JPH0529439B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、アラビノ核酸並びにDNAまたは
RNAハイブリツド形成アツセイにおけるこの新
規ポリヌクレオチドプローブの使用、特に全ての
構成ヌクレオチド中に結合部位を有するプローブ
に関する。これによりプローブの各ヌクレオチド
に対して検出部分を結合することができ、従つて
それが検出感度の改良にもつながる。 DNA及びRNAアツセイにおいて使用されるハ
イブリツド形成プローブは、プローブが分析下の
試料中の「標的」DNAまたはRNAの相補的な鎖
とハイブリツド形成した後に二重鎖の検出を容易
にするために、様々の方法で標識される。最も一
般的には、プローブは、プローブの3′または5′−
末端上に放射能標識されたヌクレオチドを酵素で
組み込むことによつて標識することができる
〔A.M.Maxamらによる「Meth.Enzymol.
Volume」65、499〜560（1980）〕。代替的に、高
レベルの放射能標識されたヌクレオチドはニツク
トランスレーシヨンにより取り込むことができる
〔P.W.J.Rigbyらによる「J.Mol.Biol.」113、237
〜251（1977）〕。後者の方法は、プローブ中の構成
ヌクレオチド当り１の放射性リンを組み入れるこ
とができるという固有の利点を有しており、この
ようなプローブを使用するアツセイは、ハイブリ
ツド形成アツセイにおける最も高感度の検出限度
によつて特徴づけられている。これらのプローブ
の目立つた欠点は、放射性同位元素の使用にとも
なう危険性と不都合があげられる。 第２の型の標識は、プローブと１のヌクレオチ
ドの中に組み込まれたビオチニル化されたピリミ
ジン塩基（ウラシルまたはアデノシン）を含むヌ
クレオチドの混合物とを酵素を用いて合成するこ
とを含む〔例えばP.R.Langerらによる「Proc.
Natl.Acad.Sci.」米国78、6633〜6637（1981）〕。
代替的にビオチニル化されたヒストンH1タンパ
ク質は、DNA中の塩基と化学的に架橋結合され
て標識されたプローブを形成することができる
〔M.Rengによる「EMBO J.」２(6)、817〜822
（1983）〕。標的DNA相補的な鎖に対してプローブ
をハイブリツド形成した後、このハイブリツドを
プローブ中のビチオン部分に対して強固に結合し
ているアビジンに結合しているリポーター分子に
よつて処理する。該リポーターは、アビジンに結
合している透明な重合性ミクロスフエア〔O.C.
Richardsらによる「Proc.Nath.Acad.Scl.」米国
76(2)、676〜680（1979）〕、またはアビジン−フエ
リチン〔A.Sodjaらによる「Nucl.Acids Res.」
５(2)、385〜401、（1978）〕のいずれかであり得
る。これら各々は、電子顕微鏡により可視化する
ことができる。または、リポーター酵素の基質に
より処理された場合に、可視的に検出可能な着色
物質を生成するアビジン−酵素複合体でありうる
〔J.J.Learyらによる「Proc.Natl.Acad.Sci.」米国
80、4045〜4049（1983）〕。このようなプローブに
基づくアツセイは、放射性物質の使用は避けるこ
とができるが、与えられたプローブ分子中わずか
約２％のヌクレオチドのみが、試料DNAの相補
的鎖に対するプローブの特異性を減ずることなく
ビオチン部分により誘導されうる。この特異性の
減少は、ビオチン部分の存在によつて相補的塩基
が適切に組み合わされる能力が変化してしまうこ
とに起因する。放射性プローブに対するこれらの
プローブ中への標識の組み込みの減少は、検出感
度を低いものとする。 第３の型の標識は、ハイブリツド形成後にハイ
ブリツド中の酵素が基質により処理されて着色物
質を生じさせるようになつているプローブに直接
結合している酵素である。この酵素は、プローブ
中の塩基（M.Rengらによる「Nucl.Acids Res.」
12(8)、3435〜3444（1984）〕、またはプローブの末
