により精製した。蛍光薄層クロマトグラフィー・プレートをゲルの下方に配し、Ｕ■ランプをゲル上に固定する、ＵＶシャドウィング技術によりバンドを明視化した。リンカ−修飾オリゴマーは、非修飾オリゴマーよりもゲル上をゆっくりと移動するバンドを与えた。

次いで、リンカ−修飾バンドをゲルから削り取り、０．１モルＮＨ，ｏＡｃ（ｐＨ７，５）により抽出し、次いでセファデックスＧ−２５０カラムに上り脱塩すると、純粋な５“ヒドロキシ置換ヌクレオチドＸが得られた。ポリアクリルアミドゲルからの相対バンド強度に基づくと（ＵＶシャドウィング方法）、アミンリンカ−のカップリングは９０％より大で評価された。

実施例３上記方法を用いて、５゛末端にアミノリンカ−を有する下記の置換合成ヌクレオチド多量体を合成および精製した。置換されたヌクレオチドＸまたは下記置換ヌクレオチドのいずれかは、相補的標的ヌクレオチド配列検出用プローブとして使用され得るものとする。

勿論その場合、適当な標識は一般的にアミン連結部分に連結される。

八１２％アクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルのＵＶシャドウィングにより示されたところでは、どの場合も、置換合成オリゴマーは母体オリゴマーよりもゆっ（りと移動した。

実施例４標識との連結に関する前述の置換ヌクレオチドのアミン部分の適性を説明するため、それをビオチンに連結した。この連結および後続のビオチン標識置換ヌクレオチドのコンジュゲーシヨンの概略を第３ｒＸＪに示す。

（ａ）ビオチニル化：モニターを簡易化するため、まずチューおよびコーヘンの標準プロトコル（ジーン１．し勇−１１７７）に従い、アルファー”Ｐ（ＴＴＰ）および末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて実施例３（ｂ）で詳述した５°−アミノ一連結合成デオキシオリゴヌクレオチドをその３’−ＯＨ末端において標識した。結果は化合物■である。

ビオチニル化するため、５ピコモルの凍結乾燥３゛−３１Ｐ標識プローブ（ｋｌ）を、０．２Ｍはう酸ナトリウム（ｐＨ９，０Ｘ５村）、ジメチルスルホキシド（４ｉＱ）および３０ミリモルのビオチン−ｘｈＨ６（カルビオケムーベルビング・コーポレイション、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国Ｘ１１２）と室温で１時間インキュベージジンした。次いで、２５０ｘＩ２の０．３Ｍ酢酸ナトリウム、７５０ｘ（ｌのエタノールおよび２０μ９のグリコーゲンを加えることにより、反応混合物を２回エタノール沈澱させに０生成物（Ｘｍ）の沈澱物を２０ｘＱのＨｌＯに溶かした。

（ｂ）ストレプトアビジン−コンジュゲート。

下記手順に従い、ストレプトアビジン−アガロースとビオチニル化プローブのコンジュゲーンヨンにより前述の標識プローブ（ＸＩ［ｌ）上のビオチン部分の存在の検証を行った。

２本の１，５ｘＱエツペンドルフ管に、各々１００μＣのストレプトアビジン− アガロース・スラリー（ベゼスダ・リサーチ・ラブダ、インコーホレイテッド、ガイザースバーグ、メリーランド、アメリカ合衆国）を取った。一方の管に、５００μｇの洗浄緩衝液（５００ｍＭ燐酸緩衝液、２ミリモルＥＤＴＡ、０．５Ｍ塩化ナトリウムから成る洗浄緩衝液、ｐＨ７，４）中１ｚｇのビオチン（カルビオケムーベーリング・コーポレイシタン、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を加えた。１５分間室温で撹はん後、標識プローブ℃による溶液２ μｇを加え、反応混合物を室温で３０分間撹はんした。

