KR20040015107A - 고체 지지체 상에 올리뉴클레오티드의 고정화 - Google Patents

고체 지지체 상에 올리뉴클레오티드의 고정화 Download PDF

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KR20040015107A
KR20040015107A KR10-2003-7013716A KR20037013716A KR20040015107A KR 20040015107 A KR20040015107 A KR 20040015107A KR 20037013716 A KR20037013716 A KR 20037013716A KR 20040015107 A KR20040015107 A KR 20040015107A
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KR10-2003-7013716A
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신하난다
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아베시아 바이오테크놀러지, 아이엔씨.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Abstract

본 발명은 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 3'-O- 또는 5'-O-치환된 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 Q가 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드이고, 각 X가 O 또는 S이고, Y는 불활성 스페이서 기이고, R은 상기 고체 지지체를 나타내는 식(I)의 물질이다. 또한, 혼합물로부터 표적 생물분자, 바람직하게는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 분리하는 방법을 개시한다.

Description

고체 지지체 상에 올리뉴클레오티드의 고정화{Immobilization of oligonucleotides onto solid supports}
고체 지지체에 고정화된 생물분자는 친화성 시약(affinity reagent)으로서 유용성이 아주 크며, 혼합물로부터 표적 분자를 결합시키고 분리하는데 종종 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 이러한 목적으로 사용될 수 있는 생물분자의 일 예이다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 상보성 서열과 혼성화할 수 있다. 더욱이, 조절 영역에서 발견된 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 그러한 영역에 대하여 특이성을 갖는 조절 단백질과 결합할 수 있다. 따라서, 고정화된 올리고뉴클레오티드를 갖는 고체 지지체를 포함하는 친화성 시약은 특히, 상보성 올리고뉴클레오티드 및 조절 단백질의 정제, 확인 및 분리에 사용될 수 있다.
고체상 지지체에 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 현재의 방법은 많은 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 일부 방법에 의하면 상기 올리고뉴클레오티드가 비특이적으로 부착되거나 부반응을 유발할 수 있다. 특이적인 방법은 일반적으로 상기 올리고뉴클레오티드의 5′또는 3′말단에 반응성 기를 직접적으로 부착시키는 것과 관련된다. 어느 한 쪽 말단에 직접적으로 부착시키는 것에 의하여, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 고체 지지체와 아주 근접하게 되어, 올리고뉴클레오티드가 표적 분자와 결합하는데 적합한 구조(configuration)를 갖는 것을 방해할 수 있다. 다른방법들은 매질(matrix)과 올리고뉴클레오티드를 상당히 조작하여야 하기 때문에 사용하기에 불편하다.
따라서, 사용하기에 편리하고, 위치 특이적이며, 부반응(side reaction)이 최소화되거나 없고, 상기 올리고뉴클레오티드가 표적 분자와 결합하는데 적합한 배향(orientation)을 가질 수 있도록 하는, 고체 매질에 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 신규한 방법이 요구되고 있다.
폴리뉴클레오티드, 특히 폴리뉴클레오티드의 3′말단에 부착된 알킬 포스페이트 연결(linking) 기가 상기 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체에 공유적으로 결합시키는데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, 유도체화된 올리고뉴클레오티드 GGTTGGTGTGGTTGG-OPO-(O-헥실)-포스페이트 (서열번호 1) (트롬빈 결합 압타머(aptamer)) 및 TAATATGACTCACTATAGGTAACT T-OPO-(O-헥실)-포스페이트 (서열번호 2)를 제조하여, 카르보디이미드 매개 결합(coupling)에 의하여 말단 포스페이트에 의하여 아미노 세파로즈에 부착하였다 (실시예 2). 이 발견에 근거하여, 올리고뉴클레오티드와 결합한 신규한 기질, 상기 기질로 생물분자를 정제 및/또는 분리하는 방법 및 상기 기질을 제조하는 방법을 본 명세서에 개시하였다.
본 발명에 따르면, 하기 식(A)의 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
상기 식중, Q는 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드이고;
각 X는 독립적으로 0 또는 S이고;
Y는 불활성 스페이서 기이고,
R은 고체 지지체이다.
본 발명의 일 구체예는 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드이다. 상기 3′-O-치환체(substituent)는 하기 구조식(I)으로 나타내어 진다:
(I)
각 X는 독립적으로 0 또는 S이고; Y는 불활성 스페이서 기이고, R은 고체 지지체이고; 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다. 바람직하게는 각 X는 O이다.