端に化学的に結合されているある長さのオリゴヌ
クレオチドに相補的なDNAの他の鎖中の塩基
〔J.G.Woodheadらによる「Biochem.Soc.，
Trans.」12(2)、279〜280（1984）〕に直接結合す
ることができる。後者の場合において、プローブ
は相補的な標的DNAに対してハイブリツド形成
され、このハイブリツドは酵素標識を含むオリゴ
ヌクレオチドにより処理される。標識されたオリ
ゴヌクレオチドのこの鎖は、プローブの末端に化
学的に結合している相補DNAの一重鎖末端と結
合する。酵素リポーターの可視化は、酵素の基質
を着色物質へ転化することによつて達成される。 この操作に関連する主な欠点は、酵素結合が低
レベルであり、ハイブリツド形成の操作手順にお
いて典型的に使用される厳密な条件（例えば高め
られた温度、非水性溶媒）下におかれた場合に、
酵素活性が失なわれることに起因する。これらの
標識方法のうち後者のものに関連する第２の欠点
は、酵素標識を含有するオリゴヌクレオチドの合
成鎖が試料中に元来存在するヌクレオチドの配列
に対して相補的になり得る可能性にある。このよ
うに、ハイブリツド形成プローブの末端に結合さ
れた塩基配列を損なう上に、酵素標識されたオリ
ゴヌクレオチドは、相補的塩基の自然の配列に対
して非特異的に結合して、それが負の対照即ちブ
ランクとして使用する試料中の背景的問題点につ
ながる。 第４の型の標識は、発蛍光団をプローブの成分
ヌクレオチド中の塩基〔C.H.Yangらによる「J.
Biochem.」13、3615〜3620（1974）〕、プローブの
3′−末端〔R.W.Richardsonらによる「Nucl.
Acids Res.」11(8)、6167〜6184（1983）〕、または
5′−末端〔C.H.Yangらによる「Arch.Biochem.
Biophys.」155、70〜81（1973）〕のいずれかに結
合させることを含む。上記のように、これらの方
法の感度は、プローブの各複製中に組み込まれう
る少数の標識によつて限定される。第５の型の標
識は、プローブまたは標識−プローブ２本鎖中の
ある抗原決定基に対応する抗体の使用を含むもの
である。この前者の場合において、抗原決定基
（例えばビオチン、臭素、Ｎ−アセトキシ−２−
アセチルアミノフルオレン）はプローブのヌクレ
オチド中の塩基と共役結合する〔例えばL.
Manuelidisらによる「J.Cell Biol.」95、617〜
625（1982）〕。これらの抗原決定基は特異的ハイブ
リツド形成を妨害し、プローブの有用性を制限す
ることがある。後者の場合において、二重鎖
DNA−RNAハイブリツド自体は、DNA−DNA
及びRNA−RNA二重鎖より免疫学的に区別する
ことができる〔G.T.Rudkinらによる「Nature」
265、472〜473（1977）〕。このプローブ−標的二重
鎖中の抗原決定基は、抗体−発蛍光団抱合体及び
蛍光顕微鏡により検出された。標識されたプロー
ブは、酵素（L.Manuelidisらによる前述の文献）
またはコロイド状金〔N.J.Hutchinsonらによる
「J.Cell Biol」95、609〜618（1982）〕が抱合され
ている抗体によつても検出することができる。ま
た、最終的な感度は、ハイブリツド形成の結果を
検出するのに有用な標識の数によつて限定され
る。 本発明は、ハイブリツド形成効率または特異性
に殆んど影響を与えないで、ヌクレオチド１個当
り１個の割合で、最大数の非放射性標識を各プロ
ーブ中に組み込むことによつて、従来技術の限界
を打ちやぶつたものである。 本発明は、新規な核酸、アラビノ核酸に関す
る。 核酸の配列を同定するための本発明の方法は、 (a) 標的核酸を一重鎖にし、 (b) この一重鎖にされた核酸を支持体上に固定
し、 (c) この一重鎖にされた核酸を一重鎖にされたア
ラビノ核酸プローブとハイブリツド形成させ、 (d) 支持体を洗浄してこの支持体上に形成された
ハイブリツド中に組み込まれていないアラビノ
