JPH02501859A - 固相非分離酵素分析 - Google Patents
固相非分離酵素分析Info
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- JPH02501859A JPH02501859A JP63508220A JP50822088A JPH02501859A JP H02501859 A JPH02501859 A JP H02501859A JP 63508220 A JP63508220 A JP 63508220A JP 50822088 A JP50822088 A JP 50822088A JP H02501859 A JPH02501859 A JP H02501859A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
固相非分離酵素分析
技術分野
酵素供与体/酵素受容体及び固体表面が関与する均一系を使用する分析物の測定
。
発明の背景
医療、化学的処理、汚染物質等に於ける多種の分析物を測定fることに絶えず拡
大する関心がはられれている。特定の市場に向けられた種々の系が考案されてい
る。行なわれる分析の数、分析の性質、熟練従業員の採用可能性、必要とされる
感度、並びにその他の個々の因子に応じて、種々市場の要求が変わる。系は分光
光度計及び螢光光度計の如き多種の装置に一般に適用し得るものからTD、の如
き特別な装置に専用とされるものまで多様である。分析は溶液、クロマトグラフ
ィーカラムまたは吸収性ストリップの使用を伴なってもよく、ここで洗浄及び分
離を伴なう幾つかの工程が必要とされてもよく、あるいは系は単に試料を添加し
、ついで結果を目視または装置により読み取ることを伴なってもよい。種々の分
析は、これらの感度、試料中に存在する脂質の如きその他の成分に対する応答、
及び結果を得ることに伴なう複雑さの程度に於いて多岐にわたる。公衆が分析を
行なうに際し選択するのに有効なプロトコル及び試薬のレパートリ−を拡大する
新規な分析を開発するのに絶えず関心がはられれている。
関連文献
米国特許第4,378.428号明細書は、分析に於ける酵素フラグメントの使
用を記載している。ラングレイ(Langley)及びザビン(Zabin)著
、Bioche+wistry (1976年)15巻、4866〜4875頁
及びラングレイ等著、Proc、Natl、Acad、Sci、USA (19
75年)72巻、1254〜1257頁は、β−ガラクトシダーゼフラグメント
間の相補性を記載している0国際特許出願−086102666及びその優先権
に基く特許出願は、分析に於けるβ−ガラクトシダーゼフラグメントの使用を記
載している。
発明の要約
酵素供与体が特異的結合対の構成員に接合され、そこで相補性構成員が固体担体
に結合される、分析物を測定するための方法及び組成物が提供される。分析物は
試薬と組み合され、逐次的に、またはひき続いて酵素受容体が添加される。こう
して、媒体中の酵素活性は試料中の分析物の量に関連し得る。
分析を行なうためのキットが提供される。
貝 、な能 のミロ
分離工程を必要としないプロトコルを使用して分析物を検出するための方法及び
組成物が提供される。その方法では、特異的結合対の構成員の一つが固体基材に
結合される特異的な結合対が関与する。検出可能なシグナルが酵素の二つの断片
を含むシグナル発生系により与えられ、小さい方の断片が酵素供与体(“ED”
)と称され約100個より少ないアミノ酸を有する。酵素供与体は特異的結合対
構成員に結合された標識として作用する。他方の断片は酵素受容体分子であり、
これは酵素供与体と複合体形成して活性な酵素複合体を生成する。酵素受容体は
酵素供与体よりも実質的に大きい。
本発明の目的のため、シグナル発生系はβ−ガラクトシダーゼにより例示され、
この場合、酵素供与体は通常少なくとも35個のアミノ酸の配列(これはCNB
rzフラグメントを類推し得る)を伴なうβ−ガラクトシダーゼの最初の75個
のアミノ酸の中に含まれるN−末端フラグメントである。酵素供与体は天然β−
ガラクトシダーゼと同じ配列を有していてもよく、あるいは1回以上の突然変異
により修飾されてもよい、突然変異は、例えば制限部位を用いる組換え技術によ
りシスチンまたはりシンの如き便利な連結基を導入して融合タンパク質を得るこ
とによる酵素供与体を調製することに於ける便利な結果としてであってもよ(、
ここで融合はN末端またはC末端で起ってもよく、融合ペプチドは分析物と拮抗
性であり、例えば分析物のエピトープ等と免疫学的に拮抗性であるエピトープを
有する。酵素受容体は一般に酵素のC末端部分であり一般に少なくとも約100
個のアミノ酸であり、酵素供与体と供に活性酵素複合体を生成する。酵素供与体