본 발명의 또다른 구체예는 혼합물로부터 표적 생물분자를 분리하는 방법이다. 상기 방법은 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 표적 생물분자를 선택적으로 결합할 수 있고, 상기 3′-O-치환체는 상기 구조식(I)에 의하여 표시되는, 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 혼합물은 상기 표적 생물분자가 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 결합하기에 적합한 조건하에서 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 접촉된다.
본 발명의 또다른 구체예는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이다. 상기 방법은 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드의 말단 포스페이트를 고체 지지체에 달려 있는 아민 또는 히드록실기로 에스테르화 또는 아미드화시키는 단계를 포함한다. 상기 3'-O-치환체는 하기 구조식(II)에 의하여 나타내어진다:
(II)
Y 와 X는 구조식(I)에 대하여 기술한 바와 같다.
본 명세서에 기술된 상기 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 용이하고 편리하게 위치 특이적으로 최소의 부반응과 함께 고체 지지체에 공유적으로 결합될 수 있다. 따라서, 상기 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 높은 순도와 수율로 제조될 수 있다. 더욱이, 상기 스페이서 기는 유익하게 충분한 길이이기 때문에, 표적 분자가 상기 고체 지지체로부터의 간섭이 최소화 또는 전혀 간섭을 받지 않으면서 상기 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 따라서, 상기 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 혼합물로부터 표적 생물분자를 분리하는 편리한 도구를 제공한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 상의 3′말단 히드록시 기를 치환하는 링커 기(linker group)에 의하여 고체 지지체 상에 결합되거나 고정화된 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 링커는 하기 구조식(III)에 의하여 표시되어진다:
(III)
X 와 Y는 구조식 (I)에 대하여 기재한 바와 같다.
본 발명은 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 관하여 기술되어 있다. 그러나, 본 발명은 또한 대응하는 고체 지지체 결합 5'-O-치환된 폴리뉴클레오티드, 즉 폴리뉴클레오티드 상의 5′말단 히드록시 기를 치환하는 링커 기에 의하여 고체 지지체 상에 결합되거나 고정화된 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 링커는 구조식 (III)에 의하여 표시되어 진다. 상기 고체 지지체 결합 5'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 유사한 유용성이 있으며, 대응하는 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하는데 사용되는 방법의 적절한 조정에 의하여 제조될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 지지체 결합 2'-O-치환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다는 것도 알 수 있다. 상기 링커는 구조식 (III)에 의하여 표시되어 진다. 상기 고체 지지체 결합 2'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 유사한 유용성이 있으며, 대응하는 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드 조성물을 제조하는데 사용되는 방법의 적절한 조정에 의하여 제조될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 또한 핵산염기(nucleobase) 상의 부착점을 통하여 고체 지지체 상에 결합되거나 고정화된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 부착은 구조식 (III)의 링커에 부착시키는 적절한 수단, 예를 들면, 아미노헥산올과 같은 아미노알칸올 부위의 형성에 의하여 상기 핵산 염기를 유도화체함으로써 달성될 수 있다.
많은 구체예에서, 상기 지지된 폴리뉴클레오티드는 쉬피겔머(spiegelmer)가 아니며, 특히 서열 GCGGCGGAGGGTGGGCTGGGGCTGGGCCGGGGGGCGTGCGTAAGCACGTAGCCT CGCCGC (서열번호 3)을 갖는 쉬피겔머는 아니다.
구조식 (A) 및 (I)-(III)의 Y는 불활성 스페이서 기이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "불활성 스페이서 기(inert spacer group)"는 폴리뉴클레오티드의 3′말단에 결합되었을 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 고체상 합성을 방해하지 않고, 상기 폴리뉴클레오티드에 결합하는 표적 분자에 대하여 상기 폴리뉴클레오티드의 친화도 또는 선택도를 유의하게 감소시키지 않는 부위이다. 많은 경우, 상기 개시된 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 3′말단에서 상기 고체 지지체에 직접적으로 결합되는 경우 대응되는 치환되지 않은 폴리뉴클레오티드에 비하여 표적 분자에 대하여 더 높은 친화도로 결합한다. 적합한 스페이서 기의 예에는 폴리알킬렌글리콜 기(즉, Y는 n이 2 또는 3이고, m은 0 내지 약 4의 정수인, -(CH2)n-[O(CH2)n]m-), 직쇄 히드로카르빌 기 및 사슬 내의 2 또는 3개의 탄소 원자가 1,4-페닐렌기로 치환되어 있는 직쇄 히드로카르빌 기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리알킬렌 글리콜 및 직쇄 히드로카르빌 기는 길이가 약 15 원자까지이고, 더욱 바람직하게는 길이는 2 내지 10 원자이다. 히드로카르빌 및 폴리알킬렌 글리콜 스페이스 기는 상기한 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드의 합성 또는 표적 분자에 대한 친화도를 상당히 방해하는 기로 친환될 수 있다. 적합한 치환체의 예에는, -F, -Cl, -Br, -I, -CH3또는 에틸이 포함된다. 그러나, 히드로카르빌 및 폴리알킬렌 글리콜 스페이스 기는 바람직하게는 치환되지 않은 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 불활성 스페이서 기는 C3-ClO 직쇄, 치환되지 않은 알킬렌 기 및 더욱 바람직하게는 C5-C7 직쇄 알킬 기이다.