第２の管に、５００μｇの洗浄緩衝液および２μｇのビオチニル化プローブ溶液を加え、室温で４５分間撹はんし乙。

次いで、両方の管を遠心分離し、上滑を除去し、ＳｌおよびＳ２としてラベルしに。沈澱したアガロースゲルを５００μｇの洗浄緩衝液で再び洗浄し、上滑をそれぞれＳｌおよびＳ２と合わせた。残留物を各々５００μｇの洗浄緩衝液にｌ！１′濁し、ツエレンコフ・シンチレーション計数管により３２ｐの量を測定しｎ０ＣＰ　Ｍ　　　　　　　　結合％管１　　　１０９５３］　　　　　　　６．０２上清１　　１７５８８Ｅ管２　　　　　９９０１コ５４．５上清２　　　９２３１］これろの結果は、さらにプローブ上のアミノ−リンケージの存在を示すビオチン −ストレプトアビジン付加体の形成を明らかに示した。

実施例５Ｂ、アクリジニウムエステルによるアミンリンカー−アームプローブの標識および後続の精製。

アクリジニウムエステルの２５ミリモルのストック溶液（組成については、！、ウイークス等、クリニカル・ケミストリー、２９巻、１４７４頁、１９８３参照）を蒸留ＤＭＳＯ中で調製した。実施例３（ｂ）で前述したアミンリンカ−プローブを１．５１円錐ポリプロピより、下記カクテルを構築した。

３μｇ　Ｈ，Ｏ１μ（ＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（８，０）４μｍ２　　ＤＭＳＯ（蒸留）２μｍ２２５ｍＭアクリジニウムエステル、ＤＭＳＯ中（蒸留）混合物を渦状に撹はんし、２秒間小型遠心分離器中で回転させ（管の底に内容物を集めるため）、３７℃で２０分間インキュベーションした。その時点で、下記成分を列挙した順に反応カクテルに加えた。

３．０μｍ２２５ｍＭアクリジニウムエステル、ＤＭＳＯ中（蒸留）１．５μＱ　８．００．５μＱ　　ＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（８，０）再びカクテルを渦状にし、回転させ、さらに２０分３７℃でインキニベーションした。０．１Ｍ　　Ｈ，ＥＰＥＳ（８，０）、５０％ＤＭＳＯ中０．１２５Ｍリジン５μＣを加えることにより５倍過剰のリジンを用いて未反応標識をクエンチングし、室温で５分間インキュベーションした。

この時点で、次の方法を用いてアクリジニウムエステル標識オリゴマーを精製した。２０ｐｇのクエンチングされに反応混合物に、３０μｍ２の３モルＮａ０Ａｃ（５，０）、２４５μｆｆのＨ，Ｏおよび５μ（のグリコーゲンを担体として加えた（グリコーゲンを前処理することによりヌクレアーゼ活性を全て除去した）。試料を短く渦状にし、６４　０ｕｌの無水ＥｔＯＨを加えた。試料を短く渦状にし、氷上で５−１Ｏ分間インキュベーションし、次いで小型遠心分離器中５分間１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を注意深く除去し、沈澱物を２０１ｔＱの０．１モルＮａ０Ａｃ（５，０）、０．１％ＳＤＳに再溶解した。さらに試料を次の要領でイオン交換高速液体クロマトグラフィーにより精製した。２０ μＱの再溶解沈澱物を、ＩＢＭ、９５３３ＨＰＬＣシステムに搭載したヌクレオーゲンーＤＥＡＥ　　６０−フイオン交換ＨＰＬＣカラムに注入した。このプロセスにおいて使用される緩衝液は全て、ＨＰＬＣ用水、アセトニトリル（ＣＨ，ＣＮ）および酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、および試薬用水酢酸（ＨＯＡｃ）およびＬｉＣ１により調製されたものであった。さらに、緩衝液を全て使用前に０．４５μπ孔サイズのナイロン−６６フイルターによりで５５％緩衝液Ａ、４５％緩衝液Ｂから３０％緩衝液Ａ１７０％緩衝液Ｂへの一次勾配により２５分間で行なわれた。溶出中２６０ｎｍでの吸光度をモニターした。０　、５　ｘＱのフラクションを１．５ｉｇの円錐ポリプロピレン管に集めた。溶出直後、容管に１０％５ＤＳ５μｇを加え、容管を渦状に回した（これは、アクリジニウムエステル標識プローブが管壁に付着していないことを確実にするために行った）。０．５μｇアリコートをフラクション２１−４２から除去し、１２×７５ｕ管中２００μｇの水に加えた（分離ピペット・チップを各アリコートに用いることにより、持ち越し問題を回避した）ｅ次いで、ハートールド・クリニルマットにおいて２００μρの０．２５Ｓ　　ＨＮｏ、、０．１％Ｈ７０２、次いで１秒遅れで２００μＣのＩＮ　　ＮａＯＨを自動注入し、１０秒間化学発光度の読み取りを行うことにより各アリコートの化学発光度を測定した。

