JP3282129B2 - 固相非分離酵素分析 - Google Patents
固相非分離酵素分析Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 酵素供与体／酵素受容体及び固体表面が関与する均一
系を使用する分析物の測定。
系を使用する分析物の測定。
発明の背景 医療、化学的処理、汚染物質等に於ける多種の分析物
を測定することに絶えず拡大する関心がはらわれてい
る。特定の市場に向けられた種々の系が考案されてい
る。行なわれる分析の数、分析の性質、熟練従業員の採
用可能性、必要とされる感度、並びにその他の個々の因
子に応じて、種々市場の要求が変わる。系は分光光度計
及び螢光光度計の如き多種の装置に一般に適用し得るも
のからTDxの如き特別な装置に専用とされるものまで多
様である。分析は溶液、クロマトグラフィーカラムまた
は吸収性ストリップの使用を伴なってもよく、ここで洗
浄及び分離を伴なう幾つかの工程が必要とされてもよ
く、あるいは系は単に試料を添加し、ついで結果を目視
または装置により読み取ることを伴なってもよい。種々
の分析は、これらの感度、試料中に存在する脂質の如き
その他の成分に対する応答、及び結果を得ることに伴な
う複雑さの程度に於いて多岐にわたる。公衆が分析を行
なうに際し選択するのに有効なプロトコル及び試薬のレ
パートリーを拡大する新規な分析を開発するのに絶えず
関心がはらわれている。
を測定することに絶えず拡大する関心がはらわれてい
る。特定の市場に向けられた種々の系が考案されてい
る。行なわれる分析の数、分析の性質、熟練従業員の採
用可能性、必要とされる感度、並びにその他の個々の因
子に応じて、種々市場の要求が変わる。系は分光光度計
及び螢光光度計の如き多種の装置に一般に適用し得るも
のからTDxの如き特別な装置に専用とされるものまで多
様である。分析は溶液、クロマトグラフィーカラムまた
は吸収性ストリップの使用を伴なってもよく、ここで洗
浄及び分離を伴なう幾つかの工程が必要とされてもよ
く、あるいは系は単に試料を添加し、ついで結果を目視
または装置により読み取ることを伴なってもよい。種々
の分析は、これらの感度、試料中に存在する脂質の如き
その他の成分に対する応答、及び結果を得ることに伴な
う複雑さの程度に於いて多岐にわたる。公衆が分析を行
なうに際し選択するのに有効なプロトコル及び試薬のレ
パートリーを拡大する新規な分析を開発するのに絶えず
関心がはらわれている。
関連文献 米国特許第4,378,428号明細書は、分析に於ける酵素
フラグメントの使用を記載している。ラングレイ（Lang
ley）及びザビン（Zabin）著、Biochemistry（1976年）
15巻、4866〜4875頁及びラングレイ等著、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1975）72巻、1254〜1257頁は、β−ガラク
トシダーゼフラグメント間の相補性を記載している。国
際特許出願WO86/02666及びその優先権に基く特許出願
は、分析に於けるβ−ガラクトシダーゼフラグメントの
使用を記載している。
フラグメントの使用を記載している。ラングレイ（Lang
ley）及びザビン（Zabin）著、Biochemistry（1976年）
15巻、4866〜4875頁及びラングレイ等著、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1975）72巻、1254〜1257頁は、β−ガラク
トシダーゼフラグメント間の相補性を記載している。国
際特許出願WO86/02666及びその優先権に基く特許出願
は、分析に於けるβ−ガラクトシダーゼフラグメントの
使用を記載している。
発明の要約 酵素供与体が特異的結合対の構成員に接合され、そこ
で相補性構成員が固体担体に結合される、分析物を測定
するための方法及び組成物が提供される。分析物は試薬
と組み合され、逐次的に、またはひき続いて酵素受容体
が添加される。こうして、媒体中の酵素活性は試料中の
分析物の量に関連し得る。分析を行なうためのキットが
提供される。
で相補性構成員が固体担体に結合される、分析物を測定
するための方法及び組成物が提供される。分析物は試薬
と組み合され、逐次的に、またはひき続いて酵素受容体
が添加される。こうして、媒体中の酵素活性は試料中の
分析物の量に関連し得る。分析を行なうためのキットが
提供される。
具体的な態様の説明 分離工程を必要としないプロトコルを使用して分析物
を検出するための方法及び組成物が提供される。その方
法では、特異的結合対の構成員の一つが固体基材に結合
される特異的な結合対が関与する。検出可能なシグナル
が酵素の二つの断片を含むシグナル発生系により与えら
れ、小さい方の断片が酵素供与体（“ED"）と称され約1
00個より少ないアミノ酸を有する。酵素供与体は特異的
結合対構成員に結合された標識として作用する。他方の
断片は酵素受容体分子であり、これは酵素供与体と複合
体形成して活性な酵素複合体を生成する酵素受容体は酵
素供与体よりも実質的に大きい。
を検出するための方法及び組成物が提供される。その方
法では、特異的結合対の構成員の一つが固体基材に結合
される特異的な結合対が関与する。検出可能なシグナル
が酵素の二つの断片を含むシグナル発生系により与えら
れ、小さい方の断片が酵素供与体（“ED"）と称され約1
00個より少ないアミノ酸を有する。酵素供与体は特異的
結合対構成員に結合された標識として作用する。他方の
断片は酵素受容体分子であり、これは酵素供与体と複合
体形成して活性な酵素複合体を生成する酵素受容体は酵
素供与体よりも実質的に大きい。
本発明の目的のため、シグナル発生系はβ−ガラクト
シダーゼにより例示され、この場合、酵素供与体は通常
少なくとも35個のアミノ酸の配列（これはCNBr2フラグ
メントを類推し得る）を伴なうβ−ガラクトシダーゼの
最初の75個のアミノ酸の中に含まれるＮ−末端フラグメ
ントである。酵素供与体は天然β−ガラクトシダーゼと
同じ配列を有していてもよく、あるいは１回以上の突然
変異により修飾されてもよい。突然変異は、例えば制限
部位を用いる組換え技術によりシステンまたはリシンの
如き便利な連結基を導入して融合タンパク質を得ること
による酵素供与体を調製することに於ける便利な結果と
してであってもよく、ここで融合はＮ末端またはＣ末端
で起ってもよく、融合ペプチドは分析物と拮抗性であ
り、例えば分析物のエピトープ等と免疫学的に拮抗性で
あるエピトープを有する。酵素受容体は一般に酵素のＣ
末端部分であり一般に少なくとも約100個のアミノ酸で
あり、酵素供与体と供に活性酵素複合体を生成する。酵
素供与体及び酵素受容体に関する詳細については、米国
特許第4,708,929号明細書（1985年４月８日に出願され
た米国特許出願第721,267号）を参照のこと。
シダーゼにより例示され、この場合、酵素供与体は通常
少なくとも35個のアミノ酸の配列（これはCNBr2フラグ
メントを類推し得る）を伴なうβ−ガラクトシダーゼの
最初の75個のアミノ酸の中に含まれるＮ−末端フラグメ
ントである。酵素供与体は天然β−ガラクトシダーゼと
同じ配列を有していてもよく、あるいは１回以上の突然
変異により修飾されてもよい。突然変異は、例えば制限
部位を用いる組換え技術によりシステンまたはリシンの
如き便利な連結基を導入して融合タンパク質を得ること
による酵素供与体を調製することに於ける便利な結果と
してであってもよく、ここで融合はＮ末端またはＣ末端
で起ってもよく、融合ペプチドは分析物と拮抗性であ
り、例えば分析物のエピトープ等と免疫学的に拮抗性で
あるエピトープを有する。酵素受容体は一般に酵素のＣ
末端部分であり一般に少なくとも約100個のアミノ酸で
あり、酵素供与体と供に活性酵素複合体を生成する。酵
素供与体及び酵素受容体に関する詳細については、米国
特許第4,708,929号明細書（1985年４月８日に出願され
た米国特許出願第721,267号）を参照のこと。
特異的結合対構成員/ED接合体は、通常の手段により
調製し得る。特異的結合対または“ミップ（mip）”
（“ミップ”は免疫対の構成員の頭文字である）は、リ
ガンド及びその相補性受容体、通常免疫グロブリンであ
る。しかしながら、或る場合には免疫グロブリン以外の
ものが特異的結合対の構成員として使用され、その範囲
でミップは免疫グロブリンだけでなく空間立体配座及び
疎水性／親水性分布に特異的に結合し得るその他の分子
を含むことが意図される。ミップ上に活性部位（このよ
うに部位は自然に存在しない）を導入するための種々の
技術、例えば活性オレフィン、スルフヒドリル基活性エ
ステル、アゾ基等の導入の如き技術がある。連結の特定
の方法は本発明に重要ではなく、通常の連結基が使用さ
れてもよい。通常、ミップ/ED接合体は結合により直接
に連結されてもよく、あるいは鎖中に約20個以下の原
子、通常10個以下の原子（環式化合物の場合には最長の
経路を数える）をもつ連結基により連結されてもよい。