본 발명의 상기 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 고상 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 표준 방법에 의하여 제조된다. 예를 들면, 1-O- (디메톡시트리틸)-ω-[N,N-디이소프로필아미노-β-시아노에톡시-포스피노]-1,ω-알칼디올이 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용한 고상 폴리뉴클레오티드 합성에 적합한 고상 지지체에 결합된다. 고상 폴리뉴클레오티드 합성에 적합한 고체 지지체의일 예는 석시닐화 실릴 아민이다. 석시닐화 실릴 아민은 예를 들면, 실리카를 3′-아미노프로필 트리에톡시실란과 반응시킴으로써, 실릴 아민을 포함하도록 실리카를 유도체화한 다음, 유리 아민을 석시닐화함으로써 제조된다. 적합한 고체 지지체의 다른 예에는 석시닐화 제어 공극 유리(control pore glass)(이하 "CPG"라 한다), 및 CPG-CO-CH2CH2-CO-O-CH2CH2-SO2-CH2CH20H가 포함된다. 1-O- (디메톡시트리틸)-ω-[N,N-디이소프로필아미노-β-시아노에톡시-포스피노]-1, ω-알칼디올의 제조와 고상 지지체와의 결합(coupling)은 Seela 및 Kaiser,Nucleic Acids Research15:3113 (1987), Wilk, 등,Nucleic Acids Res.18:2065 (1990) 및 Nelson 등,Nucleosides Nucleotides16:1951 (1997)에 개시되어 있다. 이들 참고 문헌의 전체 개시 내용(teaching)은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.
1-O- (디메톡시트리틸)-ω-[N,N-디이소프로필아미노-β-시아노에톡시-포스피노]-1, ω-알칼디올을 상기 고체 지지체에 부착시킨 다음, 상기 폴리뉴클레오티드의 합성은 표준 과정에 따라 수행된다. 상기 과정은 일반적으로 하기 4 단계 순환이다: 1) 예를 들면, 메틸렌 클로라이드 중의 디클로로아세트산(2 : 100 v/v) 또는 20% 아세트산으로 상기 트리틸 보호기의 제거; 2) 뉴클레오시드 포스포르아미다이트, 예를 들면 5'-O-DMT-2'-데옥시뉴클레오시드 3'-O-(2-시아노에틸-N, N′-디이소프로필) 포스포르아미다이트와 응축하여, 포스파이트 트리에스테르를 형성하고; 3) 반응하지 않은 5'-히드록실 기를 예를 들면, 아세트산 무수물 및 디메틸아미노피리딘/테트라히드로푸란/루티딘 (6:90:10 v/v/v)으로 아실화 또는 캡핑; 및 4) 포스파이트 트리에스테르를 예를 들면, 요오드 용액으로 포스페이트 트리에스테르로 산화. 일단 상기 합성이 완료되면, 상기 폴리뉴클레오티드는 보호기가 없으며, 일반적으로, 농축된 암모늄 히드록사이드에 의해 상기 고체 지지체로부터 잘려진다.
본 발명의 상기 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드에는 3'-O-치환된 폴리데옥시뉴클레오티드, 3'-O-치환된 폴리리보뉴클레오티드 및 3'-O-치환된 폴리데옥시 및 폴리리보뉴클레오티드의 혼합물이 포함된다. 3'-O-치환된 폴리리보뉴클레오티드를 제조하는 경우, 상기 2'-히드록시 기는 고상 합성 및 그후에 상기 3'-O-치환된 폴리리보뉴클레오티드가 상기 고체 지지체에 부착되는 동안 보호되어야만 한다.