及び酵素受容体に関する詳細については、米国特許第4,708.929号明細
書(1985年4月8日に出願された米国特許出願第721.267号)を参照
のこと。
特異的結合対構成員/ED接合体は、通常の手段により調製し得る。特異的結合
対または“ミップ(a+ip)” (“ミフブは免疫対の構成員の頭文字である
)は、リガンド及びその相補性受容体、通常免疫グロブリンである。しかしなが
ら、成る場合には免疫グロブリン以外のものが特異的結合対の構成員として使用
され、その範囲でミップは免疫グロブリンだけでなく空間立体配座及び疎水性/
親水性分布に特異的に結合し得るその他の分子を含むことが意図される。ミップ
上に活性部位(このような部位は自然に存在しない)を導入するための種々の技
術、例えば活性オレフィン、スルフヒドリル基活性エステル、アゾ基等の導入の
如き技術がある。連結の特定の方法は本発明に重要ではなく、通常の連結基が使
用されてもよい。通常、ミップ/ED接合体は結合により直接に連結されてもよ
く、あるいは鎖中に約20個以下の原子、通常10個以下の原子(環式化合物の
場合には最長の経路を数える)をもつ連結基により連結されてもよい。連結官能
基はチオエーテル、アミド、アゾ等を含んでもよい。ミップ対EDの比は通常平
均で約0.2〜1:1〜0.2、更に通常約0.3〜1:1〜0.3、好ましく
は約0.3〜1:1である。ミップ及びEDの全てが複合体として存在すること
が望ましい。
リガンドはハブテンまたは抗原のいずれであってもよく、−力受容体はほとんど
の場合免疫グロブリン、免疫グロブリンのフラグメント、特に−価のフラグメン
ト、例えばFab。
Fv等、酵素、天然受容体、例えばT−細胞受容体、ホルモル受容体、表面膜受
容体、レクチン等の如き結合タンパク質である。特異的なりガント及び受容体の
開示については、米国特許第3.996.345号明細書第1O欄〜第17欄を
参照のこと(その開示を引用により本明細書に組み入れる)0重要なその他の分
析物はヒトレトロウィルス抗原、例えば旧V−1及び!(IV−2、このような
抗原に対する抗体、HTLV−1及びHTLV−2、サイトカイニン等を含む。
特異的結合対の構成員の一つは巨大分子、通常固体表面に結合される。巨大分子
は通常約250Kdaより大きい分子量、更に通常約500Kdaより大きい分
子量を有する。巨大分子はほとんどの場合、多糖類、例えばデキストランのよう
に水溶性である。固体表面は壁部、粒子、ストリップ、膜等を含む多くの形態を
取り得る。多種の固体が固定化担体として使用し得る。固体はセファローズ(S
epharose)、セファデックス(Sephadex) 、アガロース、ポ
リスチレン、ポリアクリレート、調節細孔ガラス等を含む。分析条件下で実質的
に透明である粒子、例えばラテックス粒子が特に重要である。分析が行なわれる
容器はマイクロタイタブレートウェル、試験管、マイクロフユージ(micro
fuge)管、等であってもよい。受容体またはリガンドは固体担体に固定化さ
れてもよく、あるいは巨大分子に結合されてもよい。接合の便法が結合に使用し
得る。
固定化のため、受容体またはりガントは通常、連結基による表面への共存結合的
な接合により直接固定化されてもよ(、あるいは少なくとも一つのエピトープま
たは結合部位の有用性を妨害しないでリガンドまたは受容体に結合する受容体に
より間接的に固定化されてもよい。例えば、アビジンが表面に共有結合的に接合
され、そしてリガンドまたは受容体がビオチンに共有結合的に接合されてもよく
、その結果ビオチン−アビジン複合体はミップと表面との間の連結部として作用
する。
ミップは分析の容器の種々の部分に固定化されてもよく、またラテックス粒子、
多Pi類粒子、または結果の読み取りを妨害しないその他の粒子の如き粒子、特
に分散性粒子あるいはED接合体の活性を減少して活性酵素を与えるのに役立つ
その他の固体表面に固定化されてもよい。ラテックス粒子の如き多くの粒子は分
析媒体中で透明のようであり、その結果分析は均−法であると考えることができ
る。事実、診断方法に於いて、均一分析は通常結合標識と未結合標識との間の分
離工程を伴なわない方法を言う。主題分析に於いて、その分析は媒体及び方法の
両方に関して均一であると考えることができる。
種々の化合物を固体表面に接合するための方法は文献に広範な例示が見られる。
例えば米国特許第4,366.241号明細書及び同第4.533,629号明
細書を参照のこと。表面上に固定化されて存在する相補性ミップの量は、バック
グラウンド値を′ 最小にするために分析媒体中に存在するミップ/ED接合体
の全てが表面に実質的に結合されることを確実にするのに充分な量である。この