核酸を除去し、次いで (e) このハイブリツドを抗アラビノース抗体−標
識抱合体と接触させその標識を検出することに
よつて、支持体上に形成されたハイブリツド中
のアラビノ核酸の存在を決定する段階 からなる。 本発明は、DNA及びRNAアツセイのための新
規ハイブリツド形成プローブの合成及び使用にも
関する。この新規プローブ、アラビノ核酸
（ANA）は、RNA及びDNA各々中で見出される
従来のリボースまたはデオキシリボース糖に取つ
て替れるアラビノース糖を有する。この特別の糖
は、アラビノース糖及びその糖を含有するプロー
ブを選択的に検出するために使用され得る抗アラ
ビノース抗体−標識に対して結合部位を与える。
この糖アラビノースは、この合成プローブにのみ
見られ、天然のDNAまたはRNAには見出されな
いため、検出抗体は、プローブ中のアラビノース
部分に対してのみ結合する。 プローブは化学的方法または酵素を用いる方法
のいずれかによつて合成することができる。化学
的合成は、リボースまたはデオキキシリボースで
はなくアラビノースを含有するヌクレオシド中の
アラビノース糖の2′，3′、及び5′位の炭素原子上
に保護基を導入することを含む。このようなヌク
レオシドは商業的に入手可能である。保護基の結
合の化学的性質及び方法は、リボヌクレオシド及
びデオキシヌクレオシド〔G.H.Hakimeliahらに
よる「Can.J.Chem.」60、1106〜1113（1982）〕に
対して明らかになつており、それをアラビノヌク
レオシド中の相当する位置の保護についても採用
することができる〔K.K.Ogilvieらによる「Can.
J.Chem.〕61、1204〜1212（1983）〕。一度アラビ
ノヌクレオシドの保護が達成されると、アラビノ
核酸プローブの化学的合成は、DNA及びRNAプ
ローブについて使用される方法において進行させ
ることが可能であつて、その中で、適当なヌクレ
オチドは、連続的に連結して、分析下試料中の標
的DNAまたはRNA中のヌクレオシド配列に対し
て相補的なヌクレオチド鎖を形成する（M.H.
Caruthersらによる「Genetic Engineering」４、
１〜17（1982））。 分析用の核酸には、多くの人手源がある。これ
らは、中でも臨床試験片；細菌、ビールスクラミ
ジア、リケツチア、マイコプラズマのような様々
の微生物；原生動物；及び植物を包含する。抽出
は、ハイブリツド形成アツセイのために供給源か
ら核酸を採集するための１つの慣用方法である。
本発明のANAプローブを使用するための操作手
順は、従来のハイブリツド形成操作におけるもの
と酷似している。標的DNAまたはRNAはまず一
重鎖にされ次いで支持体上に固定化される。この
固定化された一重鎖核酸をその後、標的中の塩基
配列に対して相補的なアラビノ核酸プローブによ
り処理する。アラビノ核酸プローブと相補的塩基
配列とをハイブリツド形成させる。ハイブリツド
形成されなかつた余分のANAプローブを除去す
べく洗浄した後、プローブ−標識ハイブリツドを
抗アラビノース抗体−標識抱合体により処理す
る。 抗体自体は、アラビノース中のC2キラル部位
またはアラビノースもしくはANA構造中の他の
抗原決定基に関連するC2部位に対して形成され
る。〔Okabayashiらによる「Cancer Research」
37、619〜624（1977）〕抗体−抱合体は従来の方法
により調製することができる。標識は、酵素、蛍
光、化学ルミネセンスまたは高分子であり得り、
好ましいのは酵素である。 抗体−標識抱合体はアラビノース糖に特異的に
結合するが、天然のRNAまたはDNA中に存在す
るリボースまたはデオキシリボースには結合しな
い。系より過剰の未結合抗体−酵素抱合体を除去
するための洗浄のような処理の後に、これを酵素
の支持体により処理して、試料中の標的核酸の存
在を示す着色物質のような検出可能な信号を生成
する。酵素以外の標識ももちろん適当に検出する
ことができる。 代替的には、酵素または他の標識に抱合し得る
レクチンのような他の結合剤の使用も考えること