連結官能基はチオエーテル、アミド、アゾ等を含んでも
よい。ミップ対EDの比は通常平均で約0.2〜1:1〜0.2、
更に通常約0.3〜1:1〜0.3、好ましくは約0.3〜1:1であ
る。ミップ及びEDの全てが複合体として存在することが
望ましい。
調製し得る。特異的結合対または“ミップ（mip）”
（“ミップ”は免疫対の構成員の頭文字である）は、リ
ガンド及びその相補性受容体、通常免疫グロブリンであ
る。しかしながら、或る場合には免疫グロブリン以外の
ものが特異的結合対の構成員として使用され、その範囲
でミップは免疫グロブリンだけでなく空間立体配座及び
疎水性／親水性分布に特異的に結合し得るその他の分子
を含むことが意図される。ミップ上に活性部位（このよ
うに部位は自然に存在しない）を導入するための種々の
技術、例えば活性オレフィン、スルフヒドリル基活性エ
ステル、アゾ基等の導入の如き技術がある。連結の特定
の方法は本発明に重要ではなく、通常の連結基が使用さ
れてもよい。通常、ミップ/ED接合体は結合により直接
に連結されてもよく、あるいは鎖中に約20個以下の原
子、通常10個以下の原子（環式化合物の場合には最長の
経路を数える）をもつ連結基により連結されてもよい。
連結官能基はチオエーテル、アミド、アゾ等を含んでも
よい。ミップ対EDの比は通常平均で約0.2〜1:1〜0.2、
更に通常約0.3〜1:1〜0.3、好ましくは約0.3〜1:1であ
る。ミップ及びEDの全てが複合体として存在することが
望ましい。
リガンドはハプテンまたは抗原のいずれであってもよ
く、一方受容体はほとんどの場合免疫グロブリン、免疫
グロブリンのフラグメント、特に一価のフラグメント、
例えばFab,Fv等、酵素、天然受容体、例えばＴ−細胞受
容体、ホルモル受容体、表面膜受容体、レクチン等の如
き結合タンパク質である。特異的なリガンド及び受容体
の開示については、米国特許第3,996,345号明細書第10
欄〜第17欄を参照のこと（その開示を引用により本明細
書に組み入れる）。重要なその他の分析物はヒトレトロ
ウイルス抗原、例えばHIV−１及びHIV−２、このような
抗原に対する抗体、HTLV−１及びHTLV−２、サイトカイ
ニン等を含む。
く、一方受容体はほとんどの場合免疫グロブリン、免疫
グロブリンのフラグメント、特に一価のフラグメント、
例えばFab,Fv等、酵素、天然受容体、例えばＴ−細胞受
容体、ホルモル受容体、表面膜受容体、レクチン等の如
き結合タンパク質である。特異的なリガンド及び受容体
の開示については、米国特許第3,996,345号明細書第10
欄〜第17欄を参照のこと（その開示を引用により本明細
書に組み入れる）。重要なその他の分析物はヒトレトロ
ウイルス抗原、例えばHIV−１及びHIV−２、このような
抗原に対する抗体、HTLV−１及びHTLV−２、サイトカイ
ニン等を含む。
特異的結合対の構成員の一つは巨大分子、通常固体表
面に結合される。巨大分子は通常約250Kdaより大きい分
子量、更に通常約500Kdaより大きい分子量を有する。巨
大分子はほとんどの場合、多糖類、例えばデキストラン
のように水溶性である。固体表面は壁部、粒子、ストリ
ップ、膜等を含む多くの形態を取り得る。多種の固体が
固定化担体として使用し得る。固体はセファローズ（Se
pharose）、セファデックス（Sephadex）、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリアクリレート、調節細孔ガラス
等を含む。分析条件下で実質的に透明である粒子、例え
ばラテックス粒子が特に重要である。分析が行なわれる
容器はマイクロタイタプレートウェル、試験管、マイク
ロファージ（microfuge）管、等であってもよい。受容
体またはリガンドは固体担体に固定化されてもよく、あ
るいは巨大分子に結合されてもよい。接合の便法が結合
に使用し得る。固定化のため、受容体またはリガンドは
通常、連結基による表面への共有結合的な接合により直
接固定化されてもよく、あるいは少なくとも一つのエピ
トープまたは結合部位の有用性を妨害しないでリガンド
または受容体に結合する受容体により間接的に固定化さ
れてもよい。例えば、アビジンが表面に共有結合的に接
合され、そしてリガンドまたは受容体がビオチンに共有
結合的に接合されてもよく、その結果ビオチン−アビジ
ン複合体はミップと表面との間の連結部として作用す
る。
面に結合される。巨大分子は通常約250Kdaより大きい分
子量、更に通常約500Kdaより大きい分子量を有する。巨
大分子はほとんどの場合、多糖類、例えばデキストラン
のように水溶性である。固体表面は壁部、粒子、ストリ
ップ、膜等を含む多くの形態を取り得る。多種の固体が
固定化担体として使用し得る。固体はセファローズ（Se
pharose）、セファデックス（Sephadex）、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリアクリレート、調節細孔ガラス
等を含む。分析条件下で実質的に透明である粒子、例え
ばラテックス粒子が特に重要である。分析が行なわれる
容器はマイクロタイタプレートウェル、試験管、マイク
ロファージ（microfuge）管、等であってもよい。受容
体またはリガンドは固体担体に固定化されてもよく、あ
るいは巨大分子に結合されてもよい。接合の便法が結合
に使用し得る。固定化のため、受容体またはリガンドは
通常、連結基による表面への共有結合的な接合により直
接固定化されてもよく、あるいは少なくとも一つのエピ
トープまたは結合部位の有用性を妨害しないでリガンド
または受容体に結合する受容体により間接的に固定化さ
れてもよい。例えば、アビジンが表面に共有結合的に接
合され、そしてリガンドまたは受容体がビオチンに共有
結合的に接合されてもよく、その結果ビオチン−アビジ
ン複合体はミップと表面との間の連結部として作用す
る。
ミップは分析の容器の種々の部分に固定化されてもよ
く、またラテックス粒子、多糖類粒子、または結果の読
み取りを妨害しないその他の粒子の如き粒子、特に分散
性粒子あるいはED接合体の活性を減少して活性酵素を与
えるのに役立つその他の固体表面に固定化されてもよ
い。ラテックス粒子の如き多くの粒子は分析媒体中で透
明のようであり、その結果分析は均一法であると考える
ことができる。事実、診断方法に於いて、均一分析は通
常結合標識と未結合標識との間の分離工程を伴なわない
方法を言う。主題分析に於いて、その分析は媒体及び方
法の両方に関して均一であると考えることができる。
く、またラテックス粒子、多糖類粒子、または結果の読
み取りを妨害しないその他の粒子の如き粒子、特に分散
性粒子あるいはED接合体の活性を減少して活性酵素を与
えるのに役立つその他の固体表面に固定化されてもよ
い。ラテックス粒子の如き多くの粒子は分析媒体中で透
明のようであり、その結果分析は均一法であると考える
ことができる。事実、診断方法に於いて、均一分析は通
常結合標識と未結合標識との間の分離工程を伴なわない
方法を言う。主題分析に於いて、その分析は媒体及び方
法の両方に関して均一であると考えることができる。
種々の化合物を固体表面に接合するための方法は文献
に広範な例示が見られる。例えば米国特許第4,366,241
号明細書及び同第4,533,629号明細書を参照のこと。表
面上に固定化されて存在する相補性ミップの量は、バッ
クグラウンド値を最小にするために分析媒体中に存在す
るミップ/ED接合体の全てが表面に実質的に結合される
ことを確実にするのに充分な量である。この方法に於い
て、再現性ある比較的低い値が分析物の不在下で得られ
るべきである。分析物の存在下で、観察値は増加する。
に広範な例示が見られる。例えば米国特許第4,366,241
号明細書及び同第4,533,629号明細書を参照のこと。表
面上に固定化されて存在する相補性ミップの量は、バッ
クグラウンド値を最小にするために分析媒体中に存在す
るミップ/ED接合体の全てが表面に実質的に結合される
ことを確実にするのに充分な量である。この方法に於い
て、再現性ある比較的低い値が分析物の不在下で得られ
るべきである。分析物の存在下で、観察値は増加する。
分析物を測定するために種々のプロトコルが使用し得
る。プロトコルに応じて、種々のその他の試薬が注目の
範囲内での分析物の最大量よりも実質的に過剰で使用し
得る。或るプロトコルは固体表面へのミップの結合を伴
ない、ここで固体表面に結合されたミップは通常注目の
分析物範囲内での分析物の最高値の約５倍以下の制限さ
れた量である。試料及び固定化ミップは適当な時間、通
常少なくとも約１分であって通常約12時間以下、更に通
常約６時間以下、好ましくは約30分以下でインキュベー
トされる。ついで酵素供与体−ミップ接合体が添加さ
れ、ここでミップは固定化ミップの相互構成員または相
補性構成員である。所望により、試料及び酵素供与体接
合体は連続的よりむしろ同時に添加されて競合を与えて
もよい。相補性ミップ間の複合体の生成に充分な時間の