方法に於いて、再現性ある比較的低い値が分析物の不在下で得られるべきである
。分析物の存在下で、観察値は増加する。
分析物を測定するために種々のプロトコルが使用し得る。
プロトコルに応じて、種々のその他の試薬が注目の範囲内での分析物の最大量よ
りも実質的に過剰で使用し得る。成るプロトコルは固体表面へのミップの結合を
伴ない、ここで固体表面に結合されたミップは通常注目の分析物範囲内での分析
物の最高値の約5倍以下の制限された量である。試料及び固定化ミップは適当な
時間、通常少なくとも約1分であって通常約12時間以下、更に通常約6時間以
下、好ましくは約30分以下でインキュベートされる。ついで酵素供与体−ミツ
ブ接合体が添加され、ここでミップは固定化ミップの相互 ′構成員または相補
性構成員である。所望により、試料及び酵素供与体接合体は連続的よりむしろ同
時に添加されて競合を与えてもよい、相補性ミップ間の複合体の生成に充分な時
間の後、その結果酵素接合体が固定化ミップの有効部位に結合することができ、
その後酵素受容体及び基質が添加されてもよ(、媒体の酵素活性が平衡状態で、
あるいは酵素活性の変化の割合として測定され、後者の場合、固定化酵素供与体
の量が経時変化する。
接合体の濃度は、相補性ミップの結合親和性、注目の濃度範囲、分析時間等に応
じて広く変化する。通常、接合体は分析物の注目の範囲内の最低濃度の約0.5
倍以上、好ましくは注目の範囲内の分析物の最低濃度の約1倍以上であり、示さ
れるように特定のプロトコルに応じて10倍以上程度に実質的に過剰であっても
よい。いずれのプロトコルに於いても、特定の濃度は経験的に最適化し得る。試
薬濃度を最適化する種々の技術は、文献、例えばウィリアム・オデル(Will
iao+0dell)編集、Pr1n坦坦犯」Lぷジ至住山工上毀止匡ユ迂虹旦
ハ1粒((1983年)、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ・インコーポレー
ション(John Wiley and 5ons、 Inc、、 =ニーヨー
ク、NY、特に141〜147頁)及びエルク(Eruk)等著、Ann。
Cl1n、Biochem、 (1984年)21巻、434〜443頁に見ら
れる。
別のプロトコルは、分析物の実質的に全部が結合するように試料と実質的に過剰
量の相補性ミツブー酵素供与体接合体とを組合せることを含む。相補性ミップ間
の実質的に完全な。
複合体生成に充分な時間の後、媒体がミップ/酵素供与体接合体のミップに相補
性である固定化ミップと組合される。この状況に於いて、Fabフラグメントの
如き一価の受容体を使用することが望ましいことがある。有効な酵素供与体接合
体が固定化ミップに結合するのに充分な時間の後、実質的に過剰量の固定化ミッ
プがある場合には、酵素受容体及び基質が添加されて、媒体の酵素活性が前記の
ように測定される。
上記の如く、ミップ/ED接合体はりガントまたは受容体ミップを伴なってもよ
い0分析物が受容体である場合には、ミップ/ED接合体のミップはリガンドで
ある。また、分析物がリガンドである(また抗体もリガンドとして作用し得る)
場合には、受容体が通常使用される0種々の受容体が使用され、それらの受容体
は一価である。即ち、受容体は唯一の特異的結合部位を有する。Fabフラグメ
ントが結合に便利に使用し得る。また、酵素、血清タンパク質、等の如き天然受
容体が使用されてもよい。
ミップ/ED接合体は、測定される分析物の最高濃度よりも実質的に過剰で添加
される。それ故、分析物を実質的に飽和するのに充分なミップ/ED接合体が存
在する0通常、ミップ/ED接合体対分析物の注目の範囲の最高値の比は、少な
くとも約1.5:1、更に通常少なくとも約2:1であり、20:1以上程度に
高くてもよい、ミップ/ED接合体の量は一層多い量では臨界的ではないが、過
剰の程度が大きい程、固定化相補性ミップに結合される必要がある量が多くなり
、観察されるバックグラウンド値が大きくなる。か(して、インキュベーション
期間を最小にし、且つバックグラウンド値を最小にするように過剰の程度を制限
しつつ注目の範囲にわたって正確な結果を得るのに充分な分析物との反応を与え
る過剰量が選択される。
分析物及びミップ/ED接合体は両者とも溶液中にあり、ミップ/ED接合体は
分析物の比較的低濃度でさえも大過剰量であるので、比較的短かいインキュベー
ション時間が使用し得る。か(して、インキュベーション時間は通常少なくとも
約1分であり約30分以下、好ましくは約15分以下であり、多くの場合5分で
充分である。インキュベーション温度は分析物の性質に応じて広く変化してもよ
(、通常4°C以上、好ましくは約15℃以上で約40°C以下であり、一般に
は約25〜37℃の範囲である0分析物及びミツプ/ED接合体をその他の試薬