ができる。このような抱合体のためのアツセイ方
法も上記の方法と類似のものである。 アラビノ核酸プローブはいくつかの独特の利点
を有している。１のアラビノース結合部位はハイ
ブリツド形成プローブの各ヌクレオチド中に組み
込まれることができるので、各ヌクレオチドは、
放射性同位元素により通常得られるレベルにおい
て標識するためにそれに結合されている抗アラビ
ノース抗体標識を有することができる。同時に、
放射性物質の危険も避けられる。加えて、これら
の充分に標識されたプローブは、放射標識された
プローブが放射標識の高エネルギー崩壊物質によ
る溶解のために受けるような減成を、受けること
はない。さらに、ANAの検出性は、プローブの
糖骨格中のC2炭素原子に関する転化されたキラ
リテイに基づくものであり、またC2炭素原子に
関する化学結合は、プローブまたはプローブ標的
ハイブリツドのらせん構造内またはらせん構造間
の構造の決定に必要であるので、プローブの特異
性及びプローブ標識のハイブリツドの安定性は著
しく影響を受けるとは考えられない。塩基の相補
的配列に対するプローブの特異性を変えることな
く達成されるANAプローブの高度の標識によつ
て、本発明のプローブは従来技術の化学的に誘導
されたプローブよりも優れたものとされる。最後
に、プローブ中のアラビノースは抗体−酵素抱合
体を使用して特異的に検出されることができる。
酵素標識の使用の利点は、基質から生成物への大
量の転換による高度のシグナル拡大による。この
ように、アラビノース検出のための抗体−酵素抱
合体は、放射能標識されたプローブの高度なプロ
ーブ標識特性の利点のみならず、酵素による非放
射分析アツセイのシグナル拡大の利点も有するも
のである。 実施例 １ Ａ プローブ合成のための保護されたアラビノ核
酸の化学的合成 ヌクレオチドの化学的重合化によるプローブ合
成は、塩基グアニン、シトシン、アデニン及びウ
ラシルまたはチミンを含む少くとも４つの保護さ
れかつ活性化されたアラビノ核酸の入手が要求さ
れる。個々のこれら保護された核酸は、商業的に
入手可能な相当するヌクレオチドから調製するこ
とができる。 ヌクレオシドに対する保護及び活性化基の附加
に関しては、保護されかつ活性化されたヌクレオ
シドアラビノウラシル（araU）の調製について
説明する。他のアラビノ核酸は同一の方法により
保護されかつ活性化された。加えてシトシン及び
アデニンを含むヌクレオシドへは塩基自体上でベ
ンソイル基の形態をなす保護基を要求し、一方グ
アニンはイソブチリル保護基を要求した。 第１に、ジメトキシトリチル（DMT）基をア
ラビノースの5′−炭素上の水酸基に導入した。こ
れは、−５℃において30mlのビリジンに溶解した
6.5ミリモルのβ−Ｄ−アラビノウラシルに対し
て、８等分された7.75ミリモルのジメトキシトリ
チルクロライド（DMTCl）を１時間の間隔をお
いて加えた。最後の添加から１時間後に、反応混
合物を氷水中に注加し過剰のジメトキシトリチル
クロライドを消失させ、約25℃において回転蒸発
器上でガム状にした。この生成物、5′−DNT
araUをクロロホルム／メタノールの95/5混合物
を溶離液とするMerck Kieselgel 60シリカゲル
上のカラムで単離した。収率90〜95％であつた。 その後tert−ブチルジメチシリル基
（TBDMS）をアラビノ核酸中のアラビノースの
3′−炭素上の水酸基に導入した。 上記のようにして調製された5′−DMT
araU5.5ミリモルをジメトキシエタン（110ml）
中に溶解し、トリメチルアミン44ミリモルを加え
た。次に硝酸銀16.5ミリモルを加え、混合物を室
温において１時間撹拌した。その後tert−ブチル
−ジメチルシリルクロライド16.5ミリモルを加
え、この反応混合物を室温において５時間撹拌し
た。反応混合物を過して重炭酸ナトリウム10％
の溶液中に入れ、この水性混合物を塩化メチレン
により２度抽出した。有機抽出物を蒸発乾固さ
せ、5′−DMT、3′−TBDMSaraUを酢酸エチル
を溶離液とするMerck Kieselgel 60シリカゲル