後、その結果酵素接合体が固定化ミップの有効部位に結
合することができ、その後酵素受容体及び基質が添加さ
れてもよく、媒体の酵素活性が平衡状態で、あるいは酵
素活性の変化の割合として測定され、後者の場合、固定
化酵素供与体の量が経時変化する。
る。プロトコルに応じて、種々のその他の試薬が注目の
範囲内での分析物の最大量よりも実質的に過剰で使用し
得る。或るプロトコルは固体表面へのミップの結合を伴
ない、ここで固体表面に結合されたミップは通常注目の
分析物範囲内での分析物の最高値の約５倍以下の制限さ
れた量である。試料及び固定化ミップは適当な時間、通
常少なくとも約１分であって通常約12時間以下、更に通
常約６時間以下、好ましくは約30分以下でインキュベー
トされる。ついで酵素供与体−ミップ接合体が添加さ
れ、ここでミップは固定化ミップの相互構成員または相
補性構成員である。所望により、試料及び酵素供与体接
合体は連続的よりむしろ同時に添加されて競合を与えて
もよい。相補性ミップ間の複合体の生成に充分な時間の
後、その結果酵素接合体が固定化ミップの有効部位に結
合することができ、その後酵素受容体及び基質が添加さ
れてもよく、媒体の酵素活性が平衡状態で、あるいは酵
素活性の変化の割合として測定され、後者の場合、固定
化酵素供与体の量が経時変化する。
接合体の濃度は、相補性ミップの結合親和性、注目の
濃度範囲、分析時間等に応じて広く変化する。通常、接
合体は分析物の注目の範囲内の最低濃度の約0.5倍以
上、好ましくは注目の範囲内の分析物の最低濃度の約１
倍以上であり、示されるように特定のプロトコルに応じ
て10倍以上程度に実質的に過剰であってもよい。いずれ
のプロトコルに於いても、特定の濃度は経験的に最適化
し得る。試薬濃度を最適化する種々の技術は、文献、例
えばウィリアム・オデル（William Odell）編集、Prin
ciples of Competitive Protein Binding Assay（（198
3年）、ジョン・ウィリィ・アンド・サンズ・インコー
ポレーション（Tohn Wiley and Sons,Inc.,ニューヨー
ク、NY、特に141〜147頁）及びエルク（Eruk）等著、An
n.Clin.Biochem.（1984年）21巻、434〜443頁に見られ
る。
濃度範囲、分析時間等に応じて広く変化する。通常、接
合体は分析物の注目の範囲内の最低濃度の約0.5倍以
上、好ましくは注目の範囲内の分析物の最低濃度の約１
倍以上であり、示されるように特定のプロトコルに応じ
て10倍以上程度に実質的に過剰であってもよい。いずれ
のプロトコルに於いても、特定の濃度は経験的に最適化
し得る。試薬濃度を最適化する種々の技術は、文献、例
えばウィリアム・オデル（William Odell）編集、Prin
ciples of Competitive Protein Binding Assay（（198
3年）、ジョン・ウィリィ・アンド・サンズ・インコー
ポレーション（Tohn Wiley and Sons,Inc.,ニューヨー
ク、NY、特に141〜147頁）及びエルク（Eruk）等著、An
n.Clin.Biochem.（1984年）21巻、434〜443頁に見られ
る。
別のプロトコルは、分析物の実質的に全部が結合する
ように試料と実質的に過剰量の相補性ミップ−酵素供与
体接合体とを組合せることを含む。相補性ミップ間の実
質的に完全な複合体生成に充分な時間の後、媒体がミッ
プ／酵素供与体接合体のミップに相補性である固定化ミ
ップと組合される。この状況に於いて、Fabフラグメン
トの如き一価の受容体を使用することが望ましいことが
ある。有効な酵素供与体接合体が固定化ミップに結合す
るのに充分な時間の後、実質的に過剰量の固定化ミップ
がある場合には、酵素受容体及び基質が添加されて、媒
体の酵素活性が前記のように測定される。
ように試料と実質的に過剰量の相補性ミップ−酵素供与
体接合体とを組合せることを含む。相補性ミップ間の実
質的に完全な複合体生成に充分な時間の後、媒体がミッ
プ／酵素供与体接合体のミップに相補性である固定化ミ
ップと組合される。この状況に於いて、Fabフラグメン
トの如き一価の受容体を使用することが望ましいことが
ある。有効な酵素供与体接合体が固定化ミップに結合す
るのに充分な時間の後、実質的に過剰量の固定化ミップ
がある場合には、酵素受容体及び基質が添加されて、媒
体の酵素活性が前記のように測定される。
上記の如き、ミップ/ED接合体はリガンドまたは受容
体ミップを伴なってもよい。分析物が受容体である場合
には、ミップ/ED接合体のミップはリガンドである。ま
た、分析物がリガンドである（また抗体もリガンドとし
て作用し得る）場合には、受容体が通常使用される。種
々の受容体が使用され、それらの受容体は一価である。
即ち、受容体は唯一の特異的結合部位を有する。Fabフ
ラグメントが結合に便利に使用し得る。また、酵素、血
清タンパク質、等の如き天然受容体が使用されてもよ
い。
体ミップを伴なってもよい。分析物が受容体である場合
には、ミップ/ED接合体のミップはリガンドである。ま
た、分析物がリガンドである（また抗体もリガンドとし
て作用し得る）場合には、受容体が通常使用される。種
々の受容体が使用され、それらの受容体は一価である。
即ち、受容体は唯一の特異的結合部位を有する。Fabフ
ラグメントが結合に便利に使用し得る。また、酵素、血
清タンパク質、等の如き天然受容体が使用されてもよ
い。
ミップ/ED接合体は、測定される分析物の最高濃度よ
りも実質的に過剰で添加される。それ故、分析物を実質
的に飽和するのに充分なミップ/ED接合体が存在する。
通常、ミップ/ED接合体対分析物の注目の範囲の最高値
の比は、少なくとも約1.5:1、更に通常少なくとも約2:1
であり、20:1以上程度に高くてもよい。ミップ/ED接合
体の量は一層多い量では臨界的ではないが、過剰の程度
が大きい程、固定化相補性ミップに結合される必要があ
る量が多くなり、観察されるバックグラウンド値が大き
くなる。かくして、インキュベーション期間を最小に
し、且つバックグラウンド値を最小にするように過剰の
程度を制限しつつ注目の範囲にわたって正確な結果を得
るのに充分な分析物との反応を与える過剰量が選択され
る。
りも実質的に過剰で添加される。それ故、分析物を実質
的に飽和するのに充分なミップ/ED接合体が存在する。
通常、ミップ/ED接合体対分析物の注目の範囲の最高値
の比は、少なくとも約1.5:1、更に通常少なくとも約2:1
であり、20:1以上程度に高くてもよい。ミップ/ED接合
体の量は一層多い量では臨界的ではないが、過剰の程度
が大きい程、固定化相補性ミップに結合される必要があ
る量が多くなり、観察されるバックグラウンド値が大き
くなる。かくして、インキュベーション期間を最小に
し、且つバックグラウンド値を最小にするように過剰の
程度を制限しつつ注目の範囲にわたって正確な結果を得
るのに充分な分析物との反応を与える過剰量が選択され
る。
分析物及びミップ/ED接合体は両者とも溶液中にあ
り、ミップ/ED接合体は分析物の比較的低濃度でさえも
大過剰量であるので、比較的短かいインキュベーション
時間が使用し得る。かくして、インキュベーション時間
は通常少なくとも約１分であり約30分以下、好ましくは
約15分以下であり、多くの場合５分で充分である。イン
キュベーション温度は分析物の性質に応じて広く変化し
てもよく、通常４℃以上、好ましくは約15℃以上で約40
℃以下であり、一般には約25〜37℃の範囲である。分析
物及びミップ/ED接合体をその他の試薬の添加前にイン
キュベートすることは必要ではないが、ミップ/ED接合
体に関して表面上の固定化ミップと分析物との間の競合
を有することよりもむしろ分析を逐次行なって相補性ミ
ップ複合体生成を確実にすることが通常望ましい。
り、ミップ/ED接合体は分析物の比較的低濃度でさえも
大過剰量であるので、比較的短かいインキュベーション
時間が使用し得る。かくして、インキュベーション時間
は通常少なくとも約１分であり約30分以下、好ましくは
約15分以下であり、多くの場合５分で充分である。イン
キュベーション温度は分析物の性質に応じて広く変化し
てもよく、通常４℃以上、好ましくは約15℃以上で約40
℃以下であり、一般には約25〜37℃の範囲である。分析
物及びミップ/ED接合体をその他の試薬の添加前にイン
キュベートすることは必要ではないが、ミップ/ED接合
体に関して表面上の固定化ミップと分析物との間の競合
を有することよりもむしろ分析を逐次行なって相補性ミ
ップ複合体生成を確実にすることが通常望ましい。
分析物とミップ/ED接合体との間の反応が一旦起こる
と、分析媒体はミップ/ED接合体に対して相補性である
固定化ミップと接触されてもよい。かくして、固定化ミ
ップに結合されるミップ/ED接合体は酵素受容体（EAと
称する）と活性な酵素を生成するのに実質的に低い能力
を有する。固定化ミップと一緒にすることは、分析媒体
を異なる容器に移し、通常撹拌しながら粒子を分析媒体