の添加前にインキュベートすることは必要ではないが、ミップ/ED接合体に関
して表面上の固定化ミップと分析物との間の競合を有することよりもむしろ分析
を逐次行なって相補性ミップ複合体生成を確実にすることが通常望ましい。
分析物とミップ/ED接合体との間の反応が一旦起こると、分析媒体はミップ/
ED接合体に対して相補性である固定化ミップと接触されてもよい。かくして、
固定化ミップに結合されるミップ/ED接合体は酵素受容体(EAと称する)と
活性な酵素を生成するのに実質的に低い能力を有する。固定化ミンプと一緒にす
ることは、分析媒体を異なる容器に移し、通常撹拌しながら粒子を分析媒体に添
加し、分析媒体をカラム等の中に通すことを意味し得る。固定化相補性ミップの
量は、分析物と複合体形成しなかったミップ/ED接合体の実質的に全部を結合
するのに充分である。かくして測定が行なわれる分析媒体は未複合体化ミップ/
ED複合体を、全く含まないものではないとしても、実質的に含まないものであ
るべきである。
存在するミップ/ED接合体の量に較べて、大過剰量の固定化ミップが使用し得
る。通常、その過剰量は少なくとも約10倍、更に通常少なくとも約50倍、便
利には100倍以上であり、1000倍以上程度に多くてもよい。固定化ミップ
はミップ/ED接合体がその表面に拡散することを必要とするので、過剰量はミ
ップが固定化された方法及び溶液中のミップ/ED接合体に対するその有用性に
応じて変化する。
未複合体化ミップ/ED接合体が固定化ミップに結合させるのに充分な時間にわ
たって分析媒体を固定化ミップと供にインキュベートすることは必須ではないが
望ましい0通常、これは少なくとも約1分、更に通常少なくとも約2分て約30
分以下、通常約15分以下、好ましくは約5分を要する。
インキュベージタン期間後に、残りの試薬が添加される。
残りの試薬は通常酵素受容体及び基質のみである。付加的な試薬が添加されても
よく、読み取りが所定期間、通常約5秒以内、更に通常約10秒以内、好ましく
は約20秒以内で行なわれ、ついで読み取りが測定のため10〜60秒間隔で行
なわれる。添加されるEAO量は、固定化されないミップ/ED接合体の実質的
に全部を複合体形成するのに充分な量であり、一般には分析物の注目の最高濃度
の量に対して少なくとも等量、通常その量よりも過剰量、通常約1000倍以下
の過剰量、更に通常約500倍以下の過剰量、−iには少くとも約2倍の過剰量
である。EA及び基質が一旦添加された時、分析が通常のED/EAβ−ガラク
トシダーゼ分析として行なわれる。
粒子が使用される場合、比較的小さい粒子が使用されることが望ましく、一般に
約20〜200nm、好ましくは約50〜1100nの範囲である。
固体表面に於ける酵素活性は、溶液中の酵素活性より実質的に小さく、観察され
るその割合は媒体中の分析物の量と供に変化する。
酵素活性は、既知量の分析物を有する標準を用いることにより特定のプロトコル
について測定し得る。この方法に於いて、標準曲線が特定の条件の組のもとに作
成されてもよく、ここで未知の試料について得られた結果が標準曲線に関係づけ
られ、分析物の定量測定を与え得る。
種々の基質が分光光度測定または螢光光度測定に使用し得る。0−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシド、β−ガラクトシジルウンベリフェロン、ジ−β−ガラク
トシリルフルオレセン、レゾルフィン−β−ガラクトシドを使用し得る。基質の
濃度は律速性でないように実質的に過剰量とする。
キットが試薬の便利な組合せのために提供され得る。キットは固定化ミップ、酵
素供与体−ミツブ接合体、酵素受容体及び便利には基質を提供する0種々の成分
は凍結乾燥粉末、分散液として、容器、例えばマイクロタイタープレート等とし
て供給し得る。試薬の量は、特定のプロトコルのため相対的な比率であるように
与えられてもよい。安定剤、緩衝剤、殺菌剤、賦形剤等の如きその他の添加剤が
存在してもよい。
充填剤は別として、添加剤は一般に比較的少量、通常約2〜8%未満の量である
。
以下の実施例は、説明のために示されるものであり、本発明の範囲を制限するも
のではない。
裏−腋
固相均一分析を示すため、抗ジゴキシン(antidigoxin)セファロー
スを用いてジゴキシンの分析を開発した。
一般的な操作は、抗ジゴキシン及び22のカップリング緩衝液(0,1M重炭酸
ナトリウム、pns、a、0.5MNaCf)を4℃で一夜透析し、翌朝緩衝液
を変え透析を少なくとも30分続けることである。ついでタンパク質濃度をOD
280nmで測定し、カップリング緩衝液を添加して所望の濃度を得る。
セファロース(Igの乾燥セフ10−スはほぼ3.5 dの水和セファロースに