ラムにより75％の収率で単離した。 予め調製された5′−DNT、3′−TBDMS araU
5.4ミリモルをピリジン40ml中に溶解し次いで−
45℃に冷却することによつて、ベンゾイル（Bz）
保護基をヌクレオシド中のアラビノースの2′−炭
素上の水酸基を導入した。 塩化メチレン中の過剰の塩化ベンゾイル（6.6
ミリモル）を撹拌された反応混合物に滴加し、滴
加終了後に−45℃において30分間維持した。この
反応混合物を加温し、−20℃において２時間保つ
た。未反応の塩化ベンゾイルを加水分解すべく水
を加えた後に、混合物を回転蒸発装置によりガム
にし、5′−DMT、3′−TBDMS、2′−Bz araU
をトルエン及び酢酸エチルの50/50混合物を溶離
液とするシリカゲルカラム上で単離した。 3′−炭素上の水酸基上の一時的な遮断基
（TBDMS）を、1Mのテトラブチルアンモニウム
フルオラド（THF中）2.5ミリモルによる25℃に
おける0.5時間の5′−DMT、3′−TBDMS、2′−
Bz araU0.78gの処理により除去した。5′−
DMT、2′−Bz araUを酢酸エチルを溶離液とす
るシリカゲルカラムにより単離した。 ヌクレオチドの調製における最終工程は、ホス
フインによる3′−炭素上の水酸基の活性化を含
む。5′−DMT、2′−Bz araU（77μモル）をジイ
ソプロピルエチルアミン48μを含む塩化メチレ
ン0.23ml中に溶解した。次に注射器を用いてＮ，
Ｎ−ジイソプロピルメチルホスフオンアミジン酸
クロライド30μを、20℃において撹拌された反
応混合物へ加えた。15分後に、反応混合物を酢酸
エチルにより希釈し、（飽和）水性重炭酸ナトリ
ウムにより抽出した。有機相を水性重炭酸塩より
分離し、Na₂SO₄により乾燥させ、回転蒸発装置
により減少させて所望の活性化されかつ保護され
たヌクレオチドを生成した。 Ｂ プローブ合成 オリゴマーANAAプローブの合成は、同様の
保護されかつ活性化されたデオキシヌクレオチド
を用いるDNAプローブの生成に対して開発され
た操作に従うことができると考えられる（M.H.
Caruthersらによる「Genetic Engineering」４、
〜17）。これらの操作に従つて、合成における第
１の工程は、スターター誘導されたアラビノヌク
レオチドをシラノール誘導されたシリカ支持体に
加えることよりなる。これは適切な5′−DMT、
2′−Bzアラビノヌクレオシドをコハク酸無水物
と反応させることにより行なわれる。スクシニル
化されたアラビノヌクレオシドは、ｐ−ニトロフ
エノール及びジシクロヘキシルカルボジイミドと
反応させることにより、ｐ−ニトロフエニルエス
テルに転化される。活性化されたヌクレオシド
を、ジメチルホルムアミド、ジオキサン及びトリ
エチルアミンの混合物中において、アミノプロピ
ル−誘導化されたシリカゲルと反応させる。シリ
カ上の未反応シラノール基を、無水酢酸との反応
により遮断した。この工程により3′−末端におい
てそれに結合されたヌクレオシドを有するシリカ
ゲルが得られ、従つてこのヌクレオシドは合成さ
れるプローブの3′−末端に存在する。 次のヌクレオチドをその後シリカ支持体に結合
しているヌクレオシドに加えることができる。上
記のように調製されたシリカ−ヌクレオシド生成
物をアセトニトリル中のｐ−トルエンスルホン酸
により処理して、シリカ支持体に結合したヌクレ
オシドの5′−炭素原子上の水酸基から酸に不安定
なジメトキシトリチル基を除去した。支持体上の
ヌクレオシドを適切なアラビノヌクレオチドホス
フオアミダイトにより縮合して生長するプローブ
の5′−末端へ次のヌクレオチドを加えた。この反
応は、縮合反応を促進させるために乾燥アセトニ
トリル中において、テトラゾールの存在下で行な
われる。支持体上のアラビノヌクレオシドの未反
応5′−水酸基を、ジメチルアミノピリジン中の無
水酢酸との１〜２分間の処理により遮断する。前
記の縮合反応により形成される亜リン酸トリエス
テルは、水性テトラヒドロフラン中におけるヨウ