に添加し、分析媒体をカラム等の中に通すことを意味し
得る。固定化相補性ミップの量は、分析物と複合体形成
しなかったミップ/ED接合体の実質的に全部を結合する
のに充分である。かくして測定が行なわれる分析媒体は
未複合体化ミップ/ED複合体を、全く含まないものでは
ないとしても、実質的に含まないものであるべきであ
る。
と、分析媒体はミップ/ED接合体に対して相補性である
固定化ミップと接触されてもよい。かくして、固定化ミ
ップに結合されるミップ/ED接合体は酵素受容体（EAと
称する）と活性な酵素を生成するのに実質的に低い能力
を有する。固定化ミップと一緒にすることは、分析媒体
を異なる容器に移し、通常撹拌しながら粒子を分析媒体
に添加し、分析媒体をカラム等の中に通すことを意味し
得る。固定化相補性ミップの量は、分析物と複合体形成
しなかったミップ/ED接合体の実質的に全部を結合する
のに充分である。かくして測定が行なわれる分析媒体は
未複合体化ミップ/ED複合体を、全く含まないものでは
ないとしても、実質的に含まないものであるべきであ
る。
存在するミップ/ED接合体の量に較べて、大過剰量の
固定化ミップが使用し得る。通常、その過剰量は少なく
とも約10倍、更に通常少なくとも約50倍、便利には100
倍以上であり、1000倍以上程度に多くてもよい。固定化
ミップはミップ/ED接合体がその表面に拡散することを
必要とするので、過剰量はミップが固定化された方法及
び溶液中のミップ/ED接合体に対するその有用性に応じ
て変化する。
固定化ミップが使用し得る。通常、その過剰量は少なく
とも約10倍、更に通常少なくとも約50倍、便利には100
倍以上であり、1000倍以上程度に多くてもよい。固定化
ミップはミップ/ED接合体がその表面に拡散することを
必要とするので、過剰量はミップが固定化された方法及
び溶液中のミップ/ED接合体に対するその有用性に応じ
て変化する。
未複合体化ミップ/ED接合体が固定化ミップに結合さ
せるのに充分な時間にわたって分析媒体を固定化ミップ
と供にインキュベートすることは必須ではないが望まし
い。通常、これは少なくとも約１分、更に通常少なくと
も約２分で約30分以下、通常約15分以下、好ましくは約
５分を要する。
せるのに充分な時間にわたって分析媒体を固定化ミップ
と供にインキュベートすることは必須ではないが望まし
い。通常、これは少なくとも約１分、更に通常少なくと
も約２分で約30分以下、通常約15分以下、好ましくは約
５分を要する。
インキュベーション期間後に、残りの試薬が添加され
る。残りの試薬は通常酵素受容体及び基質のみである。
付加的な試薬が添加されてもよく、読み取りが所定期
間、通常約５秒以内、更に通常約10秒以内、好ましくは
約20秒以内で行なわれ、ついで読み取りが測定のため10
〜60秒間隔で行なわれる。添加されるEAの量は、固定化
されないミップ/ED接合体の実質的に全部を複合体形成
するのに充分な量であり、一般には分析物の注目の最高
濃度の量に対して少なくとも等量、通常その量よりも過
剰量、通常約1000倍以下の過剰量、更に通常約500倍以
下の過剰量、一般には少くとも約２倍の過剰量である。
EA及び基質が一旦添加された時、分析が通常のED/EAβ
−ガラクトシダーゼ分析として行なわれる。
る。残りの試薬は通常酵素受容体及び基質のみである。
付加的な試薬が添加されてもよく、読み取りが所定期
間、通常約５秒以内、更に通常約10秒以内、好ましくは
約20秒以内で行なわれ、ついで読み取りが測定のため10
〜60秒間隔で行なわれる。添加されるEAの量は、固定化
されないミップ/ED接合体の実質的に全部を複合体形成
するのに充分な量であり、一般には分析物の注目の最高
濃度の量に対して少なくとも等量、通常その量よりも過
剰量、通常約1000倍以下の過剰量、更に通常約500倍以
下の過剰量、一般には少くとも約２倍の過剰量である。
EA及び基質が一旦添加された時、分析が通常のED/EAβ
−ガラクトシダーゼ分析として行なわれる。
粒子が使用される場合、比較的小さい粒子が使用され
ることが望ましく、一般に約20〜200nm、好ましくは約5
0〜100nmの範囲である。
ることが望ましく、一般に約20〜200nm、好ましくは約5
0〜100nmの範囲である。
固体表面に於ける酵素活性は、溶液中の酵素活性より
実質的に小さく、観察されるその割合は媒体中の分析物
の量と供に変化する。
実質的に小さく、観察されるその割合は媒体中の分析物
の量と供に変化する。
酵素活性は、既知量の分析物を有する標準を用いるこ
とにより特定のプロトコルについて測定し得る。この方
法に於いて、標準曲線が特定の条件の組のもとに作成さ
れてもよく、ここで未知の試料について得られた結果が
標準曲線に関係づけられ、分析物の定量測定を与え得
る。
とにより特定のプロトコルについて測定し得る。この方
法に於いて、標準曲線が特定の条件の組のもとに作成さ
れてもよく、ここで未知の試料について得られた結果が
標準曲線に関係づけられ、分析物の定量測定を与え得
る。
種々の基質が分光光度測定または螢光光度測定に使用
し得る。ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド、β−
ガラクトシジルウンベリフェロン、ジ−β−ガラクトシ
ジルフルオレセン、レゾルフィン−β−ガラクトシドを
使用し得る。基質の濃度は律速性でないように実質的に
過剰量とする。
し得る。ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド、β−
ガラクトシジルウンベリフェロン、ジ−β−ガラクトシ
ジルフルオレセン、レゾルフィン−β−ガラクトシドを
使用し得る。基質の濃度は律速性でないように実質的に
過剰量とする。
キットが試薬の便利な組合せのために提供され得る。
キットは固定化ミップ、酵素供与体−ミップ接合体、酵
素受容体及び便利には器質を提供する。種々の成分は凍
結乾燥粉末、分散液として、容器、例えばマイクロタイ
タ−プレート等として供給し得る。試薬の量は、特定の
プロトコルのため相対的な比率であるように与えられて
もよい。安定剤、緩衝剤、殺菌剤、賦形剤等の如きその
他の添加剤が存在してもよい。充填剤は別として、添加
剤は一般に比較的少量、通常約２〜８％未満の量であ
る。
キットは固定化ミップ、酵素供与体−ミップ接合体、酵
素受容体及び便利には器質を提供する。種々の成分は凍
結乾燥粉末、分散液として、容器、例えばマイクロタイ
タ−プレート等として供給し得る。試薬の量は、特定の
プロトコルのため相対的な比率であるように与えられて
もよい。安定剤、緩衝剤、殺菌剤、賦形剤等の如きその
他の添加剤が存在してもよい。充填剤は別として、添加
剤は一般に比較的少量、通常約２〜８％未満の量であ
る。
以下の実施例は、説明のために示されるものであり、
本発明の範囲を制限するものではない。
本発明の範囲を制限するものではない。
実 験 固相均一分析を示すため、抗ジゴキシン（antidigoxi
n）セファロースの用いてジゴキシンの分析を開発し
た。
n）セファロースの用いてジゴキシンの分析を開発し
た。
一般的な操作は、抗ジゴキシン及び２のカップリン
グ緩衝液（0.1M重炭酸ナトリウム、pH8.3、0.5M NaCl）
を４℃で一夜透析し、翌朝緩衝液を変え透析を少なくと
も30分続けることである。ついでタンパク質濃度をOD28
0nmで測定し、カップリング緩衝液を添加して所望の濃
度を得る。セファロース（1gの乾燥セファロースはほぼ
3.5mの水和セファロースに相当する）を計量し、焼結
ガラスロートに添加し、続いて1mMの冷HCで200m HC
l/セファロース1gで洗浄する。洗浄を、HCl溶液の連続
添加により15分間続ける。ついでセファロースをカップ
リング緩衝液中でゆすぎ、抗体ジゴキシンを含む反応管
に移す。
グ緩衝液（0.1M重炭酸ナトリウム、pH8.3、0.5M NaCl）
を４℃で一夜透析し、翌朝緩衝液を変え透析を少なくと
も30分続けることである。ついでタンパク質濃度をOD28
0nmで測定し、カップリング緩衝液を添加して所望の濃
度を得る。セファロース（1gの乾燥セファロースはほぼ
3.5mの水和セファロースに相当する）を計量し、焼結
ガラスロートに添加し、続いて1mMの冷HCで200m HC
l/セファロース1gで洗浄する。洗浄を、HCl溶液の連続
添加により15分間続ける。ついでセファロースをカップ
リング緩衝液中でゆすぎ、抗体ジゴキシンを含む反応管
に移す。
管を室温で２時間または４℃で一夜振動させる。セフ
ァロース上の未反応部位は、ウシ血清アルブミンを5mg/
m BSAの濃度で添加することによりブロッキングす
る。その混合物を室温で２時間インキュベートする。セ
ファロースをペレット化し、上澄液を除去し、ペレット
を0.2Mのクリシン（pH8.0）中で分散させ、続いて室温
で２時間、または４℃で一夜振動させる。セファロース
を焼結ガラスロート上に置くことにより、過剰の吸着タ
ンパク質を除去し、続いて数倍容量の酢酸塩緩衝液（0.