相当する)を計量し、焼結ガラスロートに添加し、続いてIIIIMの冷HCf
で200d HC/!/セファロース1gで洗浄する。洗浄を、HCf溶液の連
続添加により15分間続ける。ついでセファロースをカップリング緩衝液中でゆ
すぎ、抗ジゴキシンを含む反応管に移す。
管を室温で2時間または4℃で一夜振動させる。セファロース上の未反応部位は
、ウシ血清アルブミンを5■/d BSAの濃度で添加することによりブロッキ
ングする。その混合物を室温で2時間インキュベートする。セファロースをでレ
ット化し、上澄液を除去し、ベレットを0.2 Mのクリシン(pH8,0)中
で分散させ、続いて室温で2時間、または4°Cで一夜振動させる。セファロー
スを焼結ガラスロート上に置(ことにより、過剰の吸着タンパク質を除去し、続
いて数倍容量の酢酸塩緩衝液(0,1M酢酸ナトリウム、0.5 M NaCl
、pH4,0)で洗浄し、続いて数倍容量のカップリング緩衝液で洗浄し、交互
に緩衝液洗浄を行なう、ついで得られた粒子を、5■/d BSA及び0.1%
アジ化ナトリウムを含む分析緩衝液中に懸濁し、4℃で貯蔵する。
一塩基性リン酸カリウム2.5g、二塩基性リン酸カリウム23g、−塩基性リ
ン酸ナトリウム−水和物1.7g、二塩基性リン酸ナトリウム12.5 g、酢
酸マグネシウム四水和物0.644g、アジ化ナトリウム1.3g、エチレング
リコール12.25mff1及びIQ X EGTA溶液(水20〇−中EGT
A 7.6 g、水酸化ナトリウム1.6 g)100me及び10+wMジチ
オスレイトール(di thiothrei tol中の10%トウイーン(T
ween) 20 5 rttflを組合せることにエチレン−ビス−オキシエ
チレンニトリロテトラ酢酸である。)下記の表は、上記の操作に使用される物質
の量を示す。
I 2 7.77 12 95
11[22,1” 10 30
IV 2 0.63” 10 50
* BSA (ウシ血清アルブミン)を2■/dの全タンパク質濃度になるよう
にカップリング溶液に添加した。
*本BSAを2時間で添加した。
分析を行なうため、5 ng/−〜0.025ng /dの範囲の種々の濃度の
ジゴキシンを、対照として抗ジゴキシンセファロースまたはBSA−セファロー
スと供に予備インキュベートした。固定した濃度のED−ジゴキシン複合体をジ
ゴキシン/抗ジゴキシンセファロース試験物に添加しインキュベートした。幾つ
かの場合には、ヒツジ抗ウサギ免疫グロブリン(GARSと称する)を添加して
抗−抗体の効果を測定した。
具体的な操作は、下記のとおりである。5■/d BSAを含) 有する分析緩
衝液中の抗ジゴキシンセファロースロット1vを50%スラリーとして調製し、
ついでスラリー35jiを担体セファロース165Iと混合し、1.5 dのマ
イクロフユージ管に移した。ついで、この管にジゴキシン100Iを所望濃度で
添加し、管を室温で30分振動させた。ついで、この管に酵素供与体(ED−4
)−ジゴキシン(米国特許出願第721.267号明細書を参照のこと)100
JJ1を添加して8 Xl0−”Hの最終濃度を得た。この時点で、GARSを
適当に添加して1ニア50の背中の最終希釈液を得た。ついで、試験液を展開液
(2,5X10−’M酵素受容体及び3.05mg/affi o−クロoフェ
ノールレッドーβ−ガラクトシダーゼ(CPRGと称する)〕で展開して酵素受
容体5. OXIO”’M及びCPRGo、61■/dの最終濃度を得た。各試
験管を室温で22分振動させた後、イソプロピルチオガラクトシド(240mM
) (IPTGと称する)100Jllを添加して401の最終濃度を得ること
により、反応を停止した。ついでセファロースをマイクロフユージ中でベレット
化し、上澄液100Iをマイクロタイタウエルに移し、タイターチック(Ti
tertek)分光光度計で577nmの吸光度を読み取った。また、適当な分
光光度計を用いて分離せずに管を通して吸光度を測定できた。
下記の表は、その結果を示す。
0.5 684 732
0.25 561 542
0.2 490 507
0.1 351 338
0.05 324 328
0.025 268 286
0.0セフアロースなし 839
上記の結果は、0〜5ng/mのジゴキシン濃度範囲にわたって酵素活性を調節
することができ、0.025ng / ml程度の少ないジゴキシンを検出し得
ることを示す。更に、抗ジゴキシンに対する抗体の存在は酵素活性に関して有意
な効果をもたないようである。バックグラウンドシグナルは、幾つかの因子を個
々に、または同時に変えることにより、即ちEA濃度を下げ、展開時間を変え、
そして一層純粋な酵素供与体ミップ接合体を使用することにより減少し得る。
且粁及び方法
材料