또한, 퓨린 또는 피리미딘 기의 하나이상에 변형이 가해진, 예를 들면, 5-할로겐화 티미딘, 시토신 또는 우라실; 5번 위치에 프로파인(propyne)으로 변형된 티미딘, 시토신 또는 우라실; 또는 7번 위치 질소가 -CH-로 치환된 아데노신 또는 구아닌을 갖는 상기 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 또한, 하나이상의 데옥시리보즈 기의 2′위치에서, 예를 들면, -O-(보호 기), -O-CH3, -F-CH20CH3, -OCH2CH20CH3등으로 치환된 고체 지지체 결합 3'-O-치환된 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
고상 폴리뉴클레오티드 합성의 각 주기(cycle) 동안, 상기 폴리뉴클레오티드의 작은 비율(일반적으로 1%-2%)이 5'-O-DMT-2'데옥시뉴클레오시드 포스포르아미다이트와 결합하지 못한다. 따라서, 불순물의 수준은 합성의 각 주기와 함께 증가한다. 반응하지 않은 올리고머는 바람직하게는 합성의 각 주기 동안 "캡핑"되어 후속의 합성 주기 동안에 이들 반응하지 않은 올리고머가 더 연장되지 못하도록 하여, 최종산물로부터 이들 불순물을 제거하는 것을 촉진시키도록 한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 방법에 의하여 상기 "반응하지 못한(failed)" 캡핑된 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다. 일반적으로, 분리는 겔 전기영동, 이온 교환크로마토그래피 또는 역상 HPLC에 의하여 달성될 수 있다.
"실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드(substantially pure polynucleotide)"란 합성에 의하여 제조된 다음, "반응하지 않은(failed)" 캡핑된 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 없는, 예를 들면 적어도 90.0 중량% 이상 없는, 바람직하게는 약 95.0중량% 이상 없는 및 가장 바람직하게는 98.0중량% 이상 없게 되도록 정제된 것을 의미한다. 일반적으로 본 명세서에서 기술된 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 혼합물로부터 생물분자를 분리하는데 사용하기 위하여 고체 지지체에 공유적으로 결합되어지기 전에 정제되어, 상기 캡핑된 중간체를 제거한다.
일반적으로, 본 발명은 길이에 대하여 특별한 제한이 없는 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 100 핵산 염기이하이고, 더욱 바람직하게는 약 75 이하, 더 더욱 바람직하게는 약 50 이하이다. 일반적으로, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 8 핵산 염기이상이고, 바람직하게는 길이가 약 10 내지 35이다.
상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 적합한 고체 지지체는 일차 포스페이트 기와 안정한 공유 결합을 형성할 수 있는 것이다. 그러한, 고체 지지체는, 일반적으로 중합체 골격에 달려 있거나 중합체 골격에 달려 있는 링커에 결합되어 있는 아민, 히드록실기 또는 티올 기를 갖는다. 적합한 고체 지지체의 예에는 아미노 세파로즈, 아미노 폴리스티렌, 아미노 실리카 비드 (아미노로 유도체화된 실리카), 실리카 제어된 공극(pore) 유리 비드 및 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 근거 아미노 지지체가 포함된다.
3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 일차 아민 및 포스페이트로부터 포스포르아미드를 제조하는 임의의 적합한 방법에 의하여, 매달려 있는 일차 아민 기를 포함하는 고체 지지체에 결합되어질 수 있다. 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 알콜 및 포스페이트로부터 포스페이트 에스테르를 제조하는 임의의 적합한 방법에 의하여, 매달려 있는 히드록실기를 포함하는 고체 지지체에 결합되어질 수 있다. 일반적으로, 활성화된 포스페이트 에스테르는 "결합제(coupling agent)"로 인 시투 (in situ)에서 형성되어진다. 상기 결합제는 포스페이트의 히드록실기와 결합하여, 상기 히드록실기를 예를 들면, 일차 아민 또는 알콜에 의하여 친핵성 치환(nucleophilic replacement)에 민감한 이탈기(leaving group)으로 전환시킨다. 결합제의 예에는 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CDI), 이소부틸 클로로포르메이트 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드 (EDC) 및 디시클로헥실 카르보디이미드 (DCC)와 같은 카르보디이미드 결합제가 포함된다. EDC가 바람직한 결합제이다.
본 발명의 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 혼합물로부터 생물분자를 분리하는데 사용되어질 수 있다. 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기 표적 생물분자와 선택적으로 결합하는 것이 선택되어진다. "선택적으로 결합한다(selectively binds)"란 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 상기 혼합물 중의 다른 성분에 비하여 상기 표적에 대하여 더 큰 친화성을 갖는다는 의미하는 것으로 정의된다. 바람직하게는 두 배이상의 친화성, 더욱 바람직하게는 5 배 이상의 친화성 및 더 더욱 바람직하게는 10 배 이상의 친화성을 갖는다. 예를 들면, 상기 표적 분자가 RNA 또는 DNA인 경우, 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기 표적과 충분히 상보적이어서 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 상기 표적과 혼성화하여 폴리뉴클레오티드 이중나선을 형성할 수 있는 것이 선택되어진다. 단백질이 특정한 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 친화성을 가지고 있는 경우, 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 또한 혼합물로부터 단백질을 분리할 수 있다. DNA 발현을 조절하는 단백질, 전사 효소, 번역 효소는 그러한 단백질의 예이다. 혼합물로부터 그러한 단백질을 분리하기 위하여, 상기 단백질에 친화성을 갖는 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 선택된다.