素と２，６−ルチジンの混合物により１〜２分間
処理することによつて、リン酸エステルに酸化さ
れる。この工程は、ヌクレオチドを生長するプロ
ーブに加えることにより終了する。追加のヌクレ
オチドは、プローブの5′−末端上のアラビノース
中の5′−水酸基から保護基を除去することによつ
て始められる上記の反応手順を繰り返すことによ
り加えることができる。 プローブ配列の合成が完了した場合に、オリゴ
マープローブをジオキサン中のトリエチルアミン
及びチオフエエノール反応させ、各ヌクレオチド
結合中のリン酸トリエステルをリン酸ジエステル
に転化した。その後プローブは濃水酸化アンモニ
ウムによる20℃における３時間の反応によりシリ
カ支持体より分裂させる。この処理により、プロ
ーブ中の各アラビノース部分の2′−水酸基からベ
ンゾイル保護基が、また塩基からすべての保護基
が除去される。オリゴマ−ANAプローブを逆相
液体クロマトグラフイーにより単離し、プローブ
の5′−末端上の最後のジメトキシトリチル基が80
％の酢酸による処理により除去されて精製された
ANAプローブが生成されるが、これはハイブリ
ツド形成アツセイ中での使用に供することができ
る。 Ｃ ハイブリツド形成操作 ANAプローブを使用するための操作手順は通
常利用される様々のハイブリツド形成アツセイの
手順に沿つて行ないうると考えられ、またDNA
またはRNAプローブをANAプローブと置きかえ
ることによる制限は無いものと予測される。最初
に標的または試料の核酸をいずれかの好都合な方
法により調製する。核酸をいずれかの従来方法に
より変性させて一重鎖状態にする。例えばDNA
を適切な緩衝剤中で95℃において５分間加熱する
ことにより変性することができる。代替的に、変
性は、DNAを0.25NのNaOHにより10分間処理
することによつても行なうことができる。この場
合において、変性の後に、同量の酸（例えば
HCl）を加えて一重鎖DNAを含む溶液を中性化
させることが必要である。この点において、
DNAの支持体への結合を最も効果的にするため
に、試料のイオン強度を調節することも必要であ
る。一重鎖にされたDNAの復元率を低下させる
ために、変性されたDNAを氷上で冷却すること
も望ましい。 標的核酸を支持体の表面上で固定化することが
できる。典型的には支持体はニトロセルロース膜
が選ばれていた。この材料を使用する場合は、標
的核酸のアリコートは、膜上にスポツトされるか
またはドツト−プロツトもしくはスロツト−プロ
ツトマニホルドのような装置内に含まれる膜を介
してをゆつくり過することができる。標的核酸
をニトロセルロースに適用した後、膜を乾燥させ
ニトロセルロースへの結合を確実にするために約
80℃において0.5〜2.0時間真空中で加熱した。 支持物質はニトロセルロースに限定する必要性
はない。例えば、Gene Screen （デユポン社
製）またはBiotrans （ICNラジオケミカルズ社
製）のような電荷を有するナイロン支持体をも使
用することができる。核酸を固定する場合には、
膜の製造業者に開発された操作手順を用いるべき
である。これは、ドツト−プロツトマニホルドま
たは試料核酸の電気泳動による分離の後に通常使
用される転移方法（例えばサザン法）の１つによ
つて核酸を膜に固定する場合に適用される。 他の操作手順において、標的核酸はそれを支持
物質に固定化された「捕獲」核酸の鎖にハイブリ
ツド形成することによつて固定化することができ
る。この捕獲核酸は、標的核酸中の短い塩基配列
に対して相補的であり、目的外の実質量の他の核
酸を含みうる溶液からそれを特異的に捕獲する。 支持物質にしつかり固定化された目的の核酸
は、一重鎖にされているかまたは変性された状態
であり、相補的な塩基配例を含むANAプローブ
とのハイブリツド形成にとつて有用である。固定
化された標的核酸及び支持体を次に特異的な
ANAプローブに対する非特異的結合部位を除去
するために一般的なDNA（例えば音波処理された
サケの精子DNA）を含む緩衝溶液により処理す
ることができる。典型的には、この一般的DNA