EP−fab接合体の製造のため、全ての〔腹水性(asci ties) )
抗体は、ベックマン・インストルメンツ・インコーポレーション(Beckma
n Instruments Inc、)、イルビン(イルビン)、CAから入
手した。酵素受容体(EA)及び凍結した乾燥酵素供与体(ED)は、ミクロゲ
ニクス・インコーポレーション(Microgtnics Inc、)コンコー
ド(Concord) 、CAから入手した。カルボキシル修飾ポリスチレン微
粒子は、ポリサイエンシズ・インコーポレーション(Polysciences
Inc、) 、ワリントン(Varrington)、PA及びポリマー・ラ
ボラトリイズ(Polymer Laboratories)、英国から入手し
た。ラテックス接合体の調製に使用されるhCGは、シグマ(Sigma)、セ
ントルイス、MOから入手した。スクリップス(Scripps)、サンジエゴ
、CAから入手されたhCGは試料較正物質として使用した。脱脂された全ヒト
プール血清は、バイオセル(Biocell) =カーリン、CAから入手した
。ベニンスラ・ラブズ(Peninsu−1a Labs)、バーリンゲーム(
Bur 1 ingame)、CAから入手したCPRGは基質として使用した
。
−fabフーグメント 人 の81
の゛ づし、パ′ヒ び 衛11
抗hCGモノクローナル抗体を、イムノブロッティング技術によりLH及びTS
Hに対する交差反応性に関してスクリーニングした。親和性をスカチャード(S
catchard)分析により評価した。選択された抗体を、20〜300mM
KPO,の直線勾配溶離液(pH6,8>を用いて90X2.5印のヒドロキ
シルアパタイト〔カルビオケム(Calbioche+a) )で精製した。つ
いで、夫々の精製された抗体を、メルチューリパパイン(mercuripap
ain)〔シグマ(Sigma) 〕で消化した時の最高Fab収率に関して性
格づけをした。消化物を、TRl5−)ICj! (pH8)で平衡化された1
0 X 2. S cmDEAEカラム(高性能イオン交換セルロース、ピアー
ス(Pierce) )で精製し、O〜300mM NaCl勾配で溶出した。
画分を免疫電気泳動により分析し、純粋なFabを含む両分をプールし、PEG
を用いて濃縮し、10抛Hリン酸ナトリウム4 mM EDTA 、 pH7,
4中で透析した。
EDのヨウ−び 制
製造グレードのED4(米国特許第4.708.929号明細書を参照のこと)
を、放射標@ED4−TNB(標準法により行なわれた)と混合し、逆相HPL
Cクロマトグラフィーを用いて精製した。
EDをプールし、濃度及び放射線接合性(radioconjugatabil
ity)、を測定した。アリコツトを凍結乾燥し一20°Cで貯蔵した。
夫々の接合体を下記のようにして調製した。純粋なFab/■を、10mM リ
ン酸ナトリウム、150mM NaC12(PBS) 、 (pH7−3)中2
mMスルホ−Sl’lCC(ピアース・ケミカル・カンバニイ(Pierce
Chemical Co、) )で室温で15分活性化した。活性化Fabは、
脱気PBS中で平衡にされたセファデックスG−25PD−10カラム(ファー
マシア(Pharvacia))で過剰のSMCCから分離した。逆滴定の結果
は活性化後にFab1個当りほぼ2〜3個のマレイミドがあることを示した。接
合反応中に充分過剰のEDがあることを確実にするためにED3モル対マシマレ
イミド1モルを使用する。EDの必要量が一旦決定されると、凍結乾燥したED
を活性Fabで再形成し、室温で1時間反応させる。相接合体の濃度を、CD
280及び計数/分のデータにより測定する。過剰のEDを除去するために、F
PLCでセファロースに(ファーマシア)カラムを用いて接合体を精製する。最
終生成物を含むプール画分を分割し一20°Cで貯蔵する。
hcc−−テ、・クス 人 の置割
“カルボジイミド”法によるカルボキシル ボッスチレン1 に・ るhCGの
北 人力・プ1ング使用したプロトコルは、ポリサイエンシズにより発行された
プロトコルの改良である。hcc−ラテックス接合体を下記のようにして調製す
る。?0nmのポリスチレン粒子(ポリサイエンシズ)の10%の固体素材懸濁
液2II11を、アミコン(Amicon)YmlOO濾過装置を用いて100
d炭酸塩緩衝液100d(pH9,6)で洗浄した。アミコン洗浄を繰り返し、
今度は20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4゜5)100dを用いる。
ラテックスをリン酸塩緩衝液5d中で再懸濁し、新しい2%の1−(3−ジメチ
ルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(HDAC)リン酸塩緩