원하는 표적 생물분자에 대하여 적합한 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 일단 선택되면, 상기 표적 생물분자를 포함하는 혼합물을 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 접촉시킨다. 예를 들면, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기 용해된 혼합물을 포함하는 수성 용액과 같은 용액에 첨가되어질 수 있다. 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드 및 혼합물은 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 상기 표적 생물분자 사이의 결합에 적합한 조건하에서 접촉된다. 결합에 적합한 조건은 상기 표적에 따라 달라지며, 당업자에 의하여 각 표적 생물분자에 대하여 용이하게 결정될 수 있다.
일단 상기 표적 생물분자가 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 부착되어지면, 즉 포획되어지면(captured), 상기 고체 지지체는 여과와 같은, 임의의 적합한 수단에 의하여 상기 혼합물로부터 분리된다. 여과되는 경우, 상기 고체 지지체는 적합한 용매로 세척되어 상기 표적 생물분자를 방출하지 않으면서 결합되지 않은 불순물을 제거하는 것이 바람직하다. 세척한 후, 상기 포획된 표적은 임의의 적합한 수단에 의하여 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다. 상기 포획된 생물분자가 폴리뉴클레오티드인 경우, 상기 이중가닥은 적합한 온도, 일반적으로 90 ℃에 노출시킴으로써 변성되어져, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드로부터 상기 포획된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 방출한다. 다음으로, 상기 고체 지지체는 예를 들면, 여과에 의하여 상기 방출된 표적 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다. 상기 포획된 생물분자가 단백질인 경우, 상기 고체 지지체는 적합한 용출용액으로 세척되어져, 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드로부터 상기 포획된 단백질을 방출하도록 한다. 적합한 용출 용액은 상기 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 달라진다.
본 발명의 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 혼합물, 예를 들면, 조직 시료로부터 얻어진 혼합물 중의 표적 생물분자의 존재 또는 부존재를 검출하기 위하여 사용되어질 수도 있다. 따라서, 상기 개시된 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 특정한 조직 형태 (type)가 특정한 서열을 갖는 mRNA 또는 폴리뉴클레오티드와 결합하는 것으로 알려진 특정한 단백질을 발현하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기 표적 생물분자(예, 단백질, RNA, cDNA 또는 단일가닥 DNA)와 선택적으로 결합하는 것이 선택된다. 일단 상기 원하는 표적 생물분자에 대하여 적합한 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 선택되어지면, 상기 혼합물을 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 상기 표적 생물분자 사이의 결합에 적합한 조건하에서 상기 선택된 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있는 상기 고체 지지체와 접촉시킨다. 다음으로, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기 혼합물로부터 분리되어지고, 임의의 적합한 수단에 의하여 검사하여, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드에 부착된 표적 분자의 존재 또는 부존재를 검출한다. 또한, 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같이, 표적의 존재 또는 부존재를 검사하기 이전에, 상기 고체 지지체로부터 상기 결합된 표적을 분리하기에 적합한 조건하에 두어질 수 있다.
또한, 상기 개시된 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 특정한 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 신규한 단백질을 확인하는데에 사용될 수 있다. 상기 서열을 갖는 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같이, 제조되고 고체 지지체에 부착된다. 다음으로, 검사되어질 생물학적 시료는 상기 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 표적 단백질 사이의 결합에 적합한 것으로 여겨지는 조건하에서 상기 고체 지지체 결합 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드와 접촉된다. 다음으로, 포획된 단백질의 존재 또는 부존재를 상기한 바와 같이, 검사한다. 다음으로, 임의의 포획된 단백질이 분리되고 특성화될 수 있다. 미지 물질에 결합하는 정확한 조건은 알려져 있지 않을 수 있고, 동일한 시료에 대하여 복수의 결합 조건하에서 검사되어질 수 있다는 것은 이해할 수 있는 것이다.
실시예 1 : 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드의 제조
아머샴 파마샤 바이오테크 사(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)의 아미노 관능기화된 프라이머 고체 지지체를 DMT-O-CH2CH2SO2CH2CH2-O-CO-CH2CH2-COO-니트로페닐로 유도체화하였다. 지지체의 적재량은 약 50 μmol/ 고체지지체 g이었다.