1M酢酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH4.0）で洗浄し、続い
て数倍容量のカップリング緩衝液で洗浄し、交互に緩衝
液洗浄を行なう。ついで得られた粒子を、5mg/m BSA
及び0.1％アジ化ナトリウムを含む分析緩衝液中に懸濁
し、４℃で貯蔵する。
ァロース上の未反応部位は、ウシ血清アルブミンを5mg/
m BSAの濃度で添加することによりブロッキングす
る。その混合物を室温で２時間インキュベートする。セ
ファロースをペレット化し、上澄液を除去し、ペレット
を0.2Mのクリシン（pH8.0）中で分散させ、続いて室温
で２時間、または４℃で一夜振動させる。セファロース
を焼結ガラスロート上に置くことにより、過剰の吸着タ
ンパク質を除去し、続いて数倍容量の酢酸塩緩衝液（0.
1M酢酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH4.0）で洗浄し、続い
て数倍容量のカップリング緩衝液で洗浄し、交互に緩衝
液洗浄を行なう。ついで得られた粒子を、5mg/m BSA
及び0.1％アジ化ナトリウムを含む分析緩衝液中に懸濁
し、４℃で貯蔵する。
一塩基性リン酸カリウム2.5g、二塩基性リン酸カリウ
ム23g、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物1.7g、二塩
基性リン酸ナトリウム12.5g、酢酸マグネシウム四水和
物0.644g、アジ化ナトリウム1.3g、エチレングリコール
12.25m及び10×EGTA溶液（水200m中EGTA7.6g、水酸
化ナトリウム1.6g）100m及び10mMジチオスレイトール
（dithiothreitol）中の10％トウイーン（Tween）20 5
mを組合せることにより分析緩衝液を調製し、その溶
液を１にする。（EGTAはエチレン−ビス−オキシエチ
レンニトリロテトラ酢酸である。） 下記の表は、上記の操作に使用される物質の量を示
す。
ム23g、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物1.7g、二塩
基性リン酸ナトリウム12.5g、酢酸マグネシウム四水和
物0.644g、アジ化ナトリウム1.3g、エチレングリコール
12.25m及び10×EGTA溶液（水200m中EGTA7.6g、水酸
化ナトリウム1.6g）100m及び10mMジチオスレイトール
（dithiothreitol）中の10％トウイーン（Tween）20 5
mを組合せることにより分析緩衝液を調製し、その溶
液を１にする。（EGTAはエチレン−ビス−オキシエチ
レンニトリロテトラ酢酸である。） 下記の表は、上記の操作に使用される物質の量を示
す。
分析を行なうため、5ng/m〜0.025ng/mの範囲の種
々の濃度のジゴキシンを、対照として抗ジゴキシンセフ
ァロースまたはBSA−セファロースと供に予備インキュ
ベートした。固定した濃度のED−ジゴキシン複合体をジ
ゴキシン／抗ジゴキシンセファロース試験物に添加しイ
ンキュベートした。幾つかの場合には、ヒツジ抗ウサギ
免疫グロブリン（GARSと称する）を添加して抗−抗体の
効果を測定した。
々の濃度のジゴキシンを、対照として抗ジゴキシンセフ
ァロースまたはBSA−セファロースと供に予備インキュ
ベートした。固定した濃度のED−ジゴキシン複合体をジ
ゴキシン／抗ジゴキシンセファロース試験物に添加しイ
ンキュベートした。幾つかの場合には、ヒツジ抗ウサギ
免疫グロブリン（GARSと称する）を添加して抗−抗体の
効果を測定した。
具体的な操作は、下記のとおりである。5mg/m BSA
を含有する分析緩衝液中の抗ジゴキシンセファロースロ
ット1Vを50％スラリーとして調製し、ついでスラリー35
μを担体セファロース165μと混合し、1.5mのマ
イクロフュージ管に移した。ついで、この管にジゴキシ
ン100μを所望濃度で添加し、管を室温で30分振動さ
せた。ついで、この管に酵素供与体（ED−４）−ジゴキ
シン（米国特許出願第721,267号明細書を参照のこと）1
00μを添加して８×10-10Mの最終濃度を得た。この時
点で、GARSを適当に添加して1:750の管中の最終希釈液
を得た。ついで、試験液を展開液〔2.5×10-6M酵素受容
体及び3.05mg/m o−クロロフェノール レッド−β−
ガラクトシダーゼ（CPRGと称する）〕で展開して酵素受
容体5.0×10-7M及びCPRG0.61mg/mの最終濃度を得た。
各試験管を室温で22分振動させた後、イソプロピルチオ
ガラクトシド（240mM）（IPTGと称する）100μを添加
して40mMの最終濃度を得ることにより、反応を停止し
た。ついでセファロースをマイクロファージ中でペレッ
ト化し、上澄液100μをマイクロタイタウェルに移
し、タイターテック（Titertek）分光光度計で577nmの
吸光度を読み取った。また、適当な分光光度計を用いて
分離せずに管を通して吸光度を測定できた。
を含有する分析緩衝液中の抗ジゴキシンセファロースロ
ット1Vを50％スラリーとして調製し、ついでスラリー35
μを担体セファロース165μと混合し、1.5mのマ
イクロフュージ管に移した。ついで、この管にジゴキシ
ン100μを所望濃度で添加し、管を室温で30分振動さ
せた。ついで、この管に酵素供与体（ED−４）−ジゴキ
シン（米国特許出願第721,267号明細書を参照のこと）1
00μを添加して８×10-10Mの最終濃度を得た。この時
点で、GARSを適当に添加して1:750の管中の最終希釈液
を得た。ついで、試験液を展開液〔2.5×10-6M酵素受容
体及び3.05mg/m o−クロロフェノール レッド−β−
ガラクトシダーゼ（CPRGと称する）〕で展開して酵素受
容体5.0×10-7M及びCPRG0.61mg/mの最終濃度を得た。
各試験管を室温で22分振動させた後、イソプロピルチオ
ガラクトシド（240mM）（IPTGと称する）100μを添加
して40mMの最終濃度を得ることにより、反応を停止し
た。ついでセファロースをマイクロファージ中でペレッ
ト化し、上澄液100μをマイクロタイタウェルに移
し、タイターテック（Titertek）分光光度計で577nmの
吸光度を読み取った。また、適当な分光光度計を用いて
分離せずに管を通して吸光度を測定できた。
下記の表は、その結果を示す。
上記の結果は、０〜5ng/mのジゴキシン濃度範囲に
わたって酵素活性を調節することができ、0.025ng/m
程度の少ないジゴキシンを検出し得ることを示す。更
に、抗ジゴキシンに対する抗体の存在は酵素活性に関し
て有意な効果をもたないようである。バックグラウンド
シグナルは、幾つかの因子を個々に、または同時に変え
ることにより、即ちEA濃度を下げ、展開時間を変え、そ
して一層純粋な酵素供与体ミップ接合体を使用すること
により減少し得る。
わたって酵素活性を調節することができ、0.025ng/m
程度の少ないジゴキシンを検出し得ることを示す。更
に、抗ジゴキシンに対する抗体の存在は酵素活性に関し
て有意な効果をもたないようである。バックグラウンド
シグナルは、幾つかの因子を個々に、または同時に変え
ることにより、即ちEA濃度を下げ、展開時間を変え、そ
して一層純粋な酵素供与体ミップ接合体を使用すること
により減少し得る。
材料及び方法 材料 EP−fab接合体の製造のため、全ての〔腹水性（ascit
ies）〕抗体は、ベックマン・インストルメンツ・イン
コーポレーション（Beckman Instruments Inc.）、イル
ビン（イルビン）、CAから入手した。酵素受容体（EA）
及び凍結した乾燥酵素供与体（ED）は、ミクロゲニクス
・インコーポレーション（Microgtnics Inc.）コンコー
ド（Concord）、CAから入手した。カルボキシル修飾ポ
リスチレン微粒子は、ポリサイエンシズ・インコーポレ
ーション（Polysciences Inc.）、ワリントン（Varring
ton）、PA及びポリマー・ラボラトリィズ（Polymer Lab
oratories）、英国から入手した。ラテックス接合体の
調製に使用されるhCGは、シグマ（Sigma）、セントルイ
ス、MOから入手した。スクリップス（Scripps）、サン
ジエゴ、CAから入手されたhCGは試料較正物質として使
用した。脱脂された全ヒトプール血清は、バイオセル
（Biocell）、カーソン、CAから入手した。ペニンスラ
・ラブズ（Peninsula Labs）、バーリンゲーム（Burlin
game）、CAから入手したCPRGは基質として使用した。
ies）〕抗体は、ベックマン・インストルメンツ・イン
コーポレーション（Beckman Instruments Inc.）、イル
ビン（イルビン）、CAから入手した。酵素受容体（EA）
及び凍結した乾燥酵素供与体（ED）は、ミクロゲニクス
・インコーポレーション（Microgtnics Inc.）コンコー
ド（Concord）、CAから入手した。カルボキシル修飾ポ
リスチレン微粒子は、ポリサイエンシズ・インコーポレ
ーション（Polysciences Inc.）、ワリントン（Varring
ton）、PA及びポリマー・ラボラトリィズ（Polymer Lab