は、100μg/mlの濃度で緩衝液中に存在し、支持
物質各１cm²に対してこの予備ハイブリツド形成緩
衝液100μが必要とされる。この予備ハイブリ
ツド形成緩衝液は、10％の硫酸デキストランナト
リウム、0.1％の硫酸ドデシルナトリウム、50％
のホルムアミド、並びに塩化ナトリウム、リン酸
ナトリム及びEDTAの混合物であるSSPEを含有
することができる。さらに、この緩衝液はフイコ
ール、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブ
ミンの混合物であるデンハルト（Denhardt）の
試薬をも含むことができる。 核酸が固定化されている支持体は、ANAプロ
ーブが非特異的に結合し得る固定化された核酸上
の部位を遮断するために数時間から一晩の範囲の
時間において、高められた温度（例えば37℃〜65
℃）にて、この緩衝混合物中で予備ハイブリツド
形成される。予備成形の後に、典型的には10〜
100ng/mlである所望の最終濃度となるように
ANAプローブを予備形成用緩衝剤に加えた。そ
の後ハイブリツド形成を適当な高められた温度
（例えば37〜65℃）において、適当な時間、通常
は１晩行なう。 ハイブリツド形成後、支持体に非特異的に結合
し得るANAプローブを除去すべく、一連の緩衝
剤により支持体を洗浄する。典型的には、洗浄の
操作が進行するにつれて、緩衝剤中の塩の濃度を
低下させ洗浄の温度を上昇させた。一連の洗浄の
後に、支持体を適当な緩衝液によりすすぎ、洗浄
用緩衝剤から後で加えられる抗体−酵素抱合体の
活性に悪影響を与えうる試薬を除去した。 Ｄ 抗体の検出 ANAプローブ分子中のアラビノースを検出す
るために、多クローン性または単クローン性のい
ずれかの抗体を使用することができる。多クロー
ン性抗体は変性されたDNAに対する抗体を産出
するために用いられるいかなる好都合な方法によ
つても産生することができる〔例えば、S.Cohn
及びM.W.Liebermanによる「J.Biol.Chem.」
259、12456〜62（1984）〕。同様に、単クローン性
抗体は多数の操作のうちいずれによつても産生す
ることができる〔H.G.Gratznerによる
「Science」218、474〜５（1982））。 適当な担体タンパク質（例えばBSA）に抱合
されているアラビノヌクレオチドは、抗体産生に
おける免疫原としても作用することができる。し
かし、ANAプローブ単独（または相補的核酸に
対してハイブリツド形成されたもの）が好まし
い。代替的には免疫原として作用させるべくプロ
ーブを担体タンパク質に抱合させることもでき
る。Okabayashiらは血漿中の１−β−Ｄ−アラ
ビノフラノシルシトシン（ara−Ｃ）に対する抗
体の産生について報告している（「Cancer
Research」37、619〜624（1977））。これらの抗体
は、2′位にのみ存在するara−Ｕとは異なるデオ
キシシチジンまたはシチジンとは交差反応しな
い。このことは、DNA中のデオキシリボースま
たはRNA中のリボースと交差反応しないANA中
のアラビノースに対して適当な特異性を有する抗
体が産生されうることを非常に強く提案するもの
である。 Ｅ 抗体−酵素抱合体の調製 酵素に対する抗体の抱合は周知の方法により実
施することができる。例えば酵素上のアミノ基と
抗体を結合するためにグルタルアルデヒドを使用
することは、一般的な方法である〔H.Wallinら
による「Cancer Letters」22、163〜170
（1984）〕。この操作手順を用いて、酵素（例えば
パーオキシダーゼ）を18時間室温においてグルタ
ルアルデヒドと反応させる。ゲル過カラム中の
過剰のグルタルアルデヒドを除去した後に、活性
化された酵素を24時間４℃において抗体と反応さ
せる。抗体−酵素抱合体をその後透析、硫酸アン
モニウム沈殿及びゲル過クロマトグラフイーに
より精製する。例えばJ.W.Freytagらによる
「Clin.Chem.」30、417〜420（1984）またはC.C.