DMT-O-헥실포스포르아미다이트의 합성은 Seela 및 Kaiser,Nucleic Acids Research15:3113 (1987), Wilk, 등,Nucleic Acids Res.18:2065 (1990) 및 Nelson 등,Nucleosides Nucleotides16:1951 (1997)에 개시된 과정에 의하여 수행될 수 있다.
상기 DMT 헥실포스포르아미다이트는 고상 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 표준 포스포르아미다이트 방법을 사용하여 상기한 아미노 관능기화된 고체 지지체에 결합되었다. 이 산물로부터, 하기 3′-O-치환된 폴리데옥시뉴클레오티드를 5'-O-DMT-2'-데옥시뉴클레오시드 3'-O-(2-시아노에틸-N,N´-디이소프로필) 포스포르아미다이트: GGT TGG TGT GGT TGG -OPO-(O-헥실)포스페이트 (서열번호 1) (트롬빈 결합압타머(aptamer)) 및 TAA TAT GAC TCA CTA TAG GTA ACT T-OPO-(O-헥실)-포스페이트 ("SP2")(서열번호 2)를 사용하여 고상 폴리데옥시뉴클레오티드 합성을 위한 표준 과정에 따라 제조하였다. 조산물을 이온교환 HPLC 및 MALDITOF 질량 스펙트로미터에 의하여 분석한 다음, 이온교환 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 상기 원하는 풀링된 분획들을 탈염하여 과량의 소듐 클로라이드를 제거하고, 얻어진 산물을 이온교환 HPLC 및 MALDITOF로 다시 분석하였다. 이들 물질의 순도는 예상되는 분자량에 대하여 90% 이상인 것으로 밝혀졌다. 링커를 갖는 트롬빈 결합 압타머: 분자량은 4973이었으며, 이온교환 HPLC에 의한 순도는 94.4%이었다; 링커를 갖는 SP2 올리고뉴클레오티드: 분자량은 7906이고, 이온교환 HPLC에 의한 순도는 96.7%이었다.
실시예 2 - 아미노-세파로즈 수지 상에 3′-O-치환된 폴리뉴클레오티드의 고정화
아미노-세파로즈 수지는 아머샴 파마샤 바이오테크 사로부터 입수하였다. 이 지지체를 사용하기 전에 물 (수지의 3X)로, 0.5 M 소듐 클로라이드 용액 (3X) 및 다시 물 (5X)로 세척하였다.
비특이적 결합 연구;
상기 세척된 수지 약 3.0 ml를 약 130.0 광학단위 (OD)의 올리고뉴클레오티드 D(TAA TAT GAC TCA CTA TAG GTA ACT T)-O-PO-(O-헥실)-포스페이트 용액과 함께 플라스틱 바이알에 넣었다. 이 현탁액을 가끔 혼합하면서, 20시간 동안 실온에서 방치하였다. 이 현탁액에, 결합제 EDC는 첨가하지 않았다.
상기 수지를 소결된(sintered) 유리 깔대기에 옮겼다: 상기 액체를 따라 내고(drained) 눈금이 매겨진 튜브에 수집하였다. 다음으로, 상기 수지를 물, 10 mM 소듐 히드록사이드 용액을 포함하는 2.0 M 소듐 클로라이드(3x 12 ml), 물 (2x 12 ml)로 세척하고 및 마지막으로 소듐 클로라이드 용액(3x 11ml)로 세척하였다.
APB 스펙트로포토미터를 사용하여 260 nm에서의 흡광을 측정하였다. 하기 측정 결과를 얻었다.
1. 따라진(drained) 액체와 물 세척물의 총 흡광도는 0.022이었다.
2. NaCl/NaOH 세척물의 총 흡광은 126.46이었다.
3. 물 세척물의 총 흡광도는 1.62이었다.
4. NaCl과 NaOH 세척물의 총 흡광도는 1.56이었다.
상기 세척물로부터 얻어진 총 흡광도는 : 129.66 OD이었다.
이 결과는 소듐 클로라이드 용액으로 세척함으로써 완전하게 제거될 수 있는, 아미노-세파로즈 상에 올리뉴클레오티드의 비특이적 결합이 있다는 것을 나타낸다.
올리뉴클레오티드의 공유적 또는 특이적 연결
10 OD 단위의 트롬빈 결합 압타머 올리뉴클레오티드 유도체 (0.545 ml)를 220 ml의 세척된, 아미노 세파로즈 수지에 첨가한 다음, 200 ml의 pH 6 0.1 M EDC/0.1 M N-메틸-이미다졸 용액에 첨가하였다. 이 현탁액을 실온에서 3 일 동안 배양한 다음, 5 ℃에서 2일 동안 보관하였다.