oratories）、英国から入手した。ラテックス接合体の
調製に使用されるhCGは、シグマ（Sigma）、セントルイ
ス、MOから入手した。スクリップス（Scripps）、サン
ジエゴ、CAから入手されたhCGは試料較正物質として使
用した。脱脂された全ヒトプール血清は、バイオセル
（Biocell）、カーソン、CAから入手した。ペニンスラ
・ラブズ（Peninsula Labs）、バーリンゲーム（Burlin
game）、CAから入手したCPRGは基質として使用した。
酵素供与体−fabフラグメント接合体の調製 抗体の選択、性格づけ、消化及び精製 抗hCGモノクローナル抗体を、イムノブロッティング
技術によりLH及びTSHに対する交差反応性に関してスク
リーニングした。親和性をスカチャード（Scatchard）
分析により評価した。選択された抗体を、20〜300mM KP
O4の直線勾配溶離液（pH6.8）を用いて90×2.5cmのヒド
ロキシルアパタイト〔カルビオケム（Calbiochem）〕で
精製した。ついで、夫々の精製された抗体を、メルチュ
ーリパパイン（mercuripapain）〔シグマ（Sigma）〕で
消化した時の最高Fab収率に関して性格づけをした。消
化物を、THIS−HCl（pH8）で平衡化された10×2.5cmDEA
Eカラム（高性能イオン交換セルロース、ピアース（Pie
rce）〕で精製し、０〜300mM NaCl勾配で溶出した。画
分を免疫電気泳動により分析し、純粋なFabを含む画分
をプールし、PEGを用いて濃縮し、100mMリン酸ナトリウ
ム4mM EDTA、pH7.4中で透析した。
技術によりLH及びTSHに対する交差反応性に関してスク
リーニングした。親和性をスカチャード（Scatchard）
分析により評価した。選択された抗体を、20〜300mM KP
O4の直線勾配溶離液（pH6.8）を用いて90×2.5cmのヒド
ロキシルアパタイト〔カルビオケム（Calbiochem）〕で
精製した。ついで、夫々の精製された抗体を、メルチュ
ーリパパイン（mercuripapain）〔シグマ（Sigma）〕で
消化した時の最高Fab収率に関して性格づけをした。消
化物を、THIS−HCl（pH8）で平衡化された10×2.5cmDEA
Eカラム（高性能イオン交換セルロース、ピアース（Pie
rce）〕で精製し、０〜300mM NaCl勾配で溶出した。画
分を免疫電気泳動により分析し、純粋なFabを含む画分
をプールし、PEGを用いて濃縮し、100mMリン酸ナトリウ
ム4mM EDTA、pH7.4中で透析した。
EDのヨウ素化及び精製 製造グレードのED4（米国特許第4,708,929号明細書を
参照のこと）を、放射標識ED4−TNB（標準法により行な
われた）と混合し、逆相HPLCクロマトグラフィーを用い
て精製した。EDをプールし、濃度及び放射線接合性（ra
dioconjugatability）を測定した。アリコットを凍結乾
燥し−20℃で貯蔵した。
参照のこと）を、放射標識ED4−TNB（標準法により行な
われた）と混合し、逆相HPLCクロマトグラフィーを用い
て精製した。EDをプールし、濃度及び放射線接合性（ra
dioconjugatability）を測定した。アリコットを凍結乾
燥し−20℃で貯蔵した。
接合：スルホスクシンイミジルマレイミドメチル−シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCCと称する）
による共有結合性異種二官能カップリング 夫々の接合体を下記のようにして調製した。純粋なFa
b/mgを、10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl（PBS），
（pH7.3）中2mMスルホ−SMCC（ピアース・ケミカル・カ
ンパニィ（Pierce Chemical Co.）〕で室温で15分活性
化した。活性化Fabは、脱気PBS中で平衡にされたセファ
デックスＧ−25 PD−10カラム（ファーマシア（Pharmac
ia））で過剰のSMCCから分離した。逆滴定の結果は活性
化後にFab1個当りほぼ２〜３個のマレイミドがあること
を示した。接合反応中に充分過剰のEDがあることを確実
にするためにED3モル対マレイミド１モルの比を使用す
る。EDの必要量が一旦決定されると、凍結乾燥したEDを
活性Fabで再形成し、室温で１時間反応させる。粗接合
体の濃度を、CD280及び計数／分のデータにより測定す
る。過剰のEDを除去するために、FPLCでセファロースに
（ファーマシア）カラムを用いて接合体を精製する。最
終生成物を含むプール画分を分割し−20℃で貯蔵する。
クロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCCと称する）
による共有結合性異種二官能カップリング 夫々の接合体を下記のようにして調製した。純粋なFa
b/mgを、10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl（PBS），
（pH7.3）中2mMスルホ−SMCC（ピアース・ケミカル・カ
ンパニィ（Pierce Chemical Co.）〕で室温で15分活性
化した。活性化Fabは、脱気PBS中で平衡にされたセファ
デックスＧ−25 PD−10カラム（ファーマシア（Pharmac
ia））で過剰のSMCCから分離した。逆滴定の結果は活性
化後にFab1個当りほぼ２〜３個のマレイミドがあること
を示した。接合反応中に充分過剰のEDがあることを確実
にするためにED3モル対マレイミド１モルの比を使用す
る。EDの必要量が一旦決定されると、凍結乾燥したEDを
活性Fabで再形成し、室温で１時間反応させる。粗接合
体の濃度を、CD280及び計数／分のデータにより測定す
る。過剰のEDを除去するために、FPLCでセファロースに
（ファーマシア）カラムを用いて接合体を精製する。最
終生成物を含むプール画分を分割し−20℃で貯蔵する。
hCG−ラテックス接合体の調製 “カルボジイミド”法によるカルボキシル化ポリスチレ
ン微粒子に対するhCGの共有結合カップリング 使用したプロトコルは、ポリサイエンシズにより発行
されたプロトコルの改良である。hCG−ラテックス接合
体を下記のようにして調製する。70nmのポリスチレン粒
子（ポリサイエンシズ）の10％の固体素材懸濁液2m
を、アミコン（Amicon）Ym100濾過装置を用いて100mM炭
酸塩緩衝液100m（pH9.6）で洗浄した。アミコン洗浄
を繰り返し、今度は20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH
4.5）100mを用いる。ラテックスをリン酸塩緩衝液5m
中で再懸濁し、新しい２％の１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDA
C）リン酸塩緩衝液10mを滴下して添加する。反応混合
物をロッカーテーブル上で室温で15分間撹拌する。この
（EDAC）活性化工程に続いて、70nmのラテックスをマイ
クロファージ中でペレット化する。混合物をエッペンド
ルフ（Eppendorf）遠心分離管中に分け、10分回転さ
せ、上澄液を捨てた。未反応カルボジイミドを除去する
ため、ペレットを200mMホウ酸塩緩衝液（pH8.5）中に再
懸濁し、同様にして３回洗浄した。ついでペレットを再
懸濁し、ホウ酸塩緩衝液20m中にプール化した。カッ
プリングタンパク質hCGをラテックス1m当り約3mgで添
加し、反応をロッカー上で−５℃で一夜混合した。次
に、ホウ酸塩緩衝液中の250mMエタノールアミノ800μ
を添加して微粒子上の未反応部位をブロッキングする。
ロッカー上で室温で30分インキュベートした後、ラテッ
クスをマイクロファージ中でペレット化する。上澄液を
タンパク質測定のために取っておく。残存する非特異的
タンパク質結合部位をブロッキングするために、Ｌ−α
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン×チルエステル
（APMと称する）10mg/m及びPVP−40 1mg/mを含むホ
ウ酸塩緩衝液中にラテックスを懸濁する。反応を室温で
４時間以上続行させる。ついで、ラテックスをアミコン
Ym100濾過器を用いてPBS（pH7.4、約200m）で十分に
洗浄する。最終調製物を、10mg/m BSA、５％グリセロ
ール及び0.1％アジ化ナトリウムを含むPBS（貯蔵緩衝
液）2m中に再懸濁する。
ン微粒子に対するhCGの共有結合カップリング 使用したプロトコルは、ポリサイエンシズにより発行
されたプロトコルの改良である。hCG−ラテックス接合
体を下記のようにして調製する。70nmのポリスチレン粒
子（ポリサイエンシズ）の10％の固体素材懸濁液2m
を、アミコン（Amicon）Ym100濾過装置を用いて100mM炭
酸塩緩衝液100m（pH9.6）で洗浄した。アミコン洗浄
を繰り返し、今度は20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH
4.5）100mを用いる。ラテックスをリン酸塩緩衝液5m
中で再懸濁し、新しい２％の１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDA
C）リン酸塩緩衝液10mを滴下して添加する。反応混合
物をロッカーテーブル上で室温で15分間撹拌する。この
（EDAC）活性化工程に続いて、70nmのラテックスをマイ
クロファージ中でペレット化する。混合物をエッペンド
ルフ（Eppendorf）遠心分離管中に分け、10分回転さ
せ、上澄液を捨てた。未反応カルボジイミドを除去する
ため、ペレットを200mMホウ酸塩緩衝液（pH8.5）中に再
懸濁し、同様にして３回洗浄した。ついでペレットを再
懸濁し、ホウ酸塩緩衝液20m中にプール化した。カッ
プリングタンパク質hCGをラテックス1m当り約3mgで添
加し、反応をロッカー上で−５℃で一夜混合した。次
に、ホウ酸塩緩衝液中の250mMエタノールアミノ800μ
を添加して微粒子上の未反応部位をブロッキングする。
ロッカー上で室温で30分インキュベートした後、ラテッ
クスをマイクロファージ中でペレット化する。上澄液を
タンパク質測定のために取っておく。残存する非特異的
タンパク質結合部位をブロッキングするために、Ｌ−α
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン×チルエステル
（APMと称する）10mg/m及びPVP−40 1mg/mを含むホ
ウ酸塩緩衝液中にラテックスを懸濁する。反応を室温で
４時間以上続行させる。ついで、ラテックスをアミコン
Ym100濾過器を用いてPBS（pH7.4、約200m）で十分に
洗浄する。最終調製物を、10mg/m BSA、５％グリセロ
ール及び0.1％アジ化ナトリウムを含むPBS（貯蔵緩衝
液）2m中に再懸濁する。
コバス・バイオ（Cabas Bio）分析に使用する前に、
ラテックスをアミコン濾過装置を用いて分析緩衝液約20
0m（200mMリン酸カリウム、100mMリン酸ナトリウム、
3mM酢酸マグネシウム、20mMアジ化ナトリウム、50mMエ
チレングリコール、160mM EGTA、0.01％トウイーン−2
0、pH7.0）で洗浄する。
ラテックスをアミコン濾過装置を用いて分析緩衝液約20
0m（200mMリン酸カリウム、100mMリン酸ナトリウム、
3mM酢酸マグネシウム、20mMアジ化ナトリウム、50mMエ
チレングリコール、160mM EGTA、0.01％トウイーン−2
0、pH7.0）で洗浄する。
ラテックスインヒビターを用いる均一hCG免疫分析のた
めのコバス・バイオの適用 分析プロトコル a.予備インキュベーション 患者試料を、ED−Fab複合
体と供に37℃で５分間インキュベートした。
めのコバス・バイオの適用 分析プロトコル a.予備インキュベーション 患者試料を、ED−Fab複合
体と供に37℃で５分間インキュベートした。
b.コバスバイオ分析 （１）予備インキュベートされた試料50μをhCG−ラ
テックス試薬150μと５分間混合する。
テックス試薬150μと５分間混合する。
（２）出発試薬（5.0×10-7M EA22;0.61mg/m CPRG）3
0μを添加し、OD574に於ける30秒の読み取りを行な
う。
0μを添加し、OD574に於ける30秒の読み取りを行な
う。
c.解釈 相補活性は増大する血清hCG量の関数である。h
CGが増大されるにつれて、一層多くのED−Fabが予備イ
ンキュベーション工程中で分析物をhCGに結合する。こ
れは、hCG−ラテックスによる阻害結合に用いられる一
層少ないED−Fabを残す。
CGが増大されるにつれて、一層多くのED−Fabが予備イ
ンキュベーション工程中で分析物をhCGに結合する。こ
れは、hCG−ラテックスによる阻害結合に用いられる一
層少ないED−Fabを残す。
下記の表は、その結果を示す。
上記の結果から、低濃度に於ける多種の分析物の検出
を可能にする有効で感度の良い分析が提供されることが
明らかである、その分析は、取扱い及び種々の処理によ
り導入される誤差を最小にするように分離工程または洗
浄を用いずに簡単にプロトコルで比較的短い期間にわた
って行ない得る。
を可能にする有効で感度の良い分析が提供されることが
明らかである、その分析は、取扱い及び種々の処理によ
り導入される誤差を最小にするように分離工程または洗
浄を用いずに簡単にプロトコルで比較的短い期間にわた
って行ない得る。
この方法に於いて、正確な結果が再現性のある方法で
得られここで分析が実際に均一であるように、多種類の
分光光度計または螢光光度計が使用し得る。
得られここで分析が実際に均一であるように、多種類の
分光光度計または螢光光度計が使用し得る。
本明細書に言及された全ての刊行物及び特許出願は本
発明が関係する当業者の技術水準を示す。全ての刊行物
及び特許出願は、夫々個々の刊行物または特許出願が詳
細に、しかも個々に参考として含まれるように示されて
いるのと同じ程度に本明細書に参考として含まれる。
発明が関係する当業者の技術水準を示す。全ての刊行物
及び特許出願は、夫々個々の刊行物または特許出願が詳
細に、しかも個々に参考として含まれるように示されて
いるのと同じ程度に本明細書に参考として含まれる。
本発明が充分記載されていることから、多くの変化及
び改良が請求の範囲の精神または範囲から逸脱しないで
本発明になし得ることが当業者に明らかである。
び改良が請求の範囲の精神または範囲から逸脱しないで
本発明になし得ることが当業者に明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポーレカ，パトリシア エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94704，バークレー，スチュアート 2647 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/542 C12Q 1/34 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】試料中の分析物の存在を測定する方法であ
って、この分析物は特異的結合対の構成員（ミップ）で
あり、この方法は試薬としてＮ−末端酵素供与体フラグ
メント（ED）及びＣ−末端酵素受容体フラグメント（E
A）を含んで成るβ−ガラクトシダーゼのフラグメント
を使用し、これらの酵素供与体フラグメント及び酵素受
容体フラグメントは活性な酵素複合体を生成することが
できるものであり、そしてこの酵素供与体フラグメント
はミップに結合してミップ/ED接合体を形成しており、
このミップ/ED接合体は前記分析物に対して交叉反応性
であるか又は該分析物に対して相補性であり、そして前
記ミップ/ED接合体及び前記分析物に対して相補性であ
るか又は前記ミップ/ED接合体に対して相補性であるミ
ップが約250Kda以上の分子量を有する巨大分子又は固体
表面に結合して固定化されたミップを形成しており、 当該方法は、 分析媒体中で前記試料、前記ミップ/ED接合体、前記E
A、前記固定化されたミップ及び酵素基質を接触せし
め、ここで該固定化されたミップ及び該ミップ/ED接合
体は相補的であり、そして前記固定化されたミップに結
合したミップ/ED接合体による酵素活性を有する複合体
の形成は実質的に阻害され；そして 前記分析媒体の酵素活性を、既知量の分析物を有する分
析媒体と比較して決定する； 段階を含んで成る方法。 - 【請求項２】前記の接触が前記試料、前記のミップ/ED
接合体及び前記の固定化されたミップを一緒にし、つい
で前記の酵素受容体の添加前にインキュベートすること
を含み、前記の固定化された結合ミップが前記分析物に
対して相補性である、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記の接触が、第一工程で前記試料及び前
記の固定化されたミップを一緒にして、ついでインキュ
ベートし、第二工程で前記のミップ/ED接合体を添加
し、ついでインキュベートし、ついで第三工程で前記の
EAを添加しインキュベートすることを含む、請求の範囲
第２項記載の方法。 - 【請求項４】前記の接触が、第一工程で前記試料及び前
記のミップ/ED接合体を一緒にし、前記分析物及びミッ
プ/ED接合体が相補性であり、且つ前記のミップ/ED接合
体が前記の固定化されたミップに関して一当量であり前
記分析物に対して実績的に結合過剰量であり、ついで複
合体生成が起こるのに充分な時間にわたってインキュベ
ートし、前記のミップ/ED接合体に対して実質的に結合
過剰量で固定化されたミップを添加し複合体生成が起こ
るのに充分な時間にわたってインキュベートし、ついで
EA及び基質を添加することを含む、請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項５】前記の固定化されたミップが約20〜200nm
の粒子に結合されたミップである、請求の範囲第４項記
載の方法。 - 【請求項６】試料中の分析物の存在を測定する方法であ
って、この分析物は特異的結合対の構成員（ミップ）で
あり、この方法は試薬としてＮ−末端酵素供与体フラグ
メント（ED）及びＣ−末端酵素受容体フラグメント（E
A）を含んで成るβ−ガラクトシダーゼのフラグメント
を使用し、これらの酵素供与体フラグメント及び酵素受
容体フラグメントは活性な酵素複合体を生成することが