フラクション２９−３３を、各々５μＱのグリコーゲンに加え、渦状に回し、各渦に１ｘＱのＥｔＯＨを加え、５−１０分間氷上でインキュベーションし、小型遠心分離器中１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、ＥｔＯＨ沈澱させた。各上清を注意深く除去し、各沈澱物を２０ｕＱの０．１モルＮａ０Ａｃ、ｐＨ５，０，１％ＳＤＳに再溶解し、次いでこれらの分離フラクションをプールした。

ＵＶ吸光度および化学発光アウトプットの比較に基づくと、標識プローブおよび出発標識試薬の化学発光比活性はモル・ベースで同等であった。

次に、ヌクレオチドの５゛ヒドロキシ、代表的にはヌクレオチド多量体の末端ヌクレオチドに容易に結合することにより、標準固相合成における環外アミンの脱保護と同じ条件下で容易に脱保護される連結部分を有する置換ヌクレオチド多量体を生成させ得る試薬が記載されたことは明らかである。説明された通り、それらの試薬は、公知固相合成手順における最終段階としてそれらの手順の標準化学を用いてヌクレオチド多量体に結合され得る。さらに、アシル保護基は、多量体における環外ヌクレオチドアミンの脱保護に使用される条件と同じアルカリ条件下で開裂され得ることから、同時に脱保護されるため、生成した置換ヌクレオチド多量体の連結部分に対する特別の脱保護段階は必要とされない。

この発明の実施態様の記載を行ったが、これらの態様の変形および修飾は当技術分野の熟練者が容易に想到できるものである。従って、この発明の範囲は、詳しく上述した実施態様に限定される訳ではない。

Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨ立−〇（２−ＯＨ特表千２−５０２２８４　（１２）国際調査報告　　ｖｒｒｔｒｅＦ　ＱＪ１０３７７＋