상기 수지의 소량의 시료를 취하여 세척 용액의 흡광이 260 nm에서 0.003 값이 될 때까지 10 mM 소듐 히드록사이드 용액 중의 2.0 M 소듐 클로라이드로 세척하였다. 다음으로, 이 수지를 Milli-Q 물로 세척하였다. 다음으로, 약 2.5 ml의 수지를 45 E C에서 1.5 ml 1.0 N 염산용액으로 60 분 동안 처리하였다. 실온으로 냉각하고 원심분리한 후, 상기 맑은 용액의 500 : 1을 취하여, 1.0 ml 로 희석하고 260 nm에서의 흡광을 측정하여 그 값이 0.130 OD 임을 확인하였다. 그러므로, 상기 2.5 ml의 수지로부터 용액에 방출된 총 OD = 0.39 OD (1.5 ml)이었다. 상기 수지의 적재량 = 0.156 OD 올리뉴클레오티드/수지 ml이었다. 이 결과로부터, 상기 수지에 적재된 올리뉴클레오티드의 농도는 1.04 μM로 계산되었다.
약 220 ml의 세척된 수지를 플라스틱 용기에 담았다. 이 용기에 3600 OD 단위의 트롬빈 결합 압타머 올리뉴클레오티드 GGT TGG TGT GGT TGG-OPO-O-헥실포스페이트를 첨가하고 혼합하였다. 다음으로, 상기 결합 용액(coupling solution) (200 ml의 0.1 M EDC/0.1 M N-메틸이미다졸, pH 6)을 첨가하고 실온에서 3 일 동안 배양하였다. 분액을 취하여, 소듐 클로라이드, 소듐 히드록사이드 용액, 물 및 다시 소듐 클로라이드 및 소듐 히드록사이드 용액으로, 세척물에서 260 nm에서의 흡광이 관찰되지 않을 때까지 세척하였다. 다음으로, 상기 수지를 물로 세척하여 소듐 히드록사이드를 제거하였다.
상기 수지 500 ㎕를 2.0 ml의 1.0 N HCl로 1.5 시간 동안 배양하였다. 얻어진 맑은 용액의 흡광도를 측정하고, 적재량이 3.0 OD/수지 ml임을 확인하였다. 상기 벌크 수지를 5 E C에서 2일 더 보관한 다음, 전체 수지를 2.5 L의 2.0 M 소듐 클로라이드, 10 mM 소듐 히드록사이드, 1.0 L 소듐 클로라이드 및 10 mM 소듐 히드록사이드로 세척하였다. 상기 세척물의 흡광도는 0.002 OD로 확인되었다. 마지막으로, 500 ml Milli-Q 물로 세척하여 소듐 클로라이드와 염기를 제거하였다. 약 1.0 ml의 상기 세척된 수지를 1.0 N HCl 2.0 ml 중에서 45 EC에서 60 분 동안 배양함으로써 적재량을 다시 결정하였다. 맑은 액체의 흡광도를 측정하고, 적재량이 4.8 OD/수지 ml 인 것을 확인하였다. 이 결과로부터, 상기 수지에 적재된 올리뉴클레오티드의 농도는 32.0 μM로 계산되었다.
약 30 ml의 세척된 아미노-세파로즈 수지를 25 ml 의 100 OD 단위의 SP2 올리뉴클레오티드를 포함하는 0.1 M EDC/0.1 M N-메틸이미다졸로 실온에서 배양하였다. 배양 약 40 시간 후, 상기 수지의 분액(aliquot)을 취하여, 상기 세척물 중에 260 nm에서의 흡광이 없어질 때까지 2.0 M NaCl/10 mM NaOH의 용액으로 세척하였다. 이의 적재량을 상기한 바와 같이 결정하고, 1.78 μM인 것을 확인하였다. 상기 벌크 물질을 상기 과정에 따라 세척하였다. 다시 적재량을 결정하고, 약 1.75 μM 농도인 것을 확인하였다.
약 30 ml의 세척된 수지를 160 0D 단위의 SP2 올리뉴클레오티드를 포함하는 0.1 M EDC/0.1 M N-메틸이미다졸의 25 ml 용액으로 실온에서 배양하였다. 상기한 바와 같이 적재량을 2일 (약 12 μM), 4일 (약 23 μM), 5일 (약 25 μM) 및 6일 (약 26 μM)에 추정하였다. 캡핑 이전의 상기 벌크 물질의 최종 적재량은 약 27 μM로 확인되었다.