できるものであり、そしてこの酵素供与体フラグメント
はミップに結合してミップ/ED接合体を形成しており、
このミップ/ED接合体は、相補的ミップとの結合におい
て前記分析物に対して交叉反応性であり、そして前記ミ
ップ/ED接合体及び前記分析物に対して相補性であるミ
ップが固定化されており、 当該方法は、 分析媒体中で前記試料、前記ミップ/ED接合体及び前記
固定されたミップを切断せしめ、そして複合体形成が実
質的に完結するのに十分な時間にわたってインキュベー
トして第一分析媒体を生成せしめ； 前記EA、基質、及び検出可能な生成物の生成のために必
要な追加の試薬を添加し；そして 前記検出可能な生成物により前記分析媒体の酵素活性
を、既知量の分析対象を有する分析媒体との比較におい
て決定する； 段階を含んで成る方法。 - 【請求項７】試料中の分析物の存在を測定する方法であ
って、この分析物は特異的結合対の構成員（ミップ）で
あり、この方法は試薬としてＮ−末端酵素供与体フラグ
メント（ED）及びＣ−末端酵素受容体フラグメント（E
A）を含んで成るβ−ガラクトシダーゼのフラグメント
を使用し、これらの酵素供与体フラグメント及び酵素受
容体フラグメントは活性な酵素複合体を生成することが
できるものであり、そしてこの酵素供与体フラグメント
はミップに接合してミップ/ED接合体を形成しており、
このミップ/ED接合体は前記分析物に対して相補性であ
り、そして前記ミップ/ED接合体に対して相補性である
ミップが固定化されており、 当該方法は、 分析媒体中で前記試料、及び前記分析物に対して実質的
に結合過剰量の前記ミップ/ED接合体を接触せしめ、そ
して複合体形質が実質的に完結するのに十分な時間にわ
たってインキュベートして第一分析媒体を形成せしめ； 前記第一分析媒体を、前記ミップ/ED接合体に対して実
質的に結合過剰量の前記固定化されたミップと一緒にし
て第二分析媒体を生成せしめ； 前記固定化されたミップ、EA、基質、及び検出可能な生
成物を生成するのに必要な追加の試薬を同時に又は逐時
に一緒にし；そして 前記検出可能な生成物により前記分析媒体の酵素活性
を、既知量の分析物を有する分析媒体との比較において
決定する； 段階を含んで成る方法。 - 【請求項８】前記の固定化ミップが約20〜200nmの粒子
に結合される請求の範囲７項記載の方法。 - 【請求項９】前記ミップが一価の抗体フラグメントであ
る請求の範囲７項記載の方法。 - 【請求項１０】ミップに接合されたED,EA及び巨大分子
又は固体支持体に固定化されたミップを含んで成り、該
ミップは特異的結合構成員との結合について分析物に対
して交叉反応性であるか又は相補性であり、そして前記
ED接合体と前記固定化されたミップとは相補性である、
請求の範囲第１項記載の方法において有用なキット。 - 【請求項１１】前記の固定化されたミップが約20〜200n
mの粒子に結合されたミップを含む、請求の範囲第10項
記載のキット。 - 【請求項１２】前記のED複合体が前記の分析物に対して
特異的なFabフラグメントを含む、請求の範囲第10項記
載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9939687A | 1987-09-21 | 1987-09-21 | |
| US099,396 | 1987-09-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02501859A JPH02501859A (ja) | 1990-06-21 |
| JP3282129B2 true JP3282129B2 (ja) | 2002-05-13 |
Family
ID=22274814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50822088A Expired - Fee Related JP3282129B2 (ja) | 1987-09-21 | 1988-09-19 | 固相非分離酵素分析 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0338045B1 (ja) |
| JP (1) | JP3282129B2 (ja) |
| AT (1) | ATE110469T1 (ja) |
| AU (1) | AU610281B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3851221T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| AU615780B2 (en) * | 1988-12-29 | 1991-10-10 | Roche Diagnostics Corporation | Enzyme detection wicking assay |
| CA1335707C (en) * | 1989-08-15 | 1995-05-30 | Pyare Khanna | Drug screening assay |
| US5223393A (en) * | 1990-06-12 | 1993-06-29 | Microgenics Corporation | Detection of analytes having binding sites for at least two binding moieties |
| US5244785A (en) * | 1991-02-01 | 1993-09-14 | Microgenics Corporation | Determination of high molecular weight analytes using a β-galactosidase complementation assay |
| CN110100180B (zh) * | 2017-11-29 | 2022-04-29 | 深圳琅技生命科技有限公司 | 均相检测方法 |
| IL286671B2 (en) * | 2019-03-28 | 2024-01-01 | Eurofins Discoverx Products Llc | Methods for the analysis of the promoter region and cells for their practice |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4378428A (en) * | 1981-03-30 | 1983-03-29 | Baker Instruments Corporation | Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays |
| US4708929A (en) * | 1984-10-29 | 1987-11-24 | Microgenics Corporation | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
| WO1986002666A1 (en) * | 1984-10-29 | 1986-05-09 | Microgenics Corporation | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
| AU5280086A (en) * | 1985-01-30 | 1986-08-07 | Genetic Diagnostics Corp. | Self timed immunoassay device |
| US4745055A (en) * | 1985-05-07 | 1988-05-17 | California Biotechnology Inc. | Fused protein for enzyme immunoassay system |
| EP0271204A3 (en) * | 1986-11-07 | 1989-10-25 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunochromatographic method and device |
-
1988
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- 1988-09-19 AT AT88908898T patent/ATE110469T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1988-09-20 CA CA000577915A patent/CA1335173C/en not_active Expired - Fee Related
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| EP0338045A4 (en) | 1990-12-05 |
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| AU2537688A (en) | 1989-04-17 |
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