衝液10−を滴下して添加する。反応混合物をロッカーテーブル上で室温で15
分間撹拌する。この(HDAC)活性化工程に続いて、70nmのラテックスを
マイクロフユージ中でペレット化する。混合物をエッペンドルフ(Eppend
orf)遠心分離管中に分け、10分回転させ、上澄液を捨てた。未反応カルボ
ジイミドを除去するため、ベレットを200mMホウ酸塩緩衝液(pH8,5)
中に再懸濁し、同様にして3回洗浄した。ついでペレットを再懸濁し、ホウ酸塩
緩衝液2Od中にプールした。カップリングタンパク質hCGをラテックス1
ml当り約3■で添加し、反応をロッカー上で一5℃で一夜混合した0次に、ホ
ウ酸塩緩衝液中の250mMエタノールアミノ800 t1!を添加して微粒子
上の未反応部位をブロッキングする。ロッカー上で室温で30分インキュベート
した後、ラテックスをマイクロフユージ中でペレット化する。上澄液をタンパク
質測定のために取っておく。
残存する非特異的タンパク質結合部位をブロッキングするために、L−α−アス
パルチル−し−フェニルアラニンスチルエステル(APMと称する)10mg/
d及びpvp−401g/iを含むホウ酸塩緩衝液中にラテックスを懸濁する。
反応を室温で4時間以上続行させる。ついで、ラテックスをアミコニ/YmlO
O濾過器を用イ”’CP B S (pH7,4、約200d) テ十分に洗浄
する。最終調製物を、10■/meBsA、5%グリセロール及び0.1%アジ
化ナトリウムを含むPBS (貯蔵緩衝液)2d中に再懸濁する。
コバス・バイオ(Cobas Bio)分析に使用する前に、ラテックスをアミ
コン濾過装置を用いて分析緩衝液約200d (200mMリン酸カリウム、1
00mMリン酸ナトリウム、3Il+M酢酸マグネシウム、20mMアジ化ナト
リウム、50mMエチレングリコール、160mM EGTA 、0.01%ト
ウイー:/−20,pH7,0) T:洗浄する。
一テックスインヒビ −を いる−−hCG F のためのコバス・バイオの゛
至■り]しヒエと
a、インキュベーション 患者試料を、HD −Fab複合体と供に37゛Cで
5分間インキュベートした。
b−二Δりぼ達しく土掘
(1)予備インキュベートされた試料50mをhcG−ラテックス試薬150j
1!と5分間混合する。
(2)出発試薬(5,o xlo−’n EA22 ; 0.61mg/dcp
Rc)30dを添加し、00574に於ける30秒の読み取りを行なう。
c−5玉 相補活性は増大する血清hCG量の関数である。
hCGが増大されるにつれて、一層多くのED−Fabが予備インキュベーショ
ン工程中で分析物をhCGに結合する。これは、hCG−ラテックスによる阻害
結合に用いられる一層少ないED −Fabを残す。
下記の表は、その結果を示す。
−37Xl0−” I Xl0−” 209−185 5 Xl0−IoI X
l0−” 220−370 1 Xl0−’ I XIO”′。234−185
0 5 Xl0−’ I Xl0−”−37001X10−” I Xl0−’
294−18,500 5 Xl0−” ’ I Xl0−”−37,000
1xlO−’ 1 xlO−” 307上記の結果から、低濃度に於ける多種の
分析物の検出を可能にする有効で感度の良い分析が提供されることが明らかであ
る。その分析は、取扱い及び種々の処理により導入される誤差を最小にするよう
に分離工程または洗浄を用いずに簡単なプロトコルで比較的短い期間にわたって
行ない得る。
この方法に於いて、正確な結果が再現性のある方法で得られここで分析が実際に
均一であるように、多種類の分光光度計または螢光光度計が使用し得る。
本明細書に言及された全ての刊行物及び特許出願は本発明が関係する当業者の技
術水準を示す。全ての刊行物及び特許出願は、夫々個々の刊行物または特許出願
が詳細に、しかも個々に参考として含まれるように示されているのと同じ程度に
本明細書に参考として含まれる。
本発明が充分記載されていることから、多くの変化及び改良が請求の範囲の精神
または範囲から逸脱しないで本発明になし得ることが当業者に明らかである。
国際調査報告
Claims (12)
- 1.試料中の分析物の存在を測定する方法であって、前記の分析物が特異的結合 対(“ミッブ”)の構成員であり、前記の方法が試薬としてN末端酵素供与体フ ラグメント(“ED”)及びC末端酵素受容体フラグメント(“EA”)を含む β−ガラクトシダーゼのフラグメントを使用し、前記のフラグメントが活性酵素 複合体を生成し、前記の酵素供与体が相補性ミッブヘの結合に於いて前記分析物 に対して交差反応性または相補性であるミッブに接合され、前記接合体及び/ま たは前記分析物に相補性のミッブが巨大分子または担体に接合される方法であっ て、 前記の方法が、 分析媒体中で前記試料、前記ED、前記EA、前記の結合ミッブ及び酵素基質を 接触せしめ、前記結合ミッブ及び前記ED接合体は相補性であり、且つ結合ED 接合体が酵素活性複合体を生成することを実質的に抑制され、ついで前記分析媒 体の酵素活性を、既知量の分析物を有する分析媒体と比較して測定する、 ことを含んでなる前記の測定方法。