수지에 적재된 트롬빈 결합 압타머 7-8 ml를 안정성 시험에 사용하였다. 이 수지의 적재량은 캡핑 전에 약 32 μM이었다. 이 수지를 40ml의 1.0 M NaOH 용맥(10x) 및 물 (40 mlx3)로 세척하였다. 이 물질의 적재량을 결정하고, 약 31 μM인 것을 확인하였다. 다음으로, 상기 수지를 40 ml의 1.0 M NaOH 용액(20x)으로 세척한 다음, 물 (40 mlx3)로 세척하고, 적재량을 결정하여 약 30.8 μM인 것을 확인하였다. 1.0 M NaOH로 세척하는 것을 40 ml로 20 회 반복하였다. 물로 세척한 후, 적재량을 다시 결정하여, 약 30.8 μM 인 것을 확인하였다. 이들 실험 결과는 강 염기 용액에 의한 유의한 물질의 방출이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 상기 적재된 아미노 세파로즈 상의 유리 아미노 기의 버퍼된 아세트산 용액으로의 캡핑
500 ml의 아세트산 용액(0.2 M)을 탈이온수로 제조하고, 이 용액의 pH를 N-메틸이미다졸을 첨가하여 6.0으로 조정하였다. 이 용액의 약 동부피를 올리뉴클레오티드로 적재된 상기 수지에 첨가하였다. 상기 현탁액을 혼합하고, 고체 EDC (결합제)를 최종 농도 0.1 M로 첨가하였다.
배양 20 시간 후, 소량의 시료를 취하였다. 각 시료를 물 (20 mlx3), 1.0 M NaOH (20 mlx3), 1.0 M NaCl/10 mM NaOH (20 mlx3) 및 마지막으로 물 (20 mlx2)로 세척하였다. 상기 세척된 시료를 50 ℃에서 5 분 동안 니하이드린 용액으로 처리하였다. 유리 아민 기능이 검출되지 않았다.
본 발명을 바람직한 구체예를 참조하여 구체적으로 나타내고 기술하였으나, 당업자라면 첨부된 청구의 범위에 의하여 포괄되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 상세한 내용에 있어서 다양한 변경이 가해질 수 있음을 알 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기 식의 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드로서:
    식 중 Q는 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드이고;
    각 X는 독립적으로 0 또는 S이고;
    Y는 불활성 스페이서 기이고; 그리고,
    R은 고체 지지체인 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  2. 고체 지지체 결합 3'-O- 또는 5′-O-치환된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 3'-O- 또는 5′-O-치환체는 하기 구조식에 의하여 나타내지고:
    식 중 각 X는 독립적으로 0 또는 S이고;
    Y는 불활성 스페이서 기이고; 그리고,
    R은 고체 지지체이고, 상기 3'-O- 및 5′-O-치환된 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 것임을 특징으로 하는, 3'-O- 또는 5′-O-치환된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Y는 직쇄 히드로카르빌 기 또는 폴리알킬렌 글리콜 기이고, 각 X는 O인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Y는 C3-C1O 알킬렌 기인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리데옥시뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 아미노 세파로즈, 아미노 폴리스티렌, 아미노 실리카 비드, 실리카 제어 공극 유리 비드, 아크릴레이트 근거 아미노 지지체 또는 메타크릴레이트 근거 아미노 지지체인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고체 지지체는 아미노 세파로즈인 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드.
  10. 2'-O-, 3'-O- 또는 5'-O-치환된 폴리뉴클레오티드의 말단 포스페이트를 고체 지지체에 달려 있는 아민 또는 히드록실기로 에스테르화 또는 아미드화시키는 단계를 포함하는 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서, 상기 2'-O-, 3'-O- 또는 5'-O-치환체는 하기 구조식으로 표시되고:
    각 X는 독립적으로 O 또는 S이고; Y는 직쇄 히드로카르빌 기 또는 폴리아킬렌 글리콜 기인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 말단 포스페이트는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드의 존재하에서 에스테르화 또는 아미드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 고체 지지체는 아미노 세파로즈, 아미노 폴리스티렌, 아미노 실리카 비드, 실리카 제어 공극 유리 비드, 아크릴레이트 근거 아미노 지지체 또는 메타크릴레이트 근거 아미노 지지체인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 고체 지지체는 아미노 세파로즈인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. a) 폴리뉴클레오티드가 표적 생물분자에 선택적으로 결합하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 표적 생물분자가 상기 폴리뉴클레오티드에 결합하기에 적합한 조건 하에서 혼합물을 상기 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 혼합물로부터 표적 생물분자를 분리하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 분자는 표적 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 혼합물로부터 상기 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 분리하고 상기 폴리뉴클레오티드로부터 상기 표적 단백질을 용출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 표적 분자는 상기 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 표적 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 혼합물로부터 상기 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 상기 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드로부터 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 변성시키고 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
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