Leflerらによる「Clin.Chem.」30、1809〜1811
（1984）に記載されているような異質二官能架橋
剤を使用する抱合操作をも使用することができ
る。パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、アルカリもしくは酸ホ
スフアターゼまたは他のいかなる有用な酵素をも
抗体（またはその断片）に対して抱合されうり、
次いでANAプローブ中のアラビノースの検出の
ために使用することができると考えられる。 Ｆ ハイブリツドの検出 抗体−酵素抱合体の膜に対する非特異的吸着を
減少させるための試薬を含む遮断緩衝剤中におい
て、ハイブリツド形成された試料をインキユベー
トする。典型的には１％のウシ血清アルブミンを
含む緩衝剤を使用する。遮断緩衝剤による処理後
に、抗体が標的核酸に対してハイブリツド形成さ
れたプローブの鎖中の各アラビノー部分を認識し
てかつそれに結合する機会を与えるような時間の
間、膜を適切な抗体−酵素抱合体とともにインキ
ユベートする。抗体−酵素抱合体は、プローブ中
のアラビノースに対して特異的な抗体またはその
断片に対して共有結合した酵素よりなる。 プローブに対して抗体−酵素抱合体が結合した
後に、標的核酸に対してハイブリツド形成したプ
ローブに結合した抱合体を含むようになつた膜
を、一連の緩衝剤で再び洗浄して未結合の抱合体
及び非特異的に結合している抱合体を支持体より
除去する。適当な酵素基質及び／またはクロモゲ
ンを支持体上の生成物とともにインキユベート
し、規定の時間発色現像を進行させた。ハイブリ
ツド形成の程度は、所定時間経過後の発色現像の
程度と現像された全体の発色を測定することによ
り定量することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 3′，5′−ヌクレオチド間結合を有し、1′位に
   結合した塩基を有するアラビノヌクレオチドから
   本質的になる一重鎖にされたアラビノ核酸からな
   り、前記塩基はアデニン、グアニン、シトシン、
   チミンおよびウラシルから本質的になる群から選
   択され、前記塩基は標的核酸配列に相補的である
   配列を有するものである前記標的核酸配列の決定
   のためのプローブ。 ２ (a) 試料中の標的核酸を一重鎖にし； (b) この一重鎖にされた核酸を支持体上に固定
   し； (c) この固定された一重鎖核酸を、ハイブリダイ
   ゼイシヨンが起こる条件下で、3′，5′−ヌクレ
   オチド間結合を有し、1′位に結合した塩基を有
   するアラビノヌクレオチドから本質的になる一
   重鎖にされたアラビノ核酸と接触させ、前記塩
   基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンお
   よびウラシルから本質的になる群から選択さ
   れ、前記塩基は標的核酸配列に相補的である配
   列を有するものであり； (d) 前記支持体を洗浄して、前記支持体上に形成
   されたハイブリツド中に組み込まれていないア
   ラビノ核酸を除去し；次いで (e) 前記支持体を抗アラビノース抗体標識抱合体
   と接触させ、そして前記標識を検出することに
   より前記支持体上に形成されたハイブリツド中
   のアラビノ核酸の存在を決定する 段階からなる標的核酸配列の同定方法。 ３ 標識が酵素である特許許請求の範囲第２項に
   記載の方法。