- 2.前記の接触が前記試料、前記のED接合体及び前記の結合ミッブを一緒にし 、ついで前記の酵素受容体の添加前にインキュベートすることを含み、前記の結 合ミッブが前記分析物に相補性である、請求の範囲1項記載の方法。
- 3.前記の接触が第一工程で前記試料及び前記の結合ミッブを一緒にし、ついで インキュベートし、第二工程で前記のED接合体を添加し、ついでインキュベー トし、ついで第三工程で前記のEAを添加しインキュベートすることを含む、請 求の範囲第2項記載の方法。
- 4.前記の接触が第一工程で前記試料及び前記のED複合体を一緒にし、前記分 析物及びED複合体が相補性であり、且つ前記のED接合体が前記の結合ミッブ に関して一当量であり前記分析物に対して実質的に結合過剰量であり、ついで複 合体生成が起こるのに充分な時間にわたってインキュベートし、前記のED接合 体に対して実質的に結合過剰量で結合ミッブを添加し複合体生成が起こるのに充 分な時間にわたってインキュベートし、ついでEA及び基質を添加することを含 む、請求の範囲1項記載の方法。
- 5.前記の結合ミッブが約20〜200nmの粒子に結合されたミッブである、 請求の範囲第4項記載の方法。
- 6.試料中の分析物の存在を測定する方法であって、前記の分析物が特異的結合 対(“ミッブ”)の構成員であり、前記の方法が試薬としてN末端酵素供与体フ ラグメント(“ED”)及びC末端酵素受容体フラグメント(“EA”)を含む β−ガラクトシダーゼのフラグメントを使用し、前記のフラグメントが活性酵素 複合体を生成し、前記の酵素供与体が相補性ミッブヘの結合に於いて前記分析物 に対して交差反応性または相補性であるミッブに接合され、前記接合体及び前記 分析物に相補性であるミッブが固定化される方法あって、前記の方法が、 分析媒体中で前記試料、前記のED接合体及び固定化ミッブを接触せしめ、つい で複合体生成か実質的に完結するのに充分な時間にわたってインキュベートして 第一混合物を得、前記のEA、基質及び検出可能な生成物を生成するのに必要な 付加的な試薬を添加し、 ついで前記分析媒体の酵素活性を既知量の分析物を有する分析媒体と比較して前 記の検出可能な生成物により測定することを含んでなる、前記の測定方法。
- 7.試料中の分析物の存在を測定する方法であって、前記の分析物が特異的結合 対(“ミッブ”)の構成員であり、前記の方法が試薬としてN末端酵素供与体フ ラグメント(“ED”)及びC末端酵素受容体フラグメント(“EA”)を含む β−ガラクトシダーゼのフラグメントを使用し、前記のフラグメントが活性酵素 複合体を生成し、前記の酵素供与体が相補性ミッブヘの結合に於いて前記分析物 に対して交差反応性または相補性であるミッブに接合され、前記接合体に相補性 のミッブが固定化される方法あって、 前記の方法が、 分析媒体中で前記試料及び前記分析物に対して実質的に結合過剰量の前記のED 接合体を添加し、ついで複合体生成が実質的に完結するのに充分な時間にわたっ てインキュベートして第一分析媒体を生成し、 前記の第一分析媒体を前記の固定化ミッブと一緒にし、前記の固定化ミッブは前 記のED複合体に対して実質的に結合過剰量であって第二分析媒体を生成し、前 記の固定化ミッブ、EA、基質及び検出可能な生成物を生成するのに必要な付加 的な試薬と同時にまたは逐次に一緒にし、ついで 前記の分析媒体の酵素活性を、既知量の分析物を有する分析媒体と比較して前記 の検出可能な生成物により測定することを含んでなる前記の測定方法。
- 8.前記の固定化ミッブが約20〜200nmの粒子に結合される請求の範囲7 項記載の方法。
- 9.前記ミッブが一価の抗体フラグメントである請求の範囲7項記載の方法。
- 10.ED,EA、結合ミッブを含み、前記ミッブが特異的な結合構成員への結 合に関して分析物と相補性または交差反応性であり、且つ前記のED複合体及び 前記の結合ミッブが相補性であることを特徴とする、請求の範囲1項記載の方法 に有効なキット。
- 11.前記の結合ミッブが約20〜200nmの粒子に結合されたミッブを含む 、請求の範囲10項記載のキット。
- 12.前記のED複合体が前記の分析物に対して特異的なFabフラグメントを 含む、請求の範囲10項記載のキット。
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