Claims

【特許請求の範囲】

（１）５′ヒドロキシ置換ヌクレオチドの製造に適した試薬であって、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｙは、非不適カップリング条件下、ヌクレオチドの５′ヒドロキシにＲ１をカップリングさせ得る非ヌクレオチドに基づくカップリング基であり、（ｂ）Ｒ１は非ヌクレオチド骨格であり、（ｃ）Ｘ１は、Ｓまたはアミノ基から選択される保護された連結部分であり、（ｄ）Ｒ２　▲数式、化学式、表等があります▼はＸ１保護基（ただし、ｍはＲ２の適当な数であり、各々異なり得る）であり、Ｒ２ｍＣ−が電気陰性を有する形となるように（その結果、カップリング条件下ではＸ１は脱保護されないが、非不適アルカリ条件下では脱保護される）、炭素、酸素、窒素またはハロゲン原子の１個またはそれ以上、またはそれらの組み合わせにより構成され、（ｅ）Ｘ１＝Ｓの場合ｎ＝１、Ｘ１がアミノ基の場合ｎ＝１または２である］を有する試薬。
（２）Ｘ１＝ＮおよびＲ２のうち少なくとも１個がハロゲンから選択される、請求項１記載の試薬。
（３）Ｒ２ｍＣが、Ｃｌ３Ｃ−、Ｎ　Ｃ−、ＣＦ３ＣＦ２−、▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼から選択される、請求項１記載の試薬。
（４）▲数式、化学式、表等があります▼が、トリフルオロアセチル、フタロイルおよびマレオイルから選択される、請求項１記載の試薬。
（５）Ｘ１＝Ｎおよび試薬の式が、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、各Ｘ２はハロゲンから選択され、Ｒ１＝アルキルである）である、請求項１記載の試薬。
（６）Ｘ１＝ＮおよびＲ１＝アルキル、および試薬の式が、▲数式、化学式、表等があります▼ から選択される、請求項１記載の試薬。
（７）Ｒ１が１〜１０個の炭素原子を有する非環状炭化水素鎖である、請求項１記載の試薬。
（８）Ｘがアミノ基であり、−Ｙが、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［式中、（ａ）Ｘ２＝ハロゲンまたは置換アミノ、（ｂ）Ｘ３＝ハロゲン、アミノまたはＯ−、（ｃ）Ｒ３＝アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、（ｄ）Ｒ４＝アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはＸ３＝Ｏ−の場合のみＨ］から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の試薬。
（９）Ｒ１＝アルキル、Ｘ１がアミノ基であり、−Ｙが、▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［式中、（ａ）Ｘ２＝Ｃ１または第２級アミノ、（ｂ）Ｘ３＝Ｃ１、第２級アミノまたはＯ−、（ｃ）Ｒ３＝アルコキシ、アリールオキシ、（ｄ）Ｒ４＝アルコキシ、またはＸ３＝Ｏ−の場合のみＨ］から選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の試薬。
（１０）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ｉ）Ｙは非ヌクレオチドに基づくカップリング基であり、（ｉｉ）Ｒ１は非ヌクレオチド骨格であり、（ｉｉｉ）Ｘ１は、硫黄またはアミノから選ばれる保護された連結部分であり、（ｉｖ）▲数式、化学式、表等があります▼、Ｘ１保護基（ただし、ｍはＲ２の適当な数であり、Ｒ２は各々異なり得るが、Ｒ２ｍＣ−の電気陰性がアルキルの場合よりも高くなるように選択される）である］で示される試薬を用いた、５′ ヒドロキシに連結部分を有するヌクレオチド多量体の製造方法であって、（ａ）まず、非不適条件下、Ｙを介して多量体の末端ヌクレオチドの５′ヒドロキシにＲ１をカップリングし、（ｂ）次いで、この生成物を非不適アルカリ条件に暴露することにより、Ｘ１および保護された環外アミンがあればそれも同時に脱保護する．ことを含んで成る方法。
（１１）Ｘ１＝ＮおよびＲ２のうち少なくとも１個がハロゲンから選択される、請求項１０記載の方法。
（１２）Ｘ１＝Ｎおよび▲数式、化学式、表等があります▼、トリフルオロアセチル、フタロイルおよびマレオイルから選択される、請求項１０記載の方法。
（１３）Ｘ１＝ＮおよびＲ１＝アルキル、および試薬の式が、▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ２は各々ハロゲンから選択される）である、請求項１０記載の方法。
（１４）ＸＩ＝ＮおよびＲ１＝アルキル、および試薬の式が、▲数式、化学式、表等があります▼ である、請求項１０記載の方法。
（１５）Ｘがアミノであり、−Ｙが ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［式中、（ａ）Ｘ２＝ハロゲンまたは置換アミノ、（ｂ）Ｘ３＝ハロゲン、アミノまたはＯ−、（ｃ）Ｒ３＝アルキル、アルコキシ、アリールオキシ−Ｏ−、（ｄ）Ｒ４＝アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、またはＸ３＝Ｏ−の場合のみＨ］から選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
（１６）−Ｙが、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［式中、（ａ）Ｘ２＝Ｃ１または第２級アミノ、（ｂ）Ｘ３＝Ｃ１、第２級アミノまたはＯ−、（ｃ）Ｒ３＝アルコキシ、（ｄ）Ｒ４ニアルコキシ、またはＸ３＝Ｏ−の場合のみＨ、（ｅ）Ｒ１＝アルキル］から選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
（１７）（ａ）請求項９〜１５のいずれか１項記載の方法により、５′ヒドロキシに連結部分を有するヌクレオチド多量体を製造し、（ｂ）化学発光性アクリジニウムエステルを連結部分に連結することを含む、標識ヌクレオチド多量体の製